Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh khối sợi nấm vân chi (trametes versicolor (l ) pilat) trên môi trường dịch thể và bước đầu đánh giá chất lượng sợi nấm

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG LÊ THỊ TÂM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH KHỐI SỢI NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR L.. Ảnh hưởng củ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

(TRAMETES VERSICOLOR (L.) PILAT) TRÊN

MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH

GIÁ CHẤT LƯỢNG SỢI NẤM

Đà Nẵng - năm 2017

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

LÊ THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH KHỐI SỢI NẤM VÂN CHI

(TRAMETES VERSICOLOR (L.) PILAT) TRÊN

MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH

GIÁ CHẤT LƯỢNG SỢI NẤM

Ngành : Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Bích Hằng

Đà Nẵng - năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Tâm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân tha ̀ nh cảm ơn ThS Nguyễn Thị Bích Hằng – giáo viên hướng dẫn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn đến các quý thầy cô giảng dạy tại khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã trang bị cho em một nền tảng kiến thức vững chắc để có thể vận dụng kiến thức trong quá trình thực hiện khóa luận

Em cũng xin cảm ơn chân thành đến gia đình cùng bạn bè đã động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho em có thể hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, tháng 05 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Tâm

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU 1

1.Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4

1.1 Giới thiệu chung về nấm vân chi và sợi nấm vân chi .4

1.1.1 Giới thiệu về nấm vân chi 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của nấm vân chi 4

1.1.3 Đặc tính sinh học của nấm vân chi 5

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm vân chi 6

1.2 Giá trị dược tính của nấm vân chi cũng như sợi nấm 7

1.2.1 Tính chất dược học 7

1.2.2 Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi 7

1.3 Các giá trị khác của vân chi 9

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm vân chi 10

1.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất trên thế giới 10

1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ở Việt Nam 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học sợi nấm vân chi trên môi trường đặc 13

2.2.2 Ngiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh khối sợi nấm vân

chi 13

2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học và định lượng một số hợp chất có trong sợi nấm vân chi 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Khảo sát tốc độ sinh trưởng sợi nấm vân chi trên môi trường đặc 13

2.3.2 Khảo sát sự tăng trọng của sợi tơ nấm vân chi trong các môi trường dinh dưỡng lỏng khác nhau 14

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 14

2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 14

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy 15

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thu sinh khối 15

3.3.7 Xác định sinh khối khô sợi nấm vân chi 15

2.4 Thực hiện kiểm tra sinh hóa để định tính các dược chất có trong tơ nấm vân chi 15

2.4.1 Phương pháp định tính alkaloid 15

2.4.2 Phương pháp định tính hợp chất saponin 16

2.4.3 Phương pháp định tính acid hữu cơ 17

2.4.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết sợi nấm vân chi bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn 17

2.4.5 Xác định khả năng kháng oxi hóa của nấm vân chi 18

2.5 Thực hiện kiểm tra sinh hóa để định lượng các dược chất có trong tơ nấm vân chi 18

2.5.1 Phương pháp định lượng polysaccharides 18

2.5.2 Xác định hàm lượng PSP thô có trong sợi nấm vân chi 19

2.5.3 Xác định hàm lượng PS ngoại bào có trong dịch môi trường nuôi cấy lắc nấm vân chi 19

2.5.4 Xác định hàm lượng khác trong sợi nấm vân chi 20

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Khảo sát tốc độ sinh trưởng sợi nấm vân chi trên môi trường đặc 21

3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự tăng trưởng sinh khối của sợi nấm vân chi 22

3.3 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của sợi nấm vân chi trong môi trường dịch thể 24

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của sợi nấm vân chi 25

3.5 Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến sự sinh trưởng của sợi nấm vân chi 26

3.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lắc đến sự sinh trưởng sợi nấm vân chi 27

3.7 Định tính một số dược chất có trong sợi nấm vân chi 30

a Định tính alkaloid 30

b Định tính saponin 30

c Định tính acid hữu cơ 32

3.8 Định lượng PSP, polysaccarides nội bào, polysaccharides ngoại bào trong sợi nấm vân chi 32

3.9 Khả năng kháng oxy hóa của sợi nấm vân chi 33

3.10 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết sợi nấm vân chi 34

3.11 Hàm lượng một số thành phần khác trong sợi nấm vân chi 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC 45

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Độ dài tơ nấm vân chi trên môi trường đĩa thạch PGA

3.2 Lượng sinh khối trên các môi trường dinh dưỡng khác

3.5 Lượng sinh khối sợi nấm vân chi theo thời gian nuôi cấy 28

3.6 Hàm lượng một số hợp chất trong sợi nấm vân chi 33

3.7 Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết sợi nấm vân chi 34

3.8 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết sợi nấm vân chi 34

3.9 Hàm lượng một số thành phần hóa học trong sợi nấm

DANH MỤC HÌNH ẢNH

3.1 Hình dạng sợi nấm phát triển trên môi trường đặc 21

3.2 Biều đồ lượng sinh khối nấm vân chi trong các môi

3.3 Biểu đồ lượng sinh khối sợi nấm vân chi thu nhận trên

môi trường PG cải tiến ở các điều kiện pH khác nhau 24 3.4 Hình ảnh sợi nấm vân chi trong điều kiện tĩnh và lắc 27

3.5 Biểu đồ lượng sinh khối sợi nấm vân chi nuôi cấy lắc

3.6 Hình dạng sợi nấm vân chi nuôi cấy lắc qua các

3.9 Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel 31

3.11 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết nấm vân chi 35

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay nhiều loài nấm được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một

số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị loãng xương Trên thế giới

có khoảng 2000 loại nấm có thể ăn và làm thuốc, ngoài nguồn nấm thu hái từ thiên nhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao [22], [26] Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng của con người trong tương lai [6]

Ở nước ta vài năm trở lại đây, nghề trồng nấm dược liệu được xem là hướng phát triển kinh tế tốt, vừa có thể cung cấp được cho thị trường nguồn dược liệu phong phú, vừa tận dụng được các phế phẩm trong nông nghiệp Từ việc sản xuất chỉ mang tính tiêu dùng tại chỗ, đến nay nấm dược liệu đã đi vào sản xuất ở quy mô lớn, mang lại hiệu quả kinh tế cao

Xã hội ngày càng phát triển, chất lượng môi trường sống ngày càng giảm, nguồn thực phẩm hằng ngày không đảm bảo an toàn, ảnh hưởng đến sức khỏe Chính vì thế con người cần cung cấp nguồn thực phẩm an toàn, sản phẩm chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học Nấm vân chi là loài nấm được sử dụng phổ biến trên thế giới như là một nguồn dược liệu giúp chống lại ung thư Các loại thuốc chống ung thư hiện có trên thị trường không nhằm mục tiêu cụ thể mà gây ra nhiều tác dụng phụ và biến chứng trong điều trị lâm sàng của các dạng ung thư khác nhau,

do đó phương pháp điều trị mới hiệu quả và ít độc hại là vô cùng cấp thiết Hiện nay, một số nấm được đánh giá cao và rất được quan tâm do có đặc tính chống ung thư và có các hợp chất hoạt động Trong nấm vân chi có chứa các hợp chất polysaccharid liên kết với protein, gồm hai loại chính: PSP (polysaccharide peptide)

và PSK (polysaccharide krestin) Hai hợp chất này được các nhà nghiên cứu Trung Quốc và Nhật Bản phát hiện và chứng minh có đặc tính dược học quý giá PSP và PSK có tác dụng với nhiều loại tế bào ung thư như các tế bào ung thư biểu mô

(carcinoma) và các tế bào ung thư máu (leukemia) Ngoài ra nấm vân chi còn có tác dụng với nhiều loại ung thư khác như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư gan, ung thư hệ bạch huyết [21] Hơn nữa, PSP còn giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư trước và sau điều trị thông qua trọng lượng cơ thể và chỉ số karnotsky tăng [38]

Nấm vân chi được sử dụng phổ biến khắp thế giới, đặc biệt là Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, các nước châu Âu Tại Nhật Bản các biệt dược bào chế từ nấm này đứng đầu trong 10 loại thuốc chống ung thư được tiêu thụ mạnh nhất [14] Tại nước ta, nhu cầu sử dụng nấm vân chi ngày càng cao và như là một thực phẩm chức năng không chỉ đối với các bệnh nhân ung thư mà còn đối với người khỏe mạnh Do các dược chất trong nấm vân chi không chỉ có tác dụng đối với các loại ung thư mà còn giúp giải nhiệt, tăng cường sức khỏe, tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể [34], [38], [40]

Hiện nay trên nước ta hầu hết đều sử dụng quy trình trồng nấm truyền thống trên môi trường rắn Theo phương pháp này không những rất tốn thời gian để thu hoạch, mà còn chỉ có thể trồng vào mùa đông do nấm vân chi có đặc tính là nấm lạnh Do đó, sản lượng thu được không thể đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng Việc nuôi cấy nấm vân chi trên môi trường lỏng có khả năng khắc phục hầu hết các nhược điểm khi trồng trên môi trường rắn, như rút ngắn thời gian sinh trưởng, chất lượng tốt, không phụ thuộc vào khí hậu thời tiết Và đặc biệt là quá trình chiết tách hợp chất sinh học trong nấm dễ dàng hơn, và rất thích hợp sản xuất theo quy mô công nghiệp [24] Nhằm khắc phục các hạn chế khi nuôi trồng trên môi trường rắn, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh khối sợi

nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) trên môi trường dịch thể và bước đầu đánh

giá chất lượng sợi nấm”

2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát sự tăng sinh khối nấm vân chi trên môi trường lỏng với điều kiện nuôi cấy khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu nhất nuôi cấy nấm vân chi trên môi trường dịch thể

Ly trích, định tính và định lượng hợp chất chính trong sợi nấm vân chi

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp một số dẫn liệu khoa học về các chỉ tiêu sinh trưởng tối ưu của nấm vân chi và hàm lượng các hợp chất chính của sợi nấm vân chi trong môi trường dịch thể

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Việc tìm ra điều kiện tối ưu nhất để nuôi cấy nấm vân chi trên môi trường dịch thể giúp cải thiện khả năng sinh trưởng của giống, rút ngắn thời gian nuôi cấy, tăng năng suất nấm thương phẩm, có khả năng ứng dụng trong sản xuất nấm ở quy

mô công nghiệp Đồng thời, giúp tạo ra một chế phẩm có giá trị dược tính cao, đáp ứng nhu cầu của con người

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu chung về nấm vân chi và sợi nấm vân chi

1.1.1 Giới thiệu về nấm vân chi

Vân chi có nhiều tên gọi rất khác nhau Tên tiếng Anh là Turkey tail (đuôi gà tây) Ở Trung Quốc, người ta gọi là “Yunzhi” có nghĩa là loại nấm có hình dạng như mây Người Nhật thì gọi là “Karawatake” do người ta hay tìm thấy chúng ở những

nơi gần bờ sông [1]

Vân chi có tên khoa học phổ biến hiện nay là Trametes versicolor sau một thời gian dài được nghiên cứu và đặt tên khác nhau Trametes versicolor (L.:Fr) Pilát, tức là loài Coriolus versicolori (L.:fr) Quesl, được chính Carl von Linnaeus

tìm ra và đặt tên đầu tiên: Boletus versicoler L

Vân chi là một loài nấm lớn thuộc phân lớp Basidiomycetes gồm 22000 loài

đã biết Nấm vân chi gây hoại sinh cây bệnh, cư trú trên gỗ đã chết, thuộc loại nấm gây mục trắng mạnh nhất, có thể phá hủy đồng thời tất cả các cấu tử gỗ (hemicellulose, cellulose, lignin), giúp phá vỡ các gốc cây già, cây chết, vì thế chất dinh dưỡng của cây sẽ trở về đất để tái sử dụng [1], [11]

Vị trí phân loại nấm vân chi [5], [13], [18]:

Loài : Tramestes versicolor

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của nấm vân chi

Vân chi là loại nấm hàng năm, trưởng thành dạng quả giá, chất da, hóa gỗ,

không cuống Mặt trên tán phủ lông dày, mịn, rất dễ biến đổi về mặt màu sắc Đảm quả khi non dạng u lồi tròn, sau phân hóa thành dạng bán cầu, khi già đảm quả có dạng thận, dạng quạt, thót dần lại ở phần gốc hay cũng có khi trải sát giá thể hay trải cuộn lại thành dạng vành với mép tán màu trắng – trắng kem [14] Nấm thường mọc thành tán dạng ngói lợp Mặt tán dễ thay đổi về màu sắc, đặc trưng bởi những vòng đồng tâm với màu sắc khác nhau, màu sắc từ trắng đến vàng nhạt, nâu nhạt, nâu rỉ

có sắc thái xanh đến đen

Kích thước thay đổi với đường kính tán trung bình cỡ 2 – 7 cm, dày cỡ 2,5 –

4 mm Thịt nấm mỏng, màu kem – hơi vàng, dày 0,6 – 2,5 mm, trên lát cắt hiển vi thấy rõ lớp sắc tố đen xanh đặc trưng bên dưới lớp lông [19]

1.1.3 Đặc tính sinh học của nấm vân chi

Chu trình sống của nấm vân chi:

Đảm bào tử nảy mầm cho sợi sơ cấp Hai sợi sơ cấp khác phối hợp cho sợi thứ cấp Sợi thứ cấp phát triển thành mạng sợi Trong điều kiện thuận lợi mạng sợi

sẽ kết hạch tạo tiền quả thể (nụ nấm) Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm trưởng thành, các phiến dưới mũ mang các đảm và sinh ra bào tử Đảm bào tử được phóng thích và chu trình lại tiếp tục [3], [12]

Giai đoạn phát triển của sợi nấm: Chu trình sống của nấm bắt đầu từ bào tử đảm nảy mầm cho sợi nấm, sợi nấm lúc đầu nhỏ có đường kính khoảng 1,5–1,0

mm, về sau lớn dần lên đến kích thước đường kính 1,0 – 2,0 mm Sau quá trình tiếp hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp đơn nhân sẽ hình thành nên các sợi nấm thứ cấp song nhân Các sợi nấm tăng trưởng theo kiểu tạo ra các móc (clamp) và để lại dấu vết giữa các tế bào Khi gặp điều kiện bất lợi các sợi nấm song nhân có thể tạo ra các bào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúp sợi nấm sống sót qua các trường hợp bất lợi Bào tử màng dày, khi điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm tạo ra những sợi nấm mới Khi sợi nấm thứ cấp đã phát triển dày đặc trên cơ chất sẽ bắt đầu quá trình phân hóa để tạo ra quả thể Trước khi ra quả thể thì sợi nấm phát triển sinh khối đến mức tối đa chuẩn bị cho quá trình ra quả thể Nhưng điều đặc biệt là trong sợi nấm

có đầy đủ về lượng cũng như về chất giống như quả thể, nó có thể phòng và chữa bệnh cho người, được sử dụng như một món ăn hay một chế phẩm sinh học [21]

Trong giai đoạn phát triển sợi, nấm cần các nguồn dinh dưỡng môi trường đảm bảo các nguồn cung cấp về C, N và khoáng [2]

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm vân chi

Trong quá trình sinh trưởng phát triển của nấm vân chi chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, độ pH, nồng độ

CO2; các chất dinh dưỡng cần thiết; vai trò điều khiển của các hoocmon, sự hiện diện

và hoạt động đóng mở của các gen thông qua hệ thông tin chuyển hóa cũng như các chất trao đổi trong quá trình trao đổi chất ở nấm [6], [15]

*Dinh dưỡng

Trong tự nhiên nấm sinh trưởng trên các loại phế thải có nguồn gốc thực vật, nấm có khả năng phân huỷ các chất hữu cơ Đa số nấm ăn là sinh vi sinh vật dị dưỡng nên nấm cần được cung cấp carbon và nitơ

- Carbon: khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào nấm được tạo thành từ

carbon Nấm cần một lượng lớn carbon nhiều hơn bất cứ nguyên tố nào khác Nguồn carbon thường là muối carbonat, muối của acid hữu cơ (Trịnh Tam Kiệt, 2012)

- Đạm: nitrogen là yêu cầu cơ bản trong môi trường sợi nấm sinh trưởng, nó

cần thiết cho sự tổng hợp các axit amin, tổng hợp protein là những nguyên liệu cần thiết đòi hỏi cho việc tạo thành tế bào chất Không có protein, sự sinh trưởng không diễn ra [6]

Nguồn nitrogen thường là peptone, nước luộc ngũ cốc, bột đậu tương, cao nấm men, (NH4)2SO4, asparagine, alanine, glycin Cao nấm men là nguồn nitơ tốt nhất để kích thích tăng trưởng sợi nấm [30]

hình dạng quả thể, đặc biệt ánh sáng làm thay đổi màu sắc rõ rệt của quả thể nấm vân chi Ánh sáng còn cần thiết cho sự phát triển mũ của nấm, khi chuyển chúng vào bóng tối thì kích thích sự hình thành cuống nấm mà không kích thích sự hình thành mũ nấm (Trịnh Tam Kiệt, 2012)

*Không khí

Nấm là sinh vật hiếu khí, sử dụng oxi, nhả khí cacbonic Thành phần của không khí, đặc biệt là nồng độ khí cacbonic có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của nấm [15]

1.2 Giá trị dược tính của nấm vân chi cũng như sợi nấm

1.2.1 Tính chất dược học

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm vân chi đen có tính hàn, có vị ngọt,

có tác dụng tốt đối với gan và lá lách Ngoài ra nấm vân chi được sử dụng làm giảm trầm cảm, giảm đờm, chữa lành rối loạn phổi, tăng cường vóc dáng và năng lượng.Một số nghiên cứu khác cho thấy nấm vân chi giúp xua tan nhiệt, loại bỏ độc tố, tăng cường thể lực, tăng năng lượng và tinh thần, và nâng cao chức năng miễn dịch của con người [41]

Tại Trung Quốc có rất nhiều nghiên cứu chứng minh dịch chiết xuất nấm vân

chi có tác dụng ức chế 40 - 95% đối với sự tăng trưởng của tế bào ung thư, trong khi đó lại không thấy có tác dụng phụ nào đáng kể [8]

Ngoài tác dụng chống ung thư, nấm vân chi còn có hiệu quả đối với các bệnh nhân dương tính với HIV Bằng cách sử dụng sản phẩm từ nấm vân chi, giúp con người có biểu hiện tích cực như tăng cân, cảm thấy khỏe khoắn hơn, giải tỏa ức chế tâm lý Đặc biệt số lượng virus trong cơ thể họ đều giảm một cách đáng kinh ngạc (từ vài chục nghìn xuống vài nghìn) và số lượng các tế bào trình diện kháng thể CD-4 đều tăng [45]

1.2.2 Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi

Vào khoảng năm 1965, ở Nhật, một kỹ sư hoá học đã khám phá ra thành phần trị ung thư của nấm vân chi sau khi ông quan sát thấy người hàng xóm mắc bệnh ung thư hiểm nghèo đã được chữa khỏi sau khi sử dụng vân chi Điều này đã

dẫn đến sự khám phá ra PSK (polysaccharide Kureha) Hợp chất PSP (polysaccharide peptide) - chất có cấu tạo gần giống PSK cũng đã được phân lập lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 1983

PSK và PSP được sản xuất từ các dòng CM-101 và Cov-1 của nấm vân chi

Cả hai sản phẩm thu được bằng quá trình lên men theo lô Các polyme PSP / PSK tan trong nước nhưng không hòa tan trong methanol, pyridin, chloroform, benzen,

và hexane Lên men PSK kéo dài đến 10 ngày, trong khi sản xuất PSP thu được sau

64 giờ PSK và PSP đều được chiết tách dễ dàng bằng dung môi là nước nóng, PSK thu được từ dịch chết nước nóng bằng cách tủa bằng muối amoni sunfat, trong khi PSP được thu hồi bởi cồn [24]

Polysaccharides được nghiên cứu để tách chiết tạo thương phẩm từ nhiều loài nấm Năm 2001, Reshernikov và Cộng sự đã liệt kê 650 loài chứa polysaccharides

có hoạt tính sinh học có thể tách chiết từ quả thể, sợi nấm lên men và dịch thể nuôi cấy [42]

Dịch trích polysaccharide peptide từ nấm (thuật ngữ gọi là proteoglycan) là những chuỗi polypeptide hay những phân tử protein nhỏ gắn kết chặt với các chuỗi polysaccharide β-D-glucan, là thành phần hiệu quả trong chữa trị các chứng ung thư: dạ dày, thực quản, ruột kết và ung thư vú… Polysaccharides được tìm thấy trong các vách tế bào không tiêu hoá được của vân chi có cấu trúc 3 chiều với các chuỗi bên (chuỗi đường mạch thẳng) mọc nhánh xung quanh cấu trúc trục chính (lõi protein hay polypeptide), các chuỗi bên có chức năng sinh học hay hoạt tính miễn dịch cho phép sự tương tác giữa các chuỗi nhánh bên với các thụ thể trên các tế bào miễn dịch khác nhau Thụ thể cho β-glucan được tìm thấy trên nhiều tế bào khác nhau: Tế bào tự sát thương (NK), tế bào bạch cầu trung tính, tế bào bạch cầu đơn nhân to, đại thực bào và tế bào lympho B, lympho T Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng β-1,3-glucan là chất kích hoạt hệ miễn dịch chống ung thư tự nhiên ở người và phần glucan có thể kích ứng sự co lại của khối u [3], [12] Theo các nhà khoa học thì chỉ có polysaccharide nối với peptide mới tạo ra hiệu quả kháng ung thư

*PSK

Ở Nhật Bản từ năm 1970, PSK từ nấm vân chi đã được chứng minh có khả

năng kéo dài thời gian sống thêm 5 năm hoặc hơn cho các bệnh nhân ung thư thuộc nhiều thể loại: ung thư dạ dày, ung thư đại tràng, ung thư vòm họng, ung thư thực quản, ung thư phổi và ung thư vú (P.M.Kidd, 2000)

PSK cũng có tính kháng sinh mạnh, hiệu quả trên Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Cryptococcus neoformans, Psedomonas aeruginosa, Candida albicans và một số loại vi trùng khác gây bệnh ở người

*PSP

PSP có một số tác dụng chính bao gồm: tăng cường miễn dịch bằng cách tạo

ra interleukin - 6, interferon, immunoglobulin - G, đại thực bào, và tế bào lympho T PSP còn có tác dụng chống lại tác dụng ức chế miễn dịch của hóa trị liệu, xạ trị và truyền máu gây ra bởi khối u PSP còn giúp ức chế sự phát triển của các loại ung thư khác nhau bằng cách sản xuất superoxide dismutase (SOD), peroxidase glutathione, và miễn dịch nói chung Theo các nghiên cứu khác, PSP còn giúp cải thiện sự ngon miệng và chức năng gan, làm dịu tâm hệ thần kinh, có thể điều trị rối loạn đường ruột và có lợi trong điều trị các bệnh nhiễm trùng cơ hội cơ bản có thể ngăn chặn đáp ứng miễn dịch Ngoài ra, PSP có thể có lợi cho sức khoẻ nói chung bằng cách kích thích các enzyme giải phóng các gốc tự do và giảm thiểu sự oxy hoá

PSP được phân lập từ sợi nấm có tác dụng khác như kháng u, hepatoprotective

và các hoạt động giảm đau [24]

Ngoài ra, PSP còn có tác dụng trị đái tháo đường tiềm năng như các chất ức chế α-glucosidase (Lin et al, 2008; Yang et al) [52]

Ngoài hai chất PSK và PSP đã tách chiết được một loại peptide khác từ dịch chiết thô của polysaccharopeptide từ nấm vân chi [39] Chất peptide này có hoạt tính chống ung thư cao hơn so với PSK và PSP và có tác dụng tiềm năng với hệ miễn dịch (tăng cường số lượng bạch cầu và lượng IgG ở chuột)

1.3 Các giá trị khác của vân chi

Giống nấm vân chi (T versicolor) ngoài mục đích thu sinh khối và quả thể

để làm thuốc nó còn được sử dụng trong nghiên cứu xử lý sinh học, sản xuất enzym (Walter và cộng sự, 2005)

Nấm vân chi sản xuất ra các enzyme phá gỗ như: laccaza, mangan peroxidaze (MnP), lignin peroxidaze (LnP) Các enzyme này đang được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực tẩy trắng bột cellulose Laccaza từ nấm vân chi có thể dùng trong xử lý chất thải, khử màu chất thải từ khâu tẩy trắng [28], [38]

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm vân chi

1.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất trên thế giới

Theo Liu và cộng sự (2010), phương pháp nuôi cấy truyền thống, giống nấm

ăn và nấm dược liệu đã được sản xuất trong các môi trường rắn sử dụng nguyên liệu tổng hợp có chứa nhiều lignocellulose, quá trình này thường kéo dài 2 -3 tháng để sản xuất ra đến quả thể Nuôi cấy trong môi trường dịch thể khác hẳn với nuôi cấy trên các cơ chất rắn vì nó đưa đến tiềm năng sản xuất giống nấm cao hơn trong một thời gian ngắn hơn với mức độ nhiễm bệnh ít hơn [50]

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, sợi nấm sinh trưởng trong môi trường dịch thể là phương pháp thay thế nhanh chóng để thu sinh khối sợi nấm với chất lượng phù hợp hơn [36]

Năm 1993 các nhà sinh học ở Đại học Sư phạm Thượng Hải đã dùng phương

pháp nuôi cấy chìm để thu nhận sợi nấm vân chi và phối hợp với Xí nghiệp Dược

phẩm Tân Khang để sản xuất ra thuốc Polysaccharopeptide PSP ứng dụng trong

lâm sàng, phối hợp với các biện pháp phẫu thuật hoặc hóa trị để điều trị ung thư phổi, ung thư đường tiêu hóa và ung thư vú

Năm 1981, Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên đã dùng sản phẩm nuôi

cấy chìm sợi nấm vân chi để chiết xuất polysaccharides nội bào và ngoại bào và

phối hợp với Xí nghiệp Dược phẩm Trùng Khánh để sản xuất ra thuốc Vân Tinh dùng để điều trị viêm gan do virut HBV và ung thư gan nguyên phát, đã đạt được hiệu quả tốt

Adebayo và Ugwu (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

bổ sung tới sinh khối sợi nấm vân chi, thành phần môi trường cơ bản gồm MgSO4.7H2O (0,2 g); K2HPO4 (1,0 g); NH4SO4 (5,0 g); glucose (9,75 g); Cao nấm men (CNM) (3,0 g); peptone (1,0 g) và 1l nước cất, được bổ sung 9,75 g của mỗi nguồn carbon gồm: lactose, glucose, sucrose, mannitol, maltose, galactose, fructose,

xylose, sorbitol và tinh bột Kết quả chỉ ra rằng nguồn carbon có ảnh hưởng lớn đến sinh khối sợi nấm vân chi, bổ sung các nguồn lactose, mannitol, maltose sinh khối thấp hơn các nguồn carbon còn lại, sự biến thiên của sinh khối sợi khi bổ sung các nguồn carbon này cũng rất khác so với các nguồn carbon cùng nghiên cứu Khi bổ sung các nguồn lactose, glucose, mannitol, maltose sinh khối tăng cực đại ở ngày thứ 4, giảm xuống cực tiểu ở ngày thứ 7, sau đó đến ngày thứ 14 sinh khối lại tăng gần như ngày thứ 4 Còn khi bổ sung nguồn carbon: sucrose, galactose, fructose, sorbitol và tinh bột, sinh khối tăng cực đại ở ngày thứ 7, sau đó giảm gần hết ở ngày thứ 14 Kết quả của các tác giả cho thấy nguồn nitơ và nguồn carbon ảnh hưởng lớn đến sinh khối sợi, đường cong sinh trưởng của giống không phải lúc nào cũng tuân theo quy luật tự nhiên mà nó phụ thuộc nhiều vào nguồn dinh dưỡng bổ sung [50]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ở Việt Nam

Ở nước ta hiện nay cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm vân chi

và khả năng ứng dụng của nó

Lê Thị Hoàng Yến và cộng sự (2003) đã phân lập quả thể vân chi từ Trung Quốc, sau đó thử nghiệm trên môi trường lỏng cho kết quả thu được nấm vân chi sinh trưởng tốt nhất trên môi trường 20 g bột đậu tương; 20 g đường kính; 2,5 g (NH4)2SO4; 2 g CaCO3; 1 g MgSO4; sinh khối đạt 16,68 g/l Tác giả cũng nghiên cứu khả năng sinh trưởng của nấm vân chi trên môi trường xốp, kết quả chỉ ra nấm vân chi sinh trưởng tốt trên môi trường 80 g bã rượu; 18 g cám gạo; 1 g thạch cao; 1g CaCO3, sau 10 ngày sợi vân chi đã sinh trưởng kín bình nguyên liệu, nhanh hơn

so với môi trường khác từ 1 - 10 ngày [21]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thùy cho thấy sinh trưởng của sợi nấm vân chi trên môi trường PDA cải tiến, nhiệt độ thích hợp là 300C, với pH tối ưu

là 6,5 và tốc độ lắc là 140 vòng/phút sẽ thu được sinh khối cao nhất [17]

Nghiên cứu của Lê Xuân Thám cho thấy sợi nấm vân chi trên môi trường dịch thể cần các nguyên tố Kali, photpho Trong đó, Nồng độ Kali tối ưu cho sự

phát triển tơ nấm Trametes versicolor là 3o/oo, Nồng độ Photpho thích hợp nhất cho

sự tăng sinh khối của Trametes versicolor là 1o/oo [14]

Ở nước ta, nghiên cứu về tác dụng của nấm vân chi cũng được tiến hành, nấm vân chi là loại nấm có giá trị dược liệu cao, có hoạt tính chống khối u đạt tới 77,5%, đặc biệt có tác dụng tốt ngăn ngừa các loại ung thư đường hô hấp, đường tiêu hóa, ung thư vú, ung thư tử cung Ngoài ra nấm vân chi còn có tác dụng chống viêm gan B mãn tính, tăng hệ thống miễn dịch cơ thể Thêm vào đó, vân chi còn có tác dụng thu gọn gốc oxi tự do và trung hòa chất độc (kể cả gốc dioxin), ngăn ngừa đột biến gen [1]

Nhìn chung, ở nước ta có một số nhà khoa học tập trung nghiên cứu sâu về nấm dược liệu (nấm linh chi, hắc chi, vân chi, nấm đầu khỉ, đông trùng hạ thảo,…), việc nuôi trồng nấm để thu quả thể chủ yếu sử dụng nguồn giống thể rắn nên cho thời gian thường kéo dài hơn Chính vì thế mà việc nuôi cấy nấm trong môi trường dịch thể sẽ giúp rút ngắn thời gian nuôi trồng, đem lại hiệu quả kinh tế cao

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là nấm vân chi (Trametes versicolor) có nguồn gốc từ

Trung Quốc, do Trung tâm Ứng dụng Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng cung cấp

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học sợi nấm vân chi trên môi trường đặc

2.2.2 Ngiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh khối sợi nấm vân chi

Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến lượng sinh khối sợi nấm vân chi

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến lượng sinh khối sợi nấm vân chi

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến lượng sinh khối sợi nấm vân chi

Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến lượng sinh khối sợi nấm vân chi

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thu sinh khối đến lượng sinh khối sợi nấm vân chi

2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học và định lượng một số hợp chất có trong sợi nấm vân chi

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát tốc độ sinh trưởng sợi nấm vân chi trên môi trường đặc

Môi trường thí nghiệm là môi trường thạch PGA được đổ trên các đĩa petri

có cùng đường kính Môi trường được hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở

121oC/30 phút và sau đó đổ vào các đĩa petri Cấy giống từ môi trường thạch, mỗi đĩa cấy miếng thạch bằng nhau cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Ủ ở nhiệt độ phòng

Tiến hành đo độ dài tơ qua các khoảng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 ngày sau khi cấy giống Xử lí số liệu để xác định tốc độ lan tơ của sợi nấm vân chi trên môi trường đĩa thạch.

2.3.2 Khảo sát sự tăng trọng của sợi tơ nấm vân chi trong các môi trường dinh dưỡng lỏng khác nhau

Các môi trường thí nghiệm là môi trường lỏng không có agar:

+ Môi trường tự nhiên: PG (khoai tây + đường)

+ Môi trường bán tổng hợp (BTH): khoai tây + muối khoáng + đường

+ Môi trường tổng hợp: Crapek, Raper

+Môi trường PG cải tiến: Khoai tây + đường + cao nấm men + peptone

Cho 50 ml môi trường vào chai thủy tinh cùng đường kính Mỗi môi trường thực hiện 10 bình, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/30 phút Để nguội một ngày, cấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3 cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Ủ ở nhiệt độ phòng, tiến hành thu và cân sinh khối sau 15 ngày Xử lý số liệu để chọn ra môi trường tạo sinh khối nhiều nhất

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH

Tiến hành điều chỉnh môi trường về các pH khác nhau: 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 Điều chỉnh pH acid dung dịch HCl 0,1N và pH kiềm dung dịchNaOH 0,1N Khử trùng môi trường 121oC/30 phút Sau 24h, cấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3 cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Ủ ở nhiệt độ khảo sát tốt nhất ở trên, tiến hành thu và cân sinh khối sau 15 ngày Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Môi trường và pH sử dụng là môi trường và pH đạt hiệu quả cao nhất từ khảo sát trên

Tiến hành khử trùng môi trường 121oC/30 phút Sau 24 giờ, cấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Nuôi ở 2 mức nhiệt độ 22 ± 2oC và nhiệt độ phòng (30 ± 2oC), tiến hành thu và cân sinh khối sau 15 ngày Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy

Khử trùng môi trường 121oC/30 phút Sau 24 giờ, cấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3 cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Nuối cấy

ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) trong 2 điều kiện: không lắc, lắc với tốc độ 120 vòng/phút (15 ngày)

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thu sinh khối

Khử trùng môi trường 121oC / 30 phút Sau 24 giờ, cấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3 cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Nuối cấy

ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) Sau các khoảng thời gian: 5, 7, 9, 12, 15 ngày tiến hành thu sinh khối và cân sấy, tiến hành xử lí số liệu để tìm thời gian thu sinh khối tốt nhất

3.3.7 Xác định sinh khối khô sợi nấm vân chi

Khối lượng tươi: Sinh khối sợi nấm được lọc qua giấy lọc, sau đó cân để xác định sinh khối tươi

Khối lượng khô: Khối lượng tươi của sợi nấm được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô

2.4 Thực hiện kiểm tra sinh hóa để định tính các dược chất có trong tơ nấm vân chi

Chuẩn bị mẫu thử:

Mẫu nguyên liệu khô được chiết với ethanol 700 trong 24 giờ Sau đó tiến hành cô quay chân không, thu được dịch chiết nấm

2.4.1 Phương pháp định tính alkaloid [10], [17]

Chuẩn bị dịch sợi nấm vân chi để thử nghiệm

* Áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau:

Phần 1: Bột nấm xay nhuyễn (10 – 20 g) và dung dịch H2SO4 1% được cho vào - erlen, đun nhẹ trong 1 giờ Lọc lấy dịch để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer và Dragendorff

Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính Tuy nhiên, nếu không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alkaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2

- Phần 2: bột xay nhuyễn (10 – 20 g) ngâm nguội trong dung dịch prollius trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn

- Lọc và đun dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer Dragendorff

Dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: chloroform: ethanol 95% : NH4OH đậm đặc, theo tỉ lệ là 8 : 8 : 1 (môi trường phải có tính bazơ)

* Thuốc thử định tính alkaloid

- Thuốc thử Mayer:

Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 g KI trong 10 ml nước cất Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử

- Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff (KBiI 4 - Kali tetraiodobismutat ) vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu

cam – nâu

2.4.2 Phương pháp định tính hợp chất saponin [4], [7]

Chiết 10 g sinh khối sợi nấm vân chi với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô Dùng cắn để làm các phản ứng định tính

-Thí nghiệm tạo bọt

Saponin có tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác

để định tính sự hiện diện của saponin

Phương pháp tiến hành: hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 g dược liệu vào 5 ml nước nóng Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước

cho đủ 10 ml, lắc mạnh dọc theo chiều ống nghiệm trong 1 phút Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả:

+ Bọt bền trong 15 phút: +

+ Bọt bền trong 30 phút: ++

+ Bọt bền trong 60 phút: +++

-Thử nghiệm Fontan – Kaudel

Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 g bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10 ml nước Chia đều 2 ống nghiệm

2.4.3 Phương pháp định tính acid hữu cơ [4], [7]

Lấy 2 ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri Na2CO3, hơ nhẹ qua ngọn lửa Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là có acid hữu cơ

2.4.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết sợi nấm vân chi bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [10]

Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường đĩa thạch LB

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn (Escherichia coli):

Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch LB, vi khuẩn được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh ở 4oC Từ ống tồn trữ, chọn 2 - 3 khuẩn lạc đưa vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB đã khử trùng, nuôi cấy tĩnh ở 37oC trong

16 - 18 giờ

-Tiến hành:

+ Dùng pipet man hút 100 μl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 106 CFU/ml), sau đó chang đều trên mặt đĩa thạch (50 ml môi trường LB/đĩa thạch) đã khô ổn định, chờ khô bề mặt Sau đó tiến hành cho dịch chiết nấm đầy giếng thạch đã được đục lỗ sau khi cấy vi khuẩn Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (4oC) khoảng 4 – 8 giờ để dịch chiết nấm khuếch tán ra thạch Sau đó đem nuôi ở 37oC trong 16 – 18 giờ Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (D - d) được xác định bằng đường kính vòng ngoài trừ đi đường kính đục lỗ thạch (1 cm)

2.4.5 Xác định khả năng kháng oxi hóa của nấm vân chi

Sử dụng phương pháp Reducing power để kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa: lần lượt lấy (50 -500 μg) bột chiết pha trong 1 ml nước cất, 2 ml dung dịch ethanol 96%, 2 ml dung dịch đệm phosphate (0,2M; pH 6,6) và 2 ml kali ferricyanide (1%) vào các ống nghiệm và ủ ở 30oC trong 30 phút Tiếp đó, thêm vào hỗn hợp 2 ml trichloroacetic acid 10% rồi đem li tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Cuối cùng lấy 3 ml phần dung dịch trên bề mặt pha với 2 ml ethanol 96% và 0,5 ml ferric chloride 0,1% Đo độ hấp thụ của dung dịch trên với thiết bị UV - Vis ở bước sóng 700 nm Thực hiện tương tự với mẫu kiểm chứng

Công thức tính chỉ số chống oxy hóa:

𝑅𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙AAI: chỉ số chống oxy hóa

Rsample: mật độ quang của mẫu

Rcontrol: mật độ qua mẫu kiểm chứng

2.5 Thực hiện kiểm tra sinh hóa để định lượng các dược chất có trong tơ nấm vân chi

2.5.1 Phương pháp định lượng polysaccharides

Polysaccharides có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau Chiết PS ở

100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nấm vân chi Qui trình chiết xuất polysaccharides từ nấm vân chi (Yihuai gao và cộng sự, 2001):

Tơ nấm đã sấy khô nghiền đem ngâm nước ở 70oC trong 3 giờ, tiến hành chiết thu được dịch chiết lần 1 và bã chiết lần 1 Lặp lại quá trình ngâm và chiết với

bã chiết lần 1 ta thu được dịch chiết và bã chiết lần 2 Bã chiết lần 2 ngâm với cồn

80o ở 70oC trong hai giờ thu được dịch chiết lần 3 Thu nhận được 3 dịch chiết và tủa bằng cồn 70o Thu phần cặn và bổ sung vào 1ml nước cất và 3 ml phenol Hỗn hợp được bổ sung 7 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc và đun nóng tại 400C trong 30 phút, sau đó đem mẫu để nguội ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, tiến hành so màu tại bước sóng 492 nm Làm mẫu đối chứng tương tự, dùng 3 ml nước cất thay mẫu Từ hiệu

số giá trị OD (λ = 485 nm) giữa dịch mẫu và đối chứng sẽ tính được hàm lượng polysaccharides có trong mẫu bằng cách so sánh với giá trị OD (λ = 485 nm) của glucose (4 - 20 mg/ml) được dùng làm chất chuẩn

2.5.2 Xác định hàm lượng PSP thô có trong sợi nấm vân chi

Hàm lượng PSP thô được xác định bằng phương pháp của Ueno S và cộng

sự [49]

Tiến hành thí nghiệm:

Mẫu tơ nấm được đem đi ngâm nước nóng ở nhiệt độ 800C - 980C trong 2 - 3 h Sau đó đem đi làm lạnh và lọc, bã được đem đi chiết bằng nước nóng như trên để có thể chiết hết lượng PSP có trong tơ nấm Dịch đem đi cô quay cho bay bớt hơi nước, sau đó tiến hành tủa PSP bằng cồn 70o, tiến hành lọc là thu tủa, đem đi sấy trong vòng 24 giờ ở 50oC và cân trọng lượng (trừ đi trọng lượng của giấy lọc sau khi sấy khô cùng điều kiện) Từ đó đánh giá được hàm lượng PSP có trong sợi nấm vân chi

2.5.3 Xác định hàm lượng PS ngoại bào có trong dịch môi trường nuôi cấy lắc nấm vân chi

Hàm lượng PS ngoại bào thô được xác định thông qua phương pháp của Wu