Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây kim tiền thảo (desmodium styracifolium (osb ) merr ) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay các hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây dược liệu đã được sử dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được sử dụng để sản xuất thuốc chữ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HIÊN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN

MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY KIM TIỀN THẢO

(Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)BẰNG KỸ THUẬT

NUÔI CẤY IN VITRO

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Hà Bích Hồng Các kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trên Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020

Người cam đoan

Nguyễn Thị Hiên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp,Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Hà Bích Hồng và PGS TS Nguyễn Văn Việt đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Hiên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Kim tiền thảo 3

1.1.1 Nguồn gốc và hệ thống phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây Kim tiền thảo 4

1.1.3 Đặc điểm sinh thái và phân bố 5

1.1.4 Giá trị dược liệu 5

1.1.5 Các nghi n cứu về h a sinh h c dược h c của cây Kim tiền thảo 6

1.1.6 Một số bài thuốc dân gian về cây Kim tiền thảo 9

1.2 Tình hình nhân giống một số loài thuộc chi Desmodium 10

1.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật 12

1.3.1 Cơ sở của khoa h c của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật 12

1.3.2 Các giai đoạn ch nh của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 13 1.4 Tổng quan về ADN mã vạch 14

1.4.1 Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcoding) 14

1.4.2 Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật 16

1.4.3 nh h nh nghi n cứu ADN mã vạch ở thực vật 21

1.4.3 Ứng dụng của ADN mã vạch 27

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 30

2.1.1 Mục ti u tổng quát 30

2.1.2 Mục ti u cụ thể 30

2.2 Nội dung nghiên cứu 30

2.3 Vật liệu nghiên cứu 30

2.3.1 Đối tượng nghi n cứu 30

2.3.2 hiết bị dụng cụ 31

2.3.3 H a chất 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu 32

2.4.1 Xác định một số ADN mã vạch để xác định loài cây Kim tiền thảo 32

2.4.2 Nghi n cứu nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo 35

2.5 Phương pháp thu thập và xử lí số liệu 39

2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu 39

2.5.2 Phương pháp xử lý số liệu 40

2.5.3 Địa điểm và thời gian bố tr th nghiệm 40

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Xác định một số trình tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo 41

3.1.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 41

3.1.2 Kết quả nhân bản tr nh tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo 42

3.1.3 Kết quả giải tr nh tự và so sánh tr nh tự các đoạn ADN mã vạch 45

3.1.4 o sánh hiệu quả giám định loài Kim tiền thảo của một số tr nh tự ADN mã vạch 54

3.2 Kết quả nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo 55

3.2.1 Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh chồi in vitro 55

3.2.2 Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của nồng độ chất ĐH đến nhân nhanh chồi Kim tiền thảo 57

3.2.3 Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi 60

3.2.4 Kết quả nghi n cứuảnh hưởng của chất ĐH đến khả năng ra rễ cây Kim tiến thảo 62

3.2.5 Kết quả ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống, sinh trưởng của cây Kim tiền thảo 64

KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ BIỂU

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong đề tài 31

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 34

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR 34

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khử trùng vật liệu hạt Kim tiền thảo 36

Bảng 2.5: Bố trí các thí nghiệm nhân nhanh chồi Kim tiền thảo 36

Bảng 2.6: Ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi Kim tiền thảo 37

Bảng 2.7: Thiết kế các thí nghiệm ra rễ Kim tiền thảo 37

Bảng 2.8: Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh trưởng của cây 38

Bảng 3.1: Các trình tự đoạn gen matK tương ứng với tên loài tương đồng với đoạn trình tự matK của mẫu Kim tiền thảo 48

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống và tái sinh chồi 56

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi 58

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi 60 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ α-NAAvà than hoạt tính đến khả năng 62

ra rễ 62

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống, sinh trưởng của cây Kim tiền thảo 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr) 3

Hình 1.2: Hình thái cây Kim tiền thảo 4

Hình 3.1: Kết quả tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá Kim tiền thảo 41

Hình 3.2: Kết quả điện di sản ph m PCR các đoạn trình tự ADN mã vạch 42

Hình 3.3: Trình tự nucleotide đoạn gen MatK của các mẫu Kim tiền thảo 46

Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen matK của mẫu Kim tiền thảo (query với loài Desmodium styracifolium trên NCBI (sbjct) 47

Hình 3.5: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI 49

Hình 3.6: Trình tự nucleotide đoạn gen rbcL của các mẫu Kim tiền thảo 50

Hình 3.7: Cây quan hệ di truyền của mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương đồng trên NCBI dựa trên trình tự đoạn gen rbcL 51

Hình 3.8: Trình tự nucleotide đoạn gen ITS của các mẫu Kim tiền thảo 52

Hình 3.9: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen đối với trình tự ITS 52

Hình 3.10: Trình tự nucleotide đoạn gen ycf1b của các mẫu Kim tiền thảo 53

Hình 3.11: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen dựa trên trình tự đoạn gen ycf1b 54

Hình 3.12: Hạt Kim tiền thảo được khử trùng bằng công thức 2 sau 4 tuần nuôi cấy 57

Hình 3.13: Cụm chồi Kim tiền thảo trên môi trường nhân nhanh NN1 (A và MN2 (B) 59

Hình 3.14: Cụm chồi Kim tiền thảo trong môi trường NC1 sau 7 tuần nuôi cấy 61

Hình 3.15: Cây Kim tiền thảo được nuối cấy với công thức R5 64

Hình 3.16: Cây Kim tiền thảo được nuôi cấy ở công thức B3 66

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ nảy mầm ở các công thức khử trùng 56Biểu đồ 3.2: Hệ số nhân chồi và tỉ lệ chồi hữu hiệu ở các môi trường 59Biểu đồ 3.3: Hệ số nhân chồi và tỉ lệ chồi hữu hiệu ở các công thức môi trường có bổ sung chất hữu cơ khác nhau 61Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của Chất ĐHST đến tỉ lệ chồi ra rễ (A và số rễ trung bình, chiều dài rễ ở các công thức thí nghiệm (B 63Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ cây sống và chiều cao TB của cây Kim tiền thảo được nuối cấy trong các công thức thí nghiệm 65

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay các hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây dược liệu đã được

sử dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được

sử dụng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực ph m và mĩ ph m…

Trong hệ thống các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc

họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, được dùng để bào chế làm thuốc

chữa bệnh, trong đó có cây Kim tiền thảo Đối với cây Kim tiền thảo thì mọi

bộ phận của cây như: rễ, thân, lá đều có thể sử dụng được Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp, tăng bài tiết mật, giảm đau ống mật, tăng lưu lượng máu ở thận, tăng tuần hoàn máu não và các động mạch đùi… Song công dụng chủ yếu là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng, chữa bệnh trĩ, chữa viêm mật (Đỗ Tất Lợi, 1999) Tuy nhiên, hiện nay hầu hết nguồn dược liệu đều được nhập từ nước ngoài và chưa có nghiên cứu đầy đủ về nhân giống, gieo trồng, chế biến Kim tiền thảo nên năng suất và chất lượng còn hạn chế

Để có nguồn dược liệu Kim tiền thảo chất lượng tốt, bền vững đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người đồng thời đảm bảo được hàm lượng và hoạt tính dược liệu trong sản ph m sau thu hoạch, cần phải có biện pháp hữu hiệu trong bảo tồn và phát triển loài dược liệu đa tác dụng này Vì vậy, nhân

giống loài Kim tiền thảo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro sẽ giúp tạo ra số

lượng lớn cây con trong thời gian ngắn, có thể đáp ứng nguồn giống cho các vùng sản xuất dược liệu, nhằm nâng cao thu nhập cho người dân và phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen cây thuốc

Mặt khác, để giám định hay định danh chính xác loài Kim tiền thảo phục

vụ cho lựa chọn loài đưa vào nhân giống in vitro thì phương pháp ADN mã

vạch được cho là có độ tin cậy cao Phương pháp ADN mã vạch đã trở thành công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong việc phân loại, đánh giá đa dạng

di truyền và quan hệ di truyền các loài cả động vật và thực vật

Với mục tiêubước đầu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài nhằm đảm bảo độ tin cậy và chính xác trong nhân giống Cây Kim tiền thảo tôi

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và

nhân giống Cây Kim Tiền Thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”

Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Kim tiền thảo

1.1.1 Nguồn gốc và hệ thống phân loại

Tên khoa học: Desmodium styracifolium (Osb.) Merr

Tên khác: Đồng tiền lông, Mắt trâu, Vảy rồng, Dây sâm lông, Bươm

bướm,Cỏ Đồng tiền vàng (Gold Money Herb , Cat’s foot, maiden-hair, ground ivy(Anh); Herbe de St-Jean, couronne de terre, lierre terrestre, rondette (Pháp)

Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr)

Desmodium là một chi lớn thuộc họ Đậu với khoảng 350 loài thực vật

đa số được sử dụng làm ngũ cốc và thảo dược Hiện nay chỉ có khoảng 30 loài

được nghiên cứu về đặc điểm thực vật, tính chất hóa học và tác dụng sinh học (Nguyễn Minh Ngọc, 2013)

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây Kim tiền thảo

Kim tiền thảo là loại cây thân cỏ, mọc bò Thân hình trụ, màu xanh hơi vàng, phủ đầy lông mịn màu vàng hoe Lá mọc so le, đơn hay kép lông chim

lẻ gồm 1-3 lá chét, lá chét ở giữa to hơn 2 lá bên Cuống lá dài 2-4 cm, hình trụ phù ở đáy, phủ đầy lông trắng Hai lá kèm hình mũi mác, dài 6-9 mm, ngang 2-3 mm, nhiều gân dọc, đầy lông trắng mịn Lá kèm con nhỏ, hình tam giác Lá chét có phiến tròn hoặc hơi xoăn, đường kính 2-4 cm, ít khi đến 5

cm, mép nguyên, đỉnh tròn hay tù hoặc chia 2 thùy cạn, đáy hình tim; mặt trên nhẵn, màu hơi vàng hoặc lục xám, mặt dưới mốc do phủ đầy lông mịn màu trắng, gân lá kiểu lông chim nổi rõ ở mặt dưới, gân phụ 8-10 đôi, cuống lá dài 1-2 mm, phủ đầy lông trắng mịn Hai lá chét bên có phần phiến hai bên gân giữa không đều nhau ở gốc,một bên to, một bên hơi nhỏ hơn

(https://thaoduocquy.net/products/kim-tien-thao)

Hình1.2: Hình thái cây Kim tiền thảo

Cụm hoa: Chùm dài đến 5 cm, thường ở ngọn cành ít khi ở nách những

lá phía ngọn, mỗi mấu của chùm là một xim co gồm 2 hoa có chung một lá bắc, giữa 2 gốc cuống hoa có một u lồi nhỏ Cụm hoa phủ đầy lông trắng mịn

Hoa nhỏ, không đều, lưỡng tính, mẫu 5 Hai cuống hoa của xim hướng

ra hai bên sau đó xụ xuống trên quả Quả loại đậu xụ xuống, mang đài tồn tại

ở gốc, dẹp, dài 1,5 - 2 cm, ngang 3-4 mm, nhiều lông trắng mịn, chia thành 2 -

6 đốt Cây thường được thu hái vào mùa hè thu, có thể dùng tươi hay phơi khô (Đỗ Tất Lợi, 1999); (Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương, 2000); (Võ Văn Chi, 1997)

1.1.3 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Kim tiền thảo thích hợp với điều kiện nhiệt độ nóng m hoặc m mát, đất ít chua, có thành phần cơ giới trung bình, m và thoát nước nhưng cũng chịu được đất chua, nghèo xấu và khô hạn Ưa sáng nhưng cũng chịu được bóng râm, sống lưu niên, tái sinh hạt, chồi gốc, chồi thân, chồi cành đều khỏe (Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999)

Phân bố địa lý: Cây Kim tiền thảo là một loại dược liệu mọc nhiều ở Đông Nam Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam và Nhật Bản… Tại Việt Nam, cây phân bố rộng rãi ở vùng đồi núi Thường gặp

ở những chỗ sáng, trên đất cát pha, vùng trung du Hà Tây, Lạng Sơn, Ninh Bình và Hải Phòng (Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999)

1.1.4 Giá trị dược liệu

Theo Đông y đây là một loại cây có vị ngọt, tính hàn Trong dân gian cây Kim tiền thảo được dùng thanh nhiệt, lợi thủy, tiêu sạn, giải độc, tiêu viêm Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp Nhưng công dụng chủ yếu là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng… Đối với hệ tim mạch, Kim tiền thảo làm tăng lưu lượng mạch vành,hạ huyết

áp, làm tim đập chậm, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ oxy của cơ tim Tác dụng hạ huyết áp do sự kích thích các thụ thể cholinergic vàsự phóng bế các thụ thể adrenergic Các nhà khoa học đã nghiên cứu và chứng minh được rằng

thành phần flavonoid trong Kim tiền thảo có tác dụng rất tốt trong việc làm hạ huyết áp ở những người huyết áp cao Bên cạnh đó,Kim tiền thảo cũng có tác dụng đối kháng với các triệu chứng do pituitrin gây giảm lưu lượng mạch vành, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ ôxy của cơ tim (Đoàn Thị Nhu, 2013) Đặc biệt hoạt chất soyasaponin I chứa trong Kim tiền thảo đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi calci axalat ở thận Cao Kim tiền thảo thí nghiệm trên động vật có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi can xi axalat ở thận do thành phần polysacchorid chứa trong cao có tác dụng này và đồng thời làm tăng lượng bài tiết nước tiểu, ngoài ra còn có tác dụng tăng cường sự tiết mật (Đoàn Thị Nhu, 2013)

1.1.5 Các nghiên cứu về hóa sinh học, dược học của cây Kim tiền thảo

Zhou C và cộng sự (2012) tiến hành nghiên cứu phương pháp đánh giá

chất lượng của Desmodium styracifolium bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao với phát hiện mảng photodiode và phương pháp quang phổ khối ion

hóa song song Desmodium styracifolium, với C-flavone glycosides là hợp

chất hiệu quả dược lý chính, là một loại thảo dược phổ biến của Trung Quốc

và đã được sử dụng để điều trị rối loạn tiểu tiện, sỏi tiết niệu, phù và vàng da

Xuehai Wang và cộng sự (2013 đã công bố liên quan đến lĩnh vực y học

cổ truyền Trung Quốc, đặc biệt là viên nang chứa flavonoid tổng số của

Desmodium styracifolium, một phương pháp điều chế viên nang và sử dụng viên

nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium styracifolium trong chế ph m thuốc điều trị sỏi tiết niệu Điều chế viên nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium

styracifolium với tỷ lệ hòa tan cao, tác dụng lâm sàng đáng chú ý, tác dụng phụ

nhẹ và hiệu quả điều trị tốt cho bệnh sỏi tiết niệu, đặc biệt đối với sỏi vùng chậu

thận và sỏi niệu quản(https://patents.google.com/patent/CA2931528A1/en)

Nghiên cứu của Zhou J và cộng sự (2018) cho thấy flavonoid tổng số

của D styracifolium làm suy yếu sự hình thành của sỏi niệu canxi oxalat do hydroxy-L-proline gây ra ở chuột D styracifolium được coi là một loại thuốc

thảo dược Trung Quốc, đã được báo cáo để điều trị các bệnh sỏi thận Tuy nhiên, các thành phần hoạt động hóa học tiềm năng và các cơ chế cơ bản liên quan đến hiệu quả của nó trong việc nhắm mục tiêu sỏi tiết niệu vẫn còn tiếp tục được làm sáng tỏ Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác dụng chống

tiết niệu của flavonoid tổng số của D styracifolium (TFDS trên sỏi thận

canxi oxalat (CaOx)trên chuột Sprague-Dawley Kết quả chứng minh rằng TFDS có tác dụng có lợi trong việc ức chế sự hình thành CaOx ở thận chuột

có thể thông qua sự kết hợp của các hoạt động chống oxy hóa, chống viêm, kiềm hóa nước tiểu và làm giảm nồng độ các thành phần tạo sỏi trong nước tiểu Do đó, TFDS có thể có ý nghĩa lâm sàng trong việc ngăn ngừa tổn thương tế bào thận oxy hóa và cuối cùng là hình thành sỏi thận Dữ liệu cung cấp một lý do cho việc sử dụng TFDS trong điều trị bệnh sỏi thận và xác định tác nhân này là một nguồn tiềm năng của thuốc chống lợi tiểu mới(Zhou J.và cộng sự, 2018)

Xie H và cộng sự (2018 cũng tiến hành nghiên cứu tổng flavone của

D styracifolium làm giảm bớt apoptosisvà autophagy của các tế bào HK-2

gây ra bởi COM bằng cách điều chỉnh KIM-1 thông qua con đường

p38/MAPK Mục đích của nghiên cứu là điều tra cơ chế tổng flavone của D

styracifolium (TFDS trong việc điều chỉnh sự hình thành của nước tiểu Hàm

lượng protein của KIM-1, LC3-II, p-p38 được đo bằng phương pháp Western blot Ảnh hưởng của nồng độ COM khác nhau, nồng độ TFDS khác nhau, SB203580 (chất ức chế đặc hiệu của p38/MAPK và sự biểu hiện quá mức của KIM-1 đối với khả năng sống của tế bào đã được phát hiện bằng xét nghiệm WST-1 Các tế bào apoptotic và tế bào dương tính FITC được phát hiện bằng phương pháp dòng tế bào học Khả năng sống của tế bào HK-2 giảm khi tăng nồng độ COM và nồng độ protein của KIM-1, LC3-II và p-p38 tăng theo thời gian Chặn con đường p38/MAPK hoặc đồng nuôi cấy với TFDS đã ức chế tác động của COM đối với quá trình tự hủy và tự động của

các tế bào HK-2 Ngoài ra, việc chặn đường dẫn p38/MAPK đã ức chế biểu hiện của KIM-1 Trong các tế bào gây ra bởi COM, sau khi được xử lý bằng SB203580, sự biểu hiện quá mức của KIM-1 có thể đảo ngược tác dụng bảo

vệ của SB203580 đối với tổn thương tế bào do COM gây ra và ức chế SB203580 đối với quá trình tự trị quá mức do COM gây ra, cho thấy p38/MAPK được điều chỉnh điều chỉnh quá trình apoptosis tế bào gây ra COM và autophagy Cuối cùng, chúng tôi đã chứng minh rằng TFDS ức chế con đường p38/MAPK Và hiệu quả bảo vệ của tổn thương tế bào do COM gây ra tăng lên khi tăng nồng độ TFDS, và độ bám dính giữa COM và tế bào giảm khi tăng nồng độ TFDS Với sự gia tăng nồng độ của TFDS, con đường p38/MAPK dần bị ức chế, và các protein liên quan đến KIM-1 và autophagy

đã giảm TFDS đã ức chế apoptosis tế bào HK-2 và autophagy bằng cách điều chỉnh KIM-1 thông qua con đường p38/MAPK (Xie H, Li J và Gao H.,2018)

Sun X và cộng sự (2018 tiến hành nghiên cứu phương pháp vân tay

định lượng hiệu quả để đánh giá tính nhất quán chất lượng của Desmodium

styracifolium Phương pháp vân tay định lượng HPLC này có thể được coi là

một phương pháp phù hợp để đánh giá chất lượng của các loại thuốc và chế

ph m thảo dược truyền thống của Trung Quốc Để tiến hành phương pháp định lượng HPLC cần có sự kết hợp cùng năm thành phần chính (vicenin-1,

schaftoside, isoschaftoside, vicenin-3 và isovitexin của D styracifolium đã

được phát triển để đánh giá tính nhất quán chất lượng của loại thảo dược này Việc phân tách sắc ký được thực hiện trên cột Agilent 5 TC-C18 (4,6 × 250

mm, 5 m bằng cách rửa giải gradient bằng acetonitril và axit formic 0,1% (v/

v Nhiệt độ cột là 30°C và bước sóng phát hiện là 272 nm Dữ liệu sắc ký được phân tích bằng phương pháp vân tay định lượng có hệ thống mới (SQFM Phương pháp vân tay định lượng được thiết lập đã được áp dụng thành công để xác định đồng thời mức độ của các thành phần chính và 39 đỉnh chung đã được tìm thấy Các mẫu được thu thập ở tỉnh Quảng Đông có

tính nhất quán chất lượng tốt, theo quan điểm truyền thống rằng tỉnh Quảng

Đông là khu vực tốt nhất để trồng D styracifolium Mối quan hệ hiệu quả

chống oxy hóa dấu vân tay của các mẫu khác nhau đã được nghiên cứu bằng cách kiểm tra mối tương quan giữa các đỉnh chung và tác dụng chống oxy hóa Hai mươi hai đỉnh chung có tương quan dương với tác dụng chống oxy hóa, trong khi các đỉnh khác cho thấy mối tương quan nghịch SQFM là đáng tin cậy và hiệu quả để phân tích dữ liệu sắc ký (Vasantha M.M và cộng sự,2005)

Hiện nay, hầu hết các công trình đã công bố đều chủ yếu nghiên cứu về hóa sinh học và thành phần dược học của cây Kim tiền thảo Ở Việt Nam cũng như trên thế giới hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về nhân giống

cây Kim tiền thảo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

1.1.6 Một số bài thuốc dân gian về cây Kim tiền thảo

Chữa mụn nhọt, ghẻ lở: Kim tiền thảo + xa tiền thảo tươi, giã nát, cho rượu vào, vắt lấy nước cốt, lấy lông ngỗng chấm thuốc bôi vào vết thương

Chữa sạn mật: Chỉ xác (sao) 10-15g, xuyên luyện tử 10g, hoàng tinh 10g, Kim tiền thảo 30g, sinh địa 6-10g (cho vào sau), sắc uống Hoặc Kim tiền thảo 30g, xuyên phá thạch 15g, trần bì 30g, uất kim 12g, xuyên quân (cho vào sau) 10g, sắc uống

Chữa sạn đường tiểu: Kim tiền thảo 30-60g, hải kim sa (gói vào túi vải 15g, đông quỳ tử 15g, xuyên phá thạch 15g, hoài ngưu tất 12g, hoạt thạch 15g, sắc uống Hoặc kim tiền thảo 30g, xa tiền tử (bọc vào túi vải 15g, xuyên sơn giáp (chích 10g, thanh bì 10g, đào nhân 10g, ô dược 19g, xuyên ngưu tất 12g, sắc uống

Chữa sỏi đường tiểu do thận hư thấp nhiệt: hoàng kỳ 30g, hoàng tinh 15g, hoài ngưu tất 15g, Kim tiền thảo 20g, hải kim sa (gói vào túi vải , xuyên phá thạch 15g, vương bất lưu hành 15g, sắc uống

Chữa bệnh trĩ: mỗi ngày dùng toàn cây Kim tiền thảo tươi 100g (nếu khô 50g sắc uống Đối với trĩ nội và ngoại đều có kết quả như nhau.Chữa viêm

đường mật không do vi khu n: Dùng Kim tiền thảo sắc uống sáng 1 lần hoặc nhiều lần trong ngày Mỗi ngày dùng 30g, có khi 20g hoặc 10g/ ngày, 30 ngày

là 1 liệu trình Thông thường uống trong 2-3 tháng có kết quả với tỉ lệ 76,9%

Chữa sỏi niệu gây chảy máu, sung huyết: Dùng 40g kim tiền thảo, 20g

mã đề, 12g ngưu tất, 12g ý dĩ, 8g các loại uất kim, đào nhân, đại phúc kì, kê nội kim Sắc uống, mỗi ngày 1 thang

Chữa phù, viêm túi mật, viêm gan, viêm thận: 40g Kim tiền thảo, 10g chút chít, 10g dành dành, 20g mộc thông, 20g ngưu tất Mỗi ngày sắc 1 thang uống

Chữa viêm vàng da: Mỗi ngày dùng 60g kim tiền thảo sắc uống cho đến khi hết vàng da

1.2 Tình hình nhân giống một số loài thuộc chi Desmodium

Năm 2005, Vasantha Kumari tiến hành nghiên cứu tái sinh cây

Desmodium oojeinense Roxb bằng phương pháp tạo mô sẹo Trong nghiên

cứu, mô sẹo được tạo ra bằng cách nuôi cấy lá, cuống lá, chồi nách, trụ dưới

lá mầm và lá mầm của D oojeinense trên môi trường MS, B5 hoặc WP được

bổ sung 2,4-D hoặc BAP Trong số các môi trường được sử dụng, tất cả các nhà nghiên cứu đều cho rằng môi trường MS và WP được bổ sung 2,4-D hoặc BAP được tìm thấy là môi trường lý tưởng cho việc tạo ra mô sẹo Trong đó,

B5 là môi trường kém hiệu quả nhất Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy phiến lá mỏng được nuôi trong môi trường MS được bổ sung 2,4-D hoặc BAP

ở mức 1,0 mg/l và môi trường WP được bổ sung một trong hai hormone này ở mức 0,25 mg/l thì tạo mô sẹo tốt nhất Tái sinh cây chỉ đạt được từ mô sẹo khi cho lá, lá mầm và trụ dưới lá mầm phát triển trên môi trường MS được bổ sung với sự kết hợp 4 mg/l BAP và Kinetin (Ki Chồi tái sinh được tạo thành cây hoàn chỉnh trong môi trường MS bổ sung 3 mg/l IAA 50% số cây tái sinh sống sót khi trồng ngoài tự nhiên Đây là báo cáo đầu tiên về việc tạo ra mô

sẹo và tái sinh cây con D oojeinense của các nhà nghiên cứu (Preeti S và

cộng sự, 2013)

Srivastava Preeti và cộng sự (2013 tiến hành nhân giống in vitro tần số cao cây Thóc lép (Desmodium gangeticum L.L (DDCC) – cây thuốc có nguy

cơ tuyệt chủng Các nhà nghiên cứu sử dụng cây giống vô trùng 10 ngày tuổi, cắt bỏ đỉnh sinh trưởng và lấy mắt ngủ nuôi cấy trên môi trường Murashige ADN Skoog (MS , ½ MS và Gamborg (B5 chứa các cytokinin 6-benzyl aminopurine (BA , kinetin (Ki và thiadiazuran (TDZ BA đã được tìm thấy

là hiệu quả nhất cho sự phát sinh chồi chiếm tỉ lệ 98% và số lượng chồi tối đa

là 12,4 được tạo ra trên môi trường MS được bổ sung 4,44 µM BA Tỉ lệ ra rễ cao nhất (98% và số rễ tối đa là 8 rễ/chồi khi chồi được nhúng vào dung dịch axit indol-3-butyric (IBA (492,12 µM trong 30 phút và sau đó nuôi cấy trên môi trường ½ MS Các cây con đã được trồng thành công trong Soilrite (hỗn hợp gồm 75% rêu than bùn Ailen và 25% đá trân châu có pH trong khoảng từ 5,0 đến 6,5 với tỷ lệ sống 96% Cây tái sinh phát triển bình thường và không

có bất kỳ biến đổi hình thái nào (Preeti S và cộng sự, 2013)

San Thandar và cộng sự (2015 đã nghiên cứu thành công quy trình

nhân giống in vitro cây Mũi mác (Desmodium triquetrum D.C.) Trong nghiên

cứu này, sự phát triển chồi trực tiếp và sự hình thành mô sẹo đã đạt được từ

các chồi nách và mô lá khác nhau của cây giống in vitroD.triquetrum D.C

Môi trường Murashige và Skoog từ (MS được bổ sung với nồng độ khác nhau của cytokinin và kết hợp với chất phụ gia đã được sử dụng để nhân chồi, cảm ứng mô sẹo và hình thành rễ Sự tiết ra polyphenolic từ vật liệu nuôi cấy được kiểm soát bằng cách bổ sung axit citric vào môi trường Những cây con

đã bén rễ được cấy vào một túi nhựa chứa hỗn hợp đất và được trồng trong điều kiện nhà xanh để thích nghi với môi trường tự nhiên Nồng độ khác nhau của auxin và cytokinin ảnh hưởng đến quá trình nhân nhanh chồi, cảm ứng

mô sẹo và sự hình thành rễ Kết quả của nghiên cứu cho thấy, môi trường bổ sung 4 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA là tối ưu để nhân chồi, 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA là tốt nhất cho sự tăng sinh mô sẹo Môi trường ⅟₂MS chứa ở

NAA 0,75 hoặc 1 mg/l cho thấy chồi ra rễ tối đa Quy trình nhân giống in

vitro có thể được tiêu chu n hóa rất hữu ích trong việc nâng cao chất lượng

cây trồng Desmodium triquetrum DC cho các chương trình trồng thương mại

và bảo tồn tế bào mầm (Thandar S và Tun O M.,2015)

1.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật

Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture , hoặc vi nhân giống (micropropagation là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi

cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (Nguyễn Văn

Uyển,1993) đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật

1.3.1 Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện

vô trùng (Nguyễn Quang Thạch và Lý Thị Anh , 2000)

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20: “Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN cần thiết và

đủ của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” Ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái thực chất là kết

quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin Tỷ lệ hàm lượng hai

nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau Khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là IAA)/cytokinin là kinetin thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus) (Nguyễn Quang Thạch, 2000)

1.3.2 Các giai đoạn ch nh của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật

1.3.2.1.Giai đoạn chuẩn bị

Là bước đầu tiên của quy trình nhân giống Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, chọn cơ quan để lấy mẫu Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Sau đó chọn chế độ khử trùng thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh trưởng và phát triển vẫn tốt Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay

là dùng các tác nhân hoá học có tính sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl2, NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2, để khử trùng mẫu

1.3.2.2 Giai đoạn nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh

dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy Môi trường này được xác lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khu n, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt

độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu

sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ hoặc các phôi

vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu

để cho quá trình nhân nhanh tiếp sau đó

1.3.2.3 Giai đoạn nhân nhanh

Một khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi, các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn

nhân nhanh Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường đã được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1-2 tháng tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh

là vào khoảng 10-36 tháng

1.3.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ, ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chu n của một cây giống

1.3.2.5 Giai đoạn vườn ươm

Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in

vitro khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự

nhiên Khi đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng “sốc” do thay đổi về điều kiện môi trường cần có giai đoạn thích nghi Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh để các cây con đạt tỷ lệ sống cao

1.4.Tổng quan về ADN mã vạch

1.4.1 Giới thiệu về ADN mã vạch (DNAbarcoding)

Thuật ngữ “ADN mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1993 là một khái niệm sử dụng trình tự ADN như một ký tự nhận dạng để xác định nhanh chóng và chính xác loài, dưới loài Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một đoạn ADN có kích thước khoảng từ 400 - 800 bp như là một tiêu chu n để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật ADN mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định loài, nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng

sinh học Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học sự sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực ph m, truy xuất nguồn gốc, bảo hộ sản ph m Phương pháp này vô cùng có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh học cần giám định đã được qua xử lý, chế biến như các dạng chế ph m thuốc hay thực ph m đã qua chế biến (Yao H và cộng sự, 2010)

Năm 2003, nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Canada – Paul Hebert -

đã đề xuất một phương pháp xác định loài dựa trên ADN mã vạch (DNA barcoding) ADN mã vạch là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ và vùng thay đổi theo quá trình tiến hóa (Hebert, 2003)

Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các sinh vật, tương tự như máy quét mã vạch trong siêu thị Hai mẫu vật của hai loài có thể có hình thái bên ngoài rất giống nhau, song chúng có thể được phân biệt bằng cách sử dụng ADN mã vạch Với ưu thế đó, ADN mã vạch có thể được sử dụng cho hai mục đích chính: nhận dạng

về mặt phân tử cho các loài đã được mô tả và tìm ra các loài mới chưa được

ADN mã vạch là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và virus (Hebert và cộng sự, 2003 ; (Group và cộng sự, 2009 Việc xác định loài

bằng ADN mã vạch có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài (Casiraghi và cộng sự, 2010)

Việc sử dụng ADN mã vạch để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý nghĩa ngày càng lớn Cho đến nay, sau hơn 10 năm nghiên cứu đã có trên 6000 công trình khoa học được công bố với khoảng 5 triệu trình tự ADN

mã vạch ở các loài sinh vật theo số liệu của BOLD (98 Để chu n hóa ở mức

độ quốc tế về việc sử dụng ADNmã vạch, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài (Hollingsworth và cộng sự, 2011; Ford, C.S và Ayres K.L., 2009;

Yu và cộng sự, 2011)

Một ADN mã vạch điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

- Có tính phổ biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự

- Trình tự có tính đặc hiệu cao

- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài (Hollingsworth và cộng sự, 2011)

1.4.2 Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật

Khác với động vật, ngoài bộ gen nhân và ty thể, thực vật còn có một bộ gen bổ sung là bộ gen lục lạp (cpADN) ADN nhân, ty thể và lục lạp đều được sử dụng trong phân tích loài Tùy vào mức độ phân tích mà mỗi vùng gen và mỗi phương pháp được áp dụng thích hợp Do tính phức tạp và lặp đi lặp lại, chỉ có một số gen thuộc ADN hệ gen nhân như 18S, 26S, vùng ITS…được sử dụng Vùng 18S và 5,8S thường được sử dụng để xác định ở mức bộ hoặc họ, vùng 26S thường được sử dụng để xác định ở mức dưới họ đến cho đến loài, vùng ITS và vùng 5S spacer thường được dùng để phân tích

ở mức loài cho tới mức dưới loài

Nếu như các gen ty thể như COI và Cytb được dùng rộng rãi cho động

vật và tảo (Balaraju K và cộng sự, 2008; Baskaran K và cộng sự, 1990) thì

khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính bảo thủ cao nên không phù hợp làm ADN mã vạch Thay vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như

các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF, matK và vùng intron của các gen trnL, trnL-F)

Những vùng ADN này giống như mã vạch bởi tính bảo thủ cao trong phạm vi mỗi loài nhưng đa hình giữa các loài Một vùng trình tự thông

thường khác trong nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS

nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn ARN ribosome , tuy nhiên vùng này không đạt hiệu quả cao ở một số nhóm thực vật do các yếu tố khác liên quan đến các diễn biến tiến hóa phức tạp của các vùng lặp lại cao trong hệ gen nhân(Mark Y S H P D N., 2008)

Dựa trên sự khác nhau của các vùng mã hóa và không mã hóa, 4 đề xuất chính đã được đưa ra với sự kết hợp khác nhau của 7 gen lục lạp đó là:

rpoC1 + rpoB+ matB hoặc rpoC1 + mtaK + trnH - psbA, rbcL + trnH - psbA và atpF-H + pbsK-I + matK Sự kết hợp khác nhau của các gen đã được

thảo luận tại hội nghị quốc tế Barcode of life lần thứ 2 tại Đài Bắc

Năm 2010, La Haye và cộng sự đề xuất riêng gen matK cấu thành nên

mã vạch cây trồng, đây là một trong những khu vực có mức độ tiến hóa nhanh nhất trong lục lạp và cho thấy khả năng phân biệt cao các loài thực vật hạt kín (Hilu K.W.L.H., 1997) Nhóm nghiên cứu thực vật COBL đề nghị một mã

vạch bao gồm hai khu vực mã hóa gen của lục lạp rbcL + matK (Yu J và cộng sự, 2011) Theo Barcode of life năm 2011 đã lưu trữ được hơn

1.100.000 ADN barcode của thực vật được lưu trữ trong ngân hàng gen quốc

tế và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau để chu n hóa mức độ quốc tế

về việc sử dụng ADN barcode, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN có thể làm mã vạch phân biệt nhiều loài (CBOL Plant Working Group, 2009;Chen S và cộng sự,2010; Gao T.Y.H và cộng

sự, 2009; Kress J.W., 2005)

Tính đến ngày 31/12/2019 cơ sở dữ liệu ADN mã vạch BOLD đã lưu trữ được 6.760.000 đoạn ADN mã vạch của 215.000 loài động vật, 69.000 loài thực vật, 22.000 loài nấm và loài khác

1.4.2.1 r nh tự gen nhân

Các trình tự mã vạch được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến

sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định Tuy nhiên, khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc

có số lượng bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng ADN genome khi được tách chiết và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng chỉ thị mã vạch ADNbarcode (Vijayan

K và Tsou C H., 2010; Yao H và cộng sự, 2010)

1.4.2.2 Vùng gen mã hóa ribosome

Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome Các gen DNA ribosome (rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome

18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal

transcribed spacers nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba

gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Nhìn chung các đơn vị rDNA

được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau

Hiện tại, vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những công cụ

hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng

Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính

cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do

nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó Trên cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước và nguồn gốc tiến hóa khác nhau(Scharaschklin T và Doyle J.A., 2005; Taberlet P và Eric C., 2010; Yong H L., 2010)

1.4.2.3 r nh tự gen lục lạp

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử ADN mạch vòng có kích thước 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy region và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region Hai bản sao được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb có độ dài trung bình 20

- 30 kb Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao , các gen tRNA (35 gen và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen cần thiết cho sự tồn tại của chúng

Việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm vì hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do Dựa trên các nghiên cứu

về phát sinh loài gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên thế giới Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại(Van DeWiel C C M và Van Der Schoot J.,2009; Vijayan K và Tsou C H 2010; Wu F và Mueller L A.,2006)

1.4.2.4 r nh tự gen matK

Gen matK có kích thước khoảng 1.550 bp và mã hóa cho enzyme

maturasebliên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên

mã RNA và là 1 trong những gen tiến hóa nhanh nhất trong số các gen trong hệ

gen lục lạp Do có mặt ở phần lớn thực vật nên matK đã được sử dụng như

một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực

vật CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90%

mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp

mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode chu n cho

thực vật (Vijayan K và Tsou C H., 2010; Yong H L và Jinlan R., 2010)

1.4.2.5 r nh tự gen rbcL

Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất mã hóa các

tiểu đơn vị lớn của rubilose – 1,5 bisphotphate cacboxylase/oxygenlase

(RUBISCO) rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật và đã được sử

dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn

10000 trình tự rbcLcó sẵn trong GenBank Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong

những trình tự gen tiềm năng cao nhất cho các nghiên cứu ADN barcode ở thực vật Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm

đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các chỉ thị barcode khác, ví dụ như matK là hai locus barcode chu n cho thực vật (Wu F và Mueller L A.,

2006; Yao H và cộng sự, 2010; Yong H L và Jinlan R., 2010)

1.4.2.6 r nh tự gen ycf

Gen ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids Gen này

được bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù hợp với ADN barcode của một vài nhóm Tuy nhiên, gen này chưa được công nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một ADN barcode (Van DeWiel C C.M., (2009); Vijayan K và Tsou C H 2010)

Ngoài ra còn có trình tự ycf1 (bao gồm ycf1a và ycf1b cũng được

chứng minh là một chỉ thị DNA mã vạch hiệu quả trong phân loại thực vật (W Dong và cộng sự, 2015

1.4.3 Tình hình nghiên cứu ADN mã vạch ở thực vật

1.4.3.1 Những thành tựu tr n thế giới

Hiện nay kết quả nghiên cứu một vài locus trong hệ gen lục lạp và hệ gen nhân dùng làm chỉ thị trong nghiên cứu ADN mã vạch thu được kết quả còn hạn chế Vì vậy, việc sử dụng kết hợp các locus để bổ sung cho nhau đem lại hiệu quả cao hơn trong đánh giá, phân loại các loài thực vật là thực sự cần

thiết Trên thực tế từ lâu ITS1 đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài, bên cạnh đó trình tự gen matK có tỷ lệ tiến hóa cao nhất trong các gen

lạp thể cũng có khả năng phân biệt loài cao Trên cơ sở đó CBOL đã kết hợp

hai locus của ITS1và matK mang lại hiệu quả cao (70% sự phân biệt loài và

giảm nhiều chi phí cho các điều tra về xây dựng mối quan hệ cũng như phân loại đánh giá các loài thực vật Hiệu quả kết hợp giữa hai gen này thích hợp cho các nghiên cứu như là điều tra tương tác thực vật - động vật, xác định các loài cây được bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy mô lớn và phân biệt cây giống trong các chương trình tái sinh rừng phân biệt và cho mục đích xác định loài và phân loại (Vijayan K và Tsou C H., 2010)

Ogden và cộng sự (2008) đã phát triển một cách tiếp cận kiểu SNP trên

ADN mã vạch gen matKđể phân biệt giữa các sản ph m gỗ Ramin

(Gonostylus), loài được CITES bảo vệ, với các loài không cùng họ hoặc loài

có cấu trúc giải phẫu tương tự nhưng quan hệ xa, không được bảo vệ bởi CITES Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của tiến sĩ Vincent Savolaimen

và cộng sự sử dụng gen matK đã nhận diện được 1600 loài lan và phát hiện

một loại trước đây được cho là lan thực chất là hai loài tách biệt (Srimara R.S.U, Sreejayn và cộng sự 2010

Năm 2011, Xiaohui Pang và cộng sự đã sử dụng bốn vùng ADN mã

vạch (rbcL, matK, rpoC1 và ITS2 để xác định các loài trong chi Hoa hồng Nhóm tác giả khẳng định ITS2 là tốt nhất trong 4 locus được thử nghiệm làm

mã vạch cho các loài Hoa hồng Tiếp tục đánh giá hiệu quả của ITS2 để xác

định một loạt các loài Hoa hồng Trong số 1410 mẫu thực vật được thu nhận

từ 893 loài thuộc 96 chi khác nhau, ITS2 đã xác định thành công 78 loài và

100% trong số chúng ở cấp độ loài và giống Như vậy, nghiên cứu đã cho ta

thấy vùng ITS2 là một mã vạch mạnh mẽ, mặc dù không hoàn hảo để xác định

thực vật nhưng góp phần cung cấp thông tin có giá trị để xác định các loài có liên quan chặt chẽ trong các nhóm phân loại thực vật (Xiaohui Phang và cộng

sự, 2011)

Pradosh Mahadani và cộng sự (2013 đã tiến hành nghiên cứu đề tài

“Xác định ADN mã vạch của các loài thực vật (Rauvolfioideae:

Apocynaceae) ở vùng Đông Bắc Ấn Độ” Trong nghiên cứu này, các tác giả

xem xét lựa chọn sự giống nhau của điểm lựa chọn đánh dấu Để kiểm tra

hiệu quả của gen lục lạp matK trong việc phân định loài bằng phương pháp

ADN mã vạch Trong nghiên cứu phân tích mã vạch ADN matK và psbA trình tự được kiểm tra, chọn lọc để phân biệt các loài thực vật của họ

trnH-Apocynaceae ADN từ lá non của các loài được chọn phân lập đã cho thấy gen matK dài gần 800 bp và trnH-psbA dài 450 bp Kết quả này đóng góp vào

việc cho thấy ADN lục lạp được khuếch đại để xác định cấp độ loài Trình tự

matK dài 758bp so với trnH-psbA cho thấy sự khuếch đại dễ dàng, sự liên kết

và mức độ phân biệt cao ở loài Rauvolfioideae Sự xen kẽtrnH-psbA giúp thu được các chuỗi hai chiều không đổi Rõ ràng các chuỗi matK được tạo ra một

cách liên kết nhóm chặt với các nhóm trong ngân hàng gen và có ý nghĩa lớn

Subashini Sekar và cộng sự (2014 đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nhận

dạng dây thìa canh bằng kỹ thuật RAPD và gen nhân lục lạp trnK” Trong nghiên cứu này họ đã sử dụng ba loài là Gymnema sylvestre, G elegan, G

mountain, Sử dụng mồi RAPD để đánh dấu ba điểm cho dây thìa canh, bảy điểm

cho loài G elegan và 4 điểm cho loài G mountain Nghiên cứu đã thu được kết quả Gymnema sylvestre và loài G mountain có độ tương đồng cao nhất trong khi

đó Gymnema sylvestre với loài G elegan có độ khác biệt lớn hơn Phân tích đa

hình cho thấy gen Gymnema sylvestre dài 204 bp, loài G.elegan dài 174 bp, loài

G mountain dài 168 bp Kết quả nghiên cứu này đã đóng góp thông tin vào việc

sử dụng ADN barcode để xác định loài Gymnema sylvestre

Nerea Larranage và José L.Hormaza(2015) đã xác định được trình tự

mã vạch DNA của 7 loài trong chi Na, đó là: A chemirola, A squamosa, A

reticulata, A muricata, A macroprophylata, A glabra, A.purpurea nhờ chỉ

thị gen matK và rbcL Trong đó, gen matK có thể phân biệt được 7 loài còn gen rbcL không thể phân biệt được 2 loài A cherimola và A squamosa(Nerea

Larranaga và José L Hormaza 2015)

Costion C M và cộng sự (2016 đã sử dụng bốn locus mã vạch DNA

thực vật thường được sử dụng (rbcL, matK, trnH-psbA, ITS cùng với ba dấu hiệu plastid bổ sung (spacer xen kẽ trnH-trnF, spacer xen kẽ atpB-rbcL và

petD để ước tính sự đa dạng loài cây trong một khu rừng mưa nhiệt đới nổi tiếng về mặt phân loại ở QueenslADN, Australia Họ kết luận rằng mã vạch DNA là một trợ giúp đáng kể trong đánh giá đa dạng sinh học nhanh chóng và xác định quần thể cây mật mã, ngay cả khi chúng không thể phân biệt đối xử giữa tất cả các loài trong một vùng và bên cạnh đó hiệu quả để ước tính sự đa

dạng của các vùng gen được sắp xếp theo chiều tăng dần: rbcL,

trnH-psbA, ITS, và atpB-rbcL

L Jiao và cộng sự (2018 đã sử dụng 4 chỉ thị ADN mã vạch và tổ hợp giữa giữa các ADN mã vạch này để đánh giá khả năng phân biệt các loài

Pterocarpus sử dụng cả phương pháp phân loại ADN và phân tích dựa trên

cây phân loại Kết quả cho thấy tổ hợp 3 chỉ thị ADN mã vạch matK +

ndhF-rpl32 + ITS2 có khả năng phân biệt tốt nhất các loài Pterocarpus nghiên cứu

Hiện nay hệ thống ADN mã vạch cho thực vật chưa hoàn chỉnh Tuy nhiên với các trình tự ADN mã vạch này, các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học

1.4.3.2 Những thành tựu nghi n cứu tại Việt Nam

Tính đến nay, Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về mã vạch ADN Tuy nhiên, các nghiên cứu này vẫn còn rất nhỏ lẻ, trên một vài đối tượng sinh vật, chưa có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về mã vạch ADN Một số đề tài đã và đang được triển khai tại các viện nghiên cứu và trường đại học trong cả nước, như:

Tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhiều đề tài liên quan đã được thực hiện ở các đơn vị trực thuộc (Viện Công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện sinh học nhiệt đới, Bảo tàng thiên nhiên như:

Đề tài "Nghiên cứu mối quan hệ di truyền một số loại cây gỗ quý thuộc

chi trắc (Dalbergia bị đe dọa tuyệt chủng bằng chỉ thị phân tử"; đề tài "Góp phần xác định các loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb ở Việt Nam bằng

phương pháp DNA hỗ trợ phương pháp phân loại hình thái truyền thống"

Đề tài "Đánh giá đa dạng di truyền hai loài Dầu nước (Dipterocarpus

alatus và Dầu mít (D costatus họ Dầu (Dipterocarpaceae đang bị đe doạ

trong hệ sinh thái rừng nhiệt đới Nam Việt Nam" do TS Nguyễn Minh Tâm ở Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam làm chủ nhiệm, có thể nói đây là những công trình nghiên cứu đầu tiên và bài bản về lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định loài ở Việt Nam Kết quả của đề tài đã tạo tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo (Đinh Thị Phòng,

2011, 2014; Vũ Thị Thu Hiền, 2009

Kết hợp phương pháp sinh học phân tử và hình thái trong nghiên cứu

phân loại các họ Thiên lý (Asclepiadaceae và Trúc đào (Apocynaceae ở Việt

Nam (2009-2010, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN (DNA barcode phục vụ cho việc định danh sâm Ngọc Linh và cây Bá bệnh (Nguyễn Thị Thu Hiền, 2012; Đinh Thi Phòng, 2011, 2014)

Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự (2012 đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi

Đảng Sâm (Codonopsis sp bằng kỹ thuật ADN mã vạch, kết quả nghiên cứu

đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK và phân tích được sự đa

hình trên mỗi vùng gen Nghiên cứu đã ứng dụng mã vạch ADN trong phân

tích đa dạng di truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam và cùng các kết quả nghiên cứu trước đây trên thế giới đã khẳng định vùng gen ITS và matK có

thể giúp nhận diện loài và dưới loài như một mã vạch phân tử, đồng thời có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến hóa học phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược liệu quý

Hoàng Đăng Hiếu và cộng sự (2012 , đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây Dó Bầu

(Aquilaria SP tại Hà Tĩnh, kết quả nghiên cứu đã tách chiết và tinh sạch

được ADN tổng số của 18 mẫu Dó Bầu trong đó có 3 loài của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh; đã nhân bản thành công các

đoạn gen trnH – psbA, ITS1, rpoB, ITS bằng phương pháp PCR từ ADN

tổng số của 18 mẫu Dó Bầu

Hà Văn Huân và cộng sự (2014 đã sử dụng trình tự gen matK để phân loại và giám định loài sến mật (Madhuca pasquieri) là loài cây gỗ lớn thuộc

nhóm “ Tứ thiết” của Việt Nam (đinh, lim, sến, táu Việc phân định và giám định loài sến mật góp phần nâng cao hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài này ở Việt Nam

Phan Kế Long và cộng sự (2014 đã sử dụng hai trình tự gen matKvà

ITS-rDNA để phân tích mối quan hệ di truyền của các loài sâm Lai Châu (

Panax vietnamensis var Fuscidiscus và tam thất trắng (Panax stipuleanatus)

với sâm ngọc linh (P vietnamensis var vietnamensis Kết quả phân tích trình

tự nucleotide vùng gen matK vad ITS-rDNA chỉ ra các loài sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa Hai thứ sâm Lai Châu (Panax

vietnamensis var Fuscidiscus và sâm ngọc linh (P vietnamensis var

vietnamensis Ha & Grushv var vietnamensis của loài sâm Việt ( P

vietnamensis var vietnamensis Ha & Grushv có quan hệ chị em ( Phan Kế

Long và cộng sự, 2014)

Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nghiên cứu (2018) Bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, đã giải trình tự, phân tích và chú giải thành công hệ gen lục lạp hoàn chỉnh của sâm Ngọc Linh với kích thước 156.099 bp, bao gồm 124 gen, trong đó có 87 gen mã hóa protein, 8 gen mã hóa rRNA và 37 gen mã hóa tRNA; Đồng thời tìm kiếm được 4 chỉ thị có tiềm năng làm mã vạch phân tử cho phân loại sâm Ngọc Linh và các loài khác thuộc chi Nhân sâm

Nguyễn Ngọc Công – Khóa luận tốt nghiệp ngành CNSH – Đại học Lâm nghiệp Việt Nam ( 2018 đã tách chiết và tinh sạch được ADN tổng số

của 2 mẫu Dó quả nhăn ( Aquilaria rugosa) Đồng thời nhân bản thành công

và xác định được các đoạn trình tự gen, trình tự các nucleotide của 3 đoạn gen

matK, trnH-psbA, rbcL bằng phương pháp PCR

Lưu Thị Thu – Khóa luận tốt nghiệp ngành CNSH – Đại học Lâm nghiệp Việt Nam (2019) Tách chiết được ADN tổng số của 3 mẫu Keo Lai

(Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrd) Nhân bản thành công các

gen matK, rbcL và trnH-psbA bằng kỹ thuật PCR từ ADN tổng số của các mẫu thu được Đồng thời xác định được trình tự các đoạn gen matK, rbcL và

trnH-psbA của Keo Lai

Lê Công Mạnh (2019 đã thực hiện nghiên cứu “Nghiên cứu xác định

DNA mã vạch cho loài lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata

Trong nghiên cứu, đã sử dụng phương pháp ADN mã vạch với 04 loại locus

(matK, rbcL, trnH-psbA và ITS2 để xác định loài Lan kim tuyến Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen của 03 loại locus rbcL, matK và ITS2 đều có giá trị làm ADN mã vạch cho loài Anoectochilus formosanus trong đó trình tự đoạn

gen ITS2 cho kết quả tốt nhất sau đó là matK và khả năng phân biệt loài thấp nhất là rbcL

Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng nhằm cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn để bảo tồn và phát triển nguồn gen sinh vật ở nước ta, cũng như nhận dạng, truy xuất nguồn gốc và đăng ký bản quyền về cây giống

và sản ph m của chúng

1.4.3 Ứng dụng của AND mã vạch

Những ứng dụng của mã vạch ADN không chỉ nhận diện nhanh các mẫu mà còn mở rộng nghiên cứu sắp xếp theo nhóm những bí n, còn mơ hồ hoặc những loài phức tạp Trong hệ sinh thái, mã vạch ADN rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc dù chúng hầu như không giống nhau

về hình thái Phân tích sinh thái học ở thực vật đang diễn ra mạnh mẽ để hiểu được chế độ dinh dưỡng hoặc hướng di cư của động vật

Mã vạch ADN cũng được ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ việc xác định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập kh u, để ngăn cản sự vận chuyển trái phép các loài thực vật và động vật quý hiếm qua biên giới Trong lĩnh vực pháp y, chỉ cần một lượng mẫu nhỏ, thậm chí bị vài biến dạng cũng

có thể giúp cảnh sát truy tìm nguồn gốc Gần đây, cơ sở dữ liệu mã vạch ADN của chó đã được các sở pháp y của nhiều quốc gia sử dụng nhằm hỗ trợ công việc của họ (Steinke, D và cộng sự, 2009

 Kiểm soát tác nhân gây hại trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, một trong những điều đáng lo ngại nhất là kiểm soát những tác nhân gây bệnh cho cây trồng, chi phí cho việc đó lên đến hàng

tỷ USD mỗi năm Sử dụng mã vạch ADN sẽ giúp định danh nhanh chống các loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm n (giai đoạn ấu trùng , hỗ trợ chương trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng Cho đến này, về cơ bản đã hoàn thành

mã vạch ADN để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ

có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh Kinh doanh sản ph m nông nghiệp sẽ được đ y mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh (Hoàng Cảnh, 2006

 Xác định vật chủ trung gian gây bệnh

Mã vạch ADN cũng được sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian truyền bệnh Các nhà khoa học những người mà không phải là nhà phân loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh trùng đã đ y nhanh quá trình nhận diện các loài mang bệnh lây truyền giữa người và động vật Và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng như phương pháp điều trị đạt được hiệu quả nhanh chóng Mã vạch ADN cho những vật chủ gây bệnh đang được xây dựng và phổ biến Điều này cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ và phương pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn trùng (Hoàng Cảnh, 2006

 Bảo vệ loài nguy cấp

Một thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục giảm sút, trong đó có nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng Không thể kiểm soát được săn bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trưởng giảm 90% Rất khó phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang giả quay hiếm hay không Vì vây, mã vạch ADN có thể giúp những cơ quan có

th m quyền chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học Một dự án chiến lược trên toàn trên thế giới của mã vạch ADN đã được công bố gần đây nhằm xây dựng một thư viện mã vạch của các loài đang bị đe dọa (Hoàng Cảnh, 2006

 Duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên

Mã vạch ADN ngoài việc giúp ngăn ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó còn được ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp Một quốc gia có nền kinh tế phụ thuộc vào nguồn tài nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra suy giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng của nhiều loài Để kiểm soát khai thác, nhà chức trách cần

phải thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm soát kinh doanh các sản ph m nông nghiệp, biển và lâm nghiệp Có ít nhất hai dự án về mã vạch cho cá (Fish – BOL) và cây thân gỗ (Tree – BOL nhằm thúc đ y công tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên(Hoàng Cảnh, 2006)

 Kiểm tra chất lượng nước

Hiện tại nước ngọt trở thành nguồn tài nguyên quý giá cần được bảo vệ

ở mỗi quốc gia Nguồn nước bị ô nhiễm cần được xác định để phòng ngừa và

có biện pháp xử lý Một vài sinh vật đơn giản trong nước được xem là ô nhiễm như ấu trùng của muỗi Tuy nhiên, ô nhiễm càng cao thì càng khó khan hơn trong việc xác định các chỉ số gây ô nhiễm Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học đang cố gắng xây dựng thư viện mã vạch ADN cho những “chỉ

số mập mờ” Điều này giúp cho các bộ quản lý môi trường tiêu chu n hóa lại các chỉ số trong công việc đánh giá nước và thiết lập quy trình đánh giá tiêu chu n nước tốt hơn ở mỗi quốc gia (Hoàng Cảnh, 2006

Chương 2.

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu tổngquát

Xác định được một số trình tự ADN mã vạch phục vụ giám định loài

Kim Tiền Thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) và xây dựng được kỹ thuật nhân giống cây Kim tiền thảo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, góp phần

vào bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý này ở Việt Nam

2.1.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được 3 đến 4 đoạn trình tự ADN mã vạch để giám định loài

Kim tiền thảo

- Xác định được công thức khử trùng tạo mẫu sạch sinh chồi Kim tiền thảo

- Xây dựng được môi trường nhân nhanh chồi của cây Kim tiền thảo

- Xây dựng được môi trường ra rễ tạo cây Kim tiền thảo hoàn chỉnh

- Xác định được thành phần ruột bầu phù hợp cho việc ra cây ngoài

vườn ươm

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định một số trình tự ADN mã vạch để giám định loài

Kim tiền thảo;

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu bằng Javen 8% đến khả năng tạo mẫu sạch Kim tiền thảo;

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST và chất hữu cơ bổ

sung đến khả năng nhân nhanh chồi Kim tiền thảo;

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ

in vitro;

Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả

năng sống và sinh trưởng của cây Kim tiền thảo ngoài vườn ươm

2.3 Vật iệu nghiên cứu

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Loài Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium

(Osb.) Merr)

- Vật liệu nghiên cứu: Cành Kim tiền thảo

- Địa điểm lấy mẫu: Trung tâm nghiên cứu và sản xuất thuốc Suối Hai

– Ba Vì – Hà Nội của Bệnh viện Y học cổ truyền Bộ Công an

2.3.2 Thiết bị dụng cụ

- Thiết bị, dụng cụ cho phân tích DNA: cối chày sứ, ống eppendorf các loại, pipetman, ống pancol, đầu côn các loại Máy móc gồm: bể ổn nhiệt, cân điện tử, máy li tâm lạnh, máy PCR 9700, bể điện di gel agarose nằm ngang, máy soi gel, máy vontex, lò vi sóng, máy chụp ảnh

- Thiết bị, dụng cụ cho nuôi cấy mô – tế bào: Bếp từ, tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng

2.3.3 a chất

- Hóa chất dùng trong tách chiết ADN tổng số:

Quá trình tách chiết sử dụng đệm chiết CTAB và một số hóa chất khác như: Dung dịch Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) (C:I); 70% ethanol; Isopropanol; H2O deion

- Hóa chất PCR:sử dụng bộ kít PCR Master Mix của hãng InTRON, Hàn Quốc; H2O deion và các cặp mồi đặc hiệu nhân các đoạn gen ITS, psbA-

Kích thước đoạn gen (bp)

- Hóa chất tinh sạch sản ph m PCR:sử dụng bộ Kit tinh sạch sản ph m

PCR của hãng InTRON, Hàn Quốc

- Hóa chất điện di, bao gồm:Agarose, hóa chất nhuộm axit nucleic Redsafe, dung dịch đệm điện di TAE 1X, DNA Loading Dye, DNA marker

100bp

- Các loại hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào :

Môi trường MS, 1/2MS, WBM;

Các hóa chất khử trùng mẫu cấy: HgCl2 0,1%;

Các chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin: BAP, KIN;

Các chất ĐHST nhóm auxin: IBA, -NAA;

Đường sucrose (g ;

Agar (g)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Xác định một số ADN mã vạch để xác định loài cây Kim tiền thảo

2.4.1.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ thực vật

ADN tổng số từ các mẫu lá được tách chiết theo phương pháp CTAB của Doyle và cộng sự (1990), có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Dung dịch Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) (C:I); 70% ethanol; Isopropanol; H2O deion

 Các bước tiến hành tách chiết ADN tổng số như sau:

Dụng cụ nghiền mẫu: cối chày sứ, ống eppendorf các loại, pipetman, ống pancol, đầu côn các loại… Máy móc gồm: bể ổn nhiệt, cân điện tử, máy

li tâm lạnh, máy PCR 9700, bể điện di gel agarose nằm ngang, máy soi gel, máy vontex, lò vi sóng, máy chụp ảnh (Các dụng cụ đã được hấp khử trùng)

Bước 1: Nghiền 50 mg mẫu (lá, thân, rễ) bằng cối chày sứ và trộn đều có bổ

sung 1,0 ml dung dịch đệm CTAB ( Gồm 1,4M NaCl; 1,0M Tris – HCl; 20mM EDTA; 2% CTAB; pH = 8 Cho dung dịch vào trong ống eppendorf1,5ml

Bước 2: Ủ ở nhiệt độ 65oC trong 1 giờ, Trong quá trình ủ cứ 15 phút lắc đều 1 lần