NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM CENLLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ. LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Nấm sợi đóng vai trò rất quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái RNM, nhờ có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào như cellulase, protease, kitinase, amy

_

KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM CENLLULASE CỦA MỘT SỐ

CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP

TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRẦN THANH THỦY

TS VÕ THỊ HẠNH

Thành phố Hồ Chí Minh - 2007

MỞ ĐẦU

Sự hiện hữu của rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ là kết quả của hơn 25 năm phục hồi và phát triển bằng các nổ lực to lớn của chính quyền và nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh Vào ngày 21 tháng 1 năm 2000, Ủy ban MAB/ UNESCO đã công nhận RNM Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam [55]

Trước đây, RNM Cần Giờ là một vùng đất hoang hóa với phần lớn diện tích đất bùn khô nứt nẻ và một phần là thảm thực vật xơ xác mà độ che phủ chỉ dưới 40% Sau khi khôi phục lại rừng bằng việc trồng các loài cây có giá trị kinh tế quan trọng như Đước, Dưng, Dà quánh, Gõ biển, Xu ổi…,đồng thời với việc khoanh nuôi, tu bổ rừng tự nhiên, đến nay, một hệ sinh thái RNM mới tươi tốt đã hình thành, tạo MT sống cho các loài động thực vật, gia tăng mức độ đa dạng sinh học

RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm và bền vững, có khả năng chịu đựng điều kiện sống rất đặc biệt khắc nghiệt Là nơi

có hệ VSV vô cùng phong phú và đa dạng như nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…., trong đó nấm sợi chiếm số lượng rất lớn Nấm sợi đóng vai trò rất quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái RNM, nhờ có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào như cellulase, protease, kitinase, amylase, enzym phân giải dầu… Đặc biệt, enzym cellulase do nấm sợi sống trong RNM sinh ra là rất lớn, do thảm thực vật dày đặc ở RNM Cần Giờ là nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi dào nhất cho các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym này

Enzym cellulase là hệ enzym bao gồm các loại enzym: C1, Cx, glucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose Enzym cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp để chế biến thức

β-ăn chβ-ăn nuôi, trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ lượng enzym công nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzym cellulase, hemicellulase và pectinase Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp trên thế giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD

Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzym cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm MT RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng VSV có hoạt tính enzym cao chưa được khai thác Trong khi đó, các công trình khoa học nghiên cứu về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ cho đến nay vẫn còn

bỏ ngõ Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tôi chọn đề tài:

“Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi

phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”, nhằm tận dụng nguồn phế thải nông

nghiệp để sản xuất phân bón cho cây trồng, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững, giảm thiểu sự ô nhiễm MT

Việt Nam là nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng

và đang trên đà phát triển Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào, cùng với sự công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ô nhiễm MT đang trở thành nguy cơ thật sự Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp là cellulose, sản phẩm của quá trình phân hủy chất hữu cơ trong phế thải là mùn có thể làm phân bón rất tốt cho cây trồng Do

đó, xử lý chất thải bằng VSV là hướng tích cực có nhiều ưu điểm so với các phương pháp lí, hóa, cơ học, đang rất được quan tâm khai thác

 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ

- Đề xuất hướng ứng dụng các chủng nấm sợi phân lập được

 Nhiệm vụ của đề tài

1 Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ

2 Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao

3 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và phân loại các chủng nấm sợi được tuyển chọn

4 Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển

và sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng được chọn

5 Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào việc phân hủy các chất phế thải, góp phần hạn chế ô nhiễm MT

 Địa điểm nghiên cứu đề tài

Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh và PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh

Chương 1

TỔNG QUAN1.1 Tình hình nghiên cứu nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ

1.1.1 Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ

RNM chiếm một phần đáng kể trong các kiểu rừng ngập nước, thường tồn tại ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trên thế giới hiện nay còn khoảng

15 triệu ha RNM phân bố ở các vùng bờ biển có bùn, các cửa sông lớn, các vịnh cạn và các đầm mặn giáp với biển

RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, là “lá phổi xanh” của thành phố Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sông, điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi và tạo MT phát triển ngành thủy sản Bên cạnh đó, RNM Cần Giờ còn là nơi cung cấp thức ăn, là nơi cư trú, sinh sản của các loài thủy sinh vật và động vật có xương sống ở cạn Hiện nay, Cần Giờ còn là địa điểm du lịch hấp dẫn với 3.000 - 5.000 du khách đến tham quan mỗi tuần [83]

RNM Cần Giờ hiện nay có diện tích khoảng 29,380 ha chiếm 41,18 % đất huyện Cần Giờ [87] Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm Nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ nhiệt dao động trong ngày từ 5-70

C Chế độ bán nhật triều không đều Độ mặn dao động 18‰ – 30‰ [1]

Một nghiên cứu mới đây cho biết RNM Cần Giờ đã có 157 loài thực vật; 63 loài phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc 3 ngành: Tảo khuê, Tảo giáp, Tảo lam; 100 loài động vật đáy không xương sống như tôm, cua, sò ốc Ngoài

ra, còn có 120 loài cá, trong đó có các loài có giá trị kinh tế cao như cá Ngát,

cá Dứa, cá Chẽm; 31 loài bò sát như cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu nhũ như khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 loài chim [83] Đây là các

nguồn thức ăn tốt nhất cho hệ nấm sợi sống trong RNM Nấm sợi có khả năng tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân

cây ở RNM thành glucose để sử dụng Ngoài ra, nấm sợi còn có thể sinh các

loại enzym khác như protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tôm, cua,

ốc, xác chết các loài động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng có thể hấp thu [1]

Hình 1.1 Bản đồ RNM Cần Giờ [83]

Vậy, hệ nấm sợi là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một

nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ Chúng sử dụng chất hữu cơ từ thảm thực vật và hệ động vật phong phú làm thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ

1.1.2 Tình hình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM

 Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase

Khả năng sinh enzym cellulase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi

Trichoderma và Aspergillus

Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học

Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất

cellulase đầu tiên Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74]

Năm 1998, YU đã nuôi cấy T reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột

cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68]

Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym

như polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A niger 3T5B8 trên

nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật [61]

Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A niger

trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton [67]

Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và

một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A niger VS-1 trên MT lên men

bán rắn [40]

Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T reesei sinh tổng hợp

enzym cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC [40]

Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22]

Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và

đặc điểm cellulase của A niger Rnnl 363 Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T reesei bằng phương

pháp lên men bán rắn [24], [57]

Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym

cellulase từ T reesei và A niger trên MT lên men bán rắn [40]

Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc [27]

 Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM

Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu

về phân lập và phân loại nấm sợi trong hệ sinh thái RNM Nhưng kết quả

nghiên cứu còn sơ sài, chưa đáp ứng được nhu cầu hiểu biết về sự đa dạng của nấm sợi cũng như vai trò của chúng trong hệ sinh thái RNM [64] Trước đây, người ta cho rằng điều kiện MT RNM quá khắc nghiệt, không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy trong điều kiện sống đặc biệt như vậy, thì con đường trao đổi chất của nấm sợi cũng khác hơn con đường trao đổi chất của các VSV trên đất liền Vì vậy, có thể sẽ có những sản phẩm trao đổi chất có tính chất đặc biệt hơn, khác lạ hơn trong đó có các enzym, các chất kháng sinh mới …[18] Tuy nhiên, cho đến nay cũng chưa có công trình đi sâu nghiên cứu về hoạt tính

sinh học của các chủng nấm sợi từ RNM

Năm 1955, Gribb và cs đã phân lập được hai loài nấm đầu tiên ở thực

vật RNM là Phialophloraphoma litoralis (ngành phụ Deuteromycotina) và Gnomonia longiostris (ngành phụ Ascomycotina) từ thân cây Avicennia marina var resinifera [63]

Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 loài vi nấm RNM thuộc các ngành phụ Ascomycotina, Deuteromycotina và Basidiomycotina [64]

Năm 1987, Hyde và cs công bố phát hiện được 89 loài nấm từ cây

Rhizophora mucronata lanak ở RNM Ấn Độ [66]

Năm 1994, Newell S.Y phân lập được các loài nấm nhày (Oomycetes)

ưa mặn từ lá cây mục ở RNM, có khả năng phân hủy mạnh xác động, thực vật

ở đó [73]

Năm 1997, theo Tadayoshi và cs, các chủng nấm sợi chủ yếu được tìm

thấy ở RNM Thái Lan và Nhật Bản thuộc chi Trichoderma (có nhiều ở thân cây), Oomycetes (có nhiều ở lá rụng) [77]

Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cs về nấm sợi RNM Năm 2002, tác giả này tiếp tục nghiên cứu sự

đa dạng, nghiên cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbua

hydro của nấm sợi từ RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình Riêng ở RNM Cần Giờ cho đến nay chỉ có một số ít nghiên cứu về phân lập Cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ [19], [20], [21]

 Một số chế phẩm enzym cellulase trên thế giới và Việt Nam

Ngày nay, trên thế giới và cả Việt Nam, các chế phẩm sinh học chứa các VSV có khả năng sinh các loại enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi và phổ biến trong các lĩnh vực chăn nuôi, trồng trọt,… Điều này giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế được tình trạng ô nhiễm MT

Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei, Aspergillus niger…và gần đây là các chủng vi khuẩn [30]

Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk có chế phẩm “Celluclast” dùng trong thức ăn gia súc [40]

Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từ T reesei và từ A niger trong

công nghiệp thực phẩm [40]

Ở Nhật, hãng Amano hàng năm đã sản xuất trên 8000 tấn chế phẩm enzym các loại để dùng trong nông nghiệp Enzym “Panxenlase” chứa cellulase, hemicellulase, protease và amylase, hoạt tính dùng trong chăn nuôi Chế phẩm “Cellubrix”, “Cellusoft”, “Onozuka” dùng trong công nghiệp làm mềm vải, trong thức ăn gia súc [40]

Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” trong thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol [77]

Ở Liên Xô, chế phẩm “Cellolignorin” được sử dụng trong chăn nuôi, hoạt tính 1-50 đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase [77]

Ngoài ra, còn có các chế phẩm cellulase khác được tạo ra bởi các nhà sản xuất: Cellulaset và Novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament

CT [RM], Avizyme [FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC [MJ], Cellulase

TAP [AM], Cytolase [GR] [74]

Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI,

BioII, BioIII … có dạng bột, chứa các enzym amylase, protease, cellulase và

các VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho bò, heo, cá Chế phẩm có tác dụng phòng chống các chứng rối loạn tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[78]

Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm

Trichotech chứa vi nấm Trichoderma, chế phẩm này có dạng rắn, tơi xốp,

nhẹ, màu xám nâu đậm, giúp cây trồng chống được các loại nấm bệnh….[82]

Công ty TNHH TM và sản xuất Mai Xuân (TP Hồ Chí Minh) sản xuất

chế phẩm TRICHO-MX chứa vi nấm Trichoderma, có dạng bột Có tác dụng

hạn chế nấm hại, cải tạo đất, ủ phân bón cho cây trồng

Công ty TNHH TM và sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng

(Bình Dương) đã sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh

enzym cellulase, dùng xử lý nước ao nuôi tôm cá, kích thích tiêu hóa, ở gia

súc…như: MD-Bio-Zemix, Biofat, Bio vitamin, Biolaczym…

1.2 Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase

Rất ít VSV có khả năng sinh tất cả các loại enzym cần thiết để phân giải cellulose ở dạng tinh thể Chúng phải tiết ra hệ enzym phức tạp, có khả năng phân hủy cellulose theo phương thức khác nhau như thủy phân, oxy hoá [51], [52]

Cellulose bị phân rã dưới tác dụng của vi khuẩn háo khí và kỵ khí Song khả năng phân hủy cellulose không bằng nấm, do vi khuẩn thường tạo

ra enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp hơn 0,1g/l [51] Cellulase được

sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn trong dạ cỏ Ruminococcus albus (Berger 1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp (Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khí Clostridium sp (Parsiegla, 1998) [39], các loài xạ khuẩn Streptomyces,

Thermomonospora …[51]

Nấm sợi là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy

cellulose Các enzym cellulase sản sinh từ nấm sợi được tạo ra với nồng độ

rất cao, không có các dạng vật lý phức tạp như cellulase bắt nguồn từ vi

khuẩn và có tác dụng phân hủy rất mạnh cellulose Các chi nấm có khả năng

sinh cellulase phổ biến là: Aspergillus, Alternaria tenuis, Celluvirio gilvus,

Clasdosporium, Penicillium, Fusarium, Myrotheticum, Trichoderma … [39]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm sợi

Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ

kitin-glucan, kitozan Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha)

không vách ngang hoặc có vách ngang (septum) Các sợi nấm vừa phát triển

theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm

(mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể (hình 1.2) Hệ sợi nấm phát triển

thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 1.3)

KL nấm sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn Bề mặt KL có thể mượt,

Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm,

giọt tiết, sắc tố hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng loài [78]

Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu hóa, không có khả năng quang hợp Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật [18]

Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo

kiểu vô tính hoặc hữu tính

Bào tử vô tính Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín Bào

tử trần là dạng bào tử phổ biến nhất

Hình 1.4 Các dạng bào tử trần của nấm sợi [78]

Sinh sản hữu tính Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng giao, dị giao, và tiếp hợp

Hình 1.5 Sự tiếp hợp của nấm sợi [78]

Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử túi

(ascospores) và bào tử đảm (basidiospores)

1.2.2 Đặc điểm phân loại của nấm sợi

Trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài Phân loại vi nấm vẫn đang ở thời kỳ phân loại học hình thái

(Phenetic classifications) dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc

điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản Trong những năm gần đây, tiến bộ của sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một

diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm

Hiện nay, tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996), Robert A samson (1989), Saccardo P.A (1880-1886), Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984) …[78]

Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa phân loại: Saccardo P.A (cải tiến), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Nguyễn Lân Dũng (2006) để phân loại [8], [9], [10], [12] [14], [27], [74]

1.2.3 Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi

Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh

tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro được ứng dụng trong xử lý ô nhiễm

MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất ….[5], [6], [40], [43]

 Hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào

Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể [29] Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng

3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV Nấm sợi

có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hoá các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên Một số enzym

đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: cellulase, protease, amylase, pectinase và kitinase [6]

 Enzym cellulase Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose

thành glucose Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi-cellulose và lignin (15-30%) Các chủng

nấm sợi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus….có khả năng sinh enzym

cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất

thải hữu cơ chứa cellulose…[19], [20], [21]

 Enzym protease Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên

kết nhau bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid ngắn Nấm sợi có khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi

giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải…[5], [6], [29]

 Enzym amylase Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ

chủ yếu của thực vật thành đường glucose Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose Nấm sợi có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là

những tác nhân không thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium,

xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt…[29], [30]

 Enzym kitinase Kitin là các biopolyme chứa các gốc

N-acetyl-glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside Trong RNM,

lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc…rất nhiều Nấm sợi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… sinh enzym kitanase phân giải kitin, đồng thời

tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin, chống các loài côn trùng có vỏ kitin

Như vậy, nấm sợi còn có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống

các VSV gây bệnh và côn trùng có hại trong nông-lâm- ngư nghiệp [18], [19]

Các chủng nấm sợi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả

năng sinh enzym phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất có cấu tạo phức tạp

và khó phân giải, góp phần xử lý ô nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ lượng dầu tràn vào từ biển gây ô nhiễm và độc hại đối với sinh vật sinh sống ở RNM Cần Giờ, các loài nấm sợi có khả năng phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đó

Hình 1.6 Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch [78]

 Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi

Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác

Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm sợi chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn Chất kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván Trong phẫu thuật chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương

Chất kháng sinh được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của kháng sinh Những vấn đề về chất kháng sinh được sinh ra từ VSV đang là vấn đề quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [10]

 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng

Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều Các axit hữu

cơ như axit axetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng

nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong

y học Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit xitric bằng nấm

sợi A niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì [17] Ngoài ra, các nhà khoa học

Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng

nấm sợi F monoforme và F oxysporum [29]

Tuy nhiên, có rất nhiều loài nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ

dùng, thực phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng Một số nấm

sợi tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung thư Ví dụ: A flavus sinh độc

tố Aflatoxin gây ung thư gan Một số gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm tay chân…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng

1.3 Enzym cellulase từ nấm sợi

Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease, kitinase…được chú ý nhiều nhất do có những ưu điểm: Có hoạt tính cao; khối lượng enzym thu được nhiều do tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu

rẻ tiền; có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp …[29]

1.3.1 Khái quát về enzym

 Cấu trúc

Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào

các phản ứng sinh học [30]

Enzym có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo

từ L-axit amin liên kết nhau bởi liên kết peptid Bộ phận đặc hiệu tham gia

phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzym

Enzym gồm 2 nhóm: Nhóm enzym một cấu tử gồm những enzym có

thành phần hóa học duy nhất là protein và nhóm enzym hai cấu tử gồm những enzym có hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzym có vai trò xúc tác, phần thứ hai là coenzym gồm những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc

đẩy quá trình xúc tác Ngoài ra, có một số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn,

…đóng vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử [30]

 Cơ chế hoạt động

Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của enzym (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất (S) mà chúng tham gia Phản ứng không có sẳn mà được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ

khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S)

Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết

yếu tạo thành phức enzym - cơ chất (E-S)

Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu

hình không gian và mức độ bền vững các liên kết Các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm Phức enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra

Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản

phẩm và tách khỏi enzym

Phản ứng tổng quát:

E + S  E-S  E + P E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products)

1.3.2 Cellulose và enzym cellulase

Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima,

2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109

tấn/năm Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết

đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, mùn cưa…[5], [6] Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose Cellulose chiếm đến 89% trong bông

và 40-50% trong gỗ [52]

Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là

cellobiose có cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có cấu trúc không đồng nhất Có những

phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình

Hình 1.7 Cấu trúc đơn vị cellulose [84]

Hình 1.8 Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose [84]

Hình 1.9 Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian [84]

1.3.2.2 Enzym cellulase

 Cấu trúc

Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết Nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase,

pentozanase thành hệ enzym gọi là Citolase [39] Cellulase là một phức hệ

enzym bao gồm các enzym C1, Cx và β-glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành glucose [29]

Hình 1.10 Cấu trúc enzym cellulase trong không gian [86]

 Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự

nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình)

 Enzym Cx: Còn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thủy phân cellulose

- Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác

dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử

cellulose Được chia làm hai loại EGI, EGII Cả hai loại enzym này có thể

hoạt động ở nhiệt độ khá cao

Hình 1.11 Cấu trúc tinh thể của endoglucanase [81]

- Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành disaccarit gọi là cellobiose từ đầu không khử Bao gồm hai

loại CBHI và CBHII:

* CBHI có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit

amin Enzym này tác động lên cellulose vô định hình, ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của cellulose, không tác động lên cellulose biến tính như CMC

* CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin

CBHII liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vô định hình, không tác động lên cellulose biến tính [52]

Hình 1.14 Cơ chế tác động của enzym cellulase [39]

Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết hydrogen trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng

phản ứng

Glucose Cellobiose

β-Glucosidase

ase

CxC1

Sau đó Cx tiếp tục thủy phân cellulose phản ứng thành các phân tử

cellobiose Cuối cùng, β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose

 Điều hòa sinh tổng hợp enzym cellulase

Khả năng sinh tổng hợp cellulase trong các loài nấm sợi được điều hòa

ở mức độ phiên mã, mức độ mRNA mã hóa cho CBHI luôn cao nhất (Pettila, 1993) Tỷ lệ enzym CBHI cao nhất chiếm khoảng 50% trong hổn hợp

cellulase được tiết ra bởi T reesei (theo Gritzali và Brown, 1979), mức độ mã

hóa các thành phần khác của enzym cellulase luôn ở trạng thái ổn định [40]

Quá trình sản sinh enzym cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm ứng và ức chế bởi glucose Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên MT có chứa cellulose, dẫn xuất của cellulose, lactose Còn trên MT có chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase không tạo thành enzym cellulase (Biaria và Mishra, 1989)

Hơn nữa, hoạt tính cellulase còn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất

ức chế trong MT nuôi cấy Nhiều hợp chất phenol đã được chứng minh là có

tác dụng kìm hãm sự phát sinh cellulase ở S commune [52]

Khi nuôi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase Chẳng hạn, hai loại proteaza axit được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose có

khả năng làm tăng 10 lần hoạt tính endoglucanase của P chrysosporium [52]

Quá trình tổng hợp enzym cellulase cảm ứng còn chịu tác động của AMP vòng (AMPv) Chất này có tác dụng kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải nhờ một loại protein đặc biệt làm trung gian gọi là protein nhận AMPv (CAP) Khi AMPv kết hợp với CAP tạo thành phức hợp

có tác dụng hoạt hóa gen operator làm cho RNA-polymerase dễ dàng kết hợp với chúng để bắt đầu sao chép mã [30]

Nấm sợi chịu tác động trực tiếp của các yếu tố bên ngoài rất mạnh và phản ứng lại với tác động đó rất nhanh Vì thế, có thể sử dụng pH, nhiệt độ và

đặc biệt là cơ chất mà chúng tham gia phân hủy để điều khiển tổng hợp enzym Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzym cảm ứng sẽ tăng dần Nếu cứ tiếp tục tăng liều lượng cơ chất thì sẽ đến một mức nào đó quá trình này sẽ chựng lại và giảm do tăng áp suất thẩm thấu

bởi cơ chất [30]

1.3.3 Các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành enzym cellulase của nấm sợi trên MT lên men bán rắn

1.3.3.1 Thành phần MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase

 Nguồn dinh dưỡng cacbon

Trong MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn cacbon Nấm sợi có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau Nguồn cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase thường là giấy lọc, bông, bột cellulose, cám, lõi ngô, mùn cưa, bã mía, trấu,

rơm, than bùn, CMC, ….Các chủng Trichoderma nuôi trên MT có nguồn

cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất [38]

Ngày nay, bã mía được dùng như một cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu tấn/năm Ở Việt Nam, bã mía phần lớn dùng để đốt lò hơi, làm phân bón hữu

cơ, bột giấy, trồng nấm ăn….Tuy nhiên, không sử dụng hết và đã gây ô nhiễm

MT xung quanh Bã mía có hàm lượng cellulose rất cao 46% (theo A.G.Keller, 1964), ngoài ra còn chứa hemicellulose, lipid và sáp, chất khoáng, lignin, silic nên là một cơ chất cảm ứng tuyệt vời cho nấm sợi sinh enzym Ngoài ra, cám mì thường được sử dụng với tỉ lệ (6 : 4) do nó có chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp

enzym của nấm sợi, có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng dinh dưỡng cần thiết

 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Các nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các sinh vật sinh cellulase là muối nitrat Natri nirat làm cho MT kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase tùy vào đặc tính sinh lý của từng chủng Cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase, cao ngô có khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase mạnh hơn nấm men Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase, còn cao ngô kích thích CHBI

và CBHII Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt của các axit amin, các nguyên tố khoáng và những nhân tố kích thích sinh trưởng

[38], [39], [40]

 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… có vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia vào thành phần cấu tạo prôtêin, enzym, điều hòa pH MT nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulase Nồng độ tối thích của Zn

là 0,11- 2,2 mg/l, Fe 2 - 10 mg/l, Mn 3,4 - 27,2 mg/l Biotin và Tiamin không

có ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzym này [38]

1.3.3.2 Yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase

Ảnh hưởng của độ ẩm

Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30- 80% (Moo-Young, 1983) Trong quá trình nuôi cấy nấm sợi thu enzym cellulase

độ ẩm có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzym và hoạt tính của enzym

Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy nấm sợi là 50-60%, nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo

điều kiện cho vi khuẩn phát triển, nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, hoạt tính của enzym sẽ giảm Kim (1985) cho biết tốc độ

sinh trưởng tối ưu của T reesei ở độ ẩm 60%, nhưng khả năng sinh tổng hợp

cellulase ở độ ẩm thấp hơn xấp xỉ 50% [38], [40]

Ảnh hưởng của pH

Sự sinh trưởng của nấm sợi sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ chất Cơ chất bị oxy hóa không hoàn toàn sẽ sinh ra acid, hoặc hấp thụ ion amonium sẽ làm giảm pH Ngược lại, sự giải phóng ammonia qua sự loại nhóm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH pH tối ưu cho các loài nấm sợi khác nhau được sử dụng trong lên men bán rắn có giá trị từ thấp nhất là 3 đến cao nhất là 8 (Prior, 1992) tùy vào từng chủng nấm sợi khác

nhau Nấm sợi Aspergillus, Penicillium và Rhizopus có thể giảm pH của MT xuống dưới 3, Đối với các chủng nấm Trichoderma, Sporotrichum, Pleurotus,

pH ổn định hơn ở khoảng 4 và 5 [40]

Trong suốt quá trình nuôi cấy nấm sợi ta có thể điều chỉnh pH của MT bằng axit HCl, H2SO4, NaOH, KOH Durand (1988) đã điều chỉnh pH trong

nuôi cấy T viride ở qui mô pilot trên MT hạt cà phê-đường bằng cách phun

dung dịch urea, do hoạt động của urease của nấm sợi làm tăng pH qua việc tạo ammonia [29]

Ngoài ra, việc điều chỉnh pH thích hợp trong quá trình nuôi cấy nấm sợi hạn chế sự tạp nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [73]

 Ảnh hưởng nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzym cellulase Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ

280C-320C, tối đa dưới 500C [40], [73] Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp

có thể kìm hãm sự sinh trưởng thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế Theo Raimbaut & Alazard (1989) cho biết nhiệt

độ tối ưu cho sự sinh trưởng của A niger trên MT bột khoai mì là 35- 400

C, ngược lại ở 450C, sự nảy mầm của sợi nấm bị ức chế, khả năng sinh enzym giảm [40]

 Ảnh hưởng của MT khí

MT không khí quan trọng nhất là khoảng không gian giữa các tiểu phần

cơ chất, vì đây là nơi mà sinh khối nấm sợi sinh trưởng Oxygen phải khuếch tán từ khoảng không giữa các hạt cơ chất vào sinh khối, và CO2 phải khuếch tán từ sinh khối vào khoảng không giữa các hạt cơ chất Trong nuôi cấy người

ta thường thiết kế dụng cụ nuôi cấy sao cho sự lưu thông không khí dễ dàng

và cao nhất Nuôi trên khay thì phía dưới đáy các khay có đục lỗ để không khí

dễ lưu thông, nuôi trong hộp thì thiết kế xung quanh hộp có đục lỗ vừa nhỏ sao cho MT không bị thoát ra ngoài, đồng thời có tác dụng thông khí, nấm sợi

sẽ phát triển đều ở tất cả các mặt có tiếp xúc với không khí…

Trong nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20- 25% sẽ làm tăng độ xốp của MT, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng MT, đồng thời trấu còn là cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp

của enzym cellulase [38]

 Ảnh hưởng của cơ chất và các chất kìm hãm

Ở giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng đạt cực đại, dù ta có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo [39] Nguồn cacbon

và nitrogen ảnh hưởng mạnh đến tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzym Do

đó, nếu cơ chất không chứa đủ các thành phần dinh dưỡng thì phải bổ sung thêm kịp thời

Các chất kìm hãm là những chất hóa học có thể làm giảm hoặc mất

hoạt tính enzym, thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ… Các chất

kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc không gian của

cơ chất nên sẽ kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động, kết quả là enzym

không thể kết hợp được với cơ chất Các chất kìm hãm không cạnh tranh kết

hợp với enzym ở vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzym làm giảm tốc độ phản ứng của enzym [30]

1.3.4 Ứng dụng của enzym cellulase

Enzym cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà công nghệ vì chúng

có thể được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực sau:

 Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose

Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khó phân hủy Trong điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy rất lâu (trên 8 tháng), ở điều kiện khí hậu nhiệt đới Thời gian phân hủy các chất thải này càng lâu càng gây ô nhiễm đất, nước, không khí Các chất thải này cũng khó tham gia vào dây chuyền chuyển hoá vật chất của thiên nhiên, gây mất cân bằng sinh thái

Để khắc phục tình trạng này, các nhà khoa học đã đưa vào khối ủ chế phẩm VSV giàu cellulase, kết quả là các chất thải bị phân hủy trong thời gian dưới 1 tháng, góp phần hạn chế MT [38]

 Ứng dụng trong sản xuất sản phẩm thực phẩm, thực phẩm gia

súc

Các sản phẩm thực phẩm được sản xuất từ các nguyên liệu thực vật chứa nhiều cellulose gây ra hiện tượng khó tiêu hóa ở người Người và những động vật không nhai lại thường thiếu VSV phân giải cellulose trong đường tiêu hóa Do đó, việc chế biến thực phẩm nhất là một số sản phẩm đồ hộp bằng chế phẩm cellulase có ý nghĩa làm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thêm chế phẩm cellulase vào thực phẩm gia súc làm

tăng trọng đàn lợn và tăng chất lượng thịt [38]

 Ứng dụng làm phân bón VSV

Các chế phẩm VSV có khả năng tổng hợp cellulase mạnh, khi được bón vào đất trồng có nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ tạo thành mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh [29], [38]

 Ứng dụng trong kỹ thuật di truyền

Enzym cellulase sẽ phá vỡ thành tế bào thực vật để tạo tế bào trần, rất cần thiết trong quá trình chuyển gen của tế bào thực vật [38]

 Ứng dụng trong công nghệ bột cellulose và giấy, công nghệ sợi

dệt, công nghiệp chất tẩy rửa

Đây là hướng được các nhà sản xuất quan tâm nhiều trong những năm gần đây Sử dụng enzym cellulase để tách mực khỏi giấy báo và tạp chí cũ, cải thiện tính chất quang học cũng như độ bền cơ lý của giấy sản xuất từ bột khử mực Ở Mỹ, hơn 40%, ở Nhật Bản khoảng 55% tổng lượng giấy sử dụng

là bắt nguồn từ giấy loại

Trong công nghệ sợi dệt, enzym này được sử dụng để xử lý quần áo bò, làm bóng vải bông, vải sợi nhân tạo giúp vải mềm mại hơn, độ hút ẩm tăng lên, bề mặt vải đẹp hơn

Trong công nghiệp chất tẩy rửa, các chất tẩy rửa chứa enzym cellulase làm sạch các chất bẩn trong lòng xơ bông tốt hơn sử dụng phương pháp tẩy rửa thông thường [54]

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

 Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng nấm sợi được phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây…ở RNM Cần Giờ, huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

- Các chủng VSV kiểm định: E coli, Bacillus subtilis được cung cấp từ

- Hóa chất có nguồn gốc từ Đức: thuốc thử DNS, Yeast extract, Malt extract…

- Hóa chất có nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối Seignet…

 Cách pha chế thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid) [32]

- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic: Cân 10g DNS cho vào

beaker 1000ml, thêm 400ml nước cất, đặt beaker vào nước 800C, khuấy đều Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150 ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800

C

Thêm 300g seignet vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800

C, làm lạnh đến nhiệt độ phòng vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất đến vạch

và lắc đều

Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp

- Dung dịch lactose: Hoà tan 0,12g lactose monohydrate với 80ml nước

cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều

- Dung dịch DNS- lactose: Trộn đều 150ml DNS với 50ml dung dịch

lactose

 Thiết bị, dụng cụ

 Các thiết bị

Nồi hấp vô trùng Huxlex (Đài Loan)

Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

Tủ sấy Memmert (Đức)

Tủ ấm Binder (Đức) Kính hiển vi Olympus CHL (Nhật Bản)

Tủ lạnh Hitachi (Tokyo, Nhật Bản) Máy đo pH Hana (Nhật)

Máy li tâm Heraeus (Đức) Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ) Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus (Trung Quốc) Máy nghiền mẫu (Đức)

Máy đo độ ẩm Startrious (Đức) Máy đo quang phổ UV/ Visible Spectrophometer (Nhật)

 MT phân lập, nuôi cấy và giữ giống, định danh nấm sợi

 MT1: MT Czapek- Dox cải tiến [29], [58]

- pH = 5,5 -6,0 Khử trùng 1 atm trong 30 phút

 MT 5: MTPotato glucose agar (PGA) [7]

- pH = 5,5- 6,0 Khử trùng 1atm trong 30 phút

* Cách chế nước chiết khoai tây

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch Cân 200g, xắt lát, thêm 1 lít nước cất, đun sôi trong 30 phút Lọc lấy dịch trong

 MT thử hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

* Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tôm

- Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô

- Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-750C/ 4 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất

- Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 26- 300C/ 16 giờ, rửa sạch

- Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh

 MT 10: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [29]

 MT nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định

 MT 12 : MT Meat pepton agar (MPA) [27]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ [58]

Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã Tam Thôn Hiệp, xã An Thới Đông, xã Long Hòa, xã Bình Khánh, Lâm Viên….Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2 km, các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ (hình 2.1) Lấy mẫu phân lập trong 3 tháng (tháng 7, 8, 9), mỗi tháng lấy mẫu một lần Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn 30‰, nhiệt độ khoảng

290C, pH 7,6

Hình 2.1 Vị trí lấy mẫu ở RNM Cần Giờ

Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5- 10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thân cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất

Cách lấy: Dùng dao, kéo vô trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi

nilon vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản

trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 24 giờ

2.2.2 Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo Uyenco, 1988 [58], [78]

a- Lấy mẫu và pha loãng mẫu

Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vô trùng

Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngoài Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1

Lắc đều, rồi hút 1 ml dung dịch 10-1

cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2

Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3

, 10-4, 10-5

b- Cấy mẫu

Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa MT1, MT2, MT3 Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch Sau đó sử dụng que trang đó trải tiếp hai đĩa tiếp theo

Sau đó chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hóa

2.2.3 Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên MT thạch có

lớp dầu khoáng [6]

Dầu khoáng là parafin hay vaselin, hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khô ở 1700

C trong 1- 2 giờ, để nguội

Chuẩn bị 3 ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp

Đổ lớp dầu khoáng đã vô trùng lên bề mặt Hàn kín ống nghiệm bằng parafin bảo quản ở nhiệt độ 40

C

Phương pháp này có thể bảo quản trong 1- 3 năm

2.2.4 Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi [5], [6], [11]

Nấm sợi sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau:

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng

- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm Lắc đều tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri Làm 2,3 hộp

- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL Hàng ngày lấy ra quan sát

Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:

+ Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nó

+ Hình dạng KL

+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc

+ Màu sắc của MT do sắc tố nấm sợi tạo ra

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT

+ Đặc điểm của mép KL

+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL……

2.2.5 Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi [6]

Phương pháp cấy khối thạch của J.T.Dunean

- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong

các đĩa petri

- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8 mm, khoan các khối thạch

- Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô trùng

- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch

- Các phiến kính có khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẳn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày

- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt thuốc

nhuộm lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất

- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai

- Dùng KHV quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm:

+ Hình dạng cuống sinh bào tử

+ Hình dạng thể bình

+ Hình dạng các thể bọng

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn

+ Đặc điểm bào tử đính

+ Màu sắc, kích thước bào tử…

- Chụp hình trên KHV quang học ở độ phóng đại 400-1000 lần

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [47]

a Nguyên tắc

Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy,

độ đục MT giảm, MT trở nên trong suốt Độ lớn của phần MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzym

Phương pháp này chỉ định tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu

* Phương pháp cấy chấm điểm

- Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT 6, MT7, MT8, MT9, MT10

- Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi (3 điểm) lên bề mặt MT

- Ủ trong tủ ấm 300C trong 3-4 ngày

* Phương pháp khuếch tán trên MT thạch

- Thu dịch nuôi cấy: Lấy 10g MT nuôi cấy nấm sợi trên MT11 đã ủ 3 ngày trong tủ ấm, sấy khô, nghiền với 100ml nước cất, ly tâm 10 phút, tốc độ quay 5000 vòng/ phút Thu được dịch enzym thô

- Dùng khoan nút chai (d=8mm) vô trùng, khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzym cellulase, protease, amylase, kitinase trên các đĩa petri Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym vào các lỗ khoan Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40

C trong 1- 2 giờ, sau đó chuyển sang giữ trong tủ ấm trong 24 giờ Sau 24 giờ dùng thuốc thử lugol, HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch và

đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo KL

c Kiểm tra kết quả

- Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase, kitinase Cả ba loại enzym này

đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch:

 Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải.Vùng cellulose chưa

bị phân giải có màu tím hồng nhạt

 Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh KL hoặc lỗ khoan có chứa dịch enzym.Vùng tinh bột chưa bị phân giải

có màu xanh tím đậm

 Nếu nấm sợi có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giải có

màu nâu đỏ nhạt

nấm sợi sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL hoặc quanh lỗ

khoan, do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2

Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng vớI

HgCl2 protein bị kết tủa

d Đánh giá khả năng tạo enzym

Đặt sấp hộp petri Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và

đo đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d=8mm)

Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng nấm sợi Nếu giá trị (D-d) càng lớn thì khả năng sinh enzym của nấm sợi càng cao

- Quy ước:

 D-d ≥ 15mm : hoạt tính enzym trung bình

2.2.7 Phương pháp xác định hoạt độ enzym carboxymethyl cellulase (CMCase) [28], [40]

a Nguyên tắc

Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzym cần thiết để giải phóng

ra đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC ở tốc độ 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng

Phương pháp này dựa vào sự thủy giải cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bằng enzym carboxymethyl cellulase (CMCase) ở pH 5,0 và

400C Sau phản ứng sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng

với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid tạo thành phức màu đỏ sậm và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540nm

b Cách tiến hành

Các hóa chất cần chuẩn bị:

- Dung dịch cơ chất CMC 1%: Cân chính xác 1,0g CMC, hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định

mức 100 ml, thêm dung dịch đệm đến vạch và lắc đều

- Dung dịch enzym: Pha loãng dịch enzym với dung dịch đệm acetate 50 mM, pH 5,0 đến độ pha loãng thích hợp

Na Dung dịch acid 2Na hydroxyNa 3,5Na dinitrobenzoic (DNS)

- Dung dịch lactose

- Dung dịch DNS-lactose

* Dựng đường glucose chuẩn

Hòa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều, ta được dung dịch glucose nồng độ 1mg/ml

Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:

- dd lactose

- Nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4