ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM MAI THỊ HOÀNG YẾN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT N-HEXANE VÀ ETHYL ACETATE HOA ĐU ĐỦ ĐỰC CAR
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu hoa của cây Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam- Đà Nẵng vào tháng 01 năm 2017 Hoa Đu đủ đực – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu
Cây Đu đủ đực được chọn lấy hoa cao khoảng 1,5 m – 2,0 m có nhiều lá và hoa Hoa Đu đủ đực nở theo chùm, màu trắng, hoa nở nhiều, còn nhiều nụ, không bị sâu Cuống hoa hình trụ, màu xanh lục, thân xốp
Bột hoa Đu đủ đực hơi thô, màu vàng nhạt, được bảo quản trong bình hút ẩm
Hình 2.1 Hoa Đu đủ đực và Bột hoa Đu đủ đực 2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Dung môi chiết n-hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol, ethanol và nước cất
Một số hóa chất khác cũng được sử dụng
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS
Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, tủ sấy, tủ nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc,…
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Xác định chỉ số vật lí
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 9
Chuẩn bị các cốc được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong tủ sấy đến khối lương không đổi m0 Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ.
Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu hoa Đu đủ đực, cân lấy khối lượng chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt độ 100 0 C Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân đến khối lượng mẫu không đổi m2
Cách tính độ ẩm : Độ ẩm của mỗi mẫu là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu Độ ẩm được tính theo công thức sau
Trong đó: m0: Khối lượng cốc sứ (g) m1: Mẫu bột hoa Đu đủ đực (g) m2: Cốc sứ chứa bột hoa đu đủ sau khi sấy (g)
W: Độ ẩm của mẫu (%) Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu
Tro toàn phần: Là khối lượng cặn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định
Cân 5 mẫu hoa Đu đủ đực sấy khô ở trên với khối lượng m1 đem than hóa sơ bộ trên bếp điện rồi cho vào lò nung ở 400-450 0 C trong thời gian từ 4 đến 6 tiếng, cho đến khi thu được tro trắng
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 10
Sau đó cho vào nung 2 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng m2 không đổi
Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy, là hiệu số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung
Hàm lượng tro được tính bằng công thức:
Trong đó: m0: Khối lượng cốc sứ m1: Mẫu hoa Đu đủ đực sau khi sấy khô (g) m2: Khối lượng của cốc sứ và hoa Đu đủ đực sau khi tro hóa (g) Hàm lượng tro được lấy trung bình từ các mẫu trên
Xác định hàm lượng kim loại
Mẫu hoa đu đủ sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 10% và được định mức bằng nước cất đến 10mL Lấy dung dịch đã định mức trên được đem đi xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu bột hoa Đu đủ đực thường được chiết theo phương pháp chiết rắn lỏng Trong nghiên cứu này tiến hành 3 phương pháp chiết: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm
Chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu bột hoa Đu đủ đực trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả
Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate Sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, với thể tích dung môi n-hexane/ethyl acetate thay đổi từ 100mL đến 300mL, ngâm trong thời gian 1 ngày Tiến hành chiết 5 mẫu với tỉ lệ Rắn/Lỏng khác nhau, lần lượt là 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30 Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 11
Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate Sử dụng phương pháp chiết ngâm dầm với tỉ lệ R/L 1/20 gồm khoảng 10g bột hoa Đu đủ đực và 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 1, 2, 3, 4, 5 ngày Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân
Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng bộ Soxhlet Sử dụng phương pháp chiết Soxhlet với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng10g, 200mL dung môi n-hexane ở nhiệt độ 78 o C (dung môi ethyl acetate ở nhiệt độ 87,1 o C) Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 2, 4, 6, 8, 10 giờ Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân
Khảo sát nhiệt độ: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết siêu âm lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng máy siêu âm Sử dụng phương pháp chiết siêu âm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate trong 30’ Tiến hành chiết 5 mẫu với nhiệt độ khác nhau, lần lượt là 30, 40, 50,
60 và 70 0 C Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân
Khảo sát thời gian: Mẫu bột hoa Đu đủ đực được chiết siêu âm lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, ethyl acetate bằng máy siêu âm Sử dụng phương pháp chiết siêu âm với lượng bột hoa Đu đủ đực khoảng 10g, 200mL dung môi n-hexane/ethyl acetate ở 50 0 C Tiến hành chiết 5 mẫu với thời gian khác nhau, lần lượt là 30, 60, 90,
120 và 150 phút Thu dịch chiết, cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi rồi cân
2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Việc định tính và định lượng sơ bộ một số hợp chất có trong các cao chiết được thực hiện thông qua việc đo phổ GC-MS
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 12
ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ LỚP CHẤT TRONG HOA ĐU ĐỦ ĐỰC
Cân 5g bột hoa Đu đủ đực ngâm trong dung dịch là hỗn hợp gồm chloroform: ethanol 95 độ : NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ là 8:8:1, môi trường phải có tính base Ngâm nguội trong 24 tiếng, để ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng lắc trộn
Sau khi ngâm, đem lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc, lấy dịch lọc để thử với 2 loại thuốc thử Mayer, Wagner
Sau khi thử dịch chiết với:
Thuốc thử Mayer: Xuất hiện kết tủa vàng, phản ứng dương tính
Thuốc thử Wagner: Xuất hiện kết tủa nâu, phản ứng dương tính
Ngâm 5g bột hoa Đu đủ đực trong dung môi ethanol, lọc lấy dịch Cho 1mL dịch lọc vào ống nghiệm rồi đem thử với các phản ứng:
Phản ứng với dung dịch H2SO4 đậm đăc: Thêm vài giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm chứa dịch lọc Nếu là flavone, isoflavone, flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam Chalcone, aurone cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ Flavonol cho màu từ cam đến đỏ
Phản ứng với dung dịch NaOH 1%: Thêm vài giọt dung dich NaOH 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc Nếu là flavone, isoflavone, isoflavanone, flavanone, chalcone, Leucoanthocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam aurone cho màu tím đến đỏ tím
Ngâm 5g bột hoa Đu đủ đực trong 50mL ethanol, lọc lấy dịch lọc, cho 2-3mL dịch lọc vào 2 ống nghiệm và thử bằng phản ứng mở đóng vòng lactone ̵ Ống 1: Thêm 0,5mL dung dịch NaOH 10% ̵ Ống 2: Giữ nguyên
Sau đó đun cách thủy cả 2 ống trong vài phút, để nguội thêm vào mỗi ống 4mL nước cất, nếu ống 1 trong hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa bằng H2SO4 loãng mà ống
1 đục hơn ống 2 thì có coumarin
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 13
Cân 1g bột hoa Đu đủ đực, cho vào cốc và 5mL ethanol đun cách thủy 5 phút, lọc lấy dung dịch để thử nghiệm trong 2 ống nghiệm có kích thước bằng nhau ̵ Ống 1: 5mL HCl 0,1N (pH=1) + 3giọt dung dịch ancol chứa mẫu thử ̵ Ống 2: 5mL NaOH 0,1N (pH) + 3 giọt dung dịch ancol chứa mẫu thử
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bọt bong bóng ở cả 2 ống nghiệm:
Nếu cột bọt trong cả 2 ống nghiệm cao bằng nhau và bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid
Nếu ống 2 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống 1 thì có saponin steroid
Ngâm 2g bột hoa Đu đủ đực trong 10mL chloroform, lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm, cho 5 giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B, sau đó đun cách thủy, nếu có đường khử thì xuất hiện kết tủa đỏ gạch
Ngâm 2g bột hoa Đu đủ đực trong 10mL methanol hoặc ethanol, lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 1% Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh thẫm thì có polyphenol
Cho vào ống nghiệm 1mL acetic anhydride, 1mL chloroform làm lạnh ống nghiệm và thêm vài giọt H2SO4 đậm đặc, sau đó cho dịch lọc ngâm trong chloroform, nếu sung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu bền không đổi thì có sterol.
Ngâm 2g bột hoa Đu đủ đực trong chloroform Lọc lấy dịch lọc cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, phản ứng dương tính là dung dịch chuyển thành màu đỏ đậm, xanh, xanh-tím
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 14
Cân 3g hoa Đu đủ đực cho vào cốc, thêm 10 mL nước cất đem đun sôi 10 phút Để nguội, đem lọc lấy dịch Cho 2-3 mL dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 1 ít tinh thể
Na2CO3 Quan sát hiện tượng, nếu có bọt khí thoát ra có acid hữu cơ
Ngâm 3g bột hoa Đu đủ đực trong 10mL n-hexane trong 1 giờ Lọc lấy dịch lọc, sau đó nhỏ vài giọt dịch lên mảnh giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hết dung môi, nếu có vết mờ trên giấy có chất béo
Ngâm 2g hoa Đu đủ đực trong 10 mL n-hexane trong 15 phút, lọc lấy dịch lọc và cho 2 mL dịch lọc vào ống nghiệm, đun cách thủy thu lấy cặn, sau đó nhỏ vài giọt
H2SO4 đậm đặc lắc nhẹ, thấy xuất hiện màu xanh lá thì có carotene
Pha thuốc thử Lugol: hỗn hợp gồm 0,5g KI và 1g I2 trong 5mL nước cất, cho hỗn hợp vào bình định mức 100 mL và thêm nước cất đến vạch
Cho 3g bột hoa Đu đủ đực vào cốc chứa 20 mL nước cất, đun trong vài phút, lọc lấy dịch lọc và cho dịch chiết vào 3 ống nghiệm: Ống 1: 2 mL dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 2: 2 mL nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 3: 2 mL dịch chiết
Nếu ống 1 đậm hơn ống 2 và 3 thì có polysaccharide
THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT N-
Các phân đoạn n-hexane và ethyl acetate từ dung môi ethanol 80%, methanol, nước được xác định hoạt tính độc tế bào tại Phòng thử hoạt tính sinh học - Viện hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.5.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư
Lấy 3 mẫu, mỗi mẫu 100 g hoa Đu đủ đực khô, chiết với 3 dung môi khác nhau: ethanol 80%, methanol, nước
Chiết bằng ethanol 80% và methanol: tiến hành chiết hồi lưu cách thủy (hoặc Soxhlet), gia nhiệt 40-50 o chiết 3-4 lần, lấy kiệt
Chiết bằng nước: Ngâm chiết kiệt mẫu bằng đun sôi nhẹ
Cô đuổi dung môi được 3 cặn dịch chiết Ba cặn chiết được phân bố vào nước và chiết phân đoạn lần lượt với n-hexane, chloroform, ethyl acetate ta được phân đoạn dịch chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate và lớp nước còn lại, cô đuổi dung môi ta được các cặn phân đoạn dịch chiết Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi lựa chọn các cặn phân đoạn dịch chiết chiết n-hexane và ethyl acetate (E/Et: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng ethanol 80%, N/E: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng nước, M/E: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao tổng methanol, M/H: Phân đoạn cao chiết n-hexane từ cao tổng methanol) để thử tác dụng ức chế tế bào ung thư trên các dòng: Dòng tế bào ung thư phổi, dòng tế bào ung thư gan, dòng tế bào ung thư vú
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: ̵ Phổi (A549) ̵ Gan (Hep3B) ̵ Vú (MCF-7)
2.5.4 Phương pháp thử độc tế bào
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 16
Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường RMPI 1640 hoặc DMEM cú bổ sung 10% huyết thanh bào thai bũ (FBS), 100 U/mL penicillin, và 100 àg/mL streptomycin ở 37 ºC trong tủ ấm 5% CO2
Các tế bào được cấy chuyển vào trong phiến 96 giếng (mật độ tế bào 1×10 5 tế bào/giếng) với và được xử lý với các nồng độ khác nhau của mẫu thử
Sau 48h ủ, thêm 20 μL 3-(4,5- dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (5 mg/mL) vào các giếng và ủ tiếp 4h
Sau đó gạn bỏ môi trường và hòa tan tinh thể formazan trong 100 μL isopropanol và giá trị mật độ quang (OD) được đo bằng máy đọc Elisa (xMark Pro, Biorad, USA) ở bước sóng 570 nm
SVTH: Mai Thị Hoàng Yến - 14CHD 17