KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Các công trình nghiên cứu nước ngoài đã thành công trong việc định lượng imidacloprid hoặc azoxystrobin với nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng các phương pháp như: quang phổ U

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IMIDACLOPRID VÀ

AZOXYSTROBIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

MSSV: 12D720401175

Lớp: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IMIDACLOPRID VÀ

AZOXYSTROBIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

MSSV: 12D720401175

Lớp: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017

LỜI CÁM ƠN

Qua 5 năm học tập và rèn luyện tại trường ĐH Tây Đô, dưới sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy cô khoa Dược-Điều dưỡng đã truyền đạt cho em những kiến thức về lý thuyết và thực hành để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Chính vì thế, một trong những yếu tố không nhỏ tạo nên “sản phẩm trí tuệ” này là sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của giáo viên hướng dẫn và các thầy cô Bên cạnh đó còn có sự ủng hộ của gia đình và bạn bè mà em mới có thể hoàn thành khóa luận một cách thuận lợi nhất

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths Nguyễn Phước Định,

người trực tiếp hướng dẫn em trong quá trình làm luận văn Không chỉ gợi ý và hướng dẫn em trong quá trình tìm hiểu, đọc tài liệu và lựa chọn đề tài, thầy còn tận tình chỉ bảo em những kĩ năng phân tích, khai thác tài liệu để có được những lập luận phù hợp với nội dung của khóa luận Hơn nữa, thầy còn rất nhiệt tình trong việc đốc thúc quá trình viết khóa luận, đọc và đưa ra những nhận xét, góp ý để em có thể hoàn thành luận văn một cách tốt nhất

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi đến các thầy cô giáo đang hoạt động, giảng dạy tại phòng Kiểm Nghiệm lòng biết ơn sâu sắc về những kiến thức và kĩ năng mà các thầy

cô đã truyền đạt, chỉ em thêm những kiến thức em còn thiếu sót, cũng như đóng góp thêm ý kiến cho việc hoàn thành khóa luận

Cần Thơ, tháng 6 năm 2017

Sinh viên

Lê Hữu Bảo Trân

Từ khóa: imidacloprid, azoxystrobin, định lượng, HPLC.

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN

TÓM TẮT

MỤC LỤC i

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU 2

2.1.1 Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật 2

2.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật 2

2.1.3 Imidacloprid 3

2.1.3.1 Khái niệm 3

2.1.3.2 Cấu tạo 3

2.1.3.3 Tính chất vật lý và hóa học 3

2.1.3.4 Độc tính của Imidacloprid 4

2.1.3.5 Cơ chế tác động của imidacloprid 4

2.1.4 Azoxystrobin 5

2.1.4.1 Khái niệm 5

2.1.4.2 Cấu tạo 5

2.1.4.3 Tính chất vật lý và hóa học 5

2.1.4.4 Độc tính của azoxystrobin 5

2.1.4.5 Cơ chế tác động 6

2.1.5 Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin 6

2.1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 6

2.1.6.1 Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp HPLC 6

2.1.6.2 Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC 8

2.1.6.3 Phương pháp định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và azoxystrobin 8

2.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 9

2.2.1 Khái niệm 9

2.2.2 Phân loại 9

2.2.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 9

2.2.3.1 Bình đựng dung môi 10

2.2.3.2 Bộ phận khử khí 10

2.2.3.3 Bơm cao áp 11

2.2.3.4 Bộ phận tiêm mẫu 11

2.2.3.5 Cột sắc ký 11

2.2.3.6 Đầu dò 11

2.2.3.7 Bộ phận ghi tín hiệu 11

2.2.3.8 Thiết bị in dữ liệu 12

2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột 12

2.2.5 Sắc ký phân bố hiệu năng cao 12

2.2.6 Các thông số đặc trưng trong HPLC 13

2.2.6.1 Thời gian lưu tR 13

2.2.6.2 Hệ số phân bố K 14

2.2.6.3 Hệ số dung lượng K’ 14

2.2.6.4 Hệ số tách α 15

2.2.6.5 Số đĩa lý thuyết 15

2.2.6.6 Độ phân giải RS 15

2.2.6.7 Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký 16

2.2.7 Phương pháp chọn điều kiện sắc ký 16

2.2.7.1 Lựa chọn pha tĩnh 17

2.2.7.2 Lựa chọn pha động 17

2.2.8 Các bước tiến hành sắc ký 19

2.2.8.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 19

2.2.8.2 Chuẩn bị dung môi pha động 19

2.2.8.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 19

2.2.8.4 Cách vận hành thiết bị 20

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ 21

3.1.1 Hóa chất 21

3.1.1.1 Chất chuẩn 21

3.1.1.2 Dung môi 21

3.1.2 Dụng cụ - Thiết bị 21

3.1.2.1 Thiết bị 21

3.1.2.2 Dụng cụ 22

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.3.1 Chuẩn bị dung dịch 23

3.3.2 Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký 23

3.3.2.1 Chọn cột 23

3.3.2.2 Chọn bước sóng cho detector 23

3.3.2.3 Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC 23

3.3.2.4 Khảo sát thành phần pha động 24

3.3.2.5 Khảo sát tốc độ dòng 25

3.3.3 Thẩm định phương pháp 25

3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống 25

3.3.3.2 Tính đặc hiệu 26

3.3.3.3 Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 27

3.3.3.4 Tính tuyến tính 27

3.3.3.5 Độ chính xác 28

3.3.3.6 Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) 28

3.3.4 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 30

4.1.1 Chuẩn bị dung dịch 30

4.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký 30

4.1.2.1 Đặt bước sóng cho detector 30

4.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động 31

4.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng 35

4.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN 35

4.2.1 Thẩm định quy trình 35

4.2.1.1 Tính phù hơp hệ thống 35

4.2.1.2 Tính đặc hiệu 38

4.2.1.3 Xác định LOD và LOQ của thiết bị 39

4.2.1.4 Tính tuyến tính 40

4.2.1.5 Độ chính xác 43

4.2.1.6 Độ đúng 45

4.3 THẢO LUẬN 47

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48

5.1 KẾT LUẬN 48

5.2 ĐỀ XUẤT 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu, chữ viết tắt Từ nguyên (nghĩa tiếng Việt)

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

LC50 : Lethal concentration (Nồng độ gây chết 50% )

LD50 : Lethal dose (Liều gây chết 50%)

LOD : Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) LOQ : Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

PDA : Photo Diode Array (Dãy diod quang)

ppm : Part per million (phần triệu)

Rs : Resolution (Độ phân giải)

RSD : Relative Standard Deviation

(Độ lệch chuẩn tương đối)

SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)

Speak : Diện tích pic sắc kí

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc của imidacloprid 3

Hình 2.2 Cấu trúc của azoxystrobin 5

Hình 2.3 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 9

Hình 2.4 Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B 14

Hình 4.1 Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile 31

Hình 4.2 Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%) 32

Hình 4.3 Sắc ký đồ ACN/ Nước (95%:5%) 32

Hình 4.4 Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%) 33

Hình 4.5 Sắc ký đồ ACN/ Nước (60%:40%) 33

Hình 4.6 Sắc ký đồ ACN/ Nước (55%:45%) 34

Hình 4.7 Sắc ký đồ ACN/ Nước (50%:50%) 34

Hình 4.8 Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống 36

Hình 4.9 Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin 38

Hình 4.10 Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm 39

Hình 4.11 Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm 39

Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid 42

Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid 4

Bảng 2.2 Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin 6

Bảng 2.3 Lực rửa giải của một số dung môi 18

Bảng 3.1 Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC 21

Bảng 3.2 Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu 21

Bảng 3.3 Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước 24

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid 36

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin 37

Bảng 4.3 Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin trước khi tiêm vào hệ thống HPLC 40

Bảng 4.4: Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn 41

Bảng 4.5: Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn 41

Bảng 4.6 Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid 43

Bảng 4.7 Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin 43

Bảng 4.8 Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid 44

Bảng 4.9 Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid 44

Bảng 4.10 Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin 45

Bảng 4.11 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid 45

Bảng 4.12 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin 46

Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và azoxystrobin 48

Gần đây một trong những phương pháp phổ biến nhất là việc sử dụng imidacloprid và azoxystrobin là hai loại phổ biến nhất trong nông nghiệp để ngăn ngừa sâu bệnh, côn trùng, nấm mốc ảnh hưởng đến cây trồng Các công trình nghiên cứu nước ngoài đã thành công trong việc định lượng imidacloprid hoặc azoxystrobin với nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng các phương pháp như: quang phổ UV-VIS, sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ, sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC)…Trong đó HPLC là phương pháp thường được sử dụng nhất do phương pháp này rất phổ biến, thuận lợi, đỡ tốn kém và cho độ chính xác cao hơn so với các phương pháp khác

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích mới và hiện đại đã được áp dụng vào việc phân tích, xác định hàm lượng của chúng nhằm kiểm soát chất lượng của các sản phẩm, đảm bảo an toàn và sức khỏe của người

sử dụng Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những phương pháp phân tích hiện đại, chính xác và nhanh chóng để phân tích hàm lượng của các loại hóa chất bảo vệ thực vật đang được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế

Trong nghiên cứu này định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và azoxystrobin từ đó có thể xác định dư lượng của hai chất này trong lá, rễ từ dược liệu

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Vì vậy đề tài “Xây dựng quy

trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện với mong muốn tìm ra một phương

pháp nhanh, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm

1.2 MỤC TIÊU

Nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu với hai mục tiêu sau:

 Xây dựng điều kiện phân tích đông thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS

 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU

2.1.1 Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật

Hóa chất bảo vệ thực vật là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng Hóa chất bảo vệ thực vật còn được dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm Cũng có thể dùng hóa chất bảo

vệ thực vật cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không

bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển (Trần Cao Sơn, 2015)

2.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật

Các hóa chất bảo vệ thực vật được phân loại theo ba nhóm chính sau:

- Thuốc trừ sâu: là một loại chất được sử dụng để chống côn trùng Chúng bao gồm các thuốc diệt trứng và thuốc diệt ấu trùng để diệt trứng và ấu trùng của côn trùng như: imidacloprid, dichlopropene, methyl isocyanate, chloropicrin, methyl bromide… Một số chất khác như: aldicarb, dazomet và metham natri, hoạt động chủ yếu qua tiếp xúc Gần như tất cả các loại thuốc trừ sâu đều có nguy cơ làm thay đổi lớn các hệ sinh thái; nhiều loại thuốc trừ sâu độc hại với con người; và các loại khác tích tụ trong chuỗi thức ăn (Saed Mousa Diab Ali, 2012)

- Thuốc diệt cỏ: Thuốc diệt cỏ kiểu Hormon như 2,4,5-T; 2,4-D;…là những chất không hiện diện trong đất nhưng có độc tính cao đối với thực vật và thấp đối với động vật có vú Các chất thuộc nhóm này ít ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường nhưng lại hòa tan hoàn toàn trong nước và trong các mạch nước ngầm Các loại thuốc diệt cỏ ảnh hưởng trực tiếp trên thân, lá bao gồm: dintrophenols, xianophenols, pentachlorophenol

và Paraquat (Saed Mousa Diab Ali, 2012)

- Thuốc trừ nấm: là những chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản, chống lại sự phá hoại của nấm mốc,

vi khuẩn ảnh hưởng đến năng suất của cây trồng Nhiều loại thuốc trừ nấm khác nhau được sử dụng, với các hóa chất có cấu trúc khác nhau Hầu hết đều có độc tính tương đối thấp, ngoại trừ các chất thuộc nhóm carbamat như benomyl Độc tính của thuốc trừ nấm ảnh hưởng lớn đến môi trường nhất là đối với hệ vi sinh vật trong đất nhưng ảnh hưởng này chỉ trong thời gian ngắn (Saed Mousa Diab Ali, 2012)

Trong nghiên cứu này hai chất hóa chất bảo vệ thực vật khảo sát đó là imidacloprid và azoxystrobin Theo các tài liệu trong và ngoài nước đã phân loại imidacloprid thuộc nhóm thuốc trừ sâu và azoxystrobin thuộc nhóm thuốc trừ nấm Dựa vào tính chất và đặc điểm của từng nhóm từ đó chọn ra phương pháp nghiên cứu phù hợp

2.1.3 Imidacloprid

2.1.3.1 Khái niệm

Imidacloprid là một trong những loại hoạt chất có phổ được sử dụng rộng rãi nhất Nó được dùng để trừ hầu hết các loại sâu hại trong nông nghiệp, lâm nghiệp, trừ mối,….Do có độ độc bởi vòng Pyridin có gắn với nguyên tử Clo và dị vòng Azo 5 cạnh, có độ độc cao với côn trùng, diệt trừ sâu, bướm, rầy, rệp…(Sacramento, 2002)

2.1.3.2 Cấu tạo[31]

Hình 2.1 Cấu trúc của imidacloprid

- Tên chung quốc tế: imidacloprid

- Công thức phân tử: C9H10ClN5O2

- Khối lượng phân tử: 255,662 g/mol

- Danh pháp IUPAC:

- Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo

- Độ tan trong nước: 0,61 g/l (20oC)

- Thời gian bán hủy: Trên 30 ngày (25oC ở pH 7)

- Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: nước, dchloromethane, isopropanol, toluene ở nhiệt độ 20oC

- 0.Phân hủy ở pH khoảng 5-11, khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc

2.1.3.4 Độc tính của Imidacloprid (Raihanah, 2016)

Theo một số tài liệu nghiên cứu của các tác giả nước ngoài, imidacloprid gây

độc với động vật ở một liều nhất định, cụ thể trong bảng sau:

Bảng 2.1: Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid

Chuột

miệng LD50 tương đương 130 mg/kg

da LD50 > 5000 mg/kg và gây kích

ứng da nhẹ hít LC50 > 5,33 mg/l

tiêu hóa

Nuốt một lượng lớn có thể gây nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, lơ

mơ, trầm cảm, chuột rút, run rẩy

và rối loạn hô hấp

mắt Gây kích ứng mắt

Trong các trường hợp đã được khảo sát về độc tính của Imidacloprid ở người ngộ độc cấp thường có các dấu hiệu bao gồm buồn ngủ, chóng mặt, nôn mửa, không tỉnh táo và sốt Các trường hợp ngộ độc này phụ thuộc vào hàm lượng imidacloprid có trong chế độ ăn uống (Spivastava, 2004)

 Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người

có chứa imidacloprid là 0,06 mg/kg một ngày (Spivastava, 2004)

2.1.3.5 Cơ chế tác động của imidacloprid (Spivastava, 2004)

Imidacloprid thuộc nhóm Neonicotinoid là nhóm hóa chất bảo vệ thực vật gây kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự nicotin Cơ chế gây độc là do các sản phẩm này này gắn với các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương Imidacloprid có độc tính cao với côn trùng vì nó gắn kết tốt hơn với các thụ thể của tế bào thần kinh của côn trùng Đường tiếp xúc qua da có độc tính thấp, có thể gây đỏ và ngứa mắt nhẹ Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc cấp tính trên người Các nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong đường tiêu hóa và loại trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ

2.1.4 Azoxystrobin (Bursic Vojislava and Lazic Sanja, 2012)

2.1.4.1 Khái niệm

Azoxystrobin là một loại thuốc diệt nấm phổ rộng có hoạt tính chống lại một số bệnh trên nhiều cây ăn quả và cây cảnh nhằm mục đích ngăn ngừa các bệnh ở lúa, nấm mốc, rụng lá …gây hại ảnh hưởng đến năng suất trồng trọt

2.1.4.2 Cấu tạo

Hình 2.2 Cấu trúc của azoxystrobin

- Tên chung quốc tế: Azoxystrobin

- Công thức phân tử: C22H17N3O5

- Khối lượng phân tử: 403,4 g/mol

- Danh pháp IUPAC: Methyl

- Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo

- Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: hexane, methanol, toluen, acetone, ethyl acetat, acetonitril, dichloromethane, nước ở nhiệt độ 20oC

- Phân hủy khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc nitrogen oxide (N2O)

2.1.4.4 Độc tính của azoxystrobin (Sh.A.Ashorkr, 2006)

Theo tác giả T.Nageswara Rao và cộng sự năm 2012 đã khảo sát độc tính của azoxystrobin qua các thí nghiệm trên các động vật thí nghiệm như bảng sau:

Bảng 2.2 Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin

Thỏ đực và cái mắt Không gây kích ứng trên da

 Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người có chứa azoxystrobin khoảng 0-0,2 mg/ kg một ngày (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012)

2.1.4.5 Cơ chế tác động (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012)

Azoxystrobin là một chất diệt nấm phổ rộng thuộc nhóm methocyacrylate Được bắt nguồn từ các strobilurin tự nhiên xảy ra Nó hoạt động với chất diệt nấm bằng cách ức chế ty thể trong nấm Chúng tạo thành một lớp bảo vệ trên bề mặt thực vật và ức chế sự phát triển của bào tử nấm

2.1.5 Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin

- Danh mục thuốc có chứa imidacloprid: Confidor 100 SL, Actador 100WP, Javidan 100 WP, Anvado 100WP, Conphai 10WP, Kola 700WO, Abamix 1,45SP, Aba- plus 100EC…[32]

- Danh mục thuốc có chứa azoxystrobin: Amistar Top 250 SC, Amistar Top

325 SC, Mi stop 350 SC, Ohho 3255SC, Neoamistagold 360SC, 400SC, 450SC, 500SC, Ammisdotop 400SC, Dovatop 400SC , Paramax 400SC[34]

Các loại thuốc trên được bán rộng rãi trên cả nước, trong các đại lý thuốc trừ sâu, hóa chất bảo vệ thực vật

2.1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.6.1 Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp HPLC

Phương pháp 1(J.Serb, 2009)

- Đầu dò khối phổ QuEChERS

- Pha động: acetonitril 20%: Nước 80%

2.1.6.2 Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC

Phương pháp 1 (Bursic Vojilava and Lazic Sanja, 2012):

- Thời gian lưu của azoxystrobin: 11,07 phút

Phương pháp 2 (Burket and Sapiests, 2005):

- Thời gian lưu của azoxystrobin: 8,3 phút

Phương pháp 3 (Rao Nageswara, 2012):

Năm 2015 tác giả Trần Cao Sơn đã nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất vảo

vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ Trong

nghiên cứu này tác giả nêu ra một số phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong đó có cả imidacloprid và azoxystrobin bao gồm phương pháp xử lý mẫu và các

kỹ thuật dùng để phân tích Các kỹ thuật dùng để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật như sắc ký khí và sắc ký lỏng Nhưng trong nghiên cứu này tác giả chọn sắc ký lỏng vì

có khả năng ứng dụng rộng, phù hợp với các dung môi phân cực như methanol, acetonitril, nước và được sử dụng phổ biến ở Việt Nam (Trần Cao Sơn, 2015)

2.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 2.2.1 Khái niệm

HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc

ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại pha tĩnh

- Sắc kí hấp phụ pha ngược hay pha đảo

- Sắc kí trao đổi ion và cặp ion

- Sắc kí rây phân tử

2.2.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC (Thái Duy Thìn, 2013)

Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Trong đó:

1 - Bình chứa dung môi pha động

2 - Bộ phận khử khí

3 - Bơm cao áp

4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler)

5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt

6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu)

7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống

8 - Thiết bị in dữ liệu

2.2.3.1 Bình đựng dung môi

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100% Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa

là 3 hoặc 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định

 Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết

và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích và phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích

2.2.3.2 Bộ phận khử khí

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi

- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

2.2.3.3 Bơm cao áp

Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc kí Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 – 200 bar) để tạo ra được những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độ nằm trong vùng 0,5 – 2 ml/phút

2.2.3.4 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với dung tích của loop là 5 – 100 µl Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler)

2.2.3.5 Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ 5 - 10 µm Ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt …

Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24

có tiêu chuẩn hóa các lọai cột) Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt

 Lưu ý: Tuyệt đối không đánh siêu âm vì sẽ làm hư cột

2.2.3.6 Đầu dò

Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp

để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng Hiện nay, detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ hay UV-Vis đang được dùng phổ biến nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại ko quá đắt

2.2.3.7 Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang

+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao…

+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất

cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD…

2.2.3.8 Thiết bị in dữ liệu

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ

2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột (Võ Thị Bạch Huệ, 2016)

Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động Pha này có thể là một chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng

Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định và là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký

Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký rây phân tử Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm

2.2.5 Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Trần Tử An và Thái Nguyễn Hùng Thu, 2007)

Sắc ký phân bố là phương pháp phân tách dựa trên độ khác biệt về phân bố của các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động Sắc ký phân bố được chia làm 2 loại tùy thuộc vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết

Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang nên khắc

phục được nhược điểm của sắc ký lỏng - lỏng Trong pha tĩnh loại này, các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua nhóm silanol Tính phân cực của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết

 Pha động

Pha động trong sắc ký phân bố có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung môi Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ các thành phần dung môi

Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo

- Sắc ký pha thuận: Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực được gọi là sắc ký pha thuận Dung môi pha động thường là các hydrocacbon mạch thẳng như: pentan, hexan, heptan…Trong sắc ký pha thuận các chất không phân cực sẽ được rửa giải sớm, thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều tăng của độ phân cực của các thành phần trong mẫu thử

- Sắc ký pha đảo: Hệ pha động phân cực và pha tĩnh không phân cực gọi là sắc

ký pha đảo Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm Chất càng tan tốt trong dung môi phân cực thì càng được rửa giải sớm Dung môi pha động thường là: nước, methanol, acetonitril…Việc đuổi khí hòa tan trong pha động rất quan trọng trong sắc ký pha đảo

2.2.6 Các thông số đặc trưng trong HPLC (Trần Tử An, 2007)

2.2.6.1 Thời gian lưu t R

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn

Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

 Bản chất sắc ký của pha tĩnh

 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

 Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

 Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động Trong một phép phân tích nếu tR’ nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR’ quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà tR phụ thuộc

Hình 2.4 Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B

2.2.6.2 Hệ số phân bố K

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:

S M

C K C

Trong đó: Cs là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/l)

CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/l)

Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

2.2.6.3 Hệ số dung lượng K’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

0 0

' tR t K

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc

ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

 Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh

 Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động

 Hệ số khuếch tán của các chất trong cột

Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:

Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích

W0,5 là độ rộng tại ½ của peak

Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ

2.2.6.6 Độ phân giải R S

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau:

2 RB RA S

WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy peak

Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau là RS = 1,0 Trong phép định lượng RS = 1,5 là phù hợp

Nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, nếu hai chất này tách nhau quá xa làm cho đường nền càng kéo dài thì cũng không cần thiết Vì như thế tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn Do đó giá trị RS chỉ vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau là tốt Nghĩa là chỉ cần hai peak vừa tách ra khỏi hẳn nhau dứt khoát là được

2.2.6.7 Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký

Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký người ta dùng các đại lượng:

 Hệ số bất đối AF:

b AF

a



Trong đó: a: nửa chiều rộng phía trước peak

b: nửa chiều rộng phía sau peak (cả a và b được đo ở 1/10 chiều cao peak) Giá trị AF càng gần 1, peak càng đối xứng

- Với a và b đo ở 1/20 chiều cao peak

- Nếu AS càng lớn hơn 1, peak kéo đuôi càng nhiều, peak càng mất cân đối

- Hệ số kéo đuôi của peak chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5)

2.2.7 Phương pháp chọn điều kiện sắc ký

Muốn có một kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu, các điều kiện đó bao gồm:

Pha tĩnh:

Thông thường ta dùng 2 loại cột pha thường (NP) và cột pha đảo (RP)

 Cột pha thường (NP): Silicagel trung tính Pha tĩnh loại cột này dùng để tách các chất có độ phân cực thấp hay trung bình Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm – OH phân cực ưa nước

 Cột pha đảo (RP): Silicagel đã alkyl hóa Pha tĩnh loại cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm – OH đã bị alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP-8 hay RP-18) hay các mạch carbon vòng (phenyl- tương đương cột phenyl) Vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít

2.2.7.2 Lựa chọn pha động

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích; ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị Pha động có thể làm thay đổi:

+ Độ chọn lọc α

+ Thời gian lưu

+ Hiệu năng tách của cột

+ Độ phân giải

+ Tính đối xứng của peak

Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân

tích Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5)

- Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột

- Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích

- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phải phù hợp với loại detector: detector UV-Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (ví dụ: acid acetic hấp thụ ở bước sóng thấp < 220 nm) Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang

- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC), pha động là dung môi phân cực: nước, ACN, MeOH, acid hay base hữu cơ và một vài amin hay acid amin …

- Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH Chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất

 Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo bảng sau:

Bảng 2.3 Lực rửa giải của một số dung môi

quả cao Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc

ký, tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đòi hỏi phải có thời gian, tài liệu và một phần kinh nghiệm của những người làm sắc ký

2.2.8 Các bước tiến hành sắc ký (Võ Thị Bạch Huệ, 2012)

2.2.8.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc

Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt, cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng đèn UV… đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra

Cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký:

Ví dụ: Sắc ký pha thường NP-HPLC: Rửa bằng methanol; không rửa bằng nước Còn sắc ký pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch.Tỷ lệ ACN hay methanol: Nước là 50%: 50% cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu Tuyệt đối tránh tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được

 Lưu ý: Nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng

được các yêu cầu phân tích

2.2.8.2 Chuẩn bị dung môi pha động

Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dành cho HPLC Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu

2.2.8.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC

 Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc sau:

- Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu

- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết …

- Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm

- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột Có thể gây ra nghẽn cột

 Mẫu chuẩn:

Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng

nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần

 Tỷ lệ các dung môi pha động

 Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

3.1.1 Hóa chất

3.1.1.1 Chất chuẩn

- Chất chuẩn: imidacloprid và azoxystrobin

- Nhà sản xuất: Sigma Aldrish

- Hàm lượng: imidacloprid: 99,82%

azoxystrobin: 99,60%

3.1.1.2 Dung môi

Bảng 3.1 Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC

Bảng 3.2 Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu

2 Bộ loại khí cho dung môi Vacuum Degasser Germany

3 Thiết bị tiêm mẫu Syringe 100µl Hamilton

RP-18, 250x4,6 mm, kích thước hạt 5µm

Germany

6 Thiết bị ghi tín hiệu UV/Vis Detector Germany

STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất

7 Bộ lọc dung môi dùng giấy

lọc 0,45µm

9 Máy đánh siêu âm S100H Elmasonic Germany

10 Cân phân tích Balances and Precious

- Bơm tiêm, vial

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:

 Lựa chọn điều kiện sắc ký

- Lựa chọn cột sắc ký

- Lựa chọn pha động và các điều kiện pha động

- Tốc độ dòng, thể tích tiêm

- Lựa chọn bước sóng phát hiện

 Đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng bằng cách thẩm định quy trình

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Chuẩn bị dung dịch

Chuẩn bị dung môi pha mẫu

- Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với các tài liệu tham khảo, khảo sát lựa chọn ra dung môi pha mẫu thích hợp

- Tiến hành pha dung môi pha mẫu để phục vụ cho quá trình phân tích

 Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch mẫu chuẩn

Để có thể định lượng được imidacloprid và azoxystrobin, việc chuẩn bị dung dịch gốc và các mẫu chuẩn là rất cần thiết Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp các tài liệu tham khảo lựa chọn ra dung môi pha và bảo quản dung dịch chuẩn gốc

3.3.2 Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký (Vũ Thị Quỳnh, 2013)

3.3.2.1 Chọn cột

Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc ký pha đảo C8 và C18 … Tuy nhiên cột RP –18 được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm nhờ danh tiếng thương hiệu, chất lượng cột cũng như tính kinh tế so với các loại cột khác

Hiện nay, phòng thí nghiệm có trang bị loại cột này và được kỹ thuật viên thường xuyên kiểm tra, đánh giá tình trạng Vì vậy, ta chọn cột RP – 18, kích thước hạt 5 μm, 250 x 4,6 mm cho phép định lượng này

3.3.2.2 Chọn bước sóng cho detector

Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết định tới độ nhạy của phép phân tích Do phương pháp phân tích là HPLC sử dụng đầu dò là detector UV-Vis cố định bước sóng, ta cần khảo sát điều kiện nhằm chọn bước sóng tối ưu để phân tích đồng thời các chất

Dựa vào tài liệu tham khảo và cực đại hấp thụ của imidacloprid và azoxystrobin

ta chọn các bước sóng tiêu biểu Sau đó tiến hành khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC lần lượt tại các bước sóng λ bằng 220 nm, 250 nm, 255 nm, 260nm Bên cạnh

đó sử dụng máy UV-VIS SHIMADZU quét phổ khoảng từ 200-400nm để phát hiện ra bước sóng tối ưu nhất cho cả hai chất imidacloprid và azoxystrobin

Căn cứ phổ đồ thu được, kết hợp các tài liệu tham khảo và tiến hành khảo sát để lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp

3.3.2.3 Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC

Dựa vào kết quả thực nghiệm ở mục 3.3.2.3 ta tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp

azoxystrobin và imidacloprid nồng độ 50 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau:

- Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 250 nm

Khảo sát pha động bằng cách thay đổi thành phần pha động (gradient) lần lượt với tỷ lệ như sau:

Bảng 3.3 Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước

- Giúp thực hiện các chỉ tiêu kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm

- Là công việc bắt buộc có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương pháp phân tích là phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích

- Để đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở (Bộ y tế, 2009)

3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống

Tiến hành sắc ký với hỗn hợp chứa mẫu chuẩn imidacloprid và azoxystrobin với nồng độ khoảng 50 ppm, tiến hành sắc ký 6 lần