Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (taxus wallichiana zucc ) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư

Luận văn

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt trong luận án

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ ……… ….1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY THÔNG ĐỎ 3

1.1.1 Tên khoa học 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 3

1.1.3 Thành phần hóa học 5

1.1.4 Tác dụng sinh học 9

1.1.5 Các thuốc điều trị ung thư nguồn gốc từ thông đỏ 9

1.2 CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT 11

1.2.1 Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai 11

1.2.2 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 13

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt chất trong nuôi cấy tế bào thực vật 15

1.3.1 Nhu cầu nguồn nguyên liệu paclitaxel trong điều trị ung thư 21

1.3.2 Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật 22

1.3.3 Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sử dụng trong đánh giá chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ 28

1.3.4 Các phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từ sinh khối tế bào thông đỏ 29

2.1.1 Nguyên liệu và hoá chất 31

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 31

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.2.1 Xây dựng qui trình tạo sinh khối thông đỏ 32

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học và chiết xuất phân lập một số chất chính, xây dựng TCCS của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ 36 2.2.3 Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ 42

3.1.1 Tạo callus thông đỏ 42

3.1.2 Duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch 48

3.1.3 Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng 52

3.1.4 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít 64

3.1.5 Kết quả nghiên cứu thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ 65

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ 70

3.2.1 Xác định thành phần hóa học trong sinh khối tế bào thông đỏ 70

3.2.2 Chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính trong sinh khối tế bào thông đỏ 81

3.2.3 Chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ 89

3.2.4 Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ và hoạt chất 97

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 104

4.1 QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ 104

4.1.1 Về nuôi cấy tạo callus thông đỏ 104

4.1.4 Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bioreactor 5 lít 124 4.1.5 Về quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ 126 4.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ 126 4.2.1 Về nghiên cứu thành phần hóa học 126 4.2.2 Về chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất chính có trong sinh khối tế bào thông đỏ 129 4.2.3 Về chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ130 4.2.4 Về kết quả xây dựng TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ 133 KẾT LUẬN 135 KIẾN NGHỊ 137 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO 139 PHẦN PHỤ LỤC 155

FE Fungal elicitor (elicitor từ nấm)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao

MS Môi trường Murashige - Skoog

USP United States Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) Xyl Xylosyl

3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn 42

3.3 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy 44

3.4 Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy 45

3.5 Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus 45

3.6 Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển

của callus

47

3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus 47

3.8 Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus 48

3.9 Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH 50

3.10 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus 51

3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào 51

3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus 52

3.13 Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào 53

3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế

3.18 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào 57

3.19 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 58

3.20 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào 59

lượng paclitaxel trong tế bào

3.22 Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm

lượng paclitaxel trong tế bào

60

3.23 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ

phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào

61

3.24 Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ

phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào 623.25 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose 633.26 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường 643.27 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít 653.28 Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel

trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ

3.36 Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III 78

3.38 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ 793.39 Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu

lá thông đỏ tự nhiên bằng HPLC

813.40 Số liệu phổ 13C-NMR của các các chất 1 – 6 85

3.41 Số liệu phổ H-NMR của các chất 1 - 6 863.42 Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau 89

3.44 Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế

3.46 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và

hiệu suất tinh chế paclitaxel

92

3.47 Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 933.48 Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 943.49 Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các

giai đoạn chiết xuất, tinh chế

95

3.50 Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ 973.51 Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ 983.52 Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông

1.1 Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 41.2 Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ 51.3 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 141.4 Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian 19

2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định

tính

37

3.1 Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus 43

3.3 Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian 463.4 Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau 493.5 Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch

SH

49

3.6 Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển 533.7 Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 543.8 Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong

paclitaxel và baccatin III

75

3.15 Sắc ký đồ các mẫu phân tích 80

3.17 Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột 93

3.19 Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ 963.20 Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b) 99

Trang

3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn 42

3.2 Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn 43

3.3 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy 44

3.4 Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy 45

3.5 Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus 45

3.6 Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển của callus 47

3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus 47

3.8 Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus 48

3.9 Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH 50

3.10 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus 51

3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào 51

3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus 52

3.13: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào 53

3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế bào 55

3.15 Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ 55

3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ 56

3.17 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát triển tế bào 57

3.18 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào 57

3.19 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào .58

3.20 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào .59

3.21 Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào 60

3.22 Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào 60

3.24 Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát

triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào 62

3.25 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose 63

3.26 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường 64

3.27 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít 65

3.28 Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ 67

3.29 Khảo sát điều kiện pha động 71

3.30 Chương trình chạy sắc ký 73

3.31 Độ lặp lại của hệ thống 74

3.32 Sự phụ của diện tích píc vào nồng độ paclitaxel và baccatin III 75

3.33 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel 76

3.34 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III 76

3.35 Kết quả xác định độ chính xác 77

3.36 Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III 78

3.37 Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử 78

3.38 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ 79

3.39 Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu lá thông đỏ tự nhiên bằng HPLC 81

3.40 Số liệu phổ 13C-NMR của các các chất 1 – 6 85

3.41 Số liệu phổ 1H-NMR của các chất 1 - 6 86

3.42 Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau 89

3.43 Kết quả chiết xuất paclitaxel với DCM .90

3.44 Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế paclitaxel 91

3.46 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và hiệu

suất tinh chế paclitaxel 92

3.47 Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 93

3.48 Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 94

3.49 Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các giai đoạn chiết xuất, tinh chế 95

3.50 Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ 97

3.51 Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ 98

3.52 Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông đỏ 98

3.53 Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ 99

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 4

1.2 Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ 5

1.3 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 14

1.4 Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian 19

1.5 Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel .23

2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định tính 37

3.1 Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus 43

3.2 Callus trên các môi trường khác nhau 45

3.3 Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian 46

3.4 Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau 49

3.5 Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch SH 49

3.6 Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển 53

3.7 Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 54

3.8 Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong Bioreactor 66

3.9 Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ 69

3.10 Sắc ký đồ mẫu sinh khối thông đỏ xử lý theo phương pháp chiết lỏng -lỏng (a) và -lỏng - rắn (b) 70

3.11 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha động III sử dụng cột Luna L43 72

3.12 Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b) 72

3.13 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b) .74

3.14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ paclitaxel và baccatin III 75

3.15 Sắc ký đồ các mẫu phân tích 80

3.16 Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9 89

3.17 Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột 93

3.18 Sắc ký đồ các mẫu paclitaxel 95

3.19 Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ 96 3.20 Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b) 99

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý phân bố chủ

yếu tại khu vực dãy núi Hymalaya Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m với số lượng cá thể nhỏ Từ lâu, trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hoá ; cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trị bệnh đau đầu Đặc biệt, trong thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel (taxol), cephalomannin hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung thư như baccatin III, 10-deacetyl baccatin III, deacetyl taxol… Tuy nhiên, thông đỏ là loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong cây thấp Theo tính toán của các nhà khoa học, để điều trị khỏi cho một bệnh nhân cần sử dụng nguồn dược liệu tương đương với 8 cây thông đỏ 60 năm tuổi [125] Vì vậy, nguồn nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đáp ứng đủ nhu cầu điều trị ngày càng tăng, đồng thời việc khai thác từ cây tự nhiên dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơ tiệt chủng loại dược liệu quý hiếm này [125]

Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã nhân giống thành công và trồng rộng rãi thông đỏ tại Đà Lạt để lấy lá sử dụng chiết xuất 10-deacetyl baccatin III làm nguyên liệu bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6] Hiện nay, Bộ Khoa học Công nghệ đã cho phép triển khai nhiều đề tài, dự án về nghiên cứu chiết xuất phân lập cũng như sản xuất thuốc tiêm paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam nhằm mục đích tạo ra sản phẩm thuốc điều trị ung thư phục vụ cộng đồng Bên cạnh đó việc ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các hoạt chất từ dược liệu nói chung và thông đỏ nói riêng cũng là hướng nghiên cứu mới có triển vọng [125]

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật là công nghệ nuôi cấy các tế bào trong điều kiện vô khuẩn trong ống nghiệm hay các bình nuôi cấy lớn, nhằm mục đích tạo ra khối lượng tế bào từ đó có thể sử dụng để tách chiết các hoạt chất [46], [53] Công nghệ sinh khối tế bào có ưu điểm so với việc gieo trồng ngoài tự nhiên là: thời gian từ khi nuôi cấy tới khi thu hoạch ngắn, không chịu ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, dịch bệnh, thời vụ; chất lượng nguyên liệu ổn định, hàm lượng hoạt chất có thể được cải thiện hơn so với trồng ngoài tự nhiên Công nghệ này rất thích hợp cho việc sản xuất các chất trong thực vật có cấu trúc hoá học phức tạp khó tổng hợp bằng con đường hoá học hoặc các chất có hàm lượng thấp trong cây tự nhiên Từ công nghệ sinh khối tế bào thực vật, các nhà khoa học đã cung cấp cho thị trường những sản phẩm có giá trị phục vụ cho ngành công nghiệp Dược phẩm và thực phẩm [9], [53]

Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên liệu sản xuất paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo hướng ứng dụng

công nghệ sinh khối tế bào thực vật, đề tài: “Nghiên cứu quy trình tạo sinh

khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu:

1 Xây dựng được qui trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ qui mô phòng thí nghiệm

2 Xác định được thành phần hoá học, chiết xuất, phân lập một số chất chính và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ tạo ra

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY THÔNG ĐỎ

Cây thông đỏ (Taxus sp.) hay cây thủy tùng được phân bố khắp các

vùng ôn đới của Bắc bán cầu, có tuổi đời kéo dài hàng trăm năm Có nhiều loài thông đỏ trên thế giới trong đó 8 loài được ghi nhận bao gồm: thông đỏ

Châu Âu (T baccata); thông đỏ Thái Bình Dương (T brevifolia); thông đỏ Canada (T canadensis); thông đỏ Trung Quốc (T chinensis), thông đỏ Nhật Bản (T cuspidata), thông đỏ Florida – Hoa Kỳ (T floridana); thông đỏ Mexico (T globosa) và thông đỏ Himalaya (T wallichiana) – loài thấy có ở

cao nguyên Đà Lạt – Lâm Đồng của nước ta Ngoài ra, còn có hai giống lai

được công nhận: Taxus × media = T baccata × T cuspidata và Taxus × hunnewelliana = T cuspidata × T canadensis

Tại Việt Nam chủ yếu là loài thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (hình 1.1) Ngoài ra tại các vùng Sapa – Lào Cai,

Mai Châu – Hoà Bình, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Ba Vì – Hà Nội, Sìn Hồ - Lai

Châu còn có thêm loài thông đỏ Trung Quốc (T chinensis) [1] Trong luận án này đề cập tới loài thông đỏ Hymalaya (Taxus wallichiana Zucc.) mọc ở Đà

Lạt được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu tạo sinh khối tế bào

1.1.1 Tên khoa học: Taxus wallichiana Zucc., thuộc họ Thông đỏ-Taxaceae

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Thông đỏ (thông đỏ lá dài, thông đỏ nam, hồng đậu sam) là cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ nhiều cành, lá thường xanh, sắp xếp theo hình xoắn ốc, thường vặn xoắn tại gốc lá tạo thành kiểu 2 hàng Các lá có dạng thẳng hay hình mũi mác, với dải khí khổng màu lục nhạt hay trắng ở mặt dưới Các loài phần lớn là đơn tính khác gốc, ít khi đơn tính cùng gốc Các nón đực dài khoảng 2-5 mm, tung phấn ra vào đầu mùa xuân Các nón cái bị suy giảm

mạnh, chỉ có một lá noãn và một hạt Khi hạt chín, lá noãn phát triển thành áo hạt nhiều thịt, bao phủ một phần của hạt Áo hạt khi chín có màu sáng, mềm, nhiều nước và ngọt, chúng bị một số loài chim ăn và nhờ đó mà hạt được phát tán khi chim đánh rơi chúng [3]

Hình 1.1 Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

*Nguồn: Tác giả chụp tại Đà Lạt, Lâm Đồng, tháng 5/2008

Tại Việt Nam, thông đỏ phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến

1.700 m (hình 1.1) Khu phân bố là các hẻm núi, cạnh khe suối, nơi cây lá

rộng thường chiếm ưu thế, rất ít cây lá kim Đây là dược liệu có trong sách

đỏ Hiện nay, do nạn phá rừng bừa bãi nên quần thể thông đỏ tự nhiên hiện chỉ còn đếm được ở con số hàng trăm cá thể Mặt khác, vì đặc tính tái sinh hẹp và thế hệ trung gian hầu như không có nên nguy cơ diệt vong của loài cây thông đỏ rất cao Hiện nay, tại Đà Lạt đã có nhiều dự án nghiên cứu nhân giống thành công bằng công nghệ nuôi cây mô và giâm cành Kết quả đã phát triển được hàng chục hecta thông đỏ để thu hái lá dùng trong chiết xuất 10-DAB và các dẫn chất khác để bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6] Tuy

Photo by: Vu Binh Duong

nhiên, thông đỏ vẫn là những cây đã được đưa vào sách đỏ thế giới và sách đỏ Việt Nam để lưu ý bảo vệ [3]

Các hợp chất diterpenoid khung taxan (hình 1.2) là thành phần tiêu biểu

quan trọng nhất tạo nên hoạt tính của cây thông đỏ

19

20 18

17 16 15 14 13

12

11 10 9

8 7 6 5 4 3 2 1

12 11

10 9 8 7 6 5 4 3

2 1

12 11 10 9

8 7 6 5 4

3 2 1

Hình 1.2 Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ

* Nguồn: Li C và cs (2008) [82]

Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được trên 50 chất diterpenoid

khung taxan trong loài Taxus wallichiana Zucc [6] Trong đó nhiều chất quen

thuộc có trong các loài khác thuộc chi Taxus như: paclitaxel (5), baccatin III

(1), 10-deacetyl baccatin III (3) Khung taxan diterpenoid là một khung gồm 20

carbon, trong đó có 4 loại khung khác nhau gồm: khung 6-8-6, khung 5-7-6, khung 6-10-6 và khung 6-12 Trong đó, các chất phân lập được đa số thuộc khung 6-8-6 và 5-7-6

Trong 4 bộ khung taxan thì các chất thuộc khung taxan 6-8-6 rất đáng chú ý với nhiều các hoạt chất quan trọng như baccatin III, 10-DAB,

R2

R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 TLTK

19-Hydroxybaccatin III (2) OH OH OAc OH OH [95] 10-Deacetylbaccatin III (3) OH H OH OH OH [145] Các hợp chất baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 19-hydroxybaccatin III có nhiều trong lá thông đỏ Đặc biệt, trong đó 10-deacetyl baccatin III có hàm lượng khoảng 0,01 - 0,15% là nguồn nguyên liệu quý dùng để bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]

R2

HO

R4

O Ph

O

O HO

Paclitaxel (taxol) (5) OH OAc OBz OBz [136] 10-deacetyltaxol-7-xylosid (6) O-Xyl OH OBz OBz [82]

7-Xylosyl-10-Deacetyltaxol C (8) O-Xyl OH C5H11 OBz [122]

10-deacetylcephalomannin (10) OH OH OBu(i) OBz [95]

Trong các hoạt chất tìm thấy tác dụng thì nhóm các chất thuộc bộ

khung 6-8-6 chiếm đa số, điển hình là paclitaxel (5) Paclitaxel được tìm ra

lần đầu tiên vào năm 1971 bởi Wani và cs [136] trong loài thông đỏ Thái

Bình Dương (T brevifolia), sau đó được phân lập ở tất cả các loài thông đỏ khác, trong đó hàm lượng paclitaxel trong loài T.wallichiana khoảng 0,0045 –

0,015% [3]

1.1.3.2 Các chất khác

* Các terpenoid khác

Ngoài các taxan diterpenoid, trong thông đỏ còn có các terpenoid khác

như: rhodoxathin (11), vomifoliol (12), dehydrovomifoliol (13) và

OH

OH O

15

OH OH O

OH

OH OH

16

O

OH

OH O

17

OH OH OH

OH

* Các biflavonoid

Các hợp chất flavonoid được tìm thấy ở đây chủ yếu trong thông đỏ là

các flavonoid dimeric kiểu amentoflavone như: Ginkgetin (18), sciadopitysin (19)… [39], [115], [117]

19

* Các steroid

Các hợp chất steroid quen thuộc cũng được phát hiện trong loài T

wallichiana như: β-sitosterol (20), stigmasterol (21)… mà hoạt tính của các

chất này đã được biết đến[20], [115], [142], [145]

1.1.4 Tác dụng sinh học

Cao lá thông đỏ, cho chuột cống trắng cái uống liều 100 và 500 mg/kg, trong những ngày 1-7 sau khi giao hợp, có tác dụng ức chế sự thụ thai đến 60% và 80% tương ứng [3]

Vỏ cây, lá và hạt thông đỏ có độc tính cao

Alcaloid taxin từ thông đỏ gây các triệu chứng độc: nôn, tiêu chảy, mê sảng, có tác dụng ức chế tim làm giảm lực co cơ tim, giảm nhịp tim và phong

bế nhĩ thất do tác dụng ức chế kênh natri và calci [3]

Phân đoạn flavonoid từ lá thông đỏ gồm 3 biflavonoid (sciadopitysin, gingetin và sequoiaflavon) có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương và giảm đau mà không gây ngủ

Đặc biệt paclitaxel phân lập từ cây thông đỏ có tác dụng diệt tế bào ung thư mạnh với các loại ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư dạ dày, ruột

1.1.5 Các thuốc điều trị ung thư nguồn gốc từ thông đỏ

1.5.1.1 Paclitaxel

Paclitaxel được phân lập lần đầu tiên vào năm 1971 bởi Wani và cs

[136] từ loài thông đỏ Thái Bình Dương (T brevifolia), sau đó chúng được

xác định cấu trúc hóa học và được đưa vào sử dụng đầu tiên trong điều trị ung thư vào năm 1992 dưới tên biệt dược là Taxol

* Cơ chế tác dụng chống ung thư của paclitaxel

Paclitaxel ức chế sự phân rã mạng lưới vi thể của thoi nhiễm sắc; nó kích thích quá trình ghép các dimer của vi ống thành mạng lưới vi thể và ổn định mạng lưới vi thể bằng cách ngăn chặn quá trình tháo xoắn của chúng Tính ổn định này ức chế sự tái tổ chức năng lượng bình thường của mạng lưới

vi thể, một hiện tượng chủ yếu của chức năng sống của tế bào trong kỳ trung gian của quá trình phân bào, làm cho tế bào không phân chia và nhân lên được Ngoài ra, paclitaxel còn gây ra sự hình thành không bình thường các bó của mạng lưới vi thể trong suốt chu kỳ của tế bào và tổ chức quá trình phân chia thể sao của mạng lưới vi thể trong quá trình nhân đôi [79], [139]

* Chỉ định [2]

- Điều trị ung thư buồng trứng tiến triển (> 1 cm) sau phẫu thuật Ngoài

ra còn dùng trong điều trị ung thư buồng trứng đã di căn

- Điều trị ung thư vú giai đoạn sớm, ung thư vú đã di căn

- Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ ở giai đoạn không thể phẫu thuật hoặc xạ trị Ngoài ra, paclitaxel còn dùng để điều trị ung thư Kaposi có liên quan đến bệnh AIDS

Cơ chế tác dụng của docetaxel tương tự như paclitaxel nhưng cường độ tác dụng tốt hơn, thuốc ức chế sự phân rã mạng lưới vi ống của thoi nhiễm sắc, đồng thời kích thích sự bó chặt các tubulin thành sợi vi ống bền vững, do

đó ức chế sự gián phân tế bào In-vitro, docetaxel không ức chế sự tổng hợp DNA, RNA hoặc protein của tế bào [2]

Docetaxel được chỉ định trong điều trị ung thư vú, ung thư phổi không

tế bào nhỏ, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư dạ dày, ung thư đầu và cổ tử cung

1.2 CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT

1.2.1 Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai

1.2.1.1 Một số khái niệm cơ bản

Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuôi cấy và tạo khối lượng lớn tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện nuôi cấy vô khuẩn

mà không cần thâm canh gieo trồng Các tế bào khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên được các đặc tính vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất hay các chất chuyển hóa thứ cấp sinh ra từ các tế bào gần như được giữ nguyên [9], [73], [111]

Nguyên tắc của công nghệ sinh khối dựa trên cơ sở tính toàn năng (totipotent) và tính biệt hóa của một số tế bào thực vật Khi được đưa vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp, các tế bào thực vật có thể phát triển thành một cơ quan, một cây hoàn chỉnh hoặc một khối lượng lớn dòng tế bào đó Dựa trên cơ sở đó, công nghệ nuôi cấy mô thực vật có thể tạo ra cây

từ đỉnh sinh trưởng được tách ra Sau đó, cây được nhân nhanh tạo ra nhiều mầm cây con, từ đó có thể kích thích tạo rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh Người ta nuôi cấy tạo mô sẹo (callus) từ một mô bất kì của cây Sau

đó, biệt hóa thành mô sinh trưởng, tạo mầm, tạo rễ và cuối cùng cũng phát triển thành một cây mới hoàn chỉnh [57], [112]

Khác với nuôi cấy mô, công nghệ sinh khối tế bào thực vật không nuôi cấy tạo ra cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi các tế bào để tạo ra sinh khối và có thể

sử dụng cho chiết tách các hoạt chất sinh học Quá trình này cũng bắt đầu từ

việc tạo ra callus từ những mô khác nhau của thực vật Sau đó, chúng được làm mất tính biệt hóa và được thuần hóa trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống bình nuôi cấy (bioreactor) Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, đặc tính của tế bào được giữ nguyên như ban đầu Các quá trình sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với

tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên, trong đó có việc tổng hợp và tích lũy hoạt chất [53], [59]

1.2.1.2 Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Công nghệ sinh khối tế bào thực vật không chịu tác động của các yếu tố

tự nhiên như địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai do toàn bộ quy trình tạo sinh khối được tiến hành trong phòng thí nghiệm hoặc nhà máy Điều này giúp khắc phục được ảnh hưởng bất lợi của điều kiện tự nhiên tới năng suất, chất lượng sản phẩm và loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi gieo

trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất [9], [19]

Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh khối tế bào rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến hành tạo callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình) đến việc nuôi cấy trong môi trường lỏng phải mất khá nhiều thời gian Tuy nhiên, sau khi đã lựa chọn được điều kiện, môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất một mẻ sinh khối thường khoảng từ 15 - 50 ngày Như vậy, thời gian đã rút ngắn rất nhiều

so với trồng cây ngoài tự nhiên nên chủ động được nguồn nguyên liệu phục

vụ sản xuất [9] Theo Guilk và cs (2006) trong nghiên cứu xây dựng quy trình

tạo sinh khối dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) sản xuất alcaloid

nhân indole, thời gian cho 1 mẻ nuôi cấy sản phẩm là 20 ngày [56] Trong khi

sản xuất sinh khối thông đỏ Châu Âu (Taxus baccata) cần thời gian thích hợp

cho 1 chu kỳ nuôi cấy trong môi trường lỏng là 28 ngày [107]

Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo công nghệ sinh khối tế bào thực vật rất ổn định Vì các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, thành phần môi trường, cường độ ánh sáng đều được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo cho tế

bào phát triển tốt, hàm lượng hoạt chất ổn định Do đó, sản phẩm thu được có chất lượng ổn định đáp ứng được yêu cầu sản xuất theo tiêu chuẩn GMP [7], [57], [59]

Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp để các hoạt chất có hàm lượng cao hơn so với nuôi trồng ngoài tự nhiên, nên kỹ thuật này phù hợp với các dược liệu có hàm lượng hoạt chất thấp hoặc các chất rất khó tổng hợp hóa học được như: taxol, vinblastin, vincristin, shikonin, reserpin Nghiên cứu về sinh khối tế bào thông đỏ cho thấy khi sử dụng các biện pháp kích thích làm tăng hoạt chất thì hàm lượng

hoạt chất cao hơn trong cây tự nhiên từ 10 - 15 lần [148] Khosroushahi [72]

khi nuôi cấy tế bào thông đỏ đã tối ưu điều kiện và môi trường nuôi cấy Kết quả hàm lượng paclitaxel đã cải thiện rất nhiều so với ban đầu

Đối với các dược liệu quí hiếm sản xuất theo công nghệ này thì giá thành sản xuất sẽ thấp hơn Vì trong thời gian ngắn có thể tạo ra một khối lượng lớn sản phẩm trong khi chi phí cho nuôi cấy thấp [111], [132]

1.2.1.3 Những khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào, đó là thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường và đặc điểm cấu tạo của hệ thống bình nuôi cấy) Chi phí đầu tư dây truyền sản xuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật khác với nuôi cấy nấm và vi khuẩn nên hệ thống các bình nuôi cấy (bioreactor) cần phải thiết kế riêng cho phù hợp với từng loại tế bào [109], [119] Hàm lượng các hoạt chất trong sinh khối tế bào còn thấp, đặc biệt là với các tế bào có nhiều nhóm hoạt chất cùng tồn tại thì việc kích thích tăng riêng rẽ hàm lượng từng nhóm chất rất khó khăn [9] Những khó khăn trên đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu khắc phục

1.2.2 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật

Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật thường được tiến hành theo năm

giai đoạn kế tiếp nhau [9] (hình 1.3)

* Giai đoạn 1: Tạo callus

Callus là dòng tế bào ban đầu, chưa biệt hóa được tạo ra trong phòng thí nghiệm, tương tự như những tế bào gốc tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương của cây Callus được hình thành từ các mô, các tế bào được tách ra từ cơ thể thực vật nhờ tác động của chất kích thích sinh trưởng Trong giai đoạn này, ngoài thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thì kỹ thuật vô khuẩn được xem là yếu tố quan trọng nhất [9]

* Giai đoạn 2: Duy trì nuôi cấy callus trong môi trường thạch mềm

Việc duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch mềm đảm bảo cho tế bào thích nghi hoàn toàn với điều kiện sống mới (tách ly hoàn toàn ra khỏi cơ thể mẹ) Đồng thời, nó làm cho tế bào có hình thái mềm, xốp, có đủ sức sống và đặc biệt làm mất khả năng biệt hoá thành các cơ quan bộ phận khác Điều này tạo thuận lợi cho cấy chuyển tế bào sang môi trường nuôi cấy lỏng

Hình 1.3 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật

a - Tạo callus; b - Duy trì nuôi cấy callus; c - Nuôi cấy trong môi trường lỏng; d - Khuếch đại qui mô nuôi cấy; e - Thu hoạch sinh khối

* Nguồn: Nguyễn Văn Long [7]

* Giai đoạn 3: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng

Đây là bước rất quan trọng, quyết định tốc độ phát triển cũng như hàm lượng hoạt chất của sinh khối Trong giai đoạn này, phải khảo sát đầy đủ các

yếu tố ảnh hưởng như: điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, nhằm mục đích cho sinh khối phát triển nhanh nhất, hàm lượng hoạt chất trong sinh khối cao nhất [7], [116]

* Giai đoạn 4: Nâng cấp quy mô nuôi cấy (scale-up)

Sau khi đã tìm được các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp, để tăng khối lượng sản phẩm, các tế bào phải được nuôi cấy trong hệ thống các bình nuôi cấy có thể tích khác nhau tùy theo quy mô Ở giai đoạn này, các yếu tố về điều kiện sản xuất như loại bình nuôi cấy, kiểu cánh khuấy, phân áp oxy hòa tan

là những yếu tố cần phải khảo sát Trong quy trình sản xuất taxol và shikonin, người ta đã sử dụng các bioreactor 10.000 và 75.000 lít [119], [125]

* Giai đoạn 5: Thu hoạch khối tế bào

Thu hoạch khối tế bào là bước cuối cùng trong quy trình nuôi cấy Thông thường, các hoạt chất được tích lũy chủ yếu trong tế bào nên phương pháp lọc lấy tế bào là cách phổ biến để thu sản phẩm Tuy nhiên, có một số trường hợp hoạt chất lại được giải phóng ra ngoài môi trường nên việc thu hồi các hoạt chất mất nhiều công sức và chi phí tốn kém [111] Các hoạt chất sau khi tách chiết sẽ được nghiên cứu tác dụng sinh học và bào chế sản phẩm

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt chất trong nuôi cấy tế bào thực vật

1.2.3.1 Môi trường nuôi cấy

* Loại môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường là một trong hai nhóm yếu tố quyết định thành công của quá trình tạo sinh khối Môi trường nuôi cấy phù hợp sẽ thúc đẩy tế bào phát triển Đồng thời, môi trường cũng ảnh hưởng tới các quá trình sinh

lý, sinh hóa của tế bào, làm tăng năng suất và hàm lượng hoạt chất Các nhà khoa học đã thiết lập được một số môi trường nuôi cấy cơ bản với những thành phần và tỷ lệ muối vô cơ khác nhau [47] Môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là Murashige - Skoog (MS) Bên

cạnh đó còn có nhiều loại môi trường khác như B5, Nitsch, White [46]

* Vai trò của một số yếu tố trong môi trường nuôi cấy

- Nguồn hydratcarbon

Hydratcarbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phát triển khi nuôi cấy trong điều kiện các tế bào đã bị tách li hoàn toàn ra khỏi cây Các đường thường được sử dụng là glucose, saccharose, maltose, fructose ,

có thể sử dụng riêng lẻ hay kết hợp trong quá trình nuôi cấy [130]

Nồng độ và loại đường không những ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào mà còn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Vì khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy làm tăng áp lực thẩm thấu và tác động vào tế bào thì nó kích thích làm tăng tổng hợp các phytoalexin

[11], [102] Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào Coleus blumei Benth cho thấy

khi dùng saccharose 7,5% trong môi trường nuôi cấy, thì hàm lượng hoạt chất

là 3,3 g/l, nếu dùng saccharose 2,5% thì hàm lượng hoạt chất chỉ đạt 0,8% [94]

Vì vậy, trong thực nghiệm, phải tối ưu hóa loại và nồng độ đường nhằm đảm bảo cho tế bào phát triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất

- Hormon thực vật

Hormon thực vật hoặc các chất kích thích sinh trưởng rất cần thiết đối với các tế bào chưa biệt hoá để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dòng tế bào Hormon thực vật thường dùng trong sinh khối gồm 2 nhóm chính:

+ Nhóm khung auxin: gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), naphtalenacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric acid (IBA) thường xuyên được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1 – 50

1-µM dùng làm chất kích thích tăng trưởng trong nuôi cấy tế bào Đặc biệt, trong sinh khối tế bào, NAA và 2,4-D là những chất không thể thiếu nhất là ở giai đoạn nuôi cấy tạo callus [11], [44], [64]

+ Nhóm cytokinin: gồm kinetin và benzyladenin có vai trò làm tăng sinh tổng hợp nguyên liệu di truyền, kích thích quá trình sinh trưởng làm cho

tế bào phát triển nhanh hơn Các chất này thường được sử dụng kết hợp với nhóm auxin như 2,4-D, NAA Mỗi loại tế bào thực vật khác nhau yêu cầu

nồng độ hormon thực vật khác nhau cho sự phát triển của tế bào cũng như tạo các sản phẩm thứ cấp của nó Việc lựa chọn các chất kích thích sinh trưởng thích hợp nhất đối với mỗi loại thực vật là một khâu trong quá trình nghiên cứu tạo sinh khối [44], [119]

Ngoài 2 nhóm trên, các chất khác: acid gilberilic và các ethylen cũng

có thể được sử dụng để kích thích tăng tổng hợp hoạt chất [67]

- Các biện pháp kích thích làm tăng hàm lượng hoạt chất

Các kỹ thuật phổ biến để tăng tích lũy hoạt chất là: dùng các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) hoặc các tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp hoạt chất, kỹ thuật nuôi cấy 2 pha, nghiệm pháp gen kích hoạt, bất động tế bào, nuôi cấy 2 giai đoạn Trong đó, các elicitor chất làm tăng hàm lượng hoạt chất thường được sử dụng Elicitor là các chất có bản chất hoá học khác nhau từ nhiều nguồn gốc, có tác dụng kích thích tạo các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp để chống đỡ lại các mầm bệnh khi xâm nhập vào tế bào thực vật, trong đó có việc kích thích làm tăng sinh tổng hợp các hoạt chất Bình thường, hệ thống tự bảo vệ trong tế bào được khởi động khi có tác nhân

có hại tác động vào tế bào [22], [65]

Những chất có khả năng kích thích khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi

là các elicitor Elicitor liên kết với receptor trên màng tế bào Các tín hiệu của elicitor được truyền đi thông qua các chất truyền tín hiệu thứ cấp (kênh ion, GTP, phân tử oxy hoạt động, inositol 1,4,5 - trisphosphate, các enzym, các chất trung gian dẫn truyền ) dẫn đến kết quả cuối cùng kích thích sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp, nhằm bảo vệ tế bào, trong đó có các hoạt chất sinh học [65] Elicitor được chia làm 2 loại:

+ Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): gồm các chất (nội sinh hay ngoại sinh) có nguồn gốc từ các cơ thể sống: thực vật, vi sinh vật, nấm Elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) là những thành phần đã có hoạt tính kích thích tổng hợp hoạt chất Elicitor nội sinh (endogenous elicitor) là sản phẩm tương

tác của chính các yếu tố gây bệnh với tế bào thực vật sinh ra Đây là các chất

kích thích sinh tổng hợp hoạt chất thực sự [102]

+ Elicitor vô sinh (abiotic elicitor): là các chất các yếu tố không có nguồn gốc từ cơ thể sống gồm các chất hoá học tổng hợp (acid salicylic, acid benzoic, acid ferulic, acid jasmonic ), các yếu tố vật lý (ánh sáng, tia tử ngoại, nhiệt độ ), ion kim loại nặng và những tổn thương cơ học [102]

Khi tiến hành nghiên cứu sử dụng các elicitor, cần phải lựa chọn được loại và nồng độ elicitor cũng như thời gian tiếp xúc của từng loại elicitor thích hợp cho từng loại tế bào

- Các nguyên tố đa lượng

Bao gồm các loại muối của nitơ, phospho, kali, calci, magnesi và sulfua Đây là các nguyên tố chính cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao Nếu cây trồng tự nhiên cần các muối vô cơ để sinh trưởng và phát triển, thì để nuôi cấy thành công những tế bào chưa biệt hóa, đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ nguồn nitơ và các ion vô cơ như phospho, kali, calci, magne, mangan và sulfua Trong

đó, nguồn nitơ thường chiếm tỷ lệ cao [85] Nguồn nitơ được đưa vào dưới dạng các muối amoni hoặc nitrat như NH4NO3, NaNO3 hoặc kết hợp với các muối khác như NH4H2PO4 vàCa(NO3)2 Tuy nhiên, việc cân đối giữa tỷ lệ

NH4+ /NO3- rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng tới hàm lượng hoạt chất có trong sinh khối tế bào [11] Theo S Lui và cs [86] trong sinh khối tế bào sâm Hoa

Kỳ (Panax notoginseng Wall.) hàm lượng saponin tăng khi tỷ lệ NH4+/NO3

-giảm Nhưng nếu tăng lượng amoni quá cao có thể gây độc cho tế bào và hàm lượng saponin lại giảm

- Các phụ gia hữu cơ

Một lượng nhỏ các loại vitamin (myoinositol, thiamin, acid nicotinic, pyridoxine, riboflavin ) đóng vai trò là các coenzym tham gia các quá trình chuyển hóa của tế bào nên có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào Các acid amin (thường cho phép bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có thể dùng) và các phụ gia hữu cơ khác (dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa, một số dịch chiết từ thực vật ) cũng chứa các yếu tố tăng trưởng góp phần kích thích tế bào phát triển Vì vậy, chúng được thêm vào môi trường nuôi cấy, góp phần làm tế bào phát triển tốt hơn [65]

1.2.3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy

* Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn tới tốc độ phát triển của tế bào và sinh tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp Tốc độ phát triển của các tế bào sinh vật nói chung và tế bào thực vật trong công nghệ sinh khối nói riêng đều theo một đường cong phát triển Đường cong này gồm có 4 pha (hình 1.4) [18]

Hình 1.4 Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian

* Nguồn: theo Alan H.S (1992) [18]

- Pha tiềm tàng hay còn gọi là pha thích nghi (lag phase): tại pha này, các

tế bào thực vật gần như không phát triển, nó đang thích nghi với điều kiện và môi trường nuôi cấy mới

Pha thích ghi Pha phát triển Pha dừng Pha ly giải

Thời gian (ngày)

Khối

lượng

tế bào

(g)

- Pha phát triển (exponent phase): ở pha này các tế bào đã trải qua thời gian thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ theo hàm lũy thừa, khối tế bào phát triển nhanh tạo ra một lượng lớn Trong giai đoạn này nếu cung cấp đầy

đủ chất dinh dưỡng, tế bào có thể phát triển tối đa

- Pha dừng (stationary phase): các tế bào gần như không phát triển và nhân lên nữa Lượng tế bào trong môi trường tiến dần tới hằng định Trong pha này, các tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp Pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao Vì vậy, cần phải cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để duy trì sự tồn tại của tế bào, nhằm kéo dài thời gian sinh tích lũy các sản phẩm thứ cấp [119], [125]

- Pha ly giải hay pha suy tàn (death phase, lysis phase): trong pha này các

tế bào thực vật bắt đầu chết dần, lượng tế bào giảm Biểu hiện bên ngoài là thay đổi màu sắc tế bào và môi trường nuôi cấy, pH môi trường thay đổi Như vậy, cần phải xác định điểm kết thúc của quá trình nuôi cấy, đó là thời điểm trước khi chuyển sang pha ly giải Khi đó sẽ thu được khối lượng tế bào lớn nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất và không bị lãng phí môi trường [9]

* Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển khối tế bào thực vật và sự hình thành các chất chuyển hoá thứ cấp Mỗi loại tế bào thực vật có một khoảng nhiệt độ thích nghi nhất định Nhiệt độ quá thấp sẽ làm tế bào ngừng phát triển hoặc chết đi, nhiệt độ quá cao sẽ gây chết tế bào Trong khoảng nhiệt độ tồn tại của tế bào thực vật, thường có một nhiệt độ tối ưu Tại nhiệt độ này, sự phát triển của khối tế bào đạt tốc độ tối đa Tuy nhiên, khác với vi khuẩn và vi nấm, tế bào thực vật thường thích nghi ở khoảng nhiệt độ thấp từ 20 - 280C [7], [69]

* pH môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của tế bào và sinh tổng hợp của hoạt chất sinh học vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Tuy nhiên, mô thực vật

có khả năng thích nghi lớn với sự thay đổi của pH Trong môi trường nuôi

cấy, pH có thể được điều chỉnh bằng chính các tế bào thực vật để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy pH có ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào và sự tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp [32], [55]

* Nồng độ oxy hoà tan

Nhìn chung, sự phát triển của tất cả các tế bào hiếu khí đều cần sự có mặt của oxy Oxy cần thiết cho quá trình hô hấp của tế bào, phân cắt các phân tử hữu cơ tạo năng lượng cho các quá trình phát triển của cơ thể sinh vật Tốc độ phát triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy Trong thực tế, các

tế bào thực vật phát triển tương đối chậm, chính vì vậy nồng độ oxy cung cấp cho tế bào không cần cao [37], [119]

1.3 SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ SẢN XUẤT PACLITAXEL 1.3.1 Nhu cầu nguồn nguyên liệu paclitaxel trong điều trị ung thư

Paclitaxel là một trong những loại thuốc chống ung thư thành công nhất được phát triển trong 50 năm qua Bình quân mỗi năm doanh số bán hàng trên toàn thế giới của paclitaxel trên 1,5 tỷ USD - số liệu năm 1999 của Bristol Myers Squibb (công ty độc quyền nhãn hiệu Taxol) Tuy nhiên nếu như paclitaxel chỉ được chiết xuất từ các loài thông đỏ thì không thể đáp ứng được nhu cầu điều trị ung thư cho nhân loại bởi: thông đỏ là loại cây có tốc độ sinh trưởng chậm, mỗi năm bình quân cây phát triển thêm từ 2-3 cm đường kính, không những thế hàm lượng hoạt chất trong cây rất thấp (0,001-0,05%) Để được 1 kg hoạt chất cần 10.000 kg vỏ cây hoặc 3000 cây thông đỏ [125] và điều trị một bệnh nhân ung thư khỏi bệnh cần chặt hạ khoảng tám cây thông

đỏ 60 tuổi Ngoài ra, chiết xuất paclitaxel cũng đòi hỏi một hệ thống thiết bị

phức tạp và kỹ thuật tinh chế đặc hiệu sử dụng công nghệ tiên tiến và đắt tiền Trong khi việc tổng hợp toàn phần paclitaxel và các chất dẫn chất chỉ mang giá trị khoa học mà không có giá trị ứng dụng thực tiễn do các hợp chất này

có cấu trúc hoá học phức tạp gồm nhiều loại đồng phân như hình học, quang học [61] Cho tới nay mới chỉ nghiên cứu việc bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel từ các chất trung gian như baccatin III hoặc 10-deacetylbaccatin III

chiết xuất trong lá của các loài Taxus Với những khó khăn trên, việc tạo ra

được nguồn paclitaxel và các dẫn chất tương tự thay thế có tính ổn định, bền vững và thân thiện với môi trường là rất cần thiết Công nghệ sinh khối tế bào thực vật là phương pháp có nhiều lợi thế bởi: công nghệ không phải chịu ảnh hưởng của thời tiết, mùa hoặc lây nhiễm, thời gian tạo nguồn ngắn, hàm lượng hoạt chất có thể được cải thiện so với nuôi trồng tự nhiên [130] Đây là công nghệ đang được ứng dụng phổ biến trong sản xuất paclitaxel và các dẫn

chất từ tế bào các loài thông đỏ (Taxus sp.)

1.3.2 Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật

Hiện nay công nghệ sinh khối tế bào thực vật đã áp dụng trong nghiên cứu và sản xuất paclitaxel từ các loài thông đỏ Trong nhiều thập kỉ qua, các nghiên cứu về sinh tổng hợp paclitaxel và các dẫn chất bằng việc nuôi cấy tế

bào các loài thông đỏ đã được tiến hành như T brevifolia, T baccata, T cuspidata, T chinensis, T canadensis, T yunnanensis, T x media Trong đó

điển hình là các nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp hoạt chất cũng như các biện pháp nhằm cải thiện hàm lượng paclitaxel trong sinh khối như: tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, sàng lọc các dòng tế bào có khả năng sinh hoạt chất cao, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, các biện pháp kích thích tăng sinh tổng hợp hoạt chất như sử dụng các chất kích thích sinh hoạt chất và các tiền chất, cũng như kỹ thuật nuôi hai pha, nuôi cấy hai giai đoạn và kỹ thuật bất động tế bào [119], [125]

1.3.2.1 Con đường sinh tổng hợp paclitaxel

Paclitaxel được hình thành chủ yếu từ nguyên liệu ban đầu là các phân

tử geranylgeranyl diphosphat (GGPP) gồm nhiều giai đoạn [125] (hình 1.5)

Việc nghiên cứu tìm ra con đường sinh tổng hợp paclitaxel trong thông

đỏ, góp phần cung cấp các hiểu biết về phản ứng cũng như các enzyme tham gia phản ứng Từ đó giúp các nhà khoa học nghiên cứu các biện pháp kích

hoạt làm tăng sinh tổng hợp paclitaxel như: sử dụng tiền chất phenylalanine,

sử dụng elicitor, các chất kích hoạt enzym [41], [125]

Hình 1.5 Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel

* Nguồn: Sonia M (2011) [125]

1.3.2.2 Lựa chọn các dòng tế bào có khả năng sinh hoạt chất cao

Dòng tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp Đặc biệt, khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, các tế bào có sự thay đổi đáng kể về hàm lượng hoạt chất khi nuôi cấy các dòng tế bào khác nhau Điều này là do có sự khác biệt

về gen dẫn đến sự khác biệt trong hoạt động sinh tổng hợp hoạt chất Vì vậy, trong quá trình nghiên cứu phải tạo ra được những dòng tế bào phát triển nhanh có khả năng tạo hoạt chất với hàm lượng cao Bunakova và cs [30] khi

nghiên cứu nuôi cấy 9 dòng dòng tế bào T baccata khác nhau thì chỉ có một

dòng cho thấy sự cải thiện sản lượng (23,2 µg/g khối lượng khô) Trong một nghiên cứu khác của cùng một nhóm, dòng tế bào được Brunakova lựa chọn

và nhân bản vô tính sau 20 tháng kích hoạt tạo callus, hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt tới 0,0109% [31]

1.3.2.3 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường nuôi cấy là yếu tố tác động và ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Trong nuôi cấy các loại thông đỏ, 2 môi trường thường được sử dụng là SH và B5 Tuy nhiên, các thành phần thường được thay đổi để tốc độ phát triển của tế bào tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất Các thành phần này thường là:

* Nguồn hydratcarbon

Hydratcarbon không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào, mà còn ảnh hưởng đến các con đường sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Bởi hydratcarbon trong môi trường tạo ra áp suất thẩm thấu Khi áp suất thẩm thấu tăng, tác động vào tế bào, sẽ làm tăng tổng hợp các phytoalexin, những chất này sẽ kích thích sản xuất các sản phẩm thứ cấp [72], [97], [60]

* Các hormon thực vật

Hormon thực vật hoặc chất kích thích sinh trưởng là chất rất cần thiết đối với sự phát triển cũng như biệt hóa của các dòng tế bào, đặc biệt là khi tế

bào đã tách ra khỏi cơ thể ban đầu Trong nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ, thường sử dụng 2 nhóm chất kích thích sinh trưởng chính là auxin (NAA; 2,4-D; 2,4,5-T, picloram) và cytokinin (kinetin, BAP) Thông thường, 2 nhóm chất này được sử dụng kết hợp với nhau Các hormon thực vật được sử dụng với nồng độ cao ở giai đoạn pha phát triển với mục đích tăng sinh tế bào Tuy nhiên, khi chuyển sang môi trường nuôi cấy để sản xuất hoạt chất, thì hàm lượng các hormon thực vật sử dụng với nồng độ thấp hơn [27], [72]

* Các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor)

Chất kích thích tăng hoạt chất đã được sử dụng như một chất quan trọng trong việc tăng hàm lượng paclitaxel và các dẫn chất trong nuôi cấy tế bào của các loài thông đỏ Một số loại elicitor đã được sử dụng như: dịch chiết tế bào của

các loài vi khuẩn (Penicillium minioluteum, Botrytis cinerea, Verticillium dahlliae, Gilocladium delicquecesens); chitosan glutamate; lichenan; các

polysaccharid phức hợp từ thành tế bào vi khuẩn, các acid ferulic, arachidonic và benzoic; các elicitor vô sinh như: La+3, V+2, Co+2, Ag+ [119] Trong đó, acid jasmonic và dẫn chất (methyl jasmonat, ethyl jasmonat) đã được chứng minh là một chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình dẫn truyền các tín hiệu điều chỉnh gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp hoạt chất [102] Vì vậy, các chất này đã được sử dụng rất phổ biến và hiệu quả trong việc tăng sinh hoạt chất Y Yukimune và cs [144] thêm 100 µM MJ vào ngày thứ 14 của chu kỳ nuôi cấy tế

bào T baccata Kết quả, hàm lượng paclitaxel tăng từ 0,4 mg/l lên 48,3 mg/l và

baccatin III tăng từ 0,4 mg/l lên 53,6 mg/l so với nhóm chứng Nghiên cứu của

Wang [135] ở loài T chinensis cho thấy, khi thêm 100 µM MJ vào ngày thứ 7,

thì sau 14 ngày nuôi cấy, tất cả các hoạt chất đều tăng hơn so với nhóm không dùng MJ (paclitaxel tăng từ 412 µg/g lên 3,153 µg/g, bacatin III từ 7 µg/g lên 69 µg/g, 10-deacetyl baccatin III từ 203 µg/g lên 456 µg/g)

* Tiền chất (precursor)

Một chiến lược trong việc tăng sinh hoạt chất là sử dụng các tiền chất trong quá trình nuôi cấy, giúp làm giảm thời gian sinh tổng hợp các hoạt chất