Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (igy) kháng trực khuẩn mủ xanh

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi cùng các thầy

cô ở Bộ môn Miễn dịch, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học,

Bộ môn – Khoa Vi sinh y học, Bộ môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Học viện Quân y Các số liệu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ một luận án, luận văn nào khác

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

Tim Sunnary

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô: TS Lê Văn Đông,

TS Lê Thu Hồng, TS Nguyễn Đặng Dũng đã hết lòng động viên, tận tình giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám đốc Học Viện Quân Y, Ban giám đốc Bệnh viện 103, Phòng đào tạo Sau đại học, Phòng quản lý nghiên

cứu khoa học Học viện Quân y; Đại Sự Quán đặc mệnh toàn quyền và Tuỳ Viên Quân Sự Vương quốc Căm-Pu-Chia tại Việt Nam đã tạo mọi điều

kiện cho tôi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nhân viên các đơn vị: Hệ

Quốc Tế, Bộ môn Miễn Dịch, Phòng Protein-Độc chất-Tế bào, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Bộ môn – Khoa Vi sinh y học, Bộ môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Học viện Quân y đã tận tình hướng dẫn và hỗ

trợ kỹ thuật cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài nghiên cứu của luận án

Cảm ơn các anh các chị và các bạn đồng nghiệp đã thân ái giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập; Cảm ơn mọi người thân và gia đình đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành

luận án

NGHIÊN CỨU SINH

Tim Sunnary

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BCTT Bạch cầu trung tính

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

(thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzym) HGKT Hiệu giá kháng thể

HTKTKMX Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh IgY Yolk Immunoglobin (globulin miễn dịch IgY

hay kháng thể IgY)

NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện

NKH Nhiễm khuẩn huyết

M ỤC LỤC

Trang ph ụ bìa

L ời cam đoan

L ời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các từ viết tắt sử dụng trong luận án

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CH ƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TRỰC KHUẨN MỦ XANH 3

1.1.1 Đặc điểm hình thể 3

1.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 3

1.1.3 Khả năng gây bệnh 5

1.1.4 Sức đề kháng và khả năng kháng kháng sinh 6

1.1.5 Phân loại trực khuẩn mủ xanh theo type huyết thanh 6

1.2 NHIỄM KHUẨN VẾT BỎNG DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH 7

1.2.1 Tình hình nhiễm khuẩn vết bỏng do trực khuẩn mủ xanh 7

1.2.2 Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trực khuẩn mủ xanh ở bệnh nhân bỏng 8

1.2.3 Một số đặc điểm của nhiễm khuẩn tại vết bỏng do 9

1.3 CÁC BIỆN PHÁP MIỄN DỊCH TRONG PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH 10

1.3.1 Vắc-xin trực khuẩn mủ xanh 10

1.3.2 Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh 12

1.3.3 Kết hợp vắc-xin, huyết thanh và kháng sinh trong phòng và

điều trị nhiễm khuẩn trực khuẩn mủ xanh 15

1.4 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI THU KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU TỪ TRỨNG GÀ 16

1.4.1 Hệ thống miễn dịch của gà 16

1.4.2 Kháng thể IgY 18

1.4.3 Tính ưu việt của công nghệ sản xuất IgY 19

1.5 ỨNG DỤNG CỦA IgY 22

1.5.1 Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán 22

1.5.2 Ứng dụng của IgY trong dự phòng và điều trị bệnh 22

CH ƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.1.2 Động vật để gây bỏng thực nghiệm và lây nhiễm trực khuẩn mủ xanh 26

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Trực khuẩn mủ xanh 26

2.2.2 Hoá chất sinh phẩm 26

2.2.3 Thiết bị máy móc 27

2.3 PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.3.2 Gây miễn dịch 28

2.3.3 Tách chiết, tinh sạch IgY từ trứng gà 29

2.3.4.Điện di SDS-PAGE phân tích thành phần protein kháng nguyên của trực khuẩn mủ xanh và độ tinh sạch của chế phẩm IgY 31

2.3.5 Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong máu gà và sản phẩm tách chiết từ trứng gà 32

2.3.6 Phân tích kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot 33

2.3.7 Thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn 33

2.3.8 Thử nghiệm tạo vòng kháng khuẩn in vitro trên môi trường đặc 34

2.3.9 Đánh giá độ ổn định của kháng thể IgY trong quá trình bảo quản 34

2.3.10 Gây bỏng thỏ thực nghiệm 35

2.3.11 Gây nhiễm khuẩn vết bỏng 36

2.3.12 Điều trị vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh 37

2.3.13 Xác định số lượng vi khuẩn tại vết thương 37

2.3.14 Xét nghiệm mô bệnh học 39

2.3.15 Phương pháp xử lý số liệu 41

2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 41

2.5 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 41

CH ƯƠNG 3: KẾT QUẢ 42

3.1 CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH 42

3.1.1 Kết quả gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh 42

3.1.2 Tách chiết, tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà 48

3.1.3 Độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau 56

3.2 HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC 58

3.2.1 Hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh trên in vitro 58

3.2.2 Kết quả điều trị vết bỏng thực nghiệm trên thỏ nhiễm bằng chế trực khuẩn mủ xanh phẩm IgY kháng trực khuẩn mủ xanh 61

CH ƯƠNG 4: BÀN LUẬN 69

4.1 CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH 69

4.1.1 Về gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu ở gà mái đẻ

trứng 694.1.2 Về tách chiết, tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà 744.1.3 Về độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY 75

4.2 HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO

VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC 77

4.2.1 Về hoạt tính in vitro của chế phẩm kháng thể IgY kháng trực

khuẩn mủ xanh 774.2.2 Về kết quả điều trị vết bỏng nhiễm bằng trực khuẩn mủ xanh

chế phẩm kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh 79

KẾT LUẬN 83 KIẾN NGHỊ 84 DANH M ỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

TÀI LI ỆU THAM KHẢO

PH Ụ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Một số kết quả lâm sàng của huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh 14 1.2 Tính ưu việt của IgY so với IgG 20 3.1 Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng 55 3.2 Hoạt tính ngưng kết từng chủng của trực khuẩn mủ xanh IgY kháng

trực khuẩn mủ xanh 59 3.3 Tỷ lệ % các loài vi khuẩn phân lập trên vết bỏng thỏ nhiễm trực khuẩn

mủ xanh chủng 6P11 64 3.4 Tổn thương mô học vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị 66 4.1 Khuyến cáo cách gây miễn dịch 71

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Trực khuẩn mủ xanh 5

1.2 Hệ thống kháng thể của gà mái 17

1.3 Cấu trúc phân tử IgY của gà so với IgG của động vật có vú 19

2.1 Gà mái gây miễn dịch chế tạo IgY kháng trực khuẩn mủ xanh 25

2.2 Gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên trực khuẩn mủ xanh 29

2.3 Hệ thống sắc ký trao đổi ion (BioRad, Mỹ) 31

2.4 Gây bỏng thực nghiệm và vết bỏng mới sau gây bỏng 35

2.5 Gây nhiễm khuẩn vết bỏng với trực khuẩn mủ xanh 36

2.6 Lấy mẫu xác định số lượng vi khuẩn tại vết thương 38

2.7 Sơ đồ nghiên cứu 40

3.1 Biến động hiệu giá IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong máu gà trước và sau khi gây miễn dịch ở các lô gà thí nghiệm 42

3.2 Hoạt tính IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong lòng đỏ trứng gà được đẻ ra sau lần gây miễn dịch thứ 5 ở các lô gà thí nghiệm 44

3.3 Hoạt tính IgY trong lòng đỏ trứng gà kháng từng chủng trực khuẩn mủ xanh riêng rẽ 45

3.4 Kết quả phân tích hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với các kháng nguyên của từng chủng trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot 47

3.5 Ảnh hưởng các tỉ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả tách chiết IgY 49

3.6 Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY 50

3.7 Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY 51

Hình Tên hình Trang

3.8 Sắc ký đồ trao đổi ion sản phẩm sau tủa bằng sulphat amoni 52

3.9 Kết quả phân tích bằng ELISA kiểm tra hoạt tính kháng thể ở các phân đoạn sắc ký Mỗi phân đoạn được pha loãng ở một hàng theo chiều từ trên xuống dưới 53

3.10 Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính các sản phẩm sau mỗi bước tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà 54

3.11 Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản ở nhiệt độ phòng 56

3.12 Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản ở 4°C 57

3.13 Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản ở -20°C 57

3.14 Ngưng kết vi khuẩn trên lam kính 59

3.15 Kháng thể IgY ức chế trực khuẩn mủ xanh trên môi trường đặc 60

3.16 Tổn thương mô học vết thương sau gây bỏng thực nghiệm (10X) 62

3.17 Biến động số lượng vi khuẩn trực khuẩn mủ xanh ở vết bỏng trước và sau điều trị 63

3.18 Đặc điểm mô học vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị (10X) 67

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nan giải lớn cần được giải quyết Trong số các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, trực khuẩn mủ xanh

(Pseudomonas aeruginosa) chiếm tỷ lệ cao, thậm chí chiếm tỷ lệ cao nhất ở các nước đang phát triển Vi khuẩn này có khả năng chịu đựng cao với các

yếu tố vật lý, hóa học, môi trường ẩm ướt và có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh, kể cả các kháng sinh mới được đưa vào sử dụng trên lâm sàng Vì

vậy, nhu cầu thực tiễn đòi hỏi cần có các biện pháp điều trị hiệu quả hơn như

sử dụng huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh [2], [5]

Công nghệ chế tạo kháng huyết thanh truyền thống dùng cho điều trị

bệnh ở người thường sử dụng các động vật lớn có vú như ngựa, cừu Tuy nhiên công nghệ này có nhược điểm là kích thước động vật lớn, đòi hỏi lượng kháng nguyên để gây miễn dịch phải nhiều; để có kháng thể phải lấy máu động vật để tách huyết thanh hoặc huyết tương rồi tinh chế kháng thể với qui trình chế tạo phức tạp; việc lấy máu động vật không được thường xuyên, từ

đó ảnh hưởng đến sản lượng kháng thể thu được từ mỗi cá thể động vật không nhiều [10], [11]

Loài gà có khả năng sinh kháng thể tương tự như động vật có vú Trong

số các kháng thể trong máu gà mái có một lớp kháng thể được chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng, được gọi là IgY (yolk immunoglobulin) Muốn

sản xuất kháng thể IgY chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng

do chúng đẻ ra là có kháng thể đặc hiệu Gà mái ở độ tuổi đẻ ổn định, việc thu

hoạch trứng được thực hiện hàng ngày với lượng kháng thể thu được từ mỗi

quả trứng rất lớn so với kích thước của gà mẹ Kỹ thuật tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng cũng tương đối đơn giản, từ đó công nghệ chế tạo IgY

bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ lòng đỏ trứng

do gà đẻ ra trở nên đặc biệt hấp dẫn cho yêu cầu sản xuất lượng lớn kháng thể

sử dụng cho chẩn đoán và điều trị bệnh ở động vật cũng như cho người [34], [89]

Trên thế giới, các tác giả Thụy Điển đã chế tạo IgY kháng trực khuẩn

mủ xanh được Bộ Y tế Thụy Điển cho phép sử dụng để dự phòng nhiễm trực khuẩn mủ xanh đường hô hấp cho các bệnh nhân bị chứng xơ nang phổi (cystic fibrosis) [72] Tại Việt Nam, các tác giả ở Học viện Quân y đã bước đầu thành công trong việc gây miễn dịch cho gà mái tạo ra được kháng thể IgY kháng một chủng chuẩn trực khuẩn mủ xanh [13]

Xuất phát từ cơ sở lý luận về tính ưu việt của công nghệ sản xuất kháng

thể IgY; từ cơ sở thực tiễn về nhu cầu cần có các chế phẩm kháng thể đặc

hiệu bổ trợ cho thuốc kháng sinh chống lại các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng nói chung, đặc biệt là trực khuẩn mủ xanh nói riêng; từ cơ sở thực tiễn về tính

khả thi trong việc chế tạo IgY kháng trực khuẩn mủ xanh trong điều kiện Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ

tr ứng gà (IgY) kháng trực khuẩn mủ xanh” với các mục tiêu:

1 Ch ế tạo globulin miễn dịch từ lòng đỏ trứng gà (kháng thể IgY) kháng

m ột số chủng trực khuẩn mủ xanh lưu hành tại Việt Nam bằng phương pháp gây mi ễn dịch cho gà mái, thu hoạch kháng thể từ trứng gà

2 Đánh giá hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh của kháng thể IgY trên in vitro và trên v ết thương nhiễm trực khuẩn mủ xanh thực nghiệm

Mục tiêu chung của đề tài là triển khai áp dụng một công nghệ mới, công nghệ chế tạo IgY, phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam và Căm-Pu-Chia, để tạo ra một chế phẩm kháng thể dùng dưới

dạng dung dịch rửa hoặc tẩm đắp vết thương để dự phòng và điều trị vết thương, vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh, phục vụ cho công cuộc kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện do loài vi khuẩn này

CHƯƠNG 1

1.1 TR ỰC KHUẨN MỦ XANH

Trực khuẩn mủ xanh (TKMX) là một vi khuẩn Gram âm thuộc giống

Pseudomonas, h ọ Pseudomonadaceae, được phát hiện từ năm 1872 TKMX

có khả năng chịu đựng cao với các yếu tố vật lý, hóa học, môi trường ẩm ướt

và có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh, kể cả các kháng sinh mới được đưa vào sử dụng trên lâm sàng Do tính kháng đa kháng sinh nên TKMX đang

trở thành vấn đề thực sự khó khăn trong việc phòng và điều trị các nhiễm khuẩn thông thường và nhiễm khuẩn huyết (NKH) do loài vi khuẩn này nói chung, nhiễm khuẩn vết thương bỏng nói riêng Vì vậy, nhu cầu thực tế đang đòi hỏi cần có các biện pháp dự phòng và điều trị hiệu quả hơn đối với nhiễm TKMX [2], [18], [26], [29], [82]

1.1.1 Đặc điểm hình thể

TKMX là vi khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, hoặc thành đôi và có khi xếp thành chuỗi, kích thước 1,5 - 3 x 0,5 - 0,8µm, di động nhờ vào lông ở

cực (rất hiếm chủng không có khả năng di động), có pili, không có bào tử

Những chủng TKMX phân lập trên da và tuyến nhày có thể có nhiều hình thái [2], [5]

1.1.2 Đặc điểm nuôi cấy

TKMX là vi khuẩn ưa khí tuyệt đối, phát triển dễ trên các môi trường thông thường, nhiệt độ thích hợp 30 - 37ºC nhưng vi khuẩn cũng có thể mọc ở 42ºC, pH 7,0 - 7,2 Trong môi trường lỏng, sau 18 - 24 giờ vi khuẩn mọc làm đục đều môi trường và tạo váng trên bề mặt [2]

Tính ch ất khuẩn lạc: trên môi trường đặc, vi khuẩn phát triển có thể có

3 dạng khuẩn lạc:

- Dạng S (Smooth) là khuẩn lạc nhỏ, tròn, trơn, nhẵn, bờ đều đặn, trung tâm hơi lồi Đây là dạng khuẩn lạc hay gặp trong tự nhiên

- Dạng R (Rough) là khuẩn lạc to, xù xì, bờ không đều Phần lớn những

chủng TKMX gây bệnh có khuẩn lạc dạng R

- Dạng M (Mucoid) là khuẩn lạc tròn, nhầy, rất hiếm gặp Dạng khuẩn

lạc này thường phân lập được từ bệnh nhân bị nhiễm trùng mạn tính

Tính ch ất sinh sắc tố: một trong các đặc tính quan trọng của TKMX là

khả năng sinh sắc tố khi phát triển trên môi trường dinh dưỡng hoặc trên các

tổ chức tế bào cơ thể Đặc tính này có ý nghĩa trong việc xác định TKMX in vitro và in vivo Những sắc tố do TKMX tiết ra không có tính độc Có 4 loại

sắc tố:

- Pyocyanin: có màu xanh da trời trong môi trường trung tính hoặc hơi

kiềm, pyocyanin có thể tan trong nước và clorofor Để phát hiện pyocyanin, người ta nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang thường, thạch thường, nhưng tốt

nhất là trên môi trường King A

- Pyoverdin: là sắc tố huỳnh quang có màu vàng xanh, có thể tan trong clorofor Trong môi trường nuôi cấy để lâu, sắc tố này bị oxy hoá thành pyorubin màu hồng nhạt Dùng môi trường King B để phát hiện pyoverdin

- Pyorubin: màu hồng nhạt, được sinh ra thuận lợi trong môi trường có 1% glutamat Rất ít chủng TKMX sinh sắc tố này

- Pyomelanin: màu nâu đen, có thể khuếch tán và tan được trong nước, không tan trong clorofor, ether, alcool Để phát hiện pyomelanin, dùng môi trường King A

Khoảng 95% trường hợp các chủng TKMX sinh sắc tố pyocianin và pyoverdin Tuy nhiên không phải chủng TKMX nào cũng có khả năng sinh

sắc tố Tỷ lệ % số chủng không sinh sắc tố có sự khác nhau theo từng công trình nghiên cứu

Tính ch ất sinh vật hoá học: tất cả các chủng TKMX đều có phản ứng

oxydase (+), catalase (+) Không lên men lactose và saccharose, sử dụng glucose bằng hình thức oxy hoá, không sinh indol và H2S, một số ít chủng TKMX urease (+) Hầu hết TKMX làm lỏng gelatin và thoái hoá nitrit thành nitrat, LDC (-), ODC (-), ADH (+), citrat simmon (+), ONPG (-), tuy nhiên có 98% số chủng TKMX type huyết thanh P11 có khả năng thuỷ phân ONPG, do

có enzym β- galactosidase

Hình 1.1: Tr ực khuẩn mủ xanh

Ngu ồn: www.cellsalive.com

1.1.3 Khả năng gây bệnh

TKMX là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nên trong những điều kiện nhất định chúng có thể xâm nhập vào cơ thể và gây bệnh TKMX thường gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thương, vết mổ, vết bỏng Từ vết thương, vết bỏng

vi khuẩn có thể vào máu gây NKH Khi bị NKH do loài vi khuẩn này tỷ lệ tử vong thường rất cao TKMX gây nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn đường

hô hấp dưới, viêm màng não, viêm màng trong tim, viêm tai giữa Nhiễm khuẩn do TKMX còn hay gặp ở bệnh nhân mắc các bệnh ác tính, giảm bạch

cầu, bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch hoặc dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài TKMX có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm

nhập, lan truyền và gây bệnh [2]

1.1.4 Sức đề kháng và khả năng kháng kháng sinh

TKMX có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá Trong môi trường

ẩm, không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu đặt ở 50

C, chúng sống được hơn 6 tháng TKMX kháng lại nhiều thuốc sát trùng ở nồng độ thường dùng để diệt

vi khuẩn khác Cetrimit là một hoá chất diệt khuẩn ở nồng độ 0,2gam/lít Nhưng ở nồng độ này, TKMX kháng lại thuốc vì vậy người ta cho vào Cetrimid môi trường phân lập loại bỏ tạp nhiễm [2]

TKMX là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nhưng khi gây bệnh thường khó điều trị và gây tỉ lệ tử vong cao, một trong những lý do căn bản của việc khó điều trị các nhiễm trùng do TKMX là do tính đa kháng kháng sinh của chúng TKMX là một trong số các loài vi khuẩn gây bệnh hay gặp có khả năng đề kháng kháng sinh cao nhất TKMX kháng thuốc chủ yếu do nhận gen kháng thuốc thông qua con đường truyền plasmid Bên cạnh sự kháng thuốc do plasmid, sự đề kháng do đột biến gen ở nhiễm sắc thể cũng có vai trò quan

trọng [2], [26], [36], [64], [69]

1.1.5 Phân loại trực khuẩn mủ xanh theo type huyết thanh

Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ

biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ

sở nghiên cứu chế tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do TKMX Mặt khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm TKMX

Phương pháp hay sử dụng nhất là type huyết thanh (serotype) Năm

1957, Habs và cộng sự đã xây dựng một hệ thống định type của TKMX với

12 nhóm huyết thanh Hệ thống này gọi là IATS (International antigenic typing system) Hệ thống này được Uỷ ban phân loại quốc tế chấp nhận và đề nghị thành 16 nhóm kháng nguyên chịu nhiệt được ký hiệu từ O1 đến O16 (hoặc P1 đến P16) [2], [102]

Có phản ứng ngưng kết chéo giữa các type P2 và P5; P7 và P8; P13 và P14, đồng thời có khoảng 5% số chủng tự ngưng kết Khoảng 90 - 95% số

chủng TKMX có thể xác định được type theo phương pháp này Sự phân bố các type huyết thanh ở các nước có khác nhau và trong một nước, giữa các vùng cũng có sự khác nhau [20]

1.2 NHI ỄM KHUẨN VẾT BỎNG DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH

TKMX là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội và là loài vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) điển hình TKMX có thể gây các loại nhiễm trùng trên da, nhiễm trùng đường tiêu hóa và nhiễm trùng ở người suy giảm miễn

dịch hoặc sau chấn thương Trong khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi đề cập

chủ yếu đến vai trò của TKMX trong nhiễm khuẩn vết bỏng và NKH bỏng

1.2.1 Tình hình nhi ễm khuẩn vết bỏng do trực khuẩn mủ xanh

Từ cuối thế kỷ 19, người ta đã biết đến một trong những nguyên nhân gây tử vong ở bệnh nhân bỏng là do nhiễm khuẩn Trong những năm gần đây vai trò của TKMX trong nhiễm khuẩn bỏng càng trở nên quan trọng vì tỷ lệ nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn này không ngừng tăng từ 25 - 30% (1980) đến 40% (1995 - 1997) và sự phối hợp giữa TKMX và S.aureus chiếm tới 30 -

35%; giữa TKMX và E coli chiếm 40% Có thể nói nhiễm TKMX được mô

tả ở khắp nơi trên thế giới [6], [8], [21], [23], [32], [35], [110]

Theo Donatif và cộng sự nghiên cứu từ 1976 đến 1988 cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn bỏng do TKMX là 25 – 45% [35] Nhiều nghiên cứu đều cho

thấy TKMX là căn nguyên hàng đầu trong nhiễm khuẩn bỏng Khi tiến hành nghiên cứu các vi khuẩn chỉ điểm gây NKBV ở trung tâm Bỏng (Hàn Quốc), Song W và cộng sự (2001) đã xác định TKMX chiếm tỷ lệ cao nhất: 45,7%,

sau đó là S.aureus 19,2% và Acinetobacter baumannii chiếm 13,4% Các tác

giả cũng chỉ ra rằng các chủng TKMX phân lập từ bệnh nhân bỏng có tỷ lệ kháng kháng sinh cao hơn các chủng TKMX phân lập từ bệnh nhân khác [94] Estahbanati và cộng sự (2002) nghiên cứu ở viện Bỏng Motahari -Teheran

(Iran) từ tháng 12/1998 – 4/1999 cho thấy TKMX chiếm tỷ lệ cao nhất (57%),

sau đó là Acinetobacter (17%), E.coli (12%) và S aureus (8%) [36] Lari

A.R và cộng sự (2000), nghiên cứu tình trạng NKBV tại trung tâm bỏng Tohid – Teheran (Iran) cho thấy tỷ lệ TKMX phân lập từ mủ vết bỏng ở ngày

thứ nhất là 35%; ngày thứ 3 là 73% và ngày thứ 7 là 87% [60]

Ở Việt Nam, theo Lê Thế Trung, tỷ lệ TKMX gây nhiễm khuẩn vết

bỏng là 30% [23] Tác giả Nguyễn Đình Bảng (1991) cho biết TKMX là căn nguyên thứ hai gây nhiễm khuẩn vết bỏng sau S aureus [6] Theo Lê Thế

Trung, ở tuần thứ hai sau bỏng, tỷ lệ TKMX dương tính khi phân lập từ vết

bỏng là 81,9% Ở những bệnh nhân có hoại tử ướt tại vết bỏng, TKMX thường xuất hiện sớm (từ ngày thứ 4 - 6 sau bỏng) Kể từ tuần thứ 3 - 6 sau

bỏng, TKMX thường lấn át các vi khuẩn khác Với bỏng sâu dưới 10% diện tích cơ thể, TKMX tồn tại từ 5 – 10 ngày Với vết bỏng sâu trên 10% diện tích

cơ thể, TKMX tồn tại kéo dài từ 20 - 70 ngày [23]

Như vậy, phần lớn các tác giả trong và ngoài nước đều cho rằng TKMX là căn nguyên thứ nhất hoặc thứ hai gây nhiễm khuẩn vết bỏng

1.2 2 Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trực khuẩn mủ xanh ở bệnh nhân bỏng

Bệnh nhân bỏng thường phải nằm viện lâu ngày với sức đề kháng giảm,

chịu tác động của nhiều yếu tố (thay băng, tiêm truyền, hoặc chịu các biện pháp can thiệp khác như đặt sonde, catheter, thở máy… ) làm tăng khả năng nhiễm trùng chéo

Với những vết bỏng có pH kiềm, đặc biệt hay gặp ở hoá chất kiềm

mạnh, bỏng vôi tôi nóng TKMX thường đứng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn Bỏng vôi tôi nóng hay gặp ở một số nước có phong tục dùng

vôi tôi để xây nhà Bỏng vôi tôi nóng là loại bỏng hoá chất đặc biệt vừa do

sức nóng ướt (1500

C) vừa do bỏng kiềm (pH vôi tôi:13,1); các vết bỏng nông, sâu thường xen kẽ; thường có hoại tử ướt, quá trình viêm mủ ở các hoại tử

ướt diễn biến theo kiểu lan rộng và kèm theo sự tan rữa của tổ chức hoại tử

Sự tan rữa của hoại tử ướt trở thành môi trường thuận lợi cho vi khuẩn sinh

sản và phát triển, đặc biệt là TKMX Nếu hoại tử bỏng tiếp tục phát triển, hiện tượng viêm mủ thường nặng với nhiều biến chứng nhiễm khuẩn cục bộ và toàn thân Tại vết bỏng sâu, nhiễm khuẩn TKMX thường gặp sớm với tỷ lệ cao, đặc biệt ở thời kỳ hoại tử tan rữa và rụng Vết bỏng có hoại tử ướt, có ổ

mủ ứ đọng, ở vùng tỳ đè… cũng là những điều kiện thuận lợi cho TKMX tồn

tại và phát triển

1.2.3 Một số đặc điểm của nhiễm khuẩn tại vết bỏng do

Nhiễm khuẩn vết bỏng do TKMX, ngoài những biểu hiện của nhiễm khuẩn nói chung còn có một số đặc điểm khác biệt sau [20]:

- Tại chỗ vết bỏng xuất tiết nhiều dịch mủ màu xanh, có thể thấm qua băng cũng có màu xanh, có mùi hôi đặc trưng của pyocianin Đây là đặc điểm

rất có ý nghĩa trong việc định hướng chẩn đoán căn nguyên nhiễm khuẩn

- Thường gặp ở vết bỏng có hoại tử ướt, pH kiềm, vết bỏng bị thấm phân, nước tiểu

- Ở vết bỏng và vùng xung quanh có biểu hiện phản ứng viêm mạnh: xung huyết đỏ, phù nề, đau nhiều

- Nhiễm khuẩn do TKMX có liên quan đến diện tích bỏng sâu: nếu diện tích bỏng càng rộng, độ sâu bỏng càng lớn thì nhiễm khuẩn bỏng càng nặng

nề Nếu diện tích bỏng > 60% thì TKMX chiếm ưu thế Khi TKMX xâm nhập vào vết bỏng thường gây ảnh hưởng không tốt tới diễn biến của vết bỏng và ảnh hưởng toàn thân

- Tại chỗ vết thương nhiễm TKMX quá trình liền sẹo không thuận lợi, tổ

chức hạt xấu, dịch tiết tăng, quá trình biểu mô hoá kéo dài, mảnh ghép ít bám

sống Với đặc điểm gây bệnh của nội độc tố, ngoại độc tố và các enzym ngoại

tiết (protease, hemolysine, enterotoxin, yếu tố thấm qua thành mạch,…), TKMX từ vết bỏng có thể lan dần vào các tổ chức dưới da, bạch mạch, sau đó

xâm nhập vào mao mạch gây các biến chứng nhiễm khuẩn lan toả như viêm

khớp, viêm màng não, viêm phổi, viêm mủ màng phổi và NKH Đây là những

biến chứng nặng và rất nặng, dễ dẫn tới tử vong nếu không có biện pháp điều

trị kịp thời và hiệu quả

1.3 CÁC BI ỆN PHÁP MIỄN DỊCH TRONG PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ NHI ỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH

Trong những năm 1997-1999 đã có những thông báo khẩn cấp về tình

trạng kháng kháng sinh của TKMX Do tính đa kháng sinh nên TKMX đang

trở thành vấn đề thực sự khó khăn trong việc phòng và điều trị các nhiễm khuẩn thông thường và NKH do loài vi khuẩn này Trên thế giới hiện nay đang có 3 xu hướng điều trị nhiễm khuẩn do TKMX, đặc biệt là trong nhiễm khuẩn vết bỏng [18]:

- Kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện

- Tìm kiếm các kháng sinh và các hóa chất diệt khuẩn mới

- Sử dụng các biện pháp miễn dịch trị liệu: miễn dịch chủ động bằng xin; miễn dịch thụ động bằng huyết thanh kháng TKMX

vắc-1.3.1 Vắc-xin trực khuẩn mủ xanh

Vắc-xin TKMX đã được nghiên cứu nhiều ở một số nước trên thế giới Các loại vắc-xin này được chế tạo, thử tác dụng phòng và điều trị nhiễm TKMX trên động vật thí nghiệm Một số loại cũng đã được ứng dụng trên lâm sàng nhưng chủ yếu là thử nghiệm trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ cao nhiễm TKMX như bệnh nhân bỏng, bệnh nhân xơ phổi, bệnh nhân hô hấp nhân tạo Có thể chia thành 2 loại vắc-xin chính: vắc-xin toàn tế bào và vắc-xin sử dụng các thành phần của tế bào TKMX

1.3.1.1 V ắc-xin toàn tế bào

Loại bỏ các thành phần kháng nguyên khác (kháng nguyên lông, kháng nguyên pili…) chỉ giữ lại kháng nguyên O Có nhiều phương pháp chế tạo

vắc-xin toàn tế bào như phương pháp sử dụng nhiệt, dùng hóa chất (phenol,

formaldhyt ) hoặc siêu âm Tuy có khác nhau về phương pháp kỹ thuật nhưng các nghiên cứu đều nhằm mục đích bất hoạt vi khuẩn mà vẫn bảo tồn được kháng nguyên O, loại bỏ kháng nguyên H và kháng nguyên pili [100], [103]

Ở Việt Nam, Vũ Chiến Thắng (1995) đã dùng vắc-xin TKMX đơn giá toàn tế bào để bảo vệ chuột nhắt trắng bị nhiễm khuẩn bỏng do TKMX Tác

giả cho biết: Hiệu quả bảo vệ chuột ở nhóm tiêm vắc-xin 7 ngày trước gây

bỏng và gây nhiễm TKMX là 91,6%, ở nhóm tiêm vắc-xin đồng thời với gây nhiễm TKMX và gây bỏng là 83,3%, ở nhóm tiêm muộn hơn (4 ngày sau

bỏng) tỷ lệ chuột sống sót là 41,6%, trong khi ở nhóm chứng tỷ lệ chuột sống sót là 31,3% [16]

Một số chế phẩm sau giai đoạn đánh giá hiệu quả trên động vật thí nghiệm đã được áp dụng thử nghiệm trên người tình nguyện Feller I cho biết

việc sử dụng vắc-xin TKMX tiêm phòng sớm cho bệnh nhân bỏng đã làm

giảm tỷ lệ NKH từ 51% xuống 29%, tỷ lệ chết ở nhóm tiêm vắc-xin là 20% so

với nhóm chứng là 41% Makarenko T.A (1991) tiêm vắc-xin tế bào TKMX cho 114 người tình nguyện cho thấy tỷ lệ có phản ứng phụ thấp, 98% người

thử nghiệm có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và hiệu giá kháng thể cao kéo dài trong 5 tháng (theo [11])

Nhìn chung các nghiên cứu đều cho thấy hiệu quả bảo vệ của vắc-xin tế bào TKMX trên động vật thực nghiệm, trên người tình nguyện và trên lâm sàng đều đánh giá tốt Một số tác giả còn cho biết với chương trình phòng

chống NKBV, khi tiêm vắc-xin TKMX cho các bệnh nhân nằm điều trị tại

bệnh viện đã giải quyết được dịch NKBV do TKMX, giảm 4 lần tỷ lệ NKH trong thời gian áp dụng vắc-xin liệu pháp (theo [11])

1.3.1.2 V ắc-xin điều chế từ các thành phần khác của trực khuẩn mủ xanh

Trong số các loại vắc-xin điều chế từ các thành phần khác của TKMX như vắc-xin polysaccharide (LPS), vắc-xin LPS ngoại tiết, vắc-xin chế từ exotoxin A, từ flagella và pili thì vắc-xin protein màng ngoài được nghiên

cứu nhiều hơn cả Mặc dù đạt kết quả dự phòng trong thử nghiệm lâm sàng cùng với việc sử dụng huyết thanh kháng TKMX, nhưng vắc-xin LPS vẫn chưa được dùng phổ biến Để lý giải vấn đề này người ta có thể nghĩ tới bản

chất của LPS là nội độc tố, nên vắc-xin LPS sẽ gây nhiều phản ứng phụ khi tiêm

Trong những năm gần đây, khi đã có nhiều công trình nghiên cứu sâu

về các yếu tố độc lực và khả năng gây bệnh của TKMX thì một xu hướng sử

dụng nhiều thành phần khác nhau của TKMX để điều chế vắc-xin cộng hợp

đã được triển khai Schaad U.B (1991) đã chế tạo vắc-xin cộng hợp gồm LPS

của 8 type kháng nguyên O và toxin A Kết quả gây miễn dịch cho 22 bệnh nhân xơ phổi kén thấy: vắc-xin đã kích thích sinh kháng thể trung hoà toxin A

và kháng thể có vai trò opsonin hoá giúp cho các tế bào có thụ thể với Fc của

Ig như đại thực bào, tế bào NK, TCD8 tiếp cận và tiêu diệt vi khuẩn Cheng T.Y và cộng sự (1999) đã tổng hợp bằng phương pháp tái tổ hợp exotonin A

và protein màng ngoài tế bào I và F để chế tạo vắc-xin TKMX Trong thực nghiệm, các tác giả nhận thấy vắc-xin này có khả năng bảo vệ động vật khỏi

bị nhiễm TKMX (theo [11])

1.3.2 Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh

Phương pháp dùng huyết thanh và globulin miễn dịch tạo được miễn

dịch nhanh, trước khi có đáp ứng kháng thể sau tiêm vắc-xin, đáp ứng được yêu cầu phòng và điều trị trong những trường hợp khẩn cấp cho các đối tượng

có nguy cơ bị nhiễm khuẩn hoặc NKH do TKMX, và huyết thanh liệu pháp được xem như là một biện pháp điều trị hỗ trợ có hiệu quả

Jones R.J và Roe E.A (1980) đã dùng globulin miễn dịch kháng TKMX tiêm phòng cho 31 bệnh nhân bỏng Kết quả cho thấy vào ngày thứ 4 sau điều trị, tỷ lệ phân lập TKMX dương tính ở vết bỏng là 25%, so với 50%

ở nhóm chứng Đến ngày thứ 14, tỷ lệ này là 60% ở nhóm điều trị, so với 86% ở nhóm chứng [47]

Schiller B (1985) dùng chế phẩm sanoserum của Viện vắc-xin huyết thanh Ba Lan được tách chiết từ huyết thanh cừu theo phương pháp kết tủa

bằng ammonium sulfate bão hoà với hiệu giá 1/1600 điều trị cho 20 bệnh nhân bỏng (độ 3), tiêm bắp 5mL ngay sau khi bỏng và 4-5 ngày sau bỏng Kết

quả thấy giảm tỷ lệ biến chứng NKH, trong khi ở nhóm điều trị muộn (10-12 ngày sau bỏng) huyết thanh kháng TKMX không có tác dụng [88]

B ảng 1.1: Một số kết quả lâm sàng của huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh

1991 Kholodlova[58] -Nhiễm khuẩn vết

thương, viêm mủ màng phổi, viêm phúc mạc

- Giảm số lượng vi khuẩn, dấu hiệu lâm sàng tốt lên ở 61% bệnh nhân

1993 Moss R.B [70] -Xơ phổi kén - An toàn khi tiêm tĩnh mạch và cải

thiện chức năng hô hấp của bệnh nhân

1993 Stuttmann[97] -Bỏng hô hấp

-NKH bỏng

-Tỷ lệ tử vong ở nhóm điều trị: 35%

-Tỷ lệ tử vong ở nhóm chứng: 50% -Tỷ lệ tử vong ở nhóm điều trị: 56%

-Nhóm điều trị ngày thứ 9 không còn TKMX

-Nhóm chứng ngày thứ 21 vẫn còn TKMX

Nói chung các kết quả nghiên cứu về sử dụng huyết thanh và globulin

miễn dịch kháng TKMX trong thực nghiệm và lâm sàng đã gợi mở nhiều triển

vọng vào phương pháp điều trị này Tuy nhiên hiệu quả điều trị của huyết thanh và globulin miễn dịch kháng TKMX còn phụ thuộc vào các yếu tố như dùng sớm hay dùng muộn; có dùng kết hợp với kháng sinh còn nhạy cảm với

chủng vi khuẩn gây bệnh hay không; chất lượng và liều lượng huyết thanh

hoặc globulin miễn dịch dùng cho bệnh nhân [10], [97]

1.3.3 K ết hợp vắc-xin, huyết thanh và kháng sinh trong phòng và điều trị nhiễm khuẩn trực khuẩn mủ xanh

Bắt đầu từ những năm 1980 xu hướng kết hợp miễn dịch trị liệu và kháng sinh trong phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do TKMX đã được nghiên cứu và thu được nhiều kết quả tốt

Minukhin V.V (1986) đã phối hợp huyết thanh kháng TKMX và tobramycin để điều trị chuột nhắt NKH Tác giả dùng huyết thanh hiệu giá 1/160 tiêm ổ bụng kết hợp với tobramycin liều 0.2mg/kg/ngày×10 ngày/tiêm

bắp, tỷ lệ chuột sống sót là 100% so với nhóm chứng (chỉ tiêm kháng sinh) là 46,7% (theo [11])

Nghiên cứu của Nance F.C và cộng sự (1999) cho biết, khi dùng xin đa giá kháng TKMX kết hợp với kháng sinh có khả năng cải thiện được tỷ

vắc-lệ sống của chuột NKH do TKMX (theo [11])

Akiyama M và cộng sự (2000) cho thấy khi sử dụng kết hợp kháng

thể đơn clôn Mab (IgG 2a Mab Ld3 – 2F2 đặc hiệu với LPS type 1 của TKMX) với ceftazidime có tác dụng làm giảm một cách có ý nghĩa số lượng TKMX tại chỗ tiêm vào thời điểm 9 giờ sau khi công kích chủng vi khuẩn độc

lực so với việc điều trị đơn thuần 1 loại huyết thanh hoặc kháng sinh và so với nhóm chứng [25]

Tóm lại, trong số các xu hướng giải quyết các nhiễm khuẩn do TKMX gây nên, xu hướng ưu tiên về các biện pháp miễn dịch là sử dụng vắc-xin gây

miễn dịch chủ động và xu hướng thứ 2 là dùng huyết thanh hoặc globulin

miễn dịch kháng TKMX dạng tẩm đắp, dạng tiêm để phòng và điều trị các nhiễm khuẩn, đặc biệt là NKH do loài vi khuẩn này

1.4 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY)

B ẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI THU KHÁNG TH Ể ĐẶC HIỆU TỪ TRỨNG GÀ

phần khác tạo nên đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Sau mỗi lần đáp ứng với sự xâm nhập của kháng nguyên xâm

nhập vào cơ thể, các tế bào lympho T và B của gà cũng tạo ra các tế bào mang trí nhớ miễn dịch có khả năng nhận diện và đáp ứng nhanh, mạnh hơn khi có

sự tái xâm nhập của cùng kháng nguyên đó [40], [86], [93], [101]

Gà có 3 lớp kháng thể là IgM, IgA và IgY Trọng lượng phân tử và đặc điểm hình thái học và tính linh động của IgA và IgM ở gà là tương tự như các

lớp này ở động vật có vú So với IgM và IgA của gà, IgY của gà có trọng lượng phân tử thấp hơn, có trong máu gà và được chuyển qua chứa trong lòng

đỏ trứng, từ đó có tên gọi là kháng thể lòng đỏ trứng (egg yolk immunoglobulin: IgY) (Hình 1.2) [40], [85], [86]

Hình 1.2: H ệ thống kháng thể của gà mái

*Ngu ồn www.igybiotech.com

Theo Hamal và CS (2006) [42], năm 1893 Klemperer lần đầu tiên đã

mô tả khả năng miễn dịch thụ động thu được ở gà Ông đã chứng minh có sự

di truyền các yếu tố miễn dịch chống lại độc tố uốn ván từ gà mái sang gà con Khả năng miễn dịch này sau đó đã chứng minh có được là nhờ sự vận chuyển của kháng thể từ gà mẹ sang trứng và gà con Từ đó hầu hết các tài

liệu liên quan đến các kháng thể của gà đều đề cập đến việc vận chuyển của IgY từ máu gà mẹ sang tích lũy ở lòng đỏ trứng như một cơ chế miễn dịch thụ động được chuyển từ gà mẹ sang bảo vệ phôi gà và gà con IgY được vận chuyển từ máu gà mẹ sang gà con qua 2 bước:

- Bước 1: IgY được chuyển từ máu gà mái vào lòng đỏ trứng, tương tự như quá trình vận chuyển IgG qua nhau thai ở động vật có vú

- Bước 2: IgY được chuyển từ lòng đỏ trứng sang phôi trong quá trình phát triển của phôi gà

Sự tập trung IgY ở lòng đỏ trứng về cơ bản là thông qua sự chín của noãn bào Ở trong trứng IgY không tồn tại ở lòng trắng trong khi IgA và IgM

lại không có ở lòng đỏ trứng Lượng IgY được kết lại trong lòng đỏ trứng từ ngày thứ 7 trở đi cho đến ít nhất là ngày thứ 18 Trên noãn bào có các thụ thể (receptor) ái lực cao và thấp dành cho IgY IgY sẽ gắn kết với thụ thể đặc

hiệu của nó trên bề mặt noãn bào để chuyển từ máu gà mái sang trứng Khi

IgY đặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh thì sau 3 đến 4 ngày mới thấy IgY đặc hiệu đó xuất hiện trong lòng đỏ trứng [42], [54]

1.4 2 Kháng thể IgY

1.4.2.1 Cấu trúc và chức năng

Cấu trúc của IgY nói chung cũng giống như cấu trúc của IgG ở động

vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfua (-S-S-) Trọng lượng phân

tử của IgY là 180 kilo-dalton (kDa), lớn hơn so với IgG của động vật có vú (159 kDa) Chuỗi nhẹ L của IgY gồm một vùng thay đổi VL (variable region)

và một vùng hằng định CL (constant region) Chuỗi nặng H gồm một vùng thay đổi VH và bốn vùng hằng định ký hiệu từ Cν1 đến Cν4, với trọng lượng phân tử là 68 kDa (Hình 1.3) [34], [101]

Khác với chuỗi nặng của IgG, chuỗi nặng của IgY không có vùng bản

lề Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vùng Cν3, Cν4 của IgY tương tự như các vùng Cγ2 và Cγ3 của IgG còn vùng bản lề của IgG được thay bằng vùng Cν2

ở IgY, điều này làm cho chuỗi nặng của IgY kém linh hoạt hơn (Hình 1.3) Đây có thể là lý do làm cho IgY có nhiều đặc tính sinh học khác với IgG ở động vật có vú [34], [53], [101]

Tương tự như các kháng thể khác, IgY có khả năng trung hòa các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật Trong máu và trong dịch gian bào của gà, IgY đóng vai trò tương tự như IgG của động vật có vú IgY tham gia hoạt động opsonin hóa kháng nguyên, IgY gây ngưng tập kháng nguyên hữu hình,

kết tủa kháng nguyên hòa tan Tuy nhiên, khác với IgG, IgY không có vị trí

gắn bổ thể nên không gây hoạt hóa bổ thể của động vật có vú và không phản ứng với yếu tố dạng thấp Đây là những điểm lý tưởng khi sử dụng kháng thể IgY cho các ứng dụng điều trị cho người [34], [53], [101]

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử IgY của gà so với IgG của động vật có vú

*Ngu ồn: Schade và CS, 2005 [89]

1.4.2.2 Tách chi ết IgY từ lòng đỏ trứng gà

Thành phần chính của lòng đỏ trứng gà là lipid và protein Có thể chia các thành phần này thành 2 loại: phần hạt và phần plasma, trong đó phần plasma lại bao gồm phần lipoprotein tỷ trọng thấp và thành phần hòa tan trong nước IgY nằm trong phần hòa tan trong nước [89]

Có một số cách tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng như phương pháp gây

kết tủa phân đoạn bằng các loại muối, bằng đường, bằng ethanol, bằng polyethylene glycon (PEG); các phương pháp sắc ký; hoặc hòa tan bằng nước Tùy theo yêu cầu về độ tinh sạch của kháng thể, qui mô tách chiết, mục đích

sử dụng… người ta cân nhắc sử dụng phương pháp nào hoặc phối hợp các phương pháp với nhau [9], [13], [33], [52], [63]

1.4.3 Tí nh ưu việt của công nghệ sản xuất IgY

So với công nghệ sản xuất kháng thể IgG từ động vật có vú, công nghệ

sản xuất IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ

trứng gà có một số ưu điểm vượt trội [34], [89]

Do đặc tính sinh miễn dịch cao, gà có thể sản xuất kháng thể có hoạt tính cao chỉ cần sau 1 lần gây miễn dịch, nhưng để có kết quả tương tự như

vậy ở cừu thì phải gây miễn dịch 4 lần Sau khi gây miễn dịch nồng độ IgY trong huyết thanh cao nhất ở ngày 7 - 9 sau tiêm IgY được tìm thấy trong lòng đỏ trứng từ ngày thứ 4-7 sau khi xuất hiện trong huyết thanh

Vào thời kỳ gà đẻ ổn định, gà đẻ trứng đều đặn khoảng 20 quả/tháng, trong khi đó việc lấy máu số lượng lớn ở động vật có vú không được thường xuyên Lấy máu, đặc biệt là lấy số lượng lớn, luôn tiềm ẩn các nguy cơ đối

với sức khỏe của động vật Ngoài ra các yêu cầu về điều kiện vô trùng trong quá trình lấy và bảo quản máu tương đối phức tạp hơn so với thao tác với

Sản lượng kháng thể trong

Gắn với protein A/ protein G Có Không

Tương tác với yếu tố dạng

Hoạt hóa bổ thể ở động vật có

*Nguồn: Schade và CS, 2005 [89]

Sản lượng IgY thu được trung bình khoảng 100 mg/quả trứng Một năm gà đẻ khoảng 300 quả, tổng sản lượng IgY thu được từ 1 gà mái khoảng

30 gam IgY tinh khiết Lượng IgG thu được từ máu động vật có vú trung bình khoảng 5 mg/mL máu Tùy theo kích thước của động vật (thỏ, cừu,

ngựa…), sản lượng kháng thể mỗi năm thu được khác nhau Tổng sản lượng kháng thể thu được từ một gà mái trong 1 năm bằng lượng kháng thể từ một con cừu 100 kg hoặc một nửa con ngựa 200 kg tạo ra Với sản lượng kháng

thể tạo ra lớn như vậy người ta thấy giá thành của kháng thể gà rẻ hơn 10 lần

so với kháng thể thỏ

Khi sử dụng huyết thanh để điều trị cho người, các kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh phản ứng với các kháng nguyên của vi sinh vật trong cơ thể người thường tạo thành phức hợp miễn dịch Sự hình thành các phức hợp

miễn dịch là nguyên nhân dẫn đến hoạt hoá hệ thống bổ thể và tạo ra một số

phản ứng phụ của huyết thanh, trong đó có sốc phản vệ IgY khi vào cơ thể người không gây hoạt hoá bổ thể người như các kháng thể của động vật có vú

và do vậy IgY được coi là một loại kháng thể an toàn hơn so với IgG Bên

cạnh đó, có sự khác nhau rất lớn về mức độ tiến hóa giữa loài chim và loài động vật có vú so với 2 loài động vật có vú với nhau Chính sự khác nhau này

đã làm cho phản ứng chéo (cross- reactivity) giữa IgY và IgG ở động vật có

vú không xảy ra [34], [89]

Khi sử dụng IgY để phát triển các xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán, IgY cũng cho thấy có các ưu điểm như chúng không phản ứng với yếu tố

dạng thấp (yếu tố RF - rheumatoid factor) và kháng thể người kháng globulin

miễn dịch của chuột nhắt (HAMA - human anti-mouse IgG antibodies) là nguyên nhân gây ra các phản ứng âm tính hay dương tính giả trong các phản ứng miễn dịch Chính các yếu tố này còn là nguyên nhân cản trở sự kết hợp

của kháng thể vào kháng nguyên làm cho độ nhạy của phản ứng bị giảm đi [34], [89]

1.5 ỨNG DỤNG CỦA IgY

1.5 1 Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán

Do IgY có ái lực (affinity) và háo lực (avidity) với kháng nguyên cao, IgY là ứng viên lý tưởng để chế tạo các xét nghiệm miễn dịch có độ nhạy cao

Nhờ khoảng cách tiến hóa xa nhau giữa gà và các động vật có vú nên gà có

thể tạo ra kháng thể chống lại bất kỳ kháng nguyên nào của động vật có vú, bao gồm cả con người Hơn thế nữa, do gà có khả năng sinh kháng thể chống

lại nhiều loại kháng nguyên khác nhau, bao gồm cả các kháng nguyên có kích thước bé và tính sinh miễn dịch yếu như các hapten, cho phép sử dụng IgY để

chế tạo các sinh phẩm dùng trong xét nghiệm miễn dịch để phát hiện các phân tử nhỏ như các thuốc Nhờ các đặc tính này IgY đã được sử dụng rộng rãi trong việc chế tạo các sinh phẩm dùng trong xét nghiệm miễn dịch [34], [89]

Tương tự như IgG, phân tử IgY cũng dễ dàng gắn vào các phân tử khác như các enzym, các chất đánh dấu như biotin, các chất huỳnh quang Hoạt tính của IgY không bị thay đổi sau khi gắn đồng thời vẫn giữ được sau thời gian dài bảo quản Gần đây, IgY được dùng phối hợp với kháng thể đơn clôn

để làm xét nghiệm định type huyết thanh virus gây bệnh chân tay miệng [105] hoặc gắn với các ống nano carbone để phát hiện tế bào ung thư có kháng nguyên HER2 [112], độc tố Shigatoxin [79]

1.5 2 Ứng dụng của IgY trong dự phòng và điều trị bệnh

Trị liệu miễn dịch thụ động sử dụng kháng thể đặc hiệu đã được thực

hiện từ cuối thế kỷ XIX, đầu thế kỷ XX Cho đến nay, trị liệu bằng kháng thể đặc hiệu mới chủ yếu được thực hiện theo đường tiêm truyền Nguyên nhân chính cản trở việc sử dụng kháng thể để điều trị bằng các đường khác là giá thành kháng thể đơn clôn và kháng huyết thanh từ động vật có vú có giá thành

rất đắt [30]

Với sự gia tăng của vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng cao thì sự

cần thiết của việc đưa ra những kháng sinh mới cũng như những biện pháp điều trị mới là rất cấp thiết như liệu pháp miễn dịch sử dụng kháng thể Trứng không chỉ là thành phần dinh dưỡng cơ bản trong bữa ăn, giàu dinh dưỡng, không độc, nhờ các đặc điểm ưu việt của IgY nên việc ứng dụng IgY từ trứng trong điều trị càng trở nên thuyết phục [34]

Nhờ công nghệ sản xuất đơn giản cho sản lượng cao và giá thành thấp, IgY là ứng viên tiềm năng để sử dụng điều trị bằng các đường khác như đường tiêu hóa, dung dịch rửa và tẩm đắp vết thương Thông thường để điều

trị các tác nhân gây bệnh đường ruột thì các thuốc được đưa vào đường uống

là hiệu quả nhất, do tác động trực tiếp của thuốc đối với vi sinh vật có mặt trong đường tiêu hoá Đưa trực tiếp kháng thể đặc hiệu với các tác nhân gây

bệnh đường ruột vào ruột được xác định là một biện pháp rất hiệu quả, cung

cấp khả năng bảo vệ tức thì trước các tác nhân gây bệnh đường ruột cả trên động vật và trên người (đặc biệt là khi các vi sinh vật đã trở nên kháng kháng sinh) [30]

1.5.2.1 Ứng dụng trong dự phòng và điều trị bệnh cho động vật

Ứng dụng điều trị bằng IgY cho động vật, IgY đặc hiệu đã được chế tạo

và sử dụng để ngăn ngừa nhiễm Salmonella typhimurium hoặc

Staphylococcus dublin ở chuột hay bê IgY cũng được dùng để ngăn ngừa nhiễm Rotavirus (gây tiêu chảy), làm giảm tỷ lệ bệnh tiêu chảy cho động vật Ngoài ra, IgY còn được dùng để ngăn ngừa lây nhiễm những chủng bệnh khác ở gia cầm như chống lại Eimeria maxima lây từ gà mẹ sang gà con nên

đã giảm tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng ở gia cầm mới nở Gần đây IgY được chế

tạo để dự phòng và điều trị một số bệnh cho thủy sản như bệnh mủ gan ở cá tra cá ba sa [9], [12], [27], [31], [57], [67], [106], [113]

1.5.2.2 Ứng dụng của IgY trong dự phòng và điều trị bệnh cho người

IgY đã được chế tạo chống lại hàng loạt tác nhân gây bệnh nhiễm trùng đường ruột bao gồm các bệnh tiêu chảy do virus, bệnh chân tay miệng và vi

khuẩn đường ruột gây ra; bệnh đường hô hấp do virus cúm A H5N1 và H1N1 gây ra, đặc biệt khi dịch SARS xảy ra ở nhiều nước, năm 2005 các nhà khoa

học Trung Quốc đã thành công trong việc gây miễn dịch đặc hiệu với SPF (specific pathogens-free) chủng BJ01 ở gà, tách chiết và chứng minh được IgY chống lại SARS corona virus trong lòng đỏ trứng gà; bệnh do nấm

Candida albicans; các tác nhân gây nhiễm độc như nọc rắn và các độc tố có nguy cơ sử dụng như tác nhân vũ khí sinh học [37], [38], [45], [61], [75], [78], [79], [107], [112]

IgY kháng liên cầu khuẩn Streptococcus mutans (một tác nhân gây sâu

răng) đã được đưa vào nước súc miệng để dự phòng và tiêu diệt nhiễm vi khuẩn này dự phòng bệnh sâu răng [34], [53]

Các tác giả Nhật Bản và Hàn Quốc đã chế tạo IgY kháng vi khuẩn

Helicobacter pylori gây loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ dày IgY kháng urease

của vi khuẩn này đã được bổ sung vào sữa chua để dự phòng cho người chưa nhiễm và điều trị cho các bệnh nhân đã nhiễm [45], [74], [92], [114]

Tại Thụy Điển, Bộ Y tế Thụy Điển đã cho phép sử dụng IgY kháng TKMX cho các bệnh nhân mắc chứng xơ hóa phổi bằng cách xúc họng để dự phòng nhiễm loài vi khuẩn này, đặc biệt là dự phòng nhiễm khuẩn bệnh viện

do TKMX cho những bệnh nhân này [71], [72], [88]

Mặc dù mới có IgY kháng lại 3 tác nhân gây bệnh được sử dụng trên người, trong đó các ứng dụng vẫn ở mức dùng ngoài dưới dạng xúc họng

hoặc bổ sung vào thức ăn, IgY đã thu hút được sự chú ý lớn của các nhà nghiên cứu trên khắp thế giới Khả năng sử dụng IgY kháng TKMX để sử

dụng tại chỗ dưới dạng dung dịch thay băng và tẩm đắp vết thương là có tính

khả thi, góp phần tạo ra một chế phẩm mới cho công cuộc kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện vốn đang là vấn đề bức xúc hiện nay

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Động vật để gây miễn dịch tạo IgY đặc hiệu kháng trực khuẩn mủ xanh

12 gà mái giống Ai Cập, cân nặng từ 1,3 ± 0,2 kg/con, ở độ tuổi chuẩn

bị đẻ trứng được cung cấp từ Viện Chăn nuôi Quốc Gia Toàn bộ gà được nuôi trong cùng điều kiện dư thừa thức ăn và nước uống, thời gian chiếu sáng 12/24 tiếng bằng ánh sáng tự nhiên tại Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm,

Học viện Quân y Hàng ngày gà được vệ sinh chuồng trại, cho ăn uống và theo dõi tình trạng sức khoẻ chung cũng như tình trạng đẻ trứng Trứng gà khi

đẻ được thu hoạch, đánh dấu số gà và ngày đẻ trứng sau đó được bảo quản ở 4°C cho đến khi sử dụng

Hình 2.1: Gà mái gây mi ễn dịch chế tạo IgY kháng trực khuẩn mủ xanh

2.1.2 Động vật để gây bỏng thực nghiệm và lây nhiễm trực khuẩn mủ xanh

16 thỏ đực, cân nặng trung bình 2,0 ± 0,2 kg/con

Thỏ được nuôi trong điều kiện vệ sinh sạch sẽ, đầy đủ thức ăn, nước

uống và chiếu sáng tự nhiên tại Trung tâm nghiên cứu y dược học Quân sự,

Học viện Quân y trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm

2.2 V ẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Trực khuẩn mủ xanh

Các chủng TKMX được sử dụng để chế tạo kháng nguyên gây miễn

dịch là sản phẩm của các công trình nghiên cứu trước đây do Bộ môn Khoa

Vi sinh y học, Học viện Quân y cung cấp, bao gồm 07 chủng có ký hiệu:

chất OPD (Sigma), Protein chuẩn, Acrylamide, APS, TEMED, (NH4)2SO4, Phenol, PBS, BSA (Merck), Kit Bradford (Biorad), và các hóa chất dung môi khác đều đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

- Các dụng cụ vật tư tiêu hao để tách chiết kháng thể IgY từ trứng gà:

Cột Sắc ký‎ trao đổi Ion (BioRad), màng thẩm tích, màng lọc Whatman No1, Plate ELISA 96 giếng

2.2.3 Thiết bị máy móc

- Cân điện tử, máy khuấy từ, máy đo pH, pipetman các loại

- Máy ly tâm lạnh (Hiteach, Đức)

- Máy đo độ đục chuẩn Mc-Farland của hãng BioMerieux (Pháp)

- Máy lắc Vortex của hãng Satorius (Đức)

- Máy sắc ký trao đổi ion áp suất thấp Biologic-LP (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy đo quang phổ DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ)

- Máy điện di SDS-PAGE và chuyển màng (Bio-Rad, Mỹ)

- Tủ nuôi cấy vi sinh ( Trung quốc)

- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss, Đức)

- Tủ Lạnh -20o

C (Sanyo, Nhật)

- Bộ dụng cụ chuyên dụng để gây bỏng cho thỏ

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chế tạo kháng nguyên tế bào trực khuẩn mủ xanh từ các chủng dự tuyển

Kháng nguyên tế bào TKMX được chế tạo theo phương pháp dùng phenol của Sonnenwirth (1970) [theo 11] Mục đích của phương pháp này là

bất hoạt vi khuẩn với các bước tiến hành gồm:

- Tạo sinh khối các chủng TKMX, thu hoạch sinh khối

- Xử lý bất hoạt TKMX với dung dịch phenol 0,5% trong nước muối sinh

lý ở 37 °C trong 24 giờ và điều chỉnh về nồng độ 109

vi khuẩn/mL

- Kiểm tra tiêu chuẩn của kháng nguyên tế bào TKMX về độ vô trùng, an toàn, độc tính, tính sinh miễn dịch, khả năng gây sốt

- Trộn đều các chủng vi khuẩn theo tỷ lệ tương đương về thể tích và số lượng vi khuẩn Hỗn hợp vi khuẩn bất hoạt được trộn với tá chất Freund theo

tỷ lệ 1:1 về thể tích để tạo thành huyền dịch kháng nguyên để gây miễn dịch

2.3.2 Gây miễn dịch

Sau khi nuôi cho gà thích nghi với điều kiện chuồng nuôi mới trong 2

tuần, tiến hành gây miễn dịch theo qui trình gây miễn dịch đã được các tác giả

ở Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y thử nghiệm: tiêm 0,5 mL kháng nguyên/gà dưới da ngực chia làm nhiều mũi và tiêm nhắc lại 5 lần Khoảng cách giữa các lần tiêm là 3 tuần với nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch là:

- Lô chứng âm (03 gà): không gây miễn dịch

Mũi gây miễn dịch lần đầu tiên sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh, các mũi tiêm sau sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh theo qui trình đã được

Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y đã khảo sát ứng dụng và tối ưu hóa [12]