Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chuẩn đoán rắn độc cắn ở việt nam

luận văn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rắn độc cắn là một trong những tai nạn nguy hiểm thường gặp ở cácnước nhiệt đới, với trên 2,5 triệu người bị rắn độc cắn và khoảng 125.000người tử vong do rắn độc cắn mỗi năm[39], [40], [66], [68], [121].Ở nước ta,các chuyên gia ước tính mỗi năm có khoảng 30.000 người bị rắn cắn nhưngphần lớn không được báo cáo ghi nhận đầy đủ do nạn nhân tử vong trước khikịp đến cơ sở y tế hoặc được cấp cứu và điều trị theo các biện pháp dân gian[wilken] Thống kê số liệu của gần hai nghìn bệnh nhân rắn độc cắn nhậpviện, các chuyên gia của Bệnh viện Chợ Rẫy nhận định một số loài rắn độcthường gây tai nạn rắn cắn nhất ở khu vực Miền Nam nước ta là rắn lục xanh(43,3%), hổ đất (23,8%), chàm quạp (19,4%), hổ mèo (10%) và hổ chúa(1,2%) [77]

Nhiễm độc nọc rắn nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tửvong hoặc để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sốngcủa nạn nhân sau khi sống sót [39] Theo Tổ chức Y tế Thế giới, phương phápđiều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn là huyết thanhkháng nọc rắn (HTKNR) [114] Ở Việt Nam, đã có 2 loại HTKNR thươngphẩm được sử dụng trên lâm sàng đó là huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh

và hổ đất do Viện vắc xin và Sinh phẩm y tế (IVAC) ở Nha Trang sản xuất.Tuy nhiên, việc sử dụng 2 loại huyết thanh kháng nọc rắn đơn đặc hiệu nàychỉ thực sự hiệu quả khi xác định sớm và chính xác loài rắn độc đã gây ra tainạn rắn cắn [2] Cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ratai nạn rắn cắn để sử dụng HTKNR chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng,

do đó thường bị hạn chế và chỉ được thực hiện ở các bệnh viện tuyến cuối nơi

có các chuyên gia nhiều kinh nghiệm

Hiện nay trên thế giới đã có một số loại xét nghiệm được dùng để pháthiện nọc rắn độc của Úc, Ấn Độ và Đài Loan ngay trên thực địa và lâm sàng

tại các nước này Tuy nhiên, do đặc điểm địa lý khác nhau nên có sự phân bốcác loài rắn khác nhau giữa các vùng địa lý Từ đó, xét nghiệm phát hiện nọccủa loài rắn độc có ở khu vực này không sử dụng được để phát hiện nọc củaloài rắn có ở khu vực khác [15], [56] Do vậy, cần phải phát triển các xétnghiệm phát hiện riêng nọc rắn của các loài rắn độc sinh sống ở Việt Nam màcho tới nay nước ta vẫn chưa có [5].

Bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc là bộ xét nghiệm cấp cứu; Ngoàikhả năng phát hiện nhanh và chính xác nọc độc, bộ xét nghiệm này còn đòihỏi phải đơn giản, dễ sử dụng, bền vững trong các điều kiện bảo quản và sửdụng ở thực địa, nơi có trang thiết bị tối thiểu Với các lý do trên, kỹ thuật hấpphụ miễn dịch gắn enzym (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)thường được áp dụng cho mục đích này Trong các dạng xét nghiệm ELISA,thì ELISA sandwich sử dụng hệ khuếch đại avidin-biotin (AB-ELISA) vàELISA sandwich sử dụng kháng thể thứ ba gắn enzym (AbE-ELISA) là haidạng thiết kế được ứng dụng nhiều nhất trong phát triển bộ xét nghiệm pháthiện nọc rắn độc

Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam” được tiến hành nhằm:

1 Chế tạo bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc của 4 loài rắn lụcxanh, hổ đất, chàm quạp, hổ chúa và phát triển bộ xét nghiệm AbE-ELISAphát hiện nọc độc của 2 loài rắn lục xanh và hổ đất ở Việt Nam

2 Đánh giá hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc của bộ xét nghiệmELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 TAI NẠN RẮN CẮN VÀ CHẨN ĐOÁN RẮN ĐỘC CẮN

1.1.1 Một số loài rắn độc thường gặp gây ra tai nạn rắn cắn ở Việt Nam

Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới với địa hình và khí hậukhác nhau giữa các miền Bắc, Trung, Nam Từ đặc điểm tự nhiên đó đã tạonên sự đa dạng sinh học ở nước ta, trong đó có sự đa dạng về các loài rắnđộc Theo Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng (1995), Việt Nam có hơn mộttrăm loài rắn, trong đó có hàng chục loài rắn độc phân bố cả trên cạn và dướinước [8] Trong đó, một số loài rắn độc thường gặp gây ra tai nạn rắn độc cắn

Rắn lục xanh (Trimeresurus stejnegeri K Schmidt, 1925) là loài rắn có

chiều dài dưới 1 m, sống ở trên cây, phần trước cơ thể nhỏ phân biệt rất rõ với

cổ, có hố má Mặt lưng màu xanh lá cây, mặt bụng màu xanh lá cây nhạt hơn.Dọc bên thân có thể có đường màu trắng hay vàng, ở cá thể đực đường nàythường có màu đỏ Mỗi lứa đẻ có từ 3 đến 10 rắn con; rắn sơ sinh trông giốngrắn trưởng thành Có nọc độc và nguy hiểm [8]

Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độccắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn lụcxanh cắn chiếm tỷ lệ 43,3% là loài rắn gây ra tai nạn rắn độc cắn nhiều nhấttrong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiên cứu [77]

1.1.1.2 Rắn hổ đất (Naja naja kaouthia)

Hình 1.2 Rắn hổ đất

*Nguồn: theo Lê Văn Đông (2010) [4].

Rắn hổ đất (Naja naja kouthia Linnaeus 1758) ở miền Nam Việt Nam

là loài rắn cỡ lớn, đầu không phân biệt với cổ, không có vảy má Rắn có khảnăng bạnh cổ khi bị kích thích, khi đó ở phía trên cổ trông rõ một vòng trònmàu trắng Rắn hổ miền Bắc Việt Nam (từ Đà Nẵng trở ra), ở hai bên vòngtròn có giải màu trắng (gọi là gọng kính) Lưng có màu nâu thẫm, vàng lụchay đen, hoặc đồng màu hoặc có những dải hoa văn như những vạch ngangđơn hoặc kép sáng màu hơn Chiều dài cơ thể tới 200 cm [8]

Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độccắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn hổđất cắn chiếm tỷ lệ 23,8 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiêncứu [77]

1.1.1.3 Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma)

Hình 1.3 Rắn chàm quạp

*Nguồn theo Lê Văn Đông ( 2010) [4]

Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma, Boie, in Boie, 1827) là loài

rắn có chiều dài khoảng 100cm với chín vảy che rắn chắc và cân đối ở phía

trên đỉnh đầu Mõm nhọn và chĩa lên phía trên Sống mũi kéo dài từ mắt đếnmõm Thân không dày lắm, các vảy trơn nhẵn Hoa văn trên thân gồm từ 19đến 31 dấu hình tam giác màu nâu thẫm viền trắng sắp xếp thành từng đôihoặc đối diện nhau hoặc xen kẻ Các con cái đẻ từ 13 đến 30 trứng và canhgiữ trong suốt khoảng thời gian từ 5 đến 7 tuần lễ ấp trứng Rắn con dài từ 13

- 20cm trông giống như rắn trưởng thành [8]

Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độccắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắnchàm quạp cắn chiếm tỷ lệ 19,4 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn đượcnghiên cứu [77]

1.1.1.4 Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis)

Hình 1.4 Rắn hổ mèo

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến (2003) [77].

Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) là loài rắn có đầu không phân biệt

với cổ, không có vảy má Rắn có khả năng bạnh cổ khi bị kích thích, khi đó ở

phía trên cổ nhìn rõ hai vòng tròn cân đối ở hai bên (giống hai mắt kính nêncòn gọi là rắn mắt kính) được nối với nhau bởi một vệt hoa văn hình chữ V(giống gọng kính hình chữ V) Lưng có màu nâu thẫm, vàng lục hay đen,hoặc đồng màu Chiều dài cơ thể tới 160 cm, chiều dài trung bình khoảng 90– 120 cm Rắn con non mới nở có hình dạng giống rắn trưởng thành và có khảnăng bạnh cổ [8].

Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độccắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn hổmèo cắn chiếm tỷ lệ 10 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiêncứu [77]

1.1.1.5 Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)

Hình 1.5 Rắn hổ chúa

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến (2003) [77].

Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah Cantor, 1836) là loài rắn độc

có kích thước lớn nhất, chúng có khả năng bạnh cổ song không bạnh to đượcbằng rắn hổ mang thường Mặt trên đầu rắn hổ chúa có 2 tấm vảy chấm lớn.Lưng rắn trưởng thành có màu vàng lục hay nâu nhiều khi chỉ có màu đen chì

Cá thể non lưng có màu đen với nhiều vệt ngang sáng, ở cổ có hình chữ Vngược màu vàng nhạt Chiều dài cơ thể khoảng 300 – 400 cm, có khi đạt tới

Tại nước ta, về mặt dịch tễ học, chưa có khảo sát ở cấp độ quốc gia nàođược thực hiện để ước tính tỉ lệ bệnh nhân bị rắn cắn thực tế Theo nghiên cứucủa Lê Khắc Quyến năm 2003 cho thấy tai nạn rắn cắn xảy ra ở hầu hết cácvùng trong cả nước [77] Số liệu từ 3 bệnh viện đa khoa khu vực cho thấy sốtrường hợp rắn cắn điều trị tại các bệnh viện này là các con số đáng kể Tại

bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội năm 2001 có 155 trường hợp và năm 2002 có

129 trường hợp bị rắn cắn nhập viện Tại Bệnh viện 17 Đà Nẵng năm 1991 có

84 bệnh nhân bị rắn cắn Tại bệnh viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh hàngnăm có từ 600 đến 1.000 ca rắn cắn nhập viện [77]

Các triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm độc do rắn cắn rất đadạng, phong phú, bao gồm các triệu chứng tại chỗ và toàn thân Các triệuchứng phụ thuộc vào loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn và lượng nọc rắnđộc xâm nhập vào trong cơ thể nạn nhân Trong đó, những bệnh nhân bị cácloài rắn hổ cắn với biểu hiện tại chỗ rất mờ nhạt, hầu như chỉ xác nhận có dấurăng và có móc độc tại chỗ vết cắn Theo Nguyễn Kim Sơn năm 2008, dấuhiệu có dấu răng và có móc độc tại chỗ vết cắn chiếm tỷ lệ là 56,6 % trongtổng số 380 bệnh nhân bị rắn hổ cắn điều trị tại khoa hồi sức cấp cứu A9 vàTrung tâm Chống độc Bệnh viện Bạch Mai [7] Riêng bệnh nhân bị rắn hổmèo cắn có biểu hiện sưng nề lan rộng, viêm hoại tử tổ chức xung quanh vếtcắn rất mạnh, có thể có sốt và rối loạn tiêu hóa Toàn thân có thể có hội chứngnhiễm độc thần kinh với biểu hiện ý thức từ lơ mơ đến hôn mê Có thể có biểuhiện suy hô hấp ở các mức độ khác nhau, trường hợp nặng có thể gây ngừngthở dẫn đến tử vong nếu không được điều trị kịp thời [5], [90] Các bệnh nhânnhiễm độc do các loài rắn thuộc họ rắn lục cắn thường có biểu hiện tổnthương tại chỗ rõ ràng hơn như chảy máu tại vết cắn, sưng nề, bóng nước vànhiễm trùng xung quanh vết cắn Toàn thân có thể có biểu hiện xuất huyếtdưới da và xuất huyết đa cơ quan hay gặp ở bệnh nhân bị rắn chàm quạp cắn.Xét nghiệm đông máu 20 phút tại giường cho kết quả dương tính chiếm tỷ lệ46,5 % [7] Bệnh nhân có thể có biểu hiện rối loạn đông máu toàn bộ nhưgiảm tiểu cầu, thời gian co cục máu đông kéo dài [77], [91] Tuy nhiên, cácxét nghiệm nói trên chỉ có giá trị trong xác định triệu chứng rối loạn đôngmáu của bệnh nhân mà không có giá trị trong chẩn đoán xác định loài rắn cắntrên lâm sàng

Theo WHO, đến nay huyết thanh kháng nọc rắn vẫn là loại thuốc điềutrị đặc hiệu và hiệu quả nhất cho các nạn nhân bị rắn độc cắn Liều khởi đầuHTKNR cần được sử dụng càng sớm càng tốt theo đường tiêm truyền tĩnhmạch với tốc độ là 1 ml/phút Liều tiếp theo HTKNR được nhắc lại sau 3 giờnếu chưa thấy dấu hiệu lâm sàng cải thiện rõ rệt [114] HTKNR không có liềugiới hạn tối đa, tùy thuộc tình trạng cải thiện nhiễm độc trên lâm sàng [11].

HTKNR tiêm dưới da, xung quanh vết cắn có hiệu quả giảm đau đáng

kể nên được khuyến cáo sử dụng Việc sử dụng HTKNR không phụ thuộc vàothời gian nhập viện của bệnh nhân mà căn cứ vào thực tế mức độ nhiễm độctrên lâm sàng và kết quả xét nghiệm phát hiện nọc độc của từng bệnh nhân.Thời gian trung bình từ khi bị rắn cắn đến khi tử vong là 8 giờ với rắn hổ(giới hạn từ 12 phút đến 120 giờ), ba ngày (giới hạn từ 15 phút đến 264 giờ)với rắn lục Nhiều bệnh nhân rắn cắn nhập viện muộn sau 10 ngày, khi đượcđiều trị HTKNR vẫn có hiệu quả tốt [34], [77]

HTKNR trung hòa nọc độc theo các cơ chế: kết hợp trực tiếp với nọcđộc, ngăn cản độc tố tiến tới tế bào đích; làm tăng cường quá trình thực bào

và kích hoạt hệ thống bổ thể Hồng cầu với thụ thể CR1 (CR1 receptor) được

hỗ trợ bởi phân tử C3b bổ thể đóng vai trò quan trọng trong cơ chế thải loạinọc độc sau khi đã bị cố định bởi HTKNR Trong đó kháng nguyên (nọc độc)+ kháng thể (HTKNR) tạo thành phức hợp miễn dịch sẽ gắn với hồng cầuthông qua thụ thể CR1 và bị đại thực bào bắt giữ, xử lý và loại bỏ khỏi cơ thể.Điều đáng lưu ý là các độc tố hoại tử mô, độc tố thận, độc tố cơ….độc tố tiềnsynape và độc tố hậu synape chuỗi dài khi đã gắn vào tế bào đích thì HTKNRkhông thể tách độc tố ra khỏi tế bào đích Mặt khác, HTKNR có thể trung hòacác độc tố hemorrhagins và độc tố hậu synape chuỗi ngắn để giải phóng tếbào đích [11], [64], [65]

Ở Việt Nam, tuy là nước đầu tiên phát minh ra huyết thanh kháng nọcrắn (1892) tại Viện Paster Sài Gòn bởi bác sĩ Albert Calmette Nhưng từ đó

đến năm 1990 chúng ta không có huyết thanh kháng nọc rắn để điều trị chobệnh nhân Năm 1991, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã chế tạo thành cônghuyết thanh kháng nọc rắn hổ đất ứng dụng điều trị trên lâm sàng Từ đó đếnnay, có nhiều cơ sở trong nước sản xuất các loại huyết thanh kháng nọc rắnđặc hiệu ứng dụng trong điều trị như huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh,huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất do Viện vắc xin và Sinh phẩm y tế (IVAC)tại Nha Trang sản xuất và huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia, hổ chúa dotrung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai sản xuất [10], [11] Tuy nhiên, việcchỉ định sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn trong điều trị cho bệnh nhân bịnhiễm độc rắn cắn còn nhiều hạn chế, chủ yếu vẫn dựa vào lâm sàng và phảiđợi đến khi triệu chứng rõ ràng mới có chỉ định sử dụng HTKNR nên thườngchậm và trong một số trường hợp không hiệu quả khi mà các độc tố tiềnsynape và hậu synape chuỗi dài đã gắn vào tế bào đích Để khắc phục hạn chếnêu trên, cần phải có bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc để chẩn đoán sớmloài rắn độc cắn và theo dõi mức độ nhiễm độc giúp các nhà lâm sàng chỉđịnh sử dụng HTKNR sớm và chính xác.

1.1.3 Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam

Chẩn đoán rắn độc cắn bao gồm chẩn đoán phân biệt loài rắn độc vàchẩn đoán mức độ nhiễm độc do rắn cắn, ở Việt Nam chủ yếu vẫn dựa vàotriệu chứng lâm sàng là chính [5]

Chẩn đoán phân biệt loài rắn độc cắn dựa vào:

- Mô tả của bệnh nhân hoặc người đi cùng về tình huống bị cắn và đặc điểmcon rắn gây tai nạn do họ nhìn thấy hoặc bắt được mang theo đến bệnh viện

- Dấu vết móc độc

- Biểu hiện nhiễm độc tại chỗ quanh vết cắn và nhiễm độc toàn thân

- Khả năng nhận biết loài rắn độc của bác sĩ điều trị, khi bệnh nhân có đemtheo con rắn lúc nhập viện

- Hiệu quả điều trị HTKNR đơn đặc hiệu trên bệnh nhân bị rắn cắn

Chẩn đoán mức độ nhiễm độc do rắn cắn dựa vào:

- Xác nhận có vị trí vết cắn, đôi khi nhìn thấy dấu vết của móc độc tại vị trívết cắn

- Biểu hiện nhiễm độc tại chỗ quanh vết cắn thường gặp ở những bệnh nhân

bị cắn bởi các loài rắn thuộc họ rắn lục như rắn lục xanh, rắn chàm quạp các triệu chứng có thể gặp như sưng nề, chảy máu, đau buốt, phỏng huyếtthanh, hoại tử tổ chức [77], [112] Tình trạng nhiễm độc tại chỗ đặc biệtnghiêm trọng gặp ở những bệnh nhân bị rắn hổ mèo cắn, tổn thương hoại tửlan rộng xung quanh vết cắn, thậm trí còn gây hoại tử chi dẫn đến phải phẫuthuật cắt cụt chi trong điều trị Tuy nhiên, các biểu hiện nhiễm độc tại chỗ lạirất hiếm gặp ở những bệnh nhân bị rắn hổ đất và rắn hổ chúa cắn Ở nhữngbệnh nhân bị rắn hổ đất và hổ chúa cắn thường chỉ xác nhận có vị trí vết cắnnhưng tổ chức da xung quanh vết cắn hầu như không có tổn thương [77]

- Biểu hiện nhiễm độc toàn thân rất đa dạng, tùy thuộc vào loài rắn cắn vàlượng nọc độc có trong cơ thể Bệnh nhân bị các loài rắn thuộc họ rắn lục cắn

có thể có biểu hiện rối loạn đông máu cả trên lâm sàng và cận lâm sàng, cóthể có tổn thương thận hoặc không Trong khi đó, bệnh nhân bị các loài rắn

hổ cắn chủ yếu là nhiễm độc thần kinh với các biểu hiện từ nhẹ đến co giật,hôn mê Có thể có biểu hiện suy hô hấp, nặng có thể gây ngừng thở nếukhông được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong [5] Nọc rắn độc sau khixâm nhập vào cơ thể nạn nhân có thể khu trú ở nhiều cơ quan đích và gây tổnthương đa cơ quan Jacoby-Alner và cộng sự (2011) đã chứng minh được nọcrắn độc khu trú ở trong phổi, thận và mô cơ [58]

Do chẩn đoán chủ yếu dựa vào lâm sàng nên vẫn còn rất nhiều hạn chếtrong điều trị rắn cắn: đa số trường hợp thường đến muộn, nhiễm độc nặng dokhông được sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn kịp thời Nhiều bệnh nhân saukhi bị rắn cắn được điều trị theo cách cổ truyền và nhiều người đã chết tại nhà

hoặc trên đường vận chuyển về trung tâm y tế mà không được thông báo [77].Bên cạnh đó, rắn cắn là một tai nạn thường gây hoảng loạn cho bệnh nhân dẫnđến những mô tả sai lệch về tình huống bị cắn và con rắn gây tai nạn Rất íttrường hợp bệnh nhân có thể mang theo con rắn gây tai nạn Kể cả trongtrường hợp bệnh nhân mang theo con rắn gây tai nạn đến bệnh viện thì hiểubiết của nhân viên y tế về phân loại rắn cũng còn có phần hạn chế Do đónhững bệnh nhân rắn cắn thường được xử lý và điều trị chậm trễ hoặc xử lýkhông đúng, dẫn đến tỉ lệ tử vong cao hay để lại những di chứng nặng nề chocác bệnh nhân còn sống sót Nếu như chúng ta có được bộ xét nghiệm pháthiện nọc rắn độc giúp chẩn đoán sớm và chính xác loài rắn độc cắn, làm căn

cứ chỉ định sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn sớm thì sẽ mang lại hiệu quảđiều trị tốt hơn và giảm số ca tử vong do rắn độc cắn [5]

Cho đến nay ở Việt Nam vẫn chưa có bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắnđộc nào được nghiên cứu và ứng dụng trên lâm sàng trong chẩn đoán xác địnhloài rắn cắn [4] Vì vậy, chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc ứngdụng trong chẩn đoán loài rắn độc cắn ở Việt Nam là yêu cầu cần thiết [5]

1.2 KHÁNG THỂ KHÁNG NỌC RẮN VÀ MỘT SỐ KỸ THUẬT MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN NỌC RẮN ĐỘC

1.2.1 Kháng thể kháng nọc rắn

1.2.1.1 Đặc điểm cấu tạo kháng thể kháng nọc rắn

Kháng thể kháng nọc rắn (KTKNR) có bản chất là globulin miễn dịch(chủ yếu là IgG) phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn (KNNR) đãmiễn dịch trên động vật tạo ra chúng hoặc được tạo ra sau khi bị rắn cắn.Victor Morais và cs (2012) đã phát hiện được kháng thể IgG kháng nọc rắnhình thành ở hai bệnh nhân bị rắn cắn tại Uruguay [118]

Cấu tạo kháng thể kháng nọc rắn giống cấu tạo của phân tử IgG ở độngvật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light

chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfide (-S-S-) Trọng lượng phân

tử của IgG khoảng 150 kilo-dalton (kDa) Chuỗi nhẹ L của IgG gồm mộtvùng thay đổi VL (variable region) và một vùng hằng định CL (constantregion) Chuỗi nặng H gồm một vùng thay đổi VH và ba vùng hằng định kýhiệu từ Cγ1 đến Cγ3 (hình 1.6) [3], [12]

Hình 1.6 Cấu tạo phân tử IgG của động vật có vú

*Nguồn: Goldsby et al., Kuby Immunology 5 th Ed., (2003) [3]

1.2.1.2 Sản xuất kháng thể kháng nọc rắn

- Kháng nguyên nọc rắn độc

Nọc của các loại rắn độc đa phần có bản chất là các protein có trọnglượng phân tử lớn khoảng từ 50 – 125 Kda, đó là hỗn hợp các độc tố, bao gồmcác protein có hoạt tính enzyme và không có hoạt tính enzyme [33], [87].Trong đó, nọc của các loài rắn hổ thể hiện hoạt tính enzyme esterase, còn nọccủa các loài rắn lục lại có hoạt tính mạnh với các enzyme proteolytic [37].Hầu hết độc tố nọc rắn biểu hiện tác dụng dược lý theo đặc trưng của từngloài rắn Độc tố đầu tiên được phân lập từ nọc rắn đó là Crotoxin [42], từ đóđến nay nhiều độc tố khác đã được xác định và phân lập từ hỗn hợp protein

nọc rắn như phospholipase A2 hoặc những phân tử giống phospholipase A2[49], [69], [101], [111] Điều đáng quan tâm ở đây đó là người ta đã phân lậpđược những thành phần độc tố giống nhau từ nọc độc của các loài rắn khácnhau hay nói cách khác ở những loài rắn khác nhau có các thành phần proteingiống nhau [25], [86], [106] Do vậy, khi sử dụng kháng nguyên nọc rắn độctoàn thể gây miễn dịch để chế tạo huyết thanh hoặc kháng thể kháng nọc rắnđặc hiệu loài rắn thì sản phẩm thu được luôn có phản ứng chéo với một sốthành phần độc tố có trong nọc độc ở một số loài rắn khác và sẽ làm giảm tínhđặc hiệu loài của huyết thanh hoặc kháng thể kháng nọc rắn Các nghiên cứucủa Lê Văn Đông và Cs (2003) cho thấy, để có được sản phẩm huyết thanh vàkháng thể kháng nọc rắn đặc hiệu loài cao cần phải tiến hành tinh sạch huyếtthanh và kháng thể kháng nọc rắn thu được sau gây miễn dịch [80].

Người ta có thể sử dụng độc tố đơn thành phần của nọc rắn dùng làmkháng nguyên Beata Halassy và cộng sự (2010; 2011) khi nghiên cứu vềthành phần độc tố và tính sinh miễn dịch của nọc rắn thuộc loài rắn lục

ammodytes ammodytes nhận thấy rằng thành phần độc tố Ammodytoxin quyết

định tính sinh miễn dịch và đặc hiệu loài khi gây miễn dịch tạo huyêt thanhkháng nọc độc của loài rắn này trên thỏ [19], [20] Nhưng phổ biến hơn cảvẫn là sử dụng nọc rắn độc toàn thể dùng làm kháng nguyên có phối hợp vớicác tá chất [11], [114] Các tá chất dùng chế tạo kháng nguyên gồm nhiềuloại như: Freund hoàn chỉnh, Freund không hoàn chỉnh, Aluminum Sulfat,Nanoparticle IMS 3012 [18] Trong đó, tá chất Freund hoàn chỉnh và Freundkhông hoàn chỉnh là hai loại tá chất được các tác giả sử dụng nhiều nhất trongchế tạo kháng nguyên nọc rắn [114]

- Gây miễn dịch cho động vật

Cách gây miễn dịch có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả sinh khángthể đặc hiệu Cách gây miễn dịch phổ biến nhất đó là: sử dụng kháng nguyênliều thấp, thể tích nhỏ, tiêm nhiều vị trí và tiêm nhắc lại nhiều lần Charoonroj

Chotwiwatthanakun và Cs (2001) đã sử dụng cách gây miễn dịch này chế tạothành công kháng thể kháng nọc rắn đa giá đặc hiệu với nọc độc của 3 loài rắn

hổ ở Thái Lan [31] Tiếp sau đó, các tác giả Supod Sriprapat (2003), El-Kady(2009) và Kavi Ratanabanangkoon (2010) cũng đã sử dụng cách gây miễndịch này chế tạo thành công nhiều loại kháng thể và huyết thang kháng nọcrắn [43], [71], [109] Nhìn chung, mỗi nghiên cứu đều tối ưu hóa qui trìnhgây miễn dịch cho phù hợp với loại kháng nguyên và cân nặng của động vậtcần gây miễn dịch Đa số các nghiên cứu sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnhcho mũi tiêm đầu tiên còn các mũi sau sử dụng tá chất Freund không hoànchỉnh [35], [80] Tuy nhiên, tùy theo đặc điểm của kháng nguyên, có nghiêncứu sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh cho mũi đầu còn các mũi saukhông dùng tá chất [45]

Liều gây miễn dịch có thể dao động từ 10 ng -1 mg (nhưng phổ biếntrong khoảng 10 µg – 100 µg/kg) Liều gây miễn dịch phụ thuộc vào độc tính,tính sinh miễn dịch của kháng nguyên và đáp ứng của loài động vật được sửdụng để gây miễn dịch [14], [45], [93]

Lựa chọn động vật gây miễn dịch có thể là: ngựa, cừu, lạc đà, thỏ, gàmái, ngỗng nhưng phổ biến hơn cả vẫn là thỏ và gà mái vì dễ triển khai vàphù hợp với các nghiên cứu thử nghiệm quy mô nhỏ [17], [27], [38], [80]

- Huyết thanh kháng nọc rắn sau gây miễn dịch

Huyết thanh kháng nọc rắn có thể là HTKNR đơn giá (monovalent)hoặc là HTKNR đa giá (polyvalent) HTKNR đơn giá hay còn gọi là HTKNRđơn đặc hiệu (monospecific) là loại huyết thanh kháng nọc rắn được tạo rabằng cách gây miễn dịch với nọc độc chỉ của một loài rắn [35], [84], [114] ỞViệt Nam, đây là loại huyết thanh phổ biến nhất đang sử dụng trên lâm sàngnhư: huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh và hổ đất do IVAC sản xuất, huyếtthanh kháng nọc rắn hổ chúa do Trung tâm chống độc, Bệnh viện Bạch Maisản xuất… [11], [72] HTKNR đa giá hay còn gọi là HTKNR đa đặc hiệu

(polyspecific) là loại huyết thanh được tạo ra bằng cách gây miễn dịch vớihỗn hợp nọc độc của nhiều loài rắn, do đó có khả năng trung hòa nọc củanhiều loài rắn khác nhau như một số loại HTKNR của Thái Lan, Braxin vàChâu phi [27], [63], [100] Tuy nhiên, cách gây miễn dịch này đôi khi khôngtạo được hiệu giá kháng thể tốt cho tất cả các loại nọc độc dùng làm khángnguyên mà chỉ có hiệu giá cao với một loại nọc độc trong số đó Điều này đãđược chứng minh bởi Mauren và cộng sự (2012) khi tiến hành gây miễn dịch

cho ngựa với hỗn hợp kháng nguyên được chế tạo từ hai loại nọc rắn là P Mucrosquamatus và V Stejnegeri thì thấy rằng, tất cả ngựa được gây miễn dịch chỉ tạo ra kháng thể có hiệu giá cao với nọc độc thuộc loài V Stejnegeri

[88] Huyết thanh kháng nọc rắn có thể ở dạng F(ab’)2 hoặc dạng Fab tùythuộc vào trình độ, kỹ thuật chế tạo và điều kiện kinh tế của mỗi quốc gia[23], [67], [76], [94]

Huyết thanh kháng nọc rắn đơn đặc hiệu thu được sau gây miễn dịchthường có phản ứng chéo với nọc độc của một số loài rắn khác, điều này đãđược chứng minh bởi Anindya Kanti De và cộng sự năm 1996 [15] Do đó, để

có nguồn nguyên liệu dùng cho việc chế tạo xét nghiệm phát hiện nọc rắn độcthì cần phải tiến hành tinh chế kháng thể

- Tinh chế kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn

Kháng thể IgG đặc hiệu kháng nọc rắn được tinh chế qua nhiều côngđoạn khác nhau sử dụng phối hợp nhiều kỹ thuật tinh sạch kháng thể như: kỹthuật tách huyết thanh từ máu của động vật trước và sau gây miễn dịch, kỹthuật sắc ký lọc gel, kỹ thuật sắc ký ái lực, kỹ thuật sắc ký miễn dịch

Kỹ thuật tách huyết thanh: máu của động vật gây miễn dịch được chovào các ống nghiệm không có chất chống đông để co cục máu tự nhiên ởnhiệt độ phòng hoặc trong tủ ấm 37oC trong thời gian từ 30 phút đến 60 phút.Sau đó tiến hành ly tâm để loại bỏ các thành phần hữu hình như hồng cầu,bạch cầu và tiểu cầu Phần dịch nổi mầu vàng nhạt thu được sau ly tâm chính

là huyết thanh mà trong thành phần có rất nhiều phân tử kháng thể IgG khánglại thành phần kháng nguyên đã kích thích sinh ra chúng [1].

Kỹ thuật sắc ký lọc gel (gel filtration chromatography) là kỹ thuật sắc

ký mà sự phân tách các phân tử protein dựa trên kích thước phân tử:Các hạt gel cấu tạo từ polymer của dextran (sephadex), agarose (sepharose),polyacrylamide (sephacryl hoặc bioGel P) Mỗi hạt gel đều có những mắt lưới

to hay nhỏ phụ thuộc vào loại gel

Trong quá trình sắc ký, các chất phân tử lớn sẽ chỉ di chuyển ở phalỏng phía ngoài hạt gel, và sẽ nhanh chóng trôi ra khỏi cột Trong khi đó, cácchất có kích thước nhỏ hơn sẽ chui qua các mắt lưới vào bên trong hạt gel vàtùy thuộc vào mức độ khác nhau về khối lượng và hình dạng mà chúng sẽ trôi

ra khỏi cột gel chậm hơn Phân tử càng nhỏ càng phải len lách nhiều trong hạtgel và càng ra chậm Do vậy có thể coi việc tách các chất bằng gel sephadexnhư một quá trình sàng lọc (rây) phân tử Các phân tử được phân bố thụ độnggiữa thể tích kẽ (thể tích bên ngoài hạt gel- Vo) và thể tích bên trong hạt gel(Vi), phụ thuộc vào khả năng chui được vào bên trong hạt gel của chúng Nếutổng thể tích của cột là Vt, thì: Vt = Vo + Vi Các phân tử kháng thể IgGthường có kích thước nhỏ hơn so với phân tử Albumin nên sẽ ra khỏi cột sắc

ký chậm hơn

Kỹ thuật sắc ký ái lực (affinity chromatography) sử dụng ái lực giữaphối tử gắn (ligand) và protein cần tách Phối tử gắn thường được cố định quacác liên kết cộng hoá trị với giá thể không tan như cellulose hoặc polyacryl-amide Khi tiến hành sắc ký, protein cần tách sẽ gắn với giá thể trong khi cácprotein khác sẽ rửa trôi ra khỏi cột Sau khi rửa sạch tạp chất, protein cần táchđược phản hấp phụ bằng các chất cạnh tranh như phối tử tự do hay bằng cácchất có khả năng phá vỡ tương tác Trong số các ví dụ về tương tác protein -cấu tử có thể kể đến tương tác kháng nguyên - kháng thể, hay tương tác giữaNi+ và nhân poly-histidine Để tinh sạch kháng thể IgG từ mẫu huyết thanh,

người ta có thể sử dụng các cột protein A hoặc protein G Do phân tử khángthể IgG có ái lực gắn rất mạnh với protein A hoặc protein G còn các thànhphần khác không gắn với các protein này sẽ bị rửa trôi ra khỏi cột protein Ahoặc protein G Để thu hoạch phân tử IgG, người ta dùng dung môi phá vỡliên kết giữa phân tử IgG với protein A hoặc protein G và cho các phân tửIgG chạy ra khỏi cột sắc ký [74], [92], [120].

Kỹ thuật sắc ký ái lực miễn dịch (Immuno Affinity Chromatography –IAC) là kỹ thuật dựa vào khả năng gắn kết giữa kháng nguyên và kháng thể.Tùy thuộc vào bản chất của protein cần tinh sạch là kháng nguyên hay khángthể mà người ta có thể sử dụng cột sắc ký có gắn kháng thể hay kháng nguyênđặc hiệu tương ứng Các phân tử kháng thể hoặc kháng nguyên cần tinh sạchsau khi chạy qua cột IAC sẽ bị bắt giữ bởi các phân tử kháng nguyên hoặckháng thể đặc hiệu tương ứng trên giá thể bên trong cột sắc ký bằng các liênkết kháng nguyên - kháng thể Các thành phần không bị giữ lại trong cột IAC(unbound) sẽ được rửa trôi ra khỏi cột IAC Các phân tử kháng nguyên hoặckháng thể đặc hiệu cần tinh sạch sẽ được rửa trôi ra khỏi cột IAC bằng dungdịch có khả năng phá vỡ liên kết của phức hợp kháng nguyên – kháng thể.Sau khi chạy sắc ký ái lực miễn dịch sẽ tạo ra sản phẩm kháng nguyên hoặckháng thể có tính đặc hiệu cao Đây là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để tạo

ra sản phẩm kháng thể có tính đặc hiệu cao dùng trong các bộ kít chẩn đoán[41], [107], [120]

1.2.2 Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn độc

Do nọc rắn độc có hoạt tính sinh học cao nên trước đây người ta đã sửdụng các thử nghiệm sinh học dựa trên các hoạt tính sinh học của nọc độc nhưtan huyết hoặc nhiễm độc thần kinh để phát hiện nọc rắn Tuy nhiên phươngpháp này có nhược điểm là giá thành đắt, đòi hỏi phải có động vật thí nghiệm,mất nhiều thời gian và không có tính đặc hiệu vì nhiều loại nọc độc có thể có

cùng hoạt tính như nhau Nhờ tính đặc hiệu của phản ứng kết hợp khángnguyên-kháng thể nên các phản ứng miễn dịch được coi là những phươngpháp tốt nhất được sử dụng để phát hiện nọc độc Nhiều kỹ thuật miễn dịch đãđược nghiên cứu ứng dụng để phát hiện nọc rắn, trong đó mỗi phương phápđều có những ưu điểm và hạn chế khác nhau [45].

1.2.2.1 Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch (Immunodiffusion)

Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch là kỹ thuật dựa trên sự kết hợp đặc hiệugiữa kháng nguyên và kháng thể tạo thành phức hợp kháng nguyên – khángthể trên môi trường thạch và kết quả có thể đánh giá thông qua quan sát bằngmắt thường Kỹ thuật tạo ra vòng tròn kết tủa xung quanh vị trí chứa khángnguyên được gọi là kỹ thuật khuếch tán miễn dịch vòng (Manciniimmunodiffusion) hoặc tạo ra vạch kết tủa giữa hai giếng có chứa khángnguyên và kháng thể được gọi là khuếch tán miễn dịch kép (Ouchterlonydouble diffusion method), kỹ thuật này lần đầu tiên được mô tả bởi Feinbergvào năm 1957 [45]

Kỹ thuật này được áp dụng phổ biến và được rất nhiều tác giả ứng dụngtrong việc phát hiện và đánh giá nồng độ kháng nguyên Ưu điểm của phươngpháp này là đơn giản, kết quả tin cậy, nhưng nhược điểm là đòi hỏi nồng độkháng nguyên cao Vì vậy, hiện nay phương pháp này ít được sử dụng [16],[57]

1.2.2.2 Kỹ thuật điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis)

Kỹ thuật điện di miễn dịch lần đầu tiên được đưa ra bởi Grabar vàWiliams vào năm 1953 Sau đó được các tác giả Laurell (1965); Weeke(1970) và Ghanta (1973) phát triển và hoàn thiện [119] Kỹ thuật này sử dụnggel điện di agar để phân tách các phân tử kháng nguyên hoặc kháng thể, saukhi các phân tử kháng nguyên hoặc kháng thể chạy qua vạch kháng thể hoặc

kháng nguyên có trong bản gel, những kháng nguyên hoặc kháng thể đặc hiệu

sẽ bị bắt giữ bởi kháng thể hoặc kháng nguyên tương ứng và được nhận biếtthông qua một vạch ở vị trí có phức hợp kháng nguyên kháng thể Đây là kỹthuật nhằm tìm ra kháng nguyên đặc hiệu trong hỗn hợp protein dựa vào điện

di kháng thể đặc hiệu đã biết hoặc tìm ra phân tử kháng thể đặc hiệu tronghuyết thanh dựa vào điện di kháng nguyên đặc hiệu sẵn có [89], [98]

Năm 1974 Greenwood và Cs đã sử dụng thành công kỹ thuật này pháthiện nọc độc của 4 loài rắn phổ biến ở Nigerria trong các bệnh phẩm là dịchvết thương, huyết thanh và nước tiểu của 101 bệnh nhân rắn cắn Kỹ thuật này

có ưu điểm là nhanh hơn so với khuếch tán miễn dịch Tuy nhiên, cũng giốngnhư phương pháp khuếch tán miễn dịch, nhược điểm của phương pháp này làđòi hỏi nồng độ kháng nguyên cao và chỉ có thể tiến hành tại các phòng thínghiệm nên cũng ít được sử dụng [45]

1.2.2.3 Kỹ thuật ngưng kết (Haemagglutination)

Kháng thể kháng nọc độc được gắn lên bề mặt hồng cầu Khi có mặtcủa nọc độc, các phân tử nọc độc sẽ đóng vai trò là cầu nối gắn các tế bàohồng cầu phủ kháng thể vào với nhau tạo ra hình ảnh ngưng kết hồng cầu cóthể quan sát thấy bằng mắt thường Ba loại hồng cầu thường được sử dụngtrong kỹ thuật ngưng kết là hồng cầu cừu, hồng cầu người và hồng cầu gà Kỹthuật này được nhiều tác giả nghiên cứu áp dụng để phát hiện kháng nguyênhoặc các phức hợp miễn dịch tuần hoàn trong máu bệnh nhân [1], [95].Phương pháp này đã được Boche và Russel sử dụng lần đầu tiên năm 1968

để phát hiện nọc rắn Sau đó năm 1993 Kittigul và Ratanabanagkoon sử dụng

để phân biệt 6 loài rắn phổ biến ở Thái Lan Độ nhạy của xét nghiệm pháthiện nọc rắn này dao động trong khoảng từ 2 – 635 ng/ml và tổng thời gianyêu cầu xét nghiệm từ 60 – 120 phút [73] Ưu điểm của phương pháp này làđơn giản, rẻ tiền, thích hợp với các cơ sở y tế địa phương ở các nước đang

phát triển Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là tính bất ổn định của

tế bào hồng cầu cừu, làm cho xét nghiệm không thể bảo quản được lâu và đôikhi cho kết quả không đồng nhất nên hiện nay cũng ít được sử dụng

Để khắc phục tính bất ổn định của tế bào hồng cầu, người ta đã dùngnhững hạt latex để thay thế cho hồng cầu cừu Kỹ thuật dùng các hạt latex nàyđược gọi là kỹ thuật ngưng kết Kỹ thuật ngưng kết đã được Chinonavanig và

CS (1991) sử dụng để phát hiện nọc độc của 6 loại rắn thường gặp ở Thái Lan

đó là: N Kaouthia; B Fasciatus; Ophiophagus hannah; D Russelli; C Rhodostoma và T albolabris Độ nhạy của xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc

này dao động trong khoảng 159 – 1221 ng/ml trong dung dịch đệm Glycin và

có khả năng phát hiện nọc độc trong huyết thanh của các nạn nhân bị rắn độccắn với kết quả dương tính chiếm 52,5 % Các hạt latex được gắn với cácphân tử kháng thể có thể bảo quản ở nhiệt độ 40C hơn một năm Nếu bảo quảndưới dạng đông khô thì ngay cả khi để ở nhiệt độ phòng cũng có thời gian ổnđịnh dài hơn Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là độ nhạy thấp và

kỹ thuật gắn kháng thể vào hạt latex rất phức tạp nên ít được các tác giả lựachọn [45]

1.2.2.4 Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay - RIA)

Xét nghiệm miễn dịch phóng xạ được nhiều tác giả nghiên cứu và ápdụng, có thể là xét nghiệm miễn dịch phóng xạ kiểu cạnh tranh (competitiveradioimmunoassay) hoặc xét nghiệm miễn dịch phóng xạ kiểu sandwich(sandwich radioimmunoassay) [29] Năm 1975 lần đầu tiên Sutherland và cs

đã áp dụng kỹ thuật RIA phát hiện nọc rắn độc trong máu của bệnh nhân bịrắn cắn [110] Tiếp sau đó, Pukrittayakamee và cs đã áp dụng kỹ thuật này để

phát hiện nọc rắn độc daboia ruselli trong dịch cơ thể của nạn nhân bị rắn này

cắn Kết quả cho thấy, phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao, đáng tincậy, có thể phát hiện nọc độc ở nồng độ 0,4 ng/ml trong nước tiểu, 20 ng/ml

pha trong dung dịch PBS có 0,1% BSA và 5 µg/ml trong huyết thanh Hiệuquả của xét nghiệm RIA trong phát hiện nọc rắn độc đã được chứng minhbằng bốn mẫu huyết thanh lấy từ bốn bệnh nhân bị rắn lục russelli cắn Tuynhiên, kít xét nghiệm này lại cho phản ứng dương tính giả với mẫu huyếtthanh lấy từ bệnh nhân bị rắn hổ đất của Thái lan cắn [96] Nhược điểm củaphương pháp này còn thể hiện ở chỗ nó quá phức tạp khi triển khai, cần bảoquản và xử lý các chất đồng vị phóng xạ tốt tránh bị phát tán chất phóng xạ ramôi trường nên không phù hợp cho việc sử dụng trên thực địa.

1.2.2.5 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immunofluoresence)

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật xét nghiệm sử dụngthuốc nhuộm huỳnh quang gắn với kháng thể đặc hiệu làm kháng thể pháthiện Kháng thể đặc hiệu được sử dụng chủ yếu là các kháng thể đơn clôn.Lomonte và Kahan (1988) đã sử dụng kháng thể đơn clôn phát triển xétnghiệm miễn dịch huỳnh quang gắn enzyme để phát hiện độc tố Myotoxin ở

loài rắn asper Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, cho phép

phát hiện nọc độc ở nồng độ rất thấp là 0,1 pg/ml trong dung dịch PBS Đây

là kỹ thuật đắt tiền, đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và rất khó ứng dụngtriển khai ở những nước đang phát triển như Việt Nam [21], [45], [115]

1.2.2.6 Kỹ thuật miễn dịch quang (optical immunoassay)

Kỹ thuật miễn dịch quang là kỹ thuật dựa trên sự thay đổi của ánh sángphản chiếu khi xuất hiện phản ứng kháng nguyên – kháng thể trên bề mặt củamột vật liệu mỏng phản quang (optical layer) và có thể quan sát được sự thayđổi đó bằng mắt thường [61]

Lê Văn Đông và Cs (2002; 2004) đã sử dụng kỹ thuật miễn dịch quang

để phát hiện nọc rắn Vật liệu được sử dụng là một chíp silicon có bề mặtphản quang (silicon - optical layer) và các kháng thể đặc hiệu nọc rắn được

gắn trên bề mặt lớp silicon phản quang, kháng thể phát hiện gắn Biotin và sửdụng cơ chất TMB (hình 1.7) [78], [79] Phương pháp này đã phát hiện đượcnọc rắn độc của 4 loại rắn là rắn lục xanh, rắn chàm quạp, rắn hổ chúa và rắn

hổ đất trong các mẫu máu, huyết tương, nước tiểu, dịch vết cắn và dịch nốtphỏng Phương pháp này có thể phát hiện nọc rắn độc ở nồng độ 0,4 ng/ml,trong khi ELISA là 0,8 ng/ml Như vậy, xét về độ nhạy thì kỹ thuật OIA có độnhạy cao gấp hai lần so với kỹ thuật ELISA [79] Tuy nhiên, nhược điểm củaphương pháp OIA là giá thành xét nghiệm đắt, đòi hỏi phải có trang thiết bịhiện đại do đó khó áp dụng triển khai trên thực địa, nhất là trong điều kiện cácnước đang phát triển như Việt Nam

Hình 1.7 Xét nghiệm miễn dịch quang phát hiện nọc rắn

*Nguồn: theo Lê Văn Đông và cs (2004)[79].

1.2.2.7 Xét nghiệm nhanh (rapid test)

Xét nghiệm nhanh là kỹ thuật sắc ký miễn dịch mao dẫn (capillaryimmunochromatographic) với 3 cửa sổ được mở tại vị trí tra mẫu, vạch pháthiện kháng nguyên (test line) và vạch chứng (control line)

Đây là kỹ thuật có nhiều ưu điểm hơn các kỹ thuật khác về thời gian xétnghiệm khoảng từ 3 đến 5 phút, thuận tiện trong tiến hành xét nghiệm và dễ

áp dụng xét nghiệm trên thực địa Tuy nhiên, do việc chế tạo xét nghiệmnhanh thường rất phức tạp về công nghệ, tốn kém và đòi hỏi phải có trangthiết bị hiện đại nên rất khó thực hiện trong điều kiện thực tiễn ở Việt Nam

Cho đến nay, việc ứng dụng xét nghiệm nhanh phát hiện nọc rắn độcmới chỉ có Hung D (2005) đã chế tạo xét nghiệm nhanh từ 3 loại kháng thể

đó là: kháng thể IgY vịt kháng nọc rắn gắn hạt vàng colloidal (kháng thể bắtgiữ kháng nguyên nọc rắn); kháng thể IgY vịt kháng nọc rắn (kháng thể pháthiện ở vạch test) và kháng thể IgG thỏ kháng IgY của vịt (kháng thể phát hiện

ở vạch chứng) Kít xét nghiệm này đã phát hiện được nọc rắn hổ Đài loan với

độ nhạy phát hiện nọc độc là 5 ng/ml và thời gian xét nghiệm từ 5 đến 10 phút[55]

1.3 XÉT NGHIỆM ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

1.3.1 Lựa chọn xét nghiệm ELISA trong chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc

Mặc dù có nhiều kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn độc đã đượcnghiên cứu và ứng dụng như phân tích ở mục 1.2.2 Tuy nhiên, trong điềukiện thực tiễn Việt Nam, việc chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độcdựa trên các kỹ thuật nói trên lại không phù hợp Trên thế giới, kỹ thuật miễndịch được sử dụng phổ biến nhất trong chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọcrắn độc chính là xét nghiệm ELISA Theakston và CS (1977) là những ngườiđầu tiên sử dụng ELISA để phát hiện nọc rắn và kháng thể chống nọc rắn trênđộng vật và các mẫu bệnh phẩm của người [45] Li và CS (1994) đã phát triển

bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc ở Agkistrodon [81] Anindya(1996) đã chế tạo thành công bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc của bốn

loài rắn độc phổ biến ở Ấn Độ [15] Hung Dong-Zong và CS (2003) đã chếtạo thành công bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn hổ ở Đài Loan [56],cùng thời gian này tại Singapore, Lê Văn Đông và CS cũng đã phát triển bộxét nghiệm ELISA phát hiện nọc của một số loài rắn độc ở Miền Nam, ViệtNam [80] Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có bất kỳ bộ xét nghiệm pháthiện nọc rắn độc nào được nghiên cứu và ứng dụng tại Việt Nam.

Xét nghiệm ELISA với nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, tính đặc hiệucao, nhanh, chuẩn bị mẫu xét nghiệm và qui trình kỹ thuật đơn giản Hơn thếnữa, ELISA cũng dễ dàng cải tiến và điều chỉnh các điều kiện phản ứng đểthuận lợi cho việc sử dụng trong các điều kiện khác nhau như xét nghiệm cấpcứu hay xét nghiệm dã ngoại trên thực địa [32], [97], [99] Trong điều kiệnthực tiễn Việt Nam, xét nghiệm ELISA chính là sự lựa chọn phù hợp nhất chochế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc

Một bộ xét nghiệm ELISA có thể phát hiện được tất cả các loại nọc rắnđộc giúp chẩn đoán phân biệt được tất cả các loài rắn độc có thể gây ra tai nạnrắn cắn trên lâm sàng là hoàn hảo nhất, nhưng điều này rất khó thực hiện và

vô cùng tốn kém Thực tế trên lâm sàng, chỉ có một số loài rắn độc thườnggặp và có tỷ lệ gây ra tai nạn rắn cắn cao đó là: rắn lục xanh và rắn hổ đất.Việc phát triển bộ xét nghiệm ELISA giúp chẩn đoán phân biệt được nhữngloài rắn độc phổ biến và có tỷ lệ gây ra tai nạn rắn cắn cao trên lâm sàngkhông chỉ đáp ứng được yêu cầu thực tiễn mà còn dễ thực hiện trong điềukiện ở Việt Nam

1.3.2 Một số thiết kế xét nghiệm ELISA được ứng dụng trong chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc

- Nguyên lý chung của xét nghiệm ELISA: là dùng kháng nguyên hoặc kháng

thể đánh dấu để phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể qua chất chỉ thịmàu

Để phát hiện kháng thể đặc hiệu người ta sử dụng kỹ thuật ELISA giántiếp (indirect ELISA) và để phát hiện kháng nguyên người ta sử dụng kỹ thuậtELISA sandwich [28].

Xét nghiệm ELISA gián tiếp (indirect ELISA) để phát hiện kháng thểđặc hiệu là kỹ thuật mà người ta sử dụng các phân tử kháng nguyên đã biếtgắn vào các giếng xét nghiệm để phát hiện kháng thể đặc hiệu tương ứng Cường độ màu đo được tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể đặc hiệu có trongmẫu thử [93] Lê Văn Đông và CS (2003) đã sử dụng kỹ thuật ELISA giántiếp để phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng lại nọc của 4 loài rắn độc: lụcxanh, chàm quạp, hổ chúa và hổ đất trong huyết thanh thỏ được gây miễn dịch[80]

Xét nghiệm ELISA sandwich là kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu đãbiết gắn vào giếng xét nghiệm để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu thông quaphức hợp kháng thể bắt giữ (capture antibody) - kháng nguyên (antigen) –kháng thể phát hiện (detecting antibody) hoặc cộng hợp kháng thể phát hiện.Cường độ màu đo được tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên có trong mẫuthử Có nhiều phương án thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich phát hiệnkháng nguyên

- Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich sử dụng mô hình 2 kháng thể

Các xét nghiệm ELISA sandwich sử dụng mô hình 2 kháng thể baogồm 1 kháng thể gắn bản (capture antibody) và 1 kháng thể phát hiện Tùythuộc vào kháng thể phát hiện gắn enzyme hay gắn biotin mà ta có thiết kế xétnghiệm khác nhau (hình 1.8)

Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich AbE (antibody enzyme): baogồm một kháng thể gắn bản, một kháng thể phát hiện gắn enzyme và cơ chấtphát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể (hình 1.8.A) Đây là thiết kế xétnghiệm rút ngắn được thời gian tiến hành phản ứng ELISA so với các thiết kếxét nghiệm ELISA sandwich khác, nhưng kỹ thuật gắn enzyme vào kháng thể

lại rất phức tạp, khó thực hiện và độ nhạy phát hiện kháng nguyên không cao.Thiết kế xét nghiệm này đã được Howard và CS (1982) ứng dụng chế tạo bộxét nghiệm ELISA phát hiện nọc của 5 loài rắn độc phổ biến ở Úc Kết quả độnhạy phát hiện nọc rắn độc là 15 ng/ml và tổng thời gian xét nghiệm khoảng

40 phút [53] Sau đó vào năm 1992, John Cox và cộng sự cũng sử dụng chínhthiết kế này để chế tạo lại bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc của 5 loài rắnđộc nói trên Bộ xét nghiệm này chỉ chứng minh được hiệu quả phân biệt nọccủa các loài rắn nói trên trong khoảng nồng độ dao động từ 10 – 40 ng/ml,ngoài khoảng nồng độ trên xét nghiệm có phản ứng chéo với một số loại nọcrắn độc khác [60]

Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich avidin-biotin (AB-ELISA): baogồm một kháng thể gắn bản, một kháng thể phát hiện gắn biotin, cộng hợpHRP gắn avidin (horseradish peroxidase - avidin) và cơ chất phát hiện phứchợp kháng nguyên kháng thể (hình 1.8.B) Như vậy, so với thiết kế xétnghiệm ELISA sandwich AbE (2 kháng thể) thì xét nghiệm AB-ELISA cầnnhiều hơn 1 bước trong quá trình tiến hành thực hiện phản ứng ELISA Việcgắn biotin vào kháng thể trong thiết kế xét nghiệm này dễ thực hiện hơn sovới gắn enzyme vào kháng thể Do một phân tử avidin có thể gắn với nhiềuphân tử HRP nên khi avidin gắn biotin sẽ làm khuếch đại tín hiệu của phảnứng ELISA và làm tăng độ nhạy phát hiện kháng nguyên của xét nghiệm AB-ELISA Thiết kế xét nghiệm này đã được nhiều tác giả ứng dụng trong chế tạo

bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc Anindya Kanti De (1996) đã ứng dụngthiết kế xét nghiệm này chế tạo thành công bộ xét nghiệm AB-ELISA pháthiện nọc của 4 loài rắn độc ở Ấn Độ với độ nhạy phát hiện ở mức 1 ng/ml Bộxét nghiệm này đã chứng minh được hiệu quả phát hiện nọc rắn độc trong cácmẫu bệnh phẩm của 27 bệnh nhân bị rắn độc cắn [15] Ernesto Amuy và cộng

sự (1997) cũng đã phát triển xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc dựatrên thiết kế xét nghiệm này với độ nhạy phát hiện là 4 ng/ml [46] Tại

Singapore, Lê Văn Đông và công sự (2003) đã sử dụng thiết kế xét nghiệmnày chế tạo thành công bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc của 4 loài rắnđộc thường gặp ở Miền nam, Việt Nam đó là: rắn lục xanh, rắn hổ đất, rắnchàm quạp và rắn hổ chúa với độ nhạy phát hiện từ 0,4 đến 1,6 ng/ml tùythuộc vào loại nọc rắn độc [80] Tuy nhiên, để ứng dụng trong chẩn đoán xácđịnh loài rắn độc cắn ở Việt Nam, thì bộ xét nghiệm này cần phải tiếp tụcđược chế tạo và đánh giá độ ổn định trước khi tiến hành thử nghiệm phát hiệnnọc rắn độc trên lâm sàng.

Hình 1.8 Kỹ thuật ELISA sandwich (sử dụng 2 kháng thể)

*Nguồn: theo Coligan John (2005)[28].

- Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich sử dụng mô hình 3 kháng thể

Thiết kế xét nghiệm AbE-ELISA sandwich sử dụng mô hình 3 khángthể bao gồm: một kháng thể gắn bản, kháng thể phát hiện là kháng thể đặchiệu kháng nguyên nhưng có nguồn gốc sản xuất khác với kháng thể gắn bản.Cộng hợp HRP-kháng thể kháng lại kháng thể phát hiện và cơ chất dùng để

phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể (hình 1.9) So với thiết kế xétnghiệm AB-ELISA thì hai thiết kế xét nghiệm này có tổng số bước tiến hànhxét nghiệm như nhau Tuy nhiên, đây là thiết kế xét nghiệm mà kháng thểphát hiện không phải xử lý gắn enzyme hay gắn biotin nên sẽ có độ ổn định

và hiệu giá tốt hơn so với kháng thể phát hiện sử dụng trong các thiết kếnghiên cứu nói trên Cộng hợp HRP-kháng thể kháng kháng thể phát hiện cóthể được cung cấp dưới dạng thương phẩm nên có tính đặc hiệu và độ ổn địnhcao hơn

Hình 1.9 Kỹ thuật ELISA sandwich (sử dụng 3 kháng thể)

*Nguồn: theo Coligan John (2005)[28].

Abdul và cộng sự (1993) là người đầu tiên sử dụng thiết kế xét nghiệmnày trong chế tạo bộ xét nghiệm ELISA huỳnh quang phát hiện nọc rắn lục

russelli Bộ xét nghiệm do Abdul và cộng sự chế tạo sử dụng huyết thanh ngựa kháng nọc rắn lục russelli thương phẩm làm kháng thể bắt giữ Kháng

thể phát hiện là kháng thể thỏ đặc hiệu loài rắn lục russelli được tạo ra bằng

cách gây miễn dịch trên thỏ với kháng nguyên nọc rắn độc này Cộng hợpHRP- kháng thể thứ ba là kháng thể dê gắn enzyme kháng IgG thỏ Bộ xét

nghiệm này có độ nhạy phát hiện nọc rắn lục russelli rất tốt ở mức 0,1 pg/ml

[13] Selvanayagam và cộng sự (1999) đã chế tạo thành công bộ xét nghiệmAbE-ELISA (3 kháng thể: kháng thể dê gắn bản, kháng thể phát hiện cónguồn gốc từ thỏ và cộng hợp HRP-kháng thể dê kháng IgG thỏ) Bộ xét

nghiệm này đã chứng minh hiệu quả phát hiện nọc của loài rắn hổ carinatus

với độ nhạy phát hiện ở mức 2,5 ng/ml [44] Hong Dong-Zong (2003) đã ứngdụng thiết kế xét nghiệm này chế tạo thành công bộ xét nghiệm AbE-ELISA

(3 kháng thể) phát hiện nọc rắn N Atra ở Đài Loan với độ nhạy phát hiện ở

mức 1 ng/ml [56] Với thiết kế xét nghiệm ELISA này, chúng ta có thể ứngdụng phát triển bộ xét nghiệm mới phát hiện nọc rắn độc trong điều kiện thựctiễn ở Việt Nam đó là: sử dụng các nguyên liệu thương phẩm sẵn có nhưhuyết thanh kháng nọc rắn lục xanh và hổ đất đã chứng minh được hiệu quảđiều trị trên lâm sàng dùng làm kháng thể bắt giữ kháng nguyên (captureantibody) như trong nghiên cứu của Abdul Sử dụng kháng thể phát hiện làkháng thể thỏ đặc hiệu loài rắn và cộng hợp HRP-kháng thể là HRP gắnkháng thể chuột kháng IgG thỏ thương phẩm do hãng Sigma cung cấp [56]

- Cơ chất sử dụng trong xét nghiệm ELISA

Cơ chất thường được sử dụng trong phản ứng ELISA là phenylenediamine (OPD), loại cơ chất này thường bền ở dạng tinh thể nếuđược bảo quản trong lọ tránh ánh sáng ở nhiệt độ 4-80C Khi phản ứng vớienzyme thì cơ chất này từ không màu chuyển sang màu vàng và chúng ta dễdàng nhận biết được bằng mắt thường Một loại cơ chất khác cũng được sửdụng trong phản ứng ELISA đó là Tetramethylbenzidine (TMB), đây là loại

O-cơ chất thường được cung cấp từ các nhà sản xuất ở dạng dung dịch không

màu Khi phản ứng với enzyme thì cơ chất này từ không màu chuyển thànhmàu xanh dương.

1.3.3 Một số chỉ tiêu đánh giá xét nghiệm ELISA

Trong phát triển xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn, một số chỉ tiêuđánh giá cần quan tâm đó là độ đặc hiệu, độ nhạy, độ ổn định và thời gian xétnghiệm:

Độ đặc hiệu của xét nghiệm ELISA có thể bị ảnh hưởng bởi phản ứngchéo xuất hiện giữa kháng nguyên nọc rắn này với kháng thể bắt giữ đặc hiệuloài rắn khác Phản ứng chéo thường xảy ra nếu kháng thể dùng cho mục đíchchẩn đoán là kháng thể đa clôn chống lại nọc độc tổng số Do vậy, tinh sạchkháng thể đặc hiệu loài là bước đầu tiên quan trọng nhất trong việc phát triểnxét nghiệm ELISA [106] Trong việc điều trị bệnh nhân bị nhiễm độc do rắncắn thì độ đặc hiệu của xét nghiệm ELISA rất quan trọng Dựa vào kết quảxét nghiệm ELISA có thể định hướng chẩn đoán loài rắn độc cắn và chỉ định

sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu sớm hơn cho bệnh nhân

Độ nhạy của xét nghiệm ELISA phụ thuộc vào thiết kế xét nghiệmELISA, người ta có thể làm tăng độ nhạy của xét nghiệm ELISA thông qua hệthống khuếch đại avidin – biotin Bằng phương pháp này Selvanayagam và

CS (1999) có thể phát hiện nọc độc của bốn loài rắn độc ở Ấn Độ ở mức 100pg/ml trong các mô của nạn nhân tử vong do các loài rắn này cắn [44].Kulawickrama và cộng sự (2010) có thể phát hiện nọc rắn độc ở nồng độ 0,15ng/ml trong huyết thanh bệnh nhân bị cắn bởi loài rắn taipan Australia bằngxét nghiệm AB – ELISA [75] Độ nhạy của xét nghiệm ELISA có thể tănglên khi sử dụng cộng hợp kháng thể phát hiện gắn enzyme AbE-ELISA (3kháng thể) Bằng phương pháp này Hung Dong - Zong và cộng sự (2003) cóthể phát hiện nọc rắn hổ trong 31 mẫu huyết thanh của 27 nạn nhân bị rắn hổĐài Loan cắn với độ nhạy phát hiện nọc độc ở mức 1 ng/ml [56]

Độ ổn định của xét nghiệm ELISA có ý nghĩa rất quan trọng trong việcứng dụng bộ xét nghiệm và thương mại hóa sản phẩm Độ ổn định của bộ sinhphẩm phát hiện nọc rắn độc tối thiểu phải đạt trên 3 tháng thì mới có khả năngứng dụng trong thực tế và thương mại hóa sản phẩm.

Thời gian xét nghiệm đóng vai trò quan trọng trong việc ứng dụng bộxét nghiệm phát hiện nọc rắn độc trên lâm sàng Các xét nghiệm ELISAthường có thời gian tiến hành khoảng 90 - 120 phút Sử dụng kháng thể có áilực và độ đặc hiệu cao góp phần rút ngắn thời gian xét nghiệm ELISA Thờigian cho xét nghiệm phát hiện nọc rắn được nhiều tác giả cho là hợp lý nếudao động trong khoảng 30 - 45 phút kể từ khi tra mẫu xét nghiệm [45], [82].Đối với những bệnh nhân bị các loài rắn lục cắn thì vấn đề thời gian xétnghiệm phát hiện nọc rắn độc có thể lên đến hàng giờ vẫn có thể chấp nhậnđược Tuy nhiên, những bệnh nhân bị cắn bởi các loài rắn hổ thì thời gian xétnghiệm phát hiện nọc rắn độc lại yêu cầu nhanh nhất có thể

1.3.4 Bộ xét nghiệm ELISA thương phẩm phát hiện nọc rắn độc

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện nọc rắn độc được mô tả,nhưng chỉ có hai bộ xét nghiệm chẩn đoán rắn độc cắn được phát triển Bộ xétnghiệm thứ nhất do phòng thí nghiệm huyết thanh Commonwealth - Úc chếtạo Phiên bản đầu tiên của bộ xét nghiệm này sử dụng phương pháp miễndịch enzyme đã được phát triển năm 1979 Howard Chadler và Hurrell (1982)

đã giới thiệu một phiên bản miễn dịch enzyme phản ứng trong ống mao quảnbằng thủy tinh Bộ xét nghiệm này phù hợp để sử dụng nhưng quá đắt vàkhông tiện lợi nên khó sản xuất hàng loạt [53] Năm 1991 bộ mao quản bằngthuỷ tinh đã được thay thế bằng các giếng nhựa polystyrene với 8 giếng cho 1xét nghiệm bao gồm 1 giếng trống (blank), một giếng chứng dương (positivecontrol), một giếng chứng âm (negative control) và 5 giếng còn lại được gắnbởi 5 loại kháng thể bắt giữ đặc hiệu tương ứng với 5 loại nọc rắn độc cần

phát hiện (hình 1.10.a) [60] Sự thay đổi này làm cho bộ xét nghiệm sử dụngtiện lợi hơn và có thể sản xuất hàng loạt Bộ xét nghiệm này phát hiện nọc của

5 loài rắn độc phổ biến ở Úc: rắn nâu (Pseudonaja textilis), rắn lục gây chết (Acanthophis antarcticus), rắn nâu chúa (Pseudechis australis), rắn taipan (Oxyuranus scutellatus) và rắn hổ (Notechis scutatus) Bộ xét nghiệm này có

thể phát hiện nọc rắn độc trong dịch vết cắn và mẫu nước tiểu của bệnh nhân

bị rắn độc cắn [60]

Hình 1.10 Kít phát hiện nọc rắn độc ở Úc (1.10a) và Ấn Độ (1.10b)

*Nguồn: http://www.csl.com.au và Anindya Kanti De (1996) [15]

Bộ xét nghiệm của Úc đã được sử dụng trong lâm sàng với độ nhạyphát hiện nọc rắn là 2,5 ng/ml trong khoảng thời gian nhỏ hơn 20 phút Độđặc hiệu của xét nghiệm trong việc phát hiện nọc độc của 5 loại rắn độc chủyếu hay gặp ở Úc được khảo sát trong khoảng nồng độ nọc độc dao động từ

10 – 40 ng/ml pha trong dung dịch đệm PBS Kết quả cho thấy ở nồng độ nọcđộc 10 ng/ml thấy xuất hiện phản ứng chéo giữa kít xét nghiệm đặc hiệu loàirắn độc này với kháng nguyên nọc rắn của loài rắn khác Giếng có phản ứngchéo (cường độ màu tính theo OD) yếu hơn so với giếng có phản ứng đặchiệu [106] Cơ sở phân tử của việc xuất hiện phản ứng chéo trong SVDK của

Úc đó là do các loại nọc rắn độc thuộc cùng 1 họ thường có các thành phầnđộc tố giống nhau như: three finger toxins, phospholipase A2 và enzyme hoạthóa prothrombin Các thành phần độc tố này quyết định tính đặc hiệu của cáckháng thể đơn giá dùng làm kháng thể bắt giữ trong SVDK Vai trò của từngthành phần độc tố gây ra phản ứng chéo với kít phát hiện một trong 5 loại rắn

ở Úc đã được khảo sát bởi Steuten và cộng sự (2007) [106]

Ở Ấn độ, Anindya (1996) đã phát triển một bộ xét nghiệm AB-ELISA(Avidin – Biotin – Enzyme linked immunosorbent assay) đặc hiệu loài, cókhả năng nhận biết được nọc độc của 4 loài rắn độc phổ biến ở Ấn Độ là:

Bungarus caeruleus, Naja naja, E Carinatus và daboia russelli russelli Toàn

bộ xét nghiệm mất khoảng 30 phút kể cả ủ, rửa và đọc kết quả Xét nghiệm cóthể tiến hành đơn giản ở nhiệt độ phòng, phản ứng màu có thể đọc bằng mắtthường Bộ xét nghiệm có thể phát hiện nọc độc ở nồng độ 1 ng/ml Bộ xétnghiệm này đã chứng minh hiệu quả trên lâm sàng với khả năng phát hiện nọcrắn độc trong các mẫu máu, huyết thanh, nước tiểu và dịch vết cắn được lấy

từ 27 bệnh nhân bị rắn độc cắn [15]

Cho dù những bộ xét nghiệm của Úc và Ấn độ (hình 1.10) được chứngminh là hữu ích trong chẩn đoán rắn độc cắn, nhưng những bộ xét nghiệmmiễn dịch này không phù hợp cho việc phát hiện nọc rắn độc ở các khu vựckhác trên thế giới vì có sự khác nhau về phân bố các loài rắn giữa các khuvực Các nghiên cứu về thành phần nọc độc của các loài rắn khác nhau chothấy mỗi loài rắn độc có một thành phần nọc độc đặc trưng và do vậy việcphát hiện nọc độc của mỗi loài riêng biệt cần có các xét nghiệm có tính đặchiệu loài riêng rẽ, vì thế mỗi vùng lãnh thổ cần phát triển các bộ xét nghiệmriêng biệt để phát hiện nọc độc của các loài rắn độc phân bố trên chính khuvực đó [80], [81]

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nghiên cứu chế tạo huyết thanh thỏ đơn đặc hiệu kháng nọc rắn

Thỏ đực lông xám khoẻ mạnh, trọng lượng từ 2 – 2,5 kg, số lượng 12con do Ban chăn nuôi động vật, Học viện Quân Y cung cấp Thỏ được chialàm 4 lô, mỗi lô 3 con dùng để gây miễn dịch với nọc độc của một loài rắn

- Nghiên cứu đánh giá hiệu quả phát hiện nọc rắn độc của bộ xét nghiệm ELISA trên lâm sàng

Mẫu bệnh phẩm xét nghiệm phát hiện nọc rắn gồm: 115 mẫu máu toànphần, 119 mẫu nước tiểu và 4 mẫu dịch vết cắn được lấy từ 122 bệnh nhân bịrắn độc cắn điều trị tại khoa Bệnh nhiệt đới, Bệnh viện Chợ Rẫy Tp Hồ ChíMinh Thời gian từ tháng 5/2011 đến tháng 3 năm 2012

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân lấy mẫu xét nghiệm

+ Không phân biệt tuổi, giới tính, nghề nghiệp và vùng miền

+ Được chẩn đoán rắn độc cắn

+ Nhập viện điều trị tại khoa Bệnh nhiệt đới, Bệnh viện Chợ Rẫy, Tp HCM+ Chưa được điều trị bằng huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu

+ Tự nguyện và đồng ý cho lấy mẫu phục vụ nghiên cứu

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Nọc tổng số của 4 loài rắn độc (lục xanh, hổ đất, chàm quạp và hổchúa) do Trung tâm nuôi trồng và bảo tồn Dược liệu Quân Khu 9 (Trại rắnĐồng Tâm) cung cấp dưới dạng đông khô Nọc được thu thập từ nhiều cá thểrắn của mỗi loài, không phân biệt tuổi, giới để bảo đảm tính đại diện loài Sốlượng mỗi loại 1 gam Nọc tổng số của 4 loài rắn độc là sản phẩm nghiên cứuthuộc đề tài KCB 04.06.01 đã được hội đồng khoa học nghiệm thu năm 2009

(xem kết quả kiểm định nọc độc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đảo pha HPLC ở phần phụ lục).

(RP-Các tá chất Freund hoàn chỉnh (Complete Freund’s adjuvant - CFA);

Tá chất Freund không hoàn chỉnh (Incomplete Freund’s adjuvant - IFA);

Cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ; Dung dịch DMSO;

Biotin-N-hydroxysuccinimide ester; Phức hợp Avidin-HPR; Cơ chất phenylenediamine (OPD) do hãng Sigma (Sigma Co., Mỹ) cung cấp Các táchất, kháng thể và sinh phẩm được bảo quản trong lọ kín ở nhiệt độ -20°Choặc 4°C theo hướng dẫn của nhà sản xuất cho đến khi sử dụng

O-Kít tách chiết IgG bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột protein G vàkít định lượng protein bằng phương pháp đo màu do hãng Bio-Rad (Mỹ) cungcấp;

Hạt sepharose 4B hoạt hóa bằng CNBr do hãng Armersham (ThụyĐiển) cung cấp

Các chế phẩm huyết thanh ngựa đơn đặc hiệu loài rắn lục xanh (lô số

17, sản xuất ngày 24/09/2010) và rắn hổ đất (lô số 21, sản xuất ngày21/04/2010), loại đang được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân nhiễm độc dorắn cắn tại các cơ sở y tế, được Viện vắc xin và sinh phẩm y tế (IVAC) tạiNha Trang cung cấp (có giấy chứng nhận kiểm định chất lượng kèm theo)

Các phiến xét nghiệm 96 giếng đáy phẳng - loại có thể tách rời từngthanh, mỗi thanh gồm 8 giếng dùng chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiệnnọc rắn độc do hãng CORNING Mỹ sản xuất và cung cấp

Máy đo mật độ quang (đọc ELISA): DTX 880 multimode detector dohãng BECKMAN COULTER sản xuất, được sử dụng và bảo dưỡng định kỳtại phòng Protein - Độc chất và Tế bào, Trung tâm nghiên cứu Y dược họcQuân sự, Học viện Quân y

Các hoá chất khác và vật tư tiêu hao dùng cho nghiên cứu đều đạt tiêuchuẩn phân tích và được cung cấp từ chính hãng sản xuất

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên động vật theo

mô hình sau:

Sơ đồ 2.1 Mô hình nghiên cứu

2.2.1 Chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo huyết thanh thỏ kháng nọc rắn

2.2.1.2 Gây miễn dịch tạo huyết thanh thỏ kháng nọc rắn

Thỏ được chia làm 4 nhóm, mỗi nhóm 3 con:

- Lấy máu thỏ trước gây miễn dịch làm chứng âm

- Gây miễn dịch theo quy trình của Chotwiwatthanakun và CS (2001),

có cải tiến cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm đó là sử dụng liềuthấp, thể tích nhỏ, tiêm dưới da nhiều mũi dọc hai bên sống lưng và tiêm nhắclại [31]

+ Nhóm thỏ 1: gây miễn dịch bằng kháng nguyên nọc rắn chàm quạp+ Nhóm thỏ 2: gây miễn dịch bằng kháng nguyên nọc rắn hổ chúa+ Nhóm thỏ 3: gây miễn dịch bằng kháng nguyên nọc rắn lục xanh+ Nhóm thỏ 4: gây miễn dịch bằng kháng nguyên nọc rắn hổ đất

- Tiêm nhiều mũi dọc hai bên sống lưng và khoảng cách các mũi tiêmcách nhau 1 cm (hình 2.1)

- Gây miễn dịch nhắc lại được tiến hành sau mỗi 4 tuần

- Lấy máu thỏ vào ngày thứ 7 sau mỗi lần tiêm kháng nguyên nhắc lại

để kiểm tra hiệu giá kháng thể Huyết thanh được tách từ máu thỏ và bảo quản

ở -20 0C cho đến khi sử dụng

Hình 2.1 Chế tạo kháng nguyên nọc rắn và gây miễn dịch trên thỏ