Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi nấm gây bệnh héo rũ gốc mốc đen trên cây lạc (arachis hypogaea l ) và thử nghiệm tạo chế phẩm vi sinh vật

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG BÙI THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM GÂY BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC ĐEN TRÊN CÂY

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

BÙI THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM GÂY BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC ĐEN TRÊN CÂY

LẠC (ARACHIS HYPOGAEA L.) VÀ THỬ NGHIỆM

TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT

Đà Nẵng - Năm 2017

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

BÙI THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM GÂY BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC ĐEN TRÊN CÂY

LẠC (ARACHIS HYPOGAEA L.) VÀ THỬ NGHIỆM

TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT

Ngành : SƯ PHẠM SINH HỌC

Người hướng dẫn : PGS.TS Đỗ Thu Hà

Đà Nẵng - Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đà Nẵng, tháng 05 năm 2017 Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Quyên

LỜI CẢM ƠN

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn PGS-TS Đỗ Thu Hà đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh – Môi trường – Đại Học

Sư Phạm – Đại Học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 SƠ LƯỢC VỀ XẠ KHUẨN 4

1.1.1.Cấu tạo của xạ khuẩn 4

1.1.2.Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.1.3 Ứng dụng của CKS trong bảo vệ thực vật 8

1.2 KHÁI QUÁT VỀ NẤM ASPERGILLUS NIGER 9

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÂY LẠC 12

1.3.1 Giá trị về kinh tế của cây lạc 12

1.3.2 Các bệnh thường gặp trên cây lạc 13

1.4 VỊ TRÍ ĐỊA LÝ VÀ ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN XÃ ĐIỆN THẮNG BẮC-ĐIỆN THẮNG TRUNG VÀ ĐIỆN TIẾN CỦA THỊ XÃ ĐIỆN BÀN- QUẢNG NAM 16

1.4.1 Vị trí địa lý 16

1.4.2 Điều kiện tự nhiên 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.2 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.3.1 Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa 19

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 19

2.3.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo xác định chủng nấm gây bệnh24

2.3.4 Đánh giá hiệu quả phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây lạc 24

2.3.5 Phương pháp xử lí số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 26

3.1 PHÂN LẬP CHỦNG VI NẤM GÂY BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC ĐEN TRÊN CÂY LẠC 26

3.2 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG MẠNH VỚI CHỦNG VI NẤM ASPERGILLUS NIGER GÂY BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC ĐEN TRÊN CÂY LẠC 31

3.2.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn Streptomyces 31

3.2.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn phân lập có khả năng đối kháng mạnh với chủng vi nấm Aspergillus niger (gây bệnh héo rũ gốc mốc đen) 33 3.2.3 Đặc điểm nuôi cấy, hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng XK tuyển chọn là XK08 và XK11 37

3.3 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN XỐP CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM ASPERGILLUS NIGER GÂY BỆNH TRÊN CÂY LẠC 39

3.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHẾ PHẨM XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS NIGER GÂY BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC ĐEN TRÊN CÂY LẠC 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1 KẾT LUẬN 45

2 KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

1 Đặc điểm cấu tạo của nấm mốc Aspergillus niger 10

3.1 Lây nhiễm chủng vi nấm Aspergillus trên cây lạc 29

3.2 Hoạt tính kháng VSVKĐ của 12 chủng xạ khuẩn Streptomyces 34

3.3 Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của chủng XK08 và XK11 38

3.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 2 chủng XK08 và XK11 39

3.5 Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn với nấm Aspergillus

3.6 Số lượng cây con mắc bệnh và chết trên 3 công thức sau khi lây

2.3 Mô hình bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 2 26

3.2 Khuẩn lạc của chủng vi nấm Aspergillus trên môi

3.3 Cơ quan sinh sản của chủng vi nấm Aspergillus gây

3.4 Kết quả xử lý nấm Aspergillus (bên trái) và đối chứng

(bên phải) trên cây lạc 20 ngày tuổi 29

3.5 Các triệu chứng bệnh khi lây nhiễm nấm Aspergillus

3.6 Cơ quan sinh sản cảu nấm Aspergillus sau khi lây

3.7 Nhân sinh khối nấm Aspergillus trên môi trường PDA

để lây bệnh nhân tạo sau 4 ngày 31

3.8 Dịch bào tử của chủng nấm Aspergillus sau 4 ngày

nuôi cấy trên môi trường PDA 31

3.9

Các chủng xạ khuẩn phân lập được tại 3 xã Điện Thắng Bắc, Điện Thắng Trung và Điện Tiến của thị xã Điện Bàn, Quảng Nam

33

3.10 Hình ảnh ống giống của 12 chủng xạ khuẩn có hoạt

3.11 Vòng vô khuẩn của 12 chủng xạ khuẩn tuyển chọn đối

với nấm bệnh ở cây lạc trên môi trường Gause II 36

3.16 Chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces sản xuất bằng

phương pháp lên men xốp trên môi trường trấu cám 41

3.18 Cây lạc sau 10 ngày lây nhiễm nấm Aspergillus ở CT2

PHẦN MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu của con người về vấn đề lương thực, thực phẩm ngày càng được nâng cao Nhưng trong sản xuất nông nghiệp hiện nay, người ta tăng cường gieo trồng các loại cây khác nhau trên một cùng đơn vị diện tích, chính điều này đã dẫn đến những vấn đề lớn về nguồn bệnh tồn tại lâu dài trong đất Ngoài ra, do thâm canh sản xuất và sự tăng trưởng của hóa học nông nghiệp đã và đang làm thay đổi rất nhiều đến môi trường sinh thái, hệ vi sinh vật và côn trùng có ích Trước tình hình đó, biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại bằng phương pháp sinh học là một trong những hướng nghiên cứu được các nhà khoa học quan tâm nhiều hơn Đây là hướng chiến lược, giữ vai trò đặc biệt quan trọng trong phòng trừ tổng hợp bệnh hại trên cây trồng ở hiện tại và tương lai Các chủng vi sinh vật (VSV) không những ngăn chặn được một số bệnh hại trên cây mà còn không gây ô nhiễm

môi trường, không gây hại cho người và gia súc Xạ khuẩn Streptomyces là

một trong những nhóm có tiềm năng lớn, vì tỷ lệ loài này có khả năng sinh chất kháng sinh (CKS) cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây có giá trị kinh tế cao, sản phẩm được

sử dụng rộng rãi trong đời sống hằng ngày, trong công nghiệp chế biến và xuất khẩu Ngoài ra, lạc là một loại cây trồng cải tạo đất quan trọng, rễ của chúng có khả năng cố định nito tự do từ không khí thành đạm sinh học mà cây

có thể sử dụng nhờ vi khuẩn nốt sần Rhizobium sống cộng sinh trong rễ

Điện Bàn là một thị xã giàu tiềm năng về nông nghiệp Trong đó cây lạc là một trong những cây đóng vai trò chủ đạo Hằng năm, các bệnh do nấm

đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng của cây lạc Bệnh phát sinh và gây hại trong cả chu kỳ sống của cây, trên đồng ruộng

và trong kho bảo quản, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người

Vì vậy việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh CKS chống nấm gây bệnh trở nên quan trọng Nó góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn, bền vững

Xuất phát từ những yêu cầu thực tế với mong muốn góp phần hạn chế tác hại của vi nấm trên cây lạc ở thị xã Điện Bàn - Quảng Nam, nhằm giảm chi phí sản xuất và cải thiện kinh tế hộ gia đình nên chúng tôi tiến hành chọn

đề tài: ‘‘Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng

kháng vi nấm gây bệnh héo rũ gốc mốc đen trên cây lạc (Arachis

hypogaea L.) và thử nghiệm tạo chế phẩm vi sinh vật’’

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Nghiên cứu tuyển chọn và ứng dụng một số chủng xạ khuẩn

(Streptomyces) có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh héo rũ gốc mốc

đen trên cây lạc (Arachis hypogaea L.) tại một số xã của thị xã Điện Bàn –

Tỉnh Quảng Nam Làm cơ sở khoa học cho việc tạo chế phẩm và ứng dụng vào thực tiễn địa phương

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu chủng vi nấm gây bệnh héo rũ gốc mốc đen trên cây lạc

(Arachis hypogaea L.) tại 3 xã Điện Thắng Bắc, Điện Thắng Trung và Điện

Tiến của thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

- Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn (Streptomyces) có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh héo rũ gốc mốc đen trên cây lạc (Arachis

hypogaea L.)

- Tiến hành lên men xốp và tạo chế phẩm từ các chủng xạ khuẩn

(Streptomyces) tuyển chọn để ứng dụng chống vi nấm gây bệnh héo rũ gốc

mốc đen trên cây lạc (Arachis hypogaea L.)

4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Tuyển chọn và lưu giữ các chủng xạ khuẩn Streptomyces có hoạt tính

kháng vi nấm gây bệnh héo rũ gốc mốc đen trên cây trồng phân lập tại một số

xã của thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

- Xác định một số môi trường thích hợp có hiệu quả cao để lên men tạo chế phẩm, góp phần cải tạo đất, chống bệnh cho cây trồng ứng dụng tại địa phương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ XẠ KHUẨN

1.1.1.Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng

da, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu tạo tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh học khác nhau Khuẩn lạc xạ khuẩn

có màu sắc khác nhau như: đỏ, da cam, vàng, nâu, tím, xanh … tùy thuộc vào loài và điều kiện môi trường Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài mặt môi trường thạch tạo thành hệ sợi khí sinh (HSKS) và hệ sợi cơ chất (HSCC) Phần cuối của HSKS thường biến thành cuống sinh bào tử có nhiều loại hình dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc đơn…

Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử với phương pháp phân đoạn hay cắt khúc, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que Hình dạng

và kích thước cuống sinh bào tử, hình dạng, kích thước và bề mặt bào tử là một tiêu chuẩn quan trọng trong phân loại xạ khuẩn [17]

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng

là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn… khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau

là khác nhau

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có trong đất, nước, rác, bùn, thậm chí trong cả những cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển

được Xạ khuẩn là một trong những loại VSV đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên, tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, nước Đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 0-70 xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng này Cho đến nay trong

số hơn 10.000 CKS được mô tả khoảng 80 có nguồn gốc từ xạ khuẩn, trong

đó 15 có nguồn gốc từ các loại XK hiếm như Micromonospora Các XK

hiếm cung cấp nhiều CKS có giá trị chiếm 1 3 các CKS kháng khuẩn đang sử dụng trong y học như gentamixin, tobramixin v.v Ngoài khả năng hình thành CKS xạ khuẩn còn có khả năng sản sinh hàng loạt các chất hữu cơ có giá trị như :

Vitamin nhóm B (B1, B2 )

Các acid hữu cơ (lactic, axetic)

Các loại enzyme như protease, amylase

Một trong những đặc điểm đáng lưu tâm của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự xếp lại trong phân tử AND Điều này gây ra một số hiện tượng kỳ lạ khác, tạo ra tính đa dạng của hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng Hơn nữa sự tự nhân lên của các đoạn AND còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền ở xạ khuẩn [29]

1.1.2.Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh trên thế giới và ở Việt Nam

a Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh trên thế giới

Năm 2000 Khoa Lây của Trung tâm nghiên cứu khoa học “Wyeth –

Ayerst” Mỹ đã tách được từ XK hiếm Saccharothrix espanaensis sinh các

chất kháng sinh Saccharomycin A và B, đó là 2 KS Heptadecaglycoside mới Các KS mới này có hiệu quả cao đối với việc chống vi khuẩn và nấm gây bệnh ở động thực vật [28]

Năm 2002, CKS mới munumicins được tách ra từ XK Streptomyces

NRRL 30562 Các CKS munumicins A, B, C và D là có hoạt phổ rộng, kháng được vi khuẩn Gram dương và nấm gây bệnh thực vật Các CKS munumicins

có khả năng kháng các VSVKĐ khác nhau Ví dụ, munumicins B kìm hãm

được vi khuẩn Staphycococcus aureus kháng methicillin, trong khi đó

munumicins A không có khả năng này Ngoài ra, munumicins D còn kìm hãm

được Plasmodium falciparum gây bệnh sốt rét [18]

Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn phát hiện được hàng loạt các CKS mới Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách

chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP – A035 bằng phương pháp sắc ký cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm bệnh Aspergillus

fumigalus và Candida albicans Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại

các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01 - 0,3 mg/ml [5]

Năm 2007, từ các mẫu đất tại phía Đông Nam Serbia đã phân lập được

loài xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus sinh CKS nhóm polyen có khả năng chống lại nấm Botrytis cinerea gây bệnh thối xám hại nho và kháng virus Herpes simples Tại Hàn Quốc phân lập được loài xạ khuẩn

Streptomyces sp C 84 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả

những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin, kháng được nấm gây bệnh trên thực vật

Năm 2008 từ 7 mẫu đất nông nghiệp ở Sarawak, Kuala Lumpur đã phân

lập được 2 XK thuộc chi Streptomyces trong đó có 37 chủng sinh CKS đối kháng với nhiều VSVKĐ: Fusarium palnivora, Bacillus subtilis, Ralstonia

solanacerarum Làm cơ sở để tạo ra các CKS kháng nấm, hướng tới một nền

nông nghiệp sinh thái bền vững [13]

Năm 2011, tại Thái Lan đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces

cavurensis từ đất ở vùng rễ cây trồng ức chế chống lại nấm Collectotrichum

spp, tác nhân gây bệnh thán thư Đã thu được 304 chủng xạ khuẩn trong đó có

202 chủng có hoạt tính kháng sinh chiếm 73 kháng được ít nhất một loại nấm mốc hoặc nấm men; 17,8 chống lại 3 loại nấm gây bệnh thán thư [32] Tháng 1 năm 2012 tại Ấn Độ đã phân lập và xác định đến loài xạ khuẩn

Pseudonocardia azurea sp Từ vùng đất trầm tích của các hệ sinh thái rừng

ngập mặn Ninzampatnam tại vùng ven biển phía nam của Andhra Pradesh Đây là chủng xạ khuẩn hiếm tiết ra CKS azureomycin A và B có hiệu quả chống nấm gây bệnh trên phạm vi rộng [14]

b Tình hình nghiên cứu CKS ở Việt Nam

Trường Đại học Tổng Hợp Hà Nội (nay thuộc Đại Học Quốc Gia Hà Nội), Đại Học Sư Phạm Hà Nội đã nghiên cứu sự phân bố, sự lên men các chủng xạ khuẩn sinh CKS có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng từ đất Việt Nam Viện Khoa Học Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất và khả năng ứng dụng của chế phẩm Biovit, Teravit, Baxitraxin vào chăn nuôi và bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp Trong nhiều năm qua Trường Đại Học Dược và các Xí nghiệp Dược đã thực hiện hàng tram các thí nghiệm lên men CKS: Clotetraxillin, oxytetraxillin, erythromyxin, neomyxin….đã thu được những kinh nghiệm nhất định về công nghệ sinh học và công nghệ kháng sinh [25]

Vào năm 2000, Vi Thị Đoan Chính là người đầu tiên ở Việt Nam đã sử dụng kỹ thuật gây đột biến trên tế bào trần để nghiên cứu nâng cao hoạt tính

kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces

hygroscopius 5820 sản sinh oxytetraxillin phân lập được ở đất Việt Nam

Năm 2004, Kiều Hữu Ảnh đã xác định đến loài chủng xạ khuẩn

Streptomyces hygroscopius có khả năng sinh kháng sinh chống các nấm gây

bệnh trên thực vật: F oxysporum, Scierotifum tolfsii và bước đầu thử nghiệm

chế phẩm trên đồng ruộng [8]

Năm 200 , Bùi Thị Việt Hà đã phân lập được 508 chủng xạ khuẩn từ 71 mẫu đất khác nhau ở Việt Nam và xây dựng được cây phát sinh chủng loại của 3 chủng XK T-41, D-42, TC-54, xác định được cấu trúc hóa học của CKS

TC-54 Đây là lần đầu tiên một chủng XK được nghiên cứu từ khâu đầu phân lập đến tìm ra cấu trúc phân tử [4]

1.1.3 Ứng dụng của CKS trong bảo vệ thực vật

Hiện nay, sự phát triển ở nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo

vệ thực vật hóa học với mục đích khai thác, chạy theo năng suất và sản lượng Chính vì vậy, sự canh tác trên đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất…Do đó, để khắc phục các nhược điểm trên thì ngoài các biện pháp thay đổi mùa vụ, thay đổi

cơ cấu cây trồng, tuyển chọn các giống cây trồng có khả năng kháng lại sâu bệnh thì biện pháp sử dụng CKS đã và đang được nghiên cứu CKS có nhiều

ưu điểm hơn so với thuốc hóa học như có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao, không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng Không gây ô nhiễm môi trường sinh thái và đặc biệt nó còn

có khả năng ức chế cả những VSV đã kháng lại thuốc hóa học

Trong vòng vài chục năm trở lại đây, Nhật Bản đã sản xuất ở quy mô

công nghiệp 10 loại CKS chống bệnh ở thực vật như blastisidin từ xạ khuẩn

S.griseochromogenes, kasugamixin từ S.kusugaensis, validamixin từ S.hygroscopicus Các CKS này có khả năng chống bệnh đạo ôn, khô vằn hại

lúa rất có hiệu quả, độ độc thấp Ở Anh và các nước Châu Âu khác đã sử dụng

KS griseofulvin, Ấn Độ sử dụng aureofunvin chống bệnh thối cổ rễ [19]

Ở Trung Quốc cũng đã tuyển chọn được chủng Streptomyces.sp.5406

phân lập được từ vùng đất rễ cây cỏ đinh lăng và cây bông có khả năng ức chế

Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum gây thối rễ ở cây bông non

Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces.sp.201 có khả

năng sinh chất kháng sinh mới là z-methylheptul iso- nicotinate, CKS này có

khả năng kháng được nhiều loài nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum,

F.Solani, F.semitectum…

Tháng 1 năm 2003 khoa Bệnh học Thực vật Trường Đại Học Quốc Gia Chung Hsing ở Taichung Đài Loan đã phân lập được chủng xạ khuẩn

Streptomyces padanus PMS- 702 có khả năng sinh kháng sinh fungichromin

Chất kháng sinh fungichromin có khả năng kháng khuẩn mạnh tiêu diệt được

Rhizotonia solani AG-4, một tác nhân làm chết cây bắp cải khi bị ngập nước

Nếu xử lý hạt bắp cải với dịch lọc của chủng xạ khuẩn Streptomyces padanus

PMS-702 có tác dụng làm giảm khả năng bị chết do ngập nước của cây bắp cải [17]

Năm 2008, chế phẩm Antiforhis được Viện Công Nghệ Sinh Học-Bộ Nông Nghiệp- Phát Triển Nông Thôn đã nghiên cứu và sản xuất bằng phương pháp lên men xốp thanh trùng trên nền giá thể dinh dưỡng Chế phẩm này có

nguồn gốc từ 5 chủng VSV chọn lọc đối kháng nấm gây bệnh Pseudomonas

fluorescens chống bệnh héo vàng trên cây cà chua và lỡ cổ rễ cây bắp cải

1.2 KHÁI QUÁT VỀ NẤM BỆNH ASPERGILLUS NIGER

* Giới thiệu chung

Nấm Aspergillus niger là loài phổ biến trong chi Aspergillus, phân bố

rộng rãi trên cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông – công nghiệp và ở

nhiều vùng khác nhau trên thế giới Hiện nay, A.niger được sử dụng chủ yếu

trong nông nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như glucoamylase, protease, cellulose), công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric

* Phân loại khoa học [8]

Sinh giới : Eukaryot

Giới : Fungi

Ngành : Amastigomycota

Ngành phụ : Ascomycotina

Loài : Aspergillus niger

Bảng 1: Đặc điểm cấu tạo của nấm mốc Aspergillus niger

Tên nấm mốc Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm vi thể

A.niger

Khóm nấm mốc có đường kính 4, 5cm trên thạch Czapek sau 5 ngày Khóm nấm mốc màu đen hoặc nâu đen

Bông hình cầu có màu đen Bọng hình cầu Thể bình một hoặc hai tầng Hạt đính hình cầu

Cơ thể dạng sợi, gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi (lypha), hợp lại thành hệ sợi nấm (mycelium)

Khuẩn ty của nấm mốc A.niger tăng trưởng ở ngọn, vừa dài ra vừa

ngăn vách tạo thành nhánh Khuẩn ty có 2 loại:

+ Khuẩn ty cơ chất (hay khuẩn ty dinh dưỡng) có kích thước nhỏ, màu trắng, bám chặt vào cơ chất môi trường và hấp thu các chất dinh dưỡng Các khuẩn ty này bện thành khối Khi già hệ sợi nấm mốc ngả sang màu vàng

+ Khuẩn ty khí sinh (hay khuẩn ty sinh sản) có kích thước lớn hơn khuẩn ty cơ chất nhiều lần, trong suốt bề mặt cơ chất và từ khuẩn ty khí sinh

sẽ có một sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt, mang bào tử

Thành của khuẩn ty nấm có cấu tạo sợi, thành phần hóa học là chitin và glucan

* Đặc điểm sinh lý [3]

Nấm A.niger phân bố nhiều trong tự nhiên, trong đất, ở xác bã thực vật,

hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng khí hậu ấm áp

Chúng là những cơ thể hiếu khí sống hoại sinh hoặc ký sinh, không có khả năng quang hợp tạo chất hữu cơ mà sống nhờ khả năng hấp thụ các loại chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ty

* Đặc điểm sinh hóa [3]

Khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau: A.niger đồng hóa tốt các

loại đường như glucose, fructose, mantose Đối với đường Sorbose, galactose,

A.niger đồng hóa ở mức khá tốt, còn đường lactose thì đồng hóa ở mức trung

bình

* Đặc điểm sinh sản [3]

A.niger có thể sinh sản theo hai hình thức chính:

- Sinh sản sinh dưỡng: từ một đọan khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành một hệ sợi nấm Khuẩn ty của nấm mốc có thể lẫn vào bụi, không khí bay đi khắp nơi, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nhanh chóng phát triển thành khuẩn lạc mới

- Sinh sản vô tính: Reaper và thơm (19 8) cho rằng A.niger sinh sản vô

tính bằng bào tử trần (conidiogenous cell) Các bào tử này sinh ra trực tiếp trên khuẩn ty hoặc đặc biệt là cuống sinh bào tử trần (conidiophone)

* Ứng dụng và tác hại của nấm A niger

- Ứng dụng: A niger được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học

để sản xuất phụ gia thực phẩm, các enzyme dùng trong công nghiệp và dược phẩm Ngoài ra loài này còn được sử dụng để sản xuất protein ngoại lai cà acid citric, acid glutamic cũng như có tiềm năng ứng dụng trong phân hủy sinh học

- Tác hại: A niger gây ra nấm mốc đen của hành, lạc, nho Ngoài ra nó

còn là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất của nhiễm trùng tai nấm,

mà có thể gây đau, thính lực tạm thời mất mát

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÂY LẠC

1.3.1 Giá trị về kinh tế của cây lạc

* Giá trị dinh dưỡng

Sản phẩm chính của cây lạc là hạt lạc Hạt lạc là loại hạt to và chứa nhiều dinh dưỡng như lipit, protein, glucid và các amin Trong đó lipid (dầu) chiếm tỉ lệ lớn nhất, sau đó là protein và glucid Nó cung cấp một nguồn năng lượng rất lớn

* Giá trị xuất khẩu

Trên thị trường thế giới, lạc là mặt hàng của nhiều nước Do giá trị nhiều mặt của hạt lạc nên chưa bao giờ lạc mất thị trường tiêu thụ Hiện nay

có 5 nước xuất khẩu lạc chủ yếu đó là Trung Quốc, Mỹ, Achentina, Ấn độ và Việt Nam

Trong niên vụ 2012- 2013, Việt Nam tiếp tục xuất khẩu một lượng nhỏ ( ,5 nghìn tấn) lạc vỏ và lạc nhân, chủ yếu sang Thái Lan và Đài Loan, tăng

18 so với năm trước USDA dự đoán rằng con số này sẽ tăng nhẹ trong 2 niên vụ tiếp theo do sự gia tăng các nguồn cung cấp hàng xuất khẩu

Bảng 2: Tình hình xuất khẩu lạc* của Việt Nam

Lạc vỏ (nghìn tấn)

(Mã HS: 120210 và 120241)

1.845 990 484 400 Lạc nhân (nghìn tấn)

(Mã HS: 120220 và 120242)

2.036 3.342 4.460 4.962

Tổng sản lượng chuyển đổi thành lạc vỏ

xuất khẩu (nghìn tấn) (tỉ lệ chuyển đổi 1,33) 4.553 5.435 6.416 7.000

Nguồn: GTA, *số liệu dự báo của USDA

* Giá trị công nghiệp

Do giá trị dinh dưỡng của lạc, con người đã sử dụng như nguồn thực phẩm quan trọng như luộc, rang, ép dầu ăn, làm khô dầu để chế biến nước chấm và chế biến nhiều mặt hàng khác… Gần đây nhờ công nghiệp thực phẩm phát triển, người ta chế biến nhiều mặt hàng thực phẩm có giá trị từ lạc như bơ lạc, chao, phomat sữa, loại dầu xấu dùng để nấu xà phòng

* Giá trị nông nghiệp

Khi phân tích thân lá lạc thì có 47 đường bột, trên 15 chất hữu cơ chứa Nitơ và 1,8 chất béo nên thân lá lạc có thể dùng làm thức ăn cho gia súc

Lạc có bộ rễ rất sâu và có nhiều nốt sần tự hút được đạm đáng kể Vì vậy trồng lạc có tác dụng cải tạo đất, tăng độ phì nhiêu của đất, tạo điều kiện cho việc thâm canh, tăng năng suất đối với đất bạc màu, ở vùng trung du

Tóm lại, lạc là cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, cần phải nghiên cứu phát triển để phát huy lợi thế của vùng để góp phần xây dựng bộ mặt nông thôn mới phù hợp với công nghiệp hóa, hiện đại hóa

1.3.2 Các bệnh thường gặp trên cây lạc

Bệnh hại lạc gây ra bởi 31 nấm, 2 vi khuẩn, 9 virus, 1 mycoplasma và

loài tuyến trùng thực vật Lạc bị tấn công bởi một số bệnh do nấm và vi khuẩn Tuy nhiên, chỉ có một trong số đó là rất quan trọng về mặt kinh tế Trong số những bệnh quan trọng về kinh tế, lây lan rộng hơn những bệnh khác

Ba bệnh nấm trên đó là:

- Đốm đen (Cercosporidium personatum)

- Đốm nâu (Cercospora arachidicola)

- Gỉ sắt (Puccinia arachidis)

Trong số các nấm gây bệnh trong đất phổ biến nhất là:

- Mốc vàng (Aspergillus flavus)

- Aspergillus parasiticus

- Héo rũ gốc mốc trắng (Sclerotium rolfsii)

Nấm bệnh hại lạc thường được chia làm 3 nhóm chính dựa vào bộ phận gây hại trong các giai đoạn sinh trưởng khác nhau

- Nhóm bệnh héo rũ gây chết cây

- Nhóm bệnh hại lá

- Nhóm bệnh hại quả, hạt

a Nhóm bệnh héo rũ gây chết cây

- Bệnh héo rũ gốc mốc đen lạc do nấm Aspergillus niger

Nấm Aspergillus niger gây ra hiện tượng thối hạt, lạc chết mầm và

chết héo cây con trong vòng 30 ngày sau trồng Trên vết bệnh, sợi nấm và cành bào tử phân sinh thường được quan sát thấy ở vùng cổ rễ và xuất hiện rất nhanh sau khi hạt nẩy mầm Sợi nấm xâm nhập trực tiếp vào cổ rễ, đoạn thân ngầm sát mặt đất làm cho biểu bì, vỏ thân bị nứt rạn, thâm đen, thối mục, làm cho cây bị héo rũ, chết khô

Aspergillus niger tồn tại trong đất, trên hạt giống với tỷ lệ hạt bị nhiễm

bệnh lên tới 90 Nấm bệnh truyền qua đất và có khả năng phát triển mạnh trong điều kiện biến động lớn của độ ẩm đất, chất lượng hạt giống kém và tỷ

lệ sát thương cao Độc tố do nấm sản sinh gây ra ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây như rễ quăn xoắn, biến dạng ngọn, thậm chí cả các axit béo tự do

trong hạt cũng chứa độc tố Nấm Aspergillus niger là loài nấm đất gây bệnh

héo rũ trên hạt đồng thời là nấm hại hạt điển hình Trên thế giới đã có rất

nhiều nghiên cứu về nấm Aspergillus niger, người ta đã phân lập được 37 loài

gây hại trên thực vật

- Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii

Nhiều nghiên cứu về nấm cho thấy: Sclerotium rolfsii có khả năng

sản sinh ra một lượng lớn axit oxalic Độc tố này xâm nhập làm biến đổi màu

ở trên hạt và gây nên những đốm chết hoại trên lá ở giai đoạn đầu phát triển

bệnh Sclerotium rolfsii có sợi nấm màu trắng phát triển mạnh, trên vết bệnh

hình thành hạch nấm màu trắng khi non, và khi già có màu nâu, đường kính hạch nấm từ 1 – 2 mm Hạch nấm không chỉ tồn tại trên cây, quả, hạt, đất trồng lạc mà còn có mặt trên tàn dư của các cây trồng khác Đặc biệt hạch nấm có thể tồn tại lâu dài trong tầng đất canh tác

do Fusarium solani Khi cây trưởng thành Fusarium oxysporum gây triệu

chứng thối rễ làm cho cây bị héo từ từ hoặc héo rũ, lá cây chuyển màu vàng hoặc xanh xám, đôi khi lá bị rụng trước khi chết, bó mạch và rễ bị thâm

nâu Fusarium spp tồn tại trong đất và trên tàn dư thực vật

-Bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani)

Rhizoctonia solani sản sinh ra một lượng lớn enzyme cellulilitic,

pectinolitic và các độc tố thực vật Đây chính là nguyên nhân gây ra bệnh thối hạt làm chết cây con, thối lá mầm, thối rễ, gây cháy lá lạc khi nấm này xâm

nhập vào cây Nấm Rhizoctonia solani cùng với Fusarium spp gây ra bệnh

chết vàng lạc, làm cho cây con héo vàng từ từ, ở phần gốc thân biến mầu nâu

và có thể làm cho lớp vỏ thân cây hơi bị nứt

b Nhóm bệnh hại quả hạt

* Bệnh mốc vàng (Aspergillus flavus)

Hạt giống và cây con bị nhiễm bệnh cổ rễ có màu nâu đậm hoặc màu đen,

mô mục rữa bao phủ bởi bào tử nấm và hệ sợi nấm Nấm biến đổi màu sắc tùy thuộc vào từng loài Sự thối hạt diễn ra nhanh nhất khi hạt giống bị bệnh được gieo xuống đất vì nấm từ hạt giống hoạt động ngay sau khi hạt giống hút nước Vi khuẩn cũng có trong hạt giống thối rữa nhưng thường vi sinh vật thứ

cấp sau khi hạt giống bị tấn công bởi nấm (Subrahmanyam et al, 1992)

1.4 VỊ TRÍ ĐỊA LÝ VÀ ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN XÃ ĐIỆN THẮNG BẮC-ĐIỆN THẮNG TRUNG VÀ ĐIỆN TIẾN CỦA THỊ XÃ ĐIỆN

BÀN- QUẢNG NAM

1.4.1 Vị trí địa lý

Điện Thắng Bắc và Điện Thắng Trung, Điện Tiến là các xã thuộc thị xã Điện Bàn nhưng Điện Thắng Bắc và Điện Thắng Trung nằm về phía Đông của thị xã Điện Bàn còn Điện Tiến lại thuộc về phía Tây Ranh giới hành chính được xác định :

- Phía Bắc, Tây Bắc tiếp giáp với huyện Hòa Vang - TP Đà Nẵng

- Phía Nam, Đông Nam tiếp giáp với Thành phố Hội An

- Phía Đông tiếp giáp với biển Đông

- Phía Tây tiếp giáp với huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam

1.4.2 Điều kiện tự nhiên

* Đất đai, địa hình

Các xã có địa hình tương đối bằng phẳng, ít chia cắt Diện tích đất sản xuất nông nghiệp tập trung ở nhiều cánh đồng rộng lớn, năng suất cao và ổn định

Nhìn chung, xã nằm trong khu vực có kiểu khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa Tuy nhiên do chế độ mưa phân hóa theo mùa trong năm không đồng đều gây khô hạn, nhiễm mặn trong mùa khô và bão thường xảy ra vào các tháng 9, 10, 11 kết hợp với các trận mưa lớn gây lũ lụt, xói lở khu vực ven sông làm ảnh hưởng đến sản xuất và sinh hoạt đời sống của nhân dân

*Các nguồn tài nguyên đất

- Đất phù sa sông được bồi: diện tích 35 ha, chiếm 22,98 tổng diện tích, phân bố tập trung ở các khu vực thôn , thôn 7 và thôn 8

- Đất phù sa Glây: diện tích 47,35ha ; chiếm 30,43 tổng diện tích,

phân bố ở khu vực các thôn 1, thôn 2, thôn 3, thôn 4, thôn 9, thôn 11 và dọc theo tỉnh lộ ĐT 09 đoạn Đồng Tứ đi Vĩnh Điện

- Cồn cát và baĩ cát trắng vàng: diện tích 45,38ha; chiếm 3,25 tổng diện tích, đất cồn cát thường phân bố liền dọc theo bờ sông Thu Bồn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn Streptomyces được phân lập từ các mẫu đất tại 3

xã Điện Thắng Bắc, Điện Thắng Trung và Điện Tiến của thị xã Điện Bàn – Quảng Nam

2.1.2 Nấm bệnh

Nấm mốc Aspergillus gây bệnh thối rễ gốc mốc đen, phân lập trên cây

lạc và trong đất tại 3 xã Điện Thắng Bắc, Điện Thắng Trung và Điện Tiến của thị xã Điện Bàn – Quảng Nam

2.1.3 Cây lạc (Arachis hypogaea L.)

2.2 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa

Tiến hành lấy mẫu nghiên cứu tại ba xã Điện Thắng Bắc, Điện Thắng Trung và Điện Tiến của thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

2.2.2 Địa điểm và phạm vi nghiên cứu thí nghiệm

*Địa điểm nghiên cứu thí nghiệm

- Phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh của Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại Học Sư Phạm - ĐH Đà Nẵng

- Phòng thí nghiệm Vi sinh trường Cao Đẳng Lương Thực – Thực phẩm- Đà Nẵng

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn chi Streptomyces trong

đất có khả năng sinh CKS kháng vi nấm gây bệnh trên cây lạc (Arachis hypogaea L.) tại ba xã Điện Thắng Bắc, Điện Thắng Trung và Điện Tiến của

thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

- Lên men tạo chế phẩm từ các chủng xạ khuẩn (Streptomyces) đã được

tuyển chọn trên môi trường bán rắn

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ tháng 5 201 - 5/2017

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa

- Nguyên tắc lấy mẫu đất : mẫu được lấy theo phương pháp lấy điểm theo đường chéo, ở tầng đất từ 5-15 cm ở các vị trí khác nhau (4-5 vị trí) trong một vùng 100m2 Sau đó các mẫu đất đem trộn đều, đựng trong túi nilông đã khử trùng

- Xử lý mẫu đất tại chỗ: thực vật, động vật sống trong đất và đất sỏi được loại bỏ trước khi rây qua rây cỡ lỗ 2mm để tạo thuận lợi cho sự trao đổi khí giữa các hạt đất Đất được bóp vụn bằng tay và đảo đều để tránh lớp đất

bề mặt bị quá khô (công việc được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ không đổi xung quanh)

- Lưu giữ, vận chuyển và bảo quản mẫu: thắt túi hơi lỏng để tạo điều kiện hiếu khí Mẫu đất không để chồng lên nhau Mẫu đất đem về được phân lập ngay, càng sớm càng tốt hoặc bảo quản trong tủ lạnh 4o

C

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

a Phương pháp phân lập

* Phân lập xạ khuẩn và nấm Aspergillus

- Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorov: xạ khuẩn

được phân lập trên môi trường Gause I và Gause II và ISP-4; Nấm

Aspergillus trên môi trường PDA

- Cách tiến hành: Cân 1g mẫu đất đem nghiền, cho vào bình tam giác 250ml chứa 99ml nước cất vô trùng, lắc đều ta có nồng độ pha loãng 10-2 Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước cất vô trùng, lắc đều ta được dung dịch có độ pha loãng là 10-3 Tiếp tục pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-4, 10-5 Dùng pipet vô trùng hút ở mỗi độ pha loãng 0,1ml dịch mẫu và nhỏ vào các đĩa petri có chứa môi trường phân lập vô trùng Sau đó dùng que trang dàn đều giọt dịch trên mặt thạch Mỗi độ pha loãng cấy trên 3 đĩa petri, gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ

28 – 30oC Sau 3 - 5 ngày nuôi cấy, chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, mọc tốt, cấy chuyền sang thạch nghiêng chứa cùng môi trường phân lập đến khi thuần chủng Bảo quản giống ở nhiệt độ 4 – 6oC [1]

* Phương pháp phân lập mẫu bệnh cây [5], [8], [14]

- Phân lập từ thân, lá

Rửa mẫu thân, lá trong nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác Khử trùng bề mặt mô lá hoặc thân bằng cách dùng bông đã khử trùng thấm cồn 70% lau bề mặt thân, lá hoặc nhúng nhanh vào cồn 70% trong 5 giây, rửa lại trong nước cất vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng Sau đó dùng kéo cắt thành từng đoạn nhỏ 2x2mm từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, tiến hành cấy mẫu trên môi trường WA Đặt các đĩa petri

đã cấy mẫu bệnh trong tủ ấm ở nhiệt độ 280

C trong 2-3 ngày để cho sợi nấm phát triển trên môi trường Khi nấm bệnh đã mọc, tiến hành cấy chuyền sang môi trường PDA

-Phân lập từ rễ

Rửa mẫu rễ trong nước để loại bỏ đất và các tạp chất Gọt bỏ lớp

vỏ ngoài của rễ vì phần này thường chứa vi sinh vật hoại sinh Mô cấy được lấy từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh Phun xịt mẫu bằng cồn 70% Cắt những miếng mô mỏng và cấy lên môi trường WA, khi nấm mọc tiến hành cấy chuyền sang môi trường PDA

b Phương pháp giữ giống

Để bảo quản giống cho những nghiên cứu tiếp theo, tiến hành cấy truyền định kỳ 2 tháng 1 lần trên môi trường thạch nghiêng Nuôi cấy ở tủ ấm 28-

30oC trong 2-7 ngày, sau đó để vào tủ lạnh bảo quản ở 4oC Trước khi mang

ra sử dụng cần cấy truyền qua ống nghiệm mới đã có sẵn môi trường [1]

c Các phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh

*Phương pháp khối thạch

Cấy xạ khuẩn trên môi trường Gause I; Gause II; ISP-4 trong hộp petri sau 5-7 ngày, khi xạ khuẩn mọc tốt, dùng khoan nút chai khoan các khối thạch đặt vào hộp petri đã cấy VSV kiểm định Để vào tủ lạnh 5-7 giờ cho kháng sinh kịp khuếch tán rồi nuôi cấy ở nhiệt độ 28-30oC Đọc kết quả sau 3 ngày Hoạt tính kháng nấm được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn (D-d ; mm)

*Phương pháp đục lỗ

Dùng để thử hoạt tính kháng sinh trong dung dịch Dùng khoan nút chai khoan các lỗ trên bề mặt môi trường đã trộn VSV kiểm định ở hộp petri Nhỏ vào các lỗ khoan dung dịch cần thử kháng sinh Các bước tiến hành theo phương pháp khối thạch [10]