Đánh giá tác động hạ lipid máu in vitro và in vivo của curcumin và nano curcumin

Trần Mạnh Hùng Kết quả và bàn luận Curcumin và nano curcumin ức chế HMG-CoA reductase trên dịch đồng thể với IC50 lần lượt khoảng 24 và 28 g/ml, đồng thời làm giảm cholesterol và trigly

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN HẢI MINH

ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG HẠ LIPID MÁU IN VITRO

VÀ IN VIVO CỦA CURCUMIN VÀ NANO CURCUMIN

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Thành phố Hồ Chí Minh – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN HẢI MINH

ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG HẠ LIPID MÁU IN VITRO

VÀ IN VIVO CỦA CURCUMIN VÀ NANO CURCUMIN

Ngành Dược lý – Dược lâm sàng

Mã số: 8720205

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trần Mạnh Hùng

Thành phố Hồ Chí Minh – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

TRẦN HẢI MINH

Luận văn thạc sĩ dược học – Khoá: 2016 – 2018

Ngành Dược lý – Dược lâm sàng – Mã số 8720205

ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG HẠ LIPID MÁU IN VITRO

VÀ IN VIVO CỦA CURCUMIN VÀ NANO CURCUMIN

Học viên: Trần Hải MinhHướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Mạnh Hùng

Kết quả và bàn luận

Curcumin và nano curcumin ức chế HMG-CoA reductase trên dịch đồng thể với

IC50 lần lượt khoảng 24 và 28 g/ml, đồng thời làm giảm cholesterol và triglyceridtrên tế bào HepG2 ở nồng độ 5 và 15 g/ml, tuy nhiên nano curcumin cho kết quảtốt hơn so với curcumin Nano curcumin hàm lượng 25 và 50 mg/ngày cho tác độngđiều hoà lipid cũng như ức chế hoạt tính HMGR khác biệt có ý nghĩa thống kê sovới nhóm bệnh, làm giảm lần lượt là 17,6 và 19,9%, trong khi curcumin cần liều

1000 mg/kg để cho tác động rõ ràng

Kết luận

Curcumin và nano curcumin thể hiện tác động điều hoà lipid bằng cách ức chế hoạttính HMG-CoA reductase, tuy nhiên nano curcumin cho hiệu quả tốt hơn curcumin

Final assay for the Master of Pharmacology – Course: 2016 – 2018

Specialization: Pharmacology – Clinical Pharmacy – Code: 8720205

EVALUATION OF LIPID – LOWERING EFFECT IN VITRO AND IN VIVO OF CURCUMIN AND NANO CURCUMIN

Student: Tran Hai MinhSupervisor: Assoc.Prof PhD Tran Manh Hung

Purpose

The present work aimed at investigating the hypolipidemic effect of curcumin and

nano curcumin through the inhibition of HMG-CoA reductase activity in vitro and

in vivo.

Materials and methods

In the in vitro setting, curcumin and nano curcumin inhibit HMG-CoA reductaseenzyme isolated from livers of Swiss albino mice based on spectrophotomericmeasurements and lower cholesterol and triglycerrid in HepG2 induced steatosis byoleic acid 1mM The in vivo hyperlipidemia was induced by a single intravenousịnection of tyloxapol at the dose of 250 mg/kg b.w, followed by oral administration

of curcumin/nano curcumin The determination of lipid profiles and HMG-CoAreductase activity were performed 24 hours later Atorvastatin is a positive control

of both experiments

Results and discussion

Curcumin/nano curcumin demonstrated in vitro inhibitory effect on HMG-CoAreductase activity with IC50 value range of 24 and 28 g/ml respectively as well asreduced cholesterol and triglycerid levels of HepG2 with concentration at 5 and 15

g/ml Nano curcumin containing 25 and 50 mg per day significantly regulatedlipid profile and increased HMG-CoA reductase activity with reduction 17,6 and19,9% respectively while curcumin 1000 mg/kg b.w showed difference

Conclusion

Curcumin and nano curcumin showed promising hypolidemic effect by inhibitingHMG-CoA reductase activity, however nano curcumin is more prospect

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

DANH MỤC HÌNH viii

matrix metallopeptidase x

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN RỐI LOẠN LIPID MÁU 3

1.1.1 Vai trò của lipid 3

1.1.2 Rối loạn lipid máu 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ MÔ HÌNH TYLOXAPOL VÀ MÔ HÌNH HEPG2 9

1.2.1 Mô hình Tyloxapol 9

1.2.2 Mô hình HepG2 11

1.3 CURCUMIN 12

1.3.1 Nguồn gốc: 12

1.3.2 Tính chất: 13

1.3.3 Dược động học 13

1.3.4 Tác dụng dược lý 15

1.4 TIỂU PHÂN NANO VÀ NANO CURCUMIN 18

1.4.1 Khái niệm 18

1.4.2 Tương quan giữa kích thước tiểu phân nano và một số thành phần sinh học cơ thể 18

1.4.3 Đặc điểm của các hoạt chất được nang hóa trong tiểu phân nano 18

1.4.4 Nano curcumin 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 20

2.1.1 Đối tượng thử nghiệm: 20

2.1.2 Hóa chất và thuốc thử nghiệm: 20

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu: 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Quy trình thu hỗn dịch enzym từ gan chuột nhắt và xác định hoạt tính của enzym trong hỗn dịch thu được 23

2.2.2 Đánh giá tác động ức chế HMG-CoA reductase của curcumin và nano curcumin trên dịch đồng thể: 26

2.2.3 Đánh giá tác động ức chế HMG-CoA reductase và ức chế tổng hợp cholesterol nội bào của curcumin và nano curcumin trên dòng tế bào HepG2 28 2.2.4 Đánh giá tác động ức chế HMG-CoA reductase và tác dụng hạ lipid máu của curcumin và nano curcumin trên chuột nhắt trắng 31

2.2.5 Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê 32

Chương 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Tác động ức chế in vitro HMGR của curcumin và nano curcumin trên dịch đồng thể enzym gan 33

3.2 Tác động ức chế của curcumin và nano curcumin trên tế bào HepG2 37

3.2.1 Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng test MTT 37

3.2.2 Tác động ức chế tổng hợp lipid của curcumin, nano curcumin trên tế bào HepG2 38

3.2.3 Tác động ức chế HMGR trên tế bào HepG2 39

3.3 Tác động ức chế in vivo lipid máu và HMGR của curcumin và nano curcumin trên chuột nhắt trắng 40

3.3.1 Ảnh hưởng của tyloxapol trên lipid máu và HMGR 40

3.3.2 Tác động ức chế in vivo của curcumin và nano curcumin curcumin 41

3.4.1 Tác động ức chế in vitro HMGR của curcumin và nano curcumin trên dịch đồng thể enzym gan 44

3.4.2 Tác động ức chế của curcumin và nano curcumin trên tế bào HepG2 45

3.4.3 Tác động ức chế in vivo của curcumin và nano curcumin 46

Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 KẾT LUẬN 48

4.2 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Liệu pháp statin cường độ cao, vừa và thấp .7

Bảng 1.2 Mốt số nghiên cứu sử dụng mô hình gây tăng lipid máu cấp tính in vivo bằng tyloxapol 10

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu sử dụng acid béo trên mô hình in vitro 12

ở tế bào HepG2 12

Bảng 2.1 Thành phần định lượng protein toàn phần bằng phương pháp Biuret 24

Bảng 2.2 Thể tích các chất trong cuvet 25

Bảng 2.3 Hỗn hợp phản ứng xác định hoạt tính HMGR 27

Bảng 2.4 Thành phần các chất trong phản ứng xác định hoạt tính HMGR 32

của các lô chuột 32

Bảng 3.1 Tác động ức chế in vitro HMGR của atorvastatin .33

Bảng 3.2 Tác động ức chế in vitro HMGR của curcumin và nano curcumin 35

Bảng 3.3 Tỉ lệ tế bào sống của tế bào HepG2 khi tiếp xúc với atorvastatin, curcumin và nano curcumin ở các nồng độ khác nhau 37

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của curcumin, nano curcumin lên nồng độ lipid nội bào trên tế bào HepG2 trong môi trường ủ acid béo 1mM sau 24 giờ 38

Bảng 3.5 Nồng độ lipid máu của các lô 40

Bảng 3.6 Tác động của curcumin và nano curcumin trên lipid máu 41

Bảng 3.7 Tác động của curcumin và nano curcumin trên HMGR 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bột nghệ và cấu trúc hoá học của curcumin .13

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các thí nghiệm tiến hành trong nghiên cứu 22

Hình 3.1 % ức chế HMGR in vitro của atorvastatin 34

Hình 3.2 Đường hồi quy tuyến tính liên quan giữa % ức chế HMGR 34

và log nồng độ atorvastatin 34

Hình 3.3 Đường hồi quy tuyến tính liên quan giữa % ức chế HMGR 36

và log nồng độ curcumin 36

Hình 3.4 Đường hồi quy tuyến tính liên quan giữa % ức chế HMGR 36

và log nồng độ nano curcumin 36

Hình 3.5 Tác động của curcumin và nano curcumin lên nồng độ lipid nội bào 39

ở tế bào HepG2 39

Hình 3.6 Tỉ lệ ức chế hoạt tính HMGR của curcumin và nano curcumin 43

DTT D,L Dithiothreitol

EDTA Ethylendinitrilo tetraacetic acid

disodium salt dehydrateFBS fetal bovine serum

HDL High-density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng caoHDL-C High-density lipoprotein cholesterol

HepG2 liver hepatocellular cells

HMG-CoA -hydroxy -methylglutanyl

coenzyme AHMGR HMG-CoA reductase

IDL Intermediate-density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng trung

Coenzym A

PBS Phosphat buffer saline

PPAR Peroxisome proliferator activated

receptorSEM Standard error of mean Sai số chuẩn của trung bình

TNF Tumor necrosis Factor

VLDL Very low-density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng rất thấpIDEAL Identification of the Determinants of

the Efficacy of Arterial BloodPressure Lowering Drugs

PCSK9 Proprotein convertase

subtilisin/kexin type 9

MMP matrix metallopeptidase

CRP C-reactive protein

MỞ ĐẦU

Theo thống kê của WHO năm 2016, các bệnh không truyền nhiễm là nguyên nhân

tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, chiếm 71% trong tổng số 57 triệu người chết.Trong bốn căn bệnh không truyền nhiễm chính thì tỉ lệ mắc các bệnh lý tim mạch ởmức cao nhất, lên đến 44%, cao hơn tổng ba loại bệnh còn lại là ung thư, bệnh hôhấp mạn tính và đái tháo đường, lần lượt chiếm tỉ lệ 22%, 9% và 4% [54]

Tại nhiều quốc gia châu Á, trong khi tỉ lệ mắc các bệnh truyền nhiễm đang giảm, thì

tỉ lệ mắc các bệnh không lây nhiễm lại có xu hướng tăng, trong đó nhóm bệnh timmạch ngày càng tăng nhanh do sự gia tăng tỉ lệ rối loạn lipid máu, đái tháo đường,tăng huyết áp, Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2008, tỷ lệrối loạn lipid máu ở Đông Nam Á là 30,3% [11]

Rối loại lipid máu là một yếu tố nguy cơ chính gây xơ vữa động mạch Rối loạnlipid máu, chủ yếu là nồng độ cholesterol cao, góp phần gây ra khoảng 56% bệnhtim thiếu máu cục bộ và 18% đột quỵ, dẫn đến 4,4 triệu người tử vong hàng nămtrên thế giới [31] Do vậy, việc kiểm soát tốt nồng độ lipid máu sẽ giúp làm giảmnguy cơ các bệnh tim mạch

Statin với cơ chế tác động ức chế enzym HMG-CoA là thuốc có vai trò chủ lực hiệnnay trong điều trị rối loạn lipid máu, theo khuyến cáo của ACC/AHA 2013 thì đây

là thuốc hạ lipid máu duy nhất được chứng minh có tác dụng làm giảm nguy cơ timmạch [36] Cũng theo như khuyến cáo này thì số người trưởng thành cần được kêđơn statin ước tính sẽ tăng từ 15,5% lên 31% Điều này cũng dẫn đến những lo ngại

về tác dụng phụ của thuốc, như rối loạn chức năng gan, bệnh về cơ, đặc biệt tácdụng phụ trầm trọng nhất là tiêu cơ vân, dẫn đến suy thận Do đó, việc phát triểnnhững dược liệu có tác dụng hạ lipid máu, đặc biệt là có cùng cơ chế ức chế HMG-CoA reductase là hướng đi rất được chú trọng hiện nay, nhất là đối với một quốcgia có tiềm năng phát triển nguồn dược liệu như Việt Nam

Curcumin chiết xuất từ củ nghệ từ lâu đã có nhiều ứng dụng với các tác dụng khángviêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, bảo vệ gan, hạ lipid máu [20], [33], [34], [48],

[51], [55] Nghiên cứu gần đây của Heni và cộng sự (2016) cho thấy curcumin

nanoemulsion có tác động ức chế HMG-CoA reductase trên in vitro [20] Tuy vậy,

việc ứng dụng curcumin gặp nhiều khó khăn do những hạn chế về dược động học.Nano curcumin là một dạng bào chế được phát triển nhằm khắc phục những nhượcđiểm của curcumin và bắt đầu được ứng dụng rộng rãi

Vì vậy đề tài “Đánh giá tác động hạ lipid máu của curcumin và nano curcumin in vitro và in vivo” được tiến hành với các mục tiêu cụ thể sau:

- Đánh giá tác động ức chế HMG-CoA reductase in vitro của curcumin và nano

curcumin trên dịch đồng thể enzym gan chuột nhắt

- Đánh giá tác động ức chế HMG-CoA reductase và ức chế tổng hợp lipid nội bàocủa curcumin và nano curcumin trên tế bào HepG2

- Đánh giá tác động hạ lipid máu cấp tính và ức chế HMG-CoA reductase in vivo

của curcumin và nano curcumin trên mô hình gây tăng lipid máu cấp bằng tyloxapol

ở chuột nhắt

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN RỐI LOẠN LIPID MÁU

1.1.1 Vai trò của lipid

Lipid là nguồn năng lượng trực tiếp cho cơ thể đồng thời cũng là nguồn dự trữ năng lượng lớn nhất Với khẩu phần ăn hợp lý, lipid tham gia cung cấp 25-30% năng lượng cơ thể Dạng dự trữ là triglycerid tại mô mỡ, chiếm khoảng 15-20% trọng lượng người trưởng thành Lipid tham gia cấu trúc cơ thể, là bản chất của một số hoạt chất sinh học quan trọng như: phospholipid tham gia cấu trúc màng tế bào và

là tiền chất của prostaglandin và leucotrien; cholesterol cần cho sự tổng hợp acid mật, các hormon steroid thượng thận và sinh dục; mô mỡ đệm dưới da và bọc quanh các phủ tạng

Lipid bao gồm nhiều chất: acid béo, cholesterol, phospholipid, triglycerid Lipid di chuyển trong máu dưới dạng kết hợp với apoprotein và mang tên lipoprotein Có 4 loại lipoprotein [1]

Chylomicron: được tổng hợp từ niêm mạc ruột, chuyên chở triglycerid và

cholesterol đến các mô như gan, mỡ và cơ vân Tại đó, lipoprotein lipase thuỷ phân triglycerid trong chylomicron thành acid béo tự do; các acid béo này được dùng để tổng hợp lipoprotein tỉ trọng rất thấp (VLDL) ở gan hoặc được oxy hoá sinh năng lượng ở cơ hoặc được dự trữ ở mô mỡ

VLDL được tổng hợp từ acid béo tự do có nguồn gốc từ chuyển hoá chylomicron ở

gan hoặc nội sinh Triglycerid của VLDL bị thuỷ phân bởi lipoprotein lipase mao mạch để cung cấp acid béo cho mô mỡ và cơ Phần lipid còn lại gọi là lipoprotein tỉ trọng trung gian (IDL) Sau đó IDL chuyển thành lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) bởi tác dụng của lipase gan hoặc được gan bắt giữ qua thụ thể LDL

LDL chuyên chở phần lớn lượng cholesterol có trong máu, cung cấp cholesterol cho

tế bào Thụ thể LDL ở tế bào ngoại biên hoặc gan bắt giữ LDL và lấy nó ra khỏi máu Tế bào ngoại biên dùng cholesterol trong LDL cho cấu trúc màng cũng như để

sản xuất hormon LDL là lipoprotein đóng vai trò quan trọng hình thành mảng xơ vữa động mạch; nồng độ LDL tăng dẫn đến tăng nguy cơ bệnh tim mạch

HDL (lipoprotein tỉ trọng cao) được tổng hợp và chuyển hoá ở gan và ruột HDL

lấy cholesterol từ mô ngoại biên; quá trình này được hỗ trợ bởi lecithin cholesterol acyltransferase trong hệ tuần hoàn qua phản ứng ester hoá cholesterol tự do

1.1.2 Rối loạn lipid máu

Là tình trạng bệnh lý khi có một hoặc nhiều thông số lipid bị rối loạn (tăng

cholesterol hoặc tăng triglicerid, hoặc tăng LDL-C, hoặc giảm HDL-C…) [1]

1.1.2.1 Nguyên nhân

- Rối loạn lipid máu tiên phát do đột biến gen làm tăng tổng hợp quá mức cholesterol toàn phần (TC), triglicerid (TG), LDL-C hoặc giảm thanh thải TC, TG, LDL-C hoặc giảm tổng hợp HDL-C Rối loạn lipid máu tiên phát thường xảy ra sớm ở trẻ em và người trẻ tuổi, ít khi kèm thể trạng béo phì [1]

- Rối loạn lipid máu thứ phát chủ yếu do lối sống tĩnh tại, dùng nhiều bia rượu, thức

ăn giàu chất béo bão hòa Các nguyên nhân thứ phát khác như đái tháo đường, bệnh thận mạn tính, suy giáp, xơ gan, dùng thuốc thiazid, corticoid, estrogen, chẹn beta giao cảm [1]

1.1.2.2 Chẩn đoán

Chẩn đoán bằng xét nghiệm các thông số lipid và xác định khi có một hoặc nhiều

rối loạn như sau [1]:

- Cholesterol máu > 5,2 mmol/L (200 mg/dL)

- Giảm TC, TG, LDL-C và tăng HDL-C

- Góp phần kiểm soát tốt đường huyết và huyết áp

Thời gian tập luyện - vận động thể lực khoảng 30 đến 45 phút mỗi ngày, 5 ngày mỗi tuần, cường độ và thời gian tập tùy thuộc vào tình trạng sức khỏe nhất là những người có bệnh lý huyết áp, mạch vành, suy tim… [1]

Chế độ ăn

- Hạn chế năng lượng nhất là những người béo phì

- Hạn chế mỡ chứa nhiều acid béo bão hòa như mỡ trong thịt heo, thịt bò, thịt cừu…, giảm cholesterol có trong lòng đỏ trứng, bơ, tôm… Tăng lượng acid béo không bão hòa có trong các loại thực vật như dầu đậu nành, dầu ô liu, dầu bắp, trong mỡ cá… Ăn ít muối, hạn chế đường, các đồ uống có đường

- Khẩu phần ăn có sự cân đối giữa glucid, lipid và protid Tránh dùng nhiều glucid (năng lượng do glucid cung cấp khoảng 50% năng lượng của phần ăn, lipid khoảng 30% và protid khoảng 20%)

- Hạn chế bia rượu

- Bổ sung chất xơ, vitamin, yếu tố vi lượng từ các loại rau, củ và hoa quả [1], [5]

Thuốc điều trị giảm lipid máu

Nhóm statin (HMG-CoA reductase inhibitor)

- Tác dụng: ức chế HMG-CoA reductase, một enzym tham gia tổng hợp cholesterol, làm giảm cholesterol nội sinh, kích thích tăng tổng hợp thụ thể LDL nên tăng thu giữ LDL-C tại gan Kết quả sẽ giảm nồng độ LDL-C phụ thuộc vào liều (từ 20-55%), ngoài ra còn làm giảm VLDL, TC, TG (10-30%) và tăng HDL-C (2-10%) Ngoài ra nhóm statin còn giảm quá trình viêm của nội mạc mạch máu, ngăn tiến triển mảng xơ vữa, tăng tổng hợp nitric oxid (NO) của tế bào nội mạc [1]

- Vai trò của statin: là thuốc hạ lipid máu duy nhất được ACC/AHA khuyến cáo chỉ định do có tác dụng phòng ngừa tiên phát và thứ phát các biến cố tim mạch do xơ vữa động mạch vành [36] Phân tích Cochrane (2013) bao gồm 19 nghiên cứu cho thấy điều trị với statin làm tăng hiệu quả dự phòng nguy cơ tiên phát cho bệnh nhân

và chi phí về điều trị Cụ thể, statin giảm tỉ lệ tử vong do mọi nguyên nhân (OR 0,86, CI 95% 0,79 đến 0,94); giảm nguy cơ bệnh tim mạch (RR 0,75 CI 95% 0,70 đến 0,81), giảm nguy cơ biến cố bệnh mạch vành (RR 0,73 CI 95% 0,67 đến 0,80)

và giảm nguy cơ đột qụy (RR 0,78, CI 95% 0,68 đến 0,89) [50]

Theo một phân tích gộp tiến hành năm 2010 trên 170.000 người tham gia từ 26 thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên về statin, nồng độ LDL-C giảm mỗi 1.0 mmol/L (tương đương 40 mg/dl) sẽ làm giảm 10% tỉ lệ tử vong do mọi nguyên nhân và 20%

tỉ lệ tử vong do bệnh tim mạch vành Liệu pháp statin cường độ cao làm giảm 10%

tỉ lệ tử vong do mọi nguyên nhân khi so sánh với nhóm chứng [13]

- Các đối tượng được hưởng lợi từ liệu pháp statin theo AHA/ACC 2013 [36]

Nhóm thứ nhất là những bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng của bệnh tim mạch do xơ vữa động mạch như: hội chứng mạch vành cấp, tiền sử nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực ổn định hoặc đau thắt ngực không ổn định, tiền sử tái tưới máu động mạch vành (can thiệp qua da, mổ bắc cầu) hoặc tái tưới máu động mạch khác, tiền sử đột quị hoặc cơn thiếu máu não thoáng qua, bệnh động mạch ngoại vi do xơ vữa động mạch Liệu pháp statin dùng cho nhóm đối tượng này là nhằm phòng ngừa thứ phát Nhóm thứ hai là những bệnh nhân có tăng cholesterol nguyên phát với LDL-C ≥

190 mg/dl, tăng cholesterol do mọi nguyên nhân, sử dụng statin nhằm mục đích phòng ngừa nguy cơ tiên phát

Nhóm thứ ba là những bệnh nhân đái tháo đường tuổi 40-75, có LDL-C 70-189 mg/dl và không có biểu hiện lâm sàng của bệnh tim mạch do xơ vữa động mạch

Nhóm thứ tư là những bệnh nhân 40-75 tuổi không có biểu hiện lâm sàng của bệnh tim mạch do xơ vữa động mạch, không có đái tháo đường, có LDL-C 70-189 mg/dl

và nguy cơ bị các biến cố tim mạch do XVĐM trong 10 năm tới ≥ 7,5%

- Tác dụng không mong muốn có thể gặp: mặc dù statin nói chung được dung nạp tốt, nhưng có những tác dụng phụ cần được xem xét khi kê statin

Thường gặp nhất là đau cơ và viêm cơ không có tăng creatine kinase, mất chức năng cơ Đau cơ có thể xảy ra ở 5-10% bệnh nhân sử dụng statin [29]

Tăng men gan: tăng men gan xảy ra từ 0,5-2,0% bệnh nhân điều trị với statin và phụ thuộc vào liều statin, nồng độ enzym gan tăng có ý nghĩa khi tăng ít nhất ba lần, được đo trong hai lần, sau một vài ngày đến vài tuần điều trị với statin Quá trình tiến triển đến suy gan rất hiếm khi xảy ra Nếu nồng độ transaminase tăng gấp 3 lần hoặc cao hơn mức giới hạn bình thường, cần phải ngưng thuốc [9]

Statin liều cao có thể làm tăng nhẹ nguy cơ đái tháo đường type 2, tuy nhiên lợi ích giảm biến cố tim mạch lớn hơn tác hại của thuốc, nhất là ở những đối tượng đã có triệu chứng tim mạch, hoặc nguy cơ ≥ 7,5% [5]

Bảng 1.1 Liệu pháp statin cường độ cao, vừa và thấp [36]

Liệu pháp statin cường

độ cao

Liệu pháp statin cường độ vừa

Liệu pháp statin cường độ thấp

Liều dùng mỗi ngày hạ

Fluvastatin 20-40 mg Pitavastatin 1 mg

Ghi chú: các statin và liều dùng in đậm đã được chứng minh là giảm biến cố tim mạch trong các thử nghiệm lâm sàng phân nhóm ngẫu nhiên có đối chứng Các statin và liều dùng in nghiêng đã được FDA chấp thuận nhưng chưa được đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng Liều atorvastatin 40 mg chỉ được đánh giá trong một nghiên cứu duy nhất là IDEAL: dùng liều này nếu bệnh nhân không dung nạp liều 80 mg

Nhóm fibrat

- Tác dụng: làm giảm TG do kích thích PPAR alpha làm tăng oxy hóa acid béo, tăng tổng hợp lipoprotein lipase, làm tăng thanh thải các lipoprotein giàu TG, ức chế tổng hợp apoC-III ở gan, tăng thanh thải VLDL Các fibrat cũng làm tăng HDL

do thúc đẩy trình diện apoA-I và apoA-II

- Tác dụng không mong muốn:

Các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như đầy hơi, trướng bụng, buồn nôn, giảm nhẹ chức năng gan, tăng men gan, sỏi mật, tăng men cơ, phát ban

Làm tăng tác dụng thuốc chống đông, nhất là nhóm kháng vitamin K

- Không dùng cho phụ nữ có thai hoặc cho con bú, người bệnh suy gan, suy thận

- Chỉ định điều trị: tăng TG [1]

Nhóm acid nicotinic (niacin, vitamin PP)

- Thuốc có tác dụng giảm TG do ức chế phân hủy TG từ tổ chức mỡ và giảm tổng hợp TG ở gan, ức chế tổng hợp và ester hóa acid béo tại gan, tăng thoái biến apoB, giảm VLDL-C, giảm LDL-C, và tăng HDL-C (do giảm thanh thải apoA-I)

- Tác dụng không mong muốn: đỏ bừng mặt, ngứa, các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như đầy hơi, trướng bụng, buồn nôn, tăng men gan, sỏi mật, tăng men cơ, phát ban, tăng đề kháng insulin Tác dụng phụ thường xảy ra khi dùng liều cao, hoặc cơ địa, người già, hoặc có bệnh lý thận, gan trước

- Chỉ định: tăng LDL-C, giảm HDL-C, tăng TG [1]

Nhóm resin (bile acid sequestrant)

- Resin trao đổi ion Cl- với acid mật, tăng tổng hợp acid mật từ cholesterol, làm tăng bài tiết mật và giảm cholesterol ở gan, kích thích tổng hợp thụ thể LDL, tăng thải LDL-C

- Chỉ định trong trường hợp tăng LDL-C

- Tác dụng không mong muốn: các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như đầy hơi, trướng bụng, buồn nôn, táo bón [1]

Ezetimib

- Thuốc ức chế hấp thu cholesterol tại ruột, làm giảm LDL-C và tăng HDL-C

- Tác dụng phụ: thuốc rất ít tác dụng phụ, có thể gặp tăng men gan

Omega 3 (fish oil)

- Cơ chế: tăng dị hóa TG ở gan

- Tác dụng không mong muốn: các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như đầy hơi, trướng bụng, tiêu chảy

- Chỉ định trong trường hợp tăng TG (> 500 mg/dl), với liều từ 2-4 g mỗi ngày FDA không chấp thuận sử dụng omega 3 hàng ngày để điều trị tăng TG cũng như không khuyến cáo sử dụng cho mục đích này [40]

1.2 TỔNG QUAN VỀ MÔ HÌNH TYLOXAPOL VÀ MÔ HÌNH HEPG2

1.2.1 Mô hình Tyloxapol

Tyloxapol, còn có tên gọi là Triton WR1339, là một chất tẩy rửa không ion hoá, đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu để gây tăng lipid máu cấp tính trên động vật thử nghiệm Mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol thường được sử dụng để sàng lọc các hoạt chất có tác dụng hạ lipid máu có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp [23], [30], [32] Trong suốt 3 giờ đầu tiên sau khi tiêm tĩnh mạch tyloxapol trên chuột nhắt với liều 400 mg/kg, nồng độ cholesterol máu tăng 2 lần, mức độ hoạt động của HMGR không

thay đổi Tuy nhiên, sau 6-9 giờ, nồng độ cholesterol máu tăng từ 3-4 lần và hoạt tính của HMGR cũng tăng từ 4-5 lần [32]

Bảng 1.2 Mốt số nghiên cứu sử dụng mô hình gây tăng lipid máu cấp tính in vivo

bằng tyloxapol

Tác giả Năm công

tyloxapol Thời gian

IV

200 mg/kg

Lấy mẫu máu sau

7 giờ và 24 giờ sau tiêm

IV

200 mg/kg

Lấy mẫu máu lúc

7 giờ và 24 giờ sau tiêm

Các nghiên cứu khác cũng cho thấy tyloxapol làm tăng nhanh nồng độ cholesterol máu, đạt mức cao nhất 24 giờ sau tiêm và giảm dần, tác dụng mất sau 48-72 giờ Jamile và cộng sự (2014), sau khi tiêm Triton liều 400 mg/kg trên chuột, nồng độ

triglycerid ghi nhận được sau 24 và 48 giờ lần lượt là 4200 và 1500 mg/dl [24] Tyloxapol thường được sử dụng gây tăng nhanh cholesterol máu ở động vật thử nghiệm trong các nghiên cứu cấp tính hơn là mô hình gây bệnh mạn tính Mặc dù vậy, cũng đã có nghiên cứu sử dụng tyloxapol để gây tăng lipid máu ở mô hình mạn tính, nghiên cứu của Levine và cộng sự (2007) cho thấy tyloxapol phải được tiêm tĩnh mạch ba lần mỗi tuần để duy trì mức tăng cholesterol và triglycerid bền vững trong 1, 2 hoặc 3 tuần [44]

Cơ chế của tyloxapol là ức chế hoạt động của enzym lipoprotein lipase dẫn đến sự tích tụ của triglycerid và VLDL trong huyết tương, ngoài ra tyloxapol còn có tác dụng làm tăng quá trình tổng hợp cholesterol của gan bằng cách kích thích hoạt động của enzym HMG-CoA reductase [30]

1.2.2 Mô hình HepG2

Các dòng tế bào gan có một số ưu điểm khi so sánh với các tế bào gan người được nuôi cấy Các dòng tế bào gan phát triển liên tục, có tuổi thọ gần như không giới hạn và khá ổn định về mặt kiểu hình Dòng tế bào dễ dàng có sẵn, điều kiện nuôi cấy đơn giản hơn so với tế bào gan nguyên phát và dễ dàng chuẩn hóa trong các phòng thí nghiệm [14] Những tính năng này làm cho các dòng tế bào gan thích hợp

cho mục đích sàng lọc, được dùng làm mô hình in vitro cho nghiên cứu chức năng

tế bào gan, cũng như trong các nghiên cứu độc tính

HepG2 là dòng tế bào ung thư biểu mô gan được phân lập từ khối ung thư gan của bệnh nhân nam người gốc Mĩ da trắng, có hình thái và chức năng giống với tế bào gan người biệt hóa bình thường, đáp ứng tất cả các yêu cầu sinh hóa cho các nghiên cứu hiện nay Dòng tế bào này đã được sử dụng rộng rãi trong sinh hóa và nghiên cứu dinh dưỡng vì nó được coi là một trong các mô hình thử nghiệm gần giống với

tế bào gan người trong nuôi cấy, thể hiện qua khả năng sản xuất các protein chinh như albumin huyết tương, transferrin, fibfrinogen, plasminogen…

Có rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng dòng tế bào HepG2 để sàng lọc các tác dụng dược lý của hoạt chất Myung-A Jung và cộng sự (2015) đã nghiên cứu tác dụng hạ

lipid máu của dịch chiết từ nghệ (Curcuma longa L) và dịch chiết từ lá sen (Nelumbo nucifera) trên mô hình in vitro sử dụng tế bào HepG2 phối hợp với mô hình in vivo gây tăng lilpid bằng chế độ ăn trên chuột Trong mô hình gây tình trạng

quá tải lipid của tế bào, tế bào HepG2 được tiếp xúc với hỗn hợp chuỗi acid béo tự

do (acid oleic và palmitic) Hỗn hợp hai dịch chiết dược liệu trên cũng được thêm vào môi trường nuôi cấy vào thời điểm 12 và 24 giờ sau đó Nồng độ cholesterol nội bào được đánh giá sau khi ly giải tế bào [35]

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu sử dụng acid béo trên mô hình in vitro

6 giờ

1.3 CURCUMIN

1.3.1 Nguồn gốc:

Curcumin được chiết xuất từ củ nghệ (Curcuma longa) là thành phần có hoạt tính

chính, đồng thời tạo nên màu của nghệ Curcumin được xác định lần đầu tiên vào

dầu dễ bay hơi (tumeron, atlanton và zingiberon), đường, protein, nhựa và một nhóm curcuminoid gồm 3 loại có tỉ lệ: curcumin (diferuloylmethan) chiếm khoảng

75%, khoảng 16% demethoxycurcumin, khoảng 8% bisdemethoxycurcumin [52]

Hình 1.1 Bột nghệ và cấu trúc hoá học của curcumin [52]

1.3.3 Dược động học

Hấp thu: curcumin rất kém hấp thu bằng đường uống

Một thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I thực hiện trong số 25 bệnh nhân cho thấy rằng liều dùng đường uống lần lượt là 4, 6 và 8 g curcumin hàng ngày trong ba tháng cho

nồng độ curcumin huyết thanh tương ứng là 0,51 ± 0,11, 0,63 ± 0,06 và 1,77 ± 1,87 μg/ml Nghiên cứu này cho thấy curcumin kém hấp thu và sinh khả dụng rất giới hạn Nồng độ curcumin huyết thanh đạt cao nhất trong khoảng một và hai giờ sau khi dùng thuốc và giảm nhanh sau đó [12] Để đạt được nồng độ curcumin ở

ngưỡng trị liệu, cần phải uống 12-20 g curcumin mỗi ngày [10]

Một nghiên cứu tiến hành tiêm một liều 1 g/kg ở chuột cống cho thấy 75% curcumin bài tiết qua phân, một lượng không đáng kể xuất hiện trong nước tiểu Nồng độ curcumin trong máu và trong dịch bài tiết qua mật cho thấy curcumin hấp thu kém qua đường ruột Bên cạnh đó, lượng curcumin đạt được ở bên ngoài tế bào không có ý nghĩa về mặt dược lý [42] Một nghiên cứu gần đây của Yang và cộng

sự (2007) cho thấy rằng với liều 10 mg/kg curcumin tiêm IV ở chuột cống cho kết quả nồng độ curcumin tối đa trong huyết thanh là 0,36 ± 0,05 μg/ml, trong khi liều curcumin cao gấp 50 lần bằng đường uống cho nồng độ huyết thanh tối đa chỉ 0,06

± 0,01 μg/ml [56]

Phân bố: Ravindranath và cộng sự (1981) nhận thấy sau khi cho chuột cống uống

400 mg curcumin, các phân tử curcumin chỉ được phát hiện ở dạng vết trong gan và thận Sau 30 phút dùng đường uống, 90% curcumin được tìm thấy trong dạ dày và

ruột non, nhưng chỉ có 1% là tồn tại sau 24 giờ [42]

Chuyển hóa: gan là cơ quan chuyển hóa curcumin, hai chất chuyển hóa đầu tiên là

tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin, sau đó sẽ tiếp tục được glucuronid hóa [42] Ngoài ra hợp chất liên kết với sulfat của curcumin cũng được phát hiện trong nước tiểu

Thải trừ: thời gian bán thải của curcumin đường uống (liều 2 g/kg) ở chuột cống

được báo cáo là 1,7 ± 0,5 giờ [42] Một nghiên cứu khác cho thấy thời gian bán thải của curcumin là 1,45 giờ và của dạng phức hợp curcumin-phospholipid thì dài hơn (1,96 giờ) [27]

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã xác định được một số phân tử khác nhau

có liên quan đến viêm bị ức chế bởi curcumin bao gồm phospholipase, lipooxygenase, cyclooxygenase-2, leukotrien, thromboxan, prostaglandin, oxit nitric, collagenase, elastase, hyaluronidase, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), protein kích thích interferon, yếu tố hoại tử khối u (TNF), interleukin-12 (IL-12) [37]

- Hoạt tính kháng ung thư

Curcumin có tác dụng dự phòng và điều trị nhiều lọai ung thư với nhiều đích phân tử: làm giảm và ức chế hoạt tính của yếu tố nhân NF-kB, gây chết tế bào theo chương trình, làm giảm sự tăng sinh, giảm di căn và xâm nhập của tế bào ung thư, làm giảm tân tạo mạch nên kìm hãm sự phát triển khối u Curcumin là một phân tử rất đa hướng, có tác dụng điều biến trên rất nhiều mục tiêu, bao gồm:

Curcumin làm giảm một số cytokin thúc đẩy viêm như TNFa, 1, 2, 8,

IL-12 nên làm giảm được các triệu chứng của ung thư cũng như các tác dụng không mong muốn của hóa trị/xạ trị, như đau thần kinh, trầm cảm, mệt mỏi, mất ngủ, giảm

sự ngon miệng [43]

Hoạt hóa các yếu tố phiên mã như NF-kB (Nuclear factor-kappa B), STAT3 (signal

transducers and activators of transcription), PPAR-g (peroxisome activated receptor-gamma)…[43]

proliferator-Nhờ những tác dụng đó, curcumin đã ức chế sự tăng sinh và di căn của tế bào ung thư, đồng thời gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) Một nghiên cứu đã chứng minh curcumin có tác dụng chống ung thư thông qua việc điều chỉnh methylating transferase (DNMT1), qua đó làm tăng biểu hiện của transcription factor (TCF 21)[19]

- Tác dụng trên Helicobacter pylori

Nghiên cứu tiến hành trên chuột nhắt gây nhiễm Helicobacter pylori, sau đó sử

dụng curcumin với liều 200 hoặc 600 mg/kg cho thấy curcumin thể hiện hiệu quả chống viêm thông qua việc ức chế biểu hiện NF-κB p65 trong biểu mô dạ dày

Curcumin làm giảm viêm dạ dày do Helicobacter pylori ở chuột [26]

- Tác dụng bảo vệ gan

Curcumin bảo vệ gan chống lại tổn thương và sự hình thành sản phẩm thoái hoái của fibrin (fibrigenosis) bằng cách giảm stress oxy hoá, ức chế viêm và ức chế hoạt hóa tế bào Stellate gan, giảm hoạt động của các enzym như aspartat aminotransferase, alanin aminotransferase, phosphatase kiềm và cải thiện cấu trúc

mô học của gan Ngoài ra, curcumin làm giảm stress oxy hóa bằng cách tăng nồng

độ glutathion gan, dẫn đến giảm hydroperoxid lipid

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của curcumin khỏi tổn thương gan do rượu và chế

độ ăn nhiều chất béo tiến hành trên chuột nhắt, kết quả cho thấy curcumin làm giảm đáng kể nồng độ enzym aspartat aminotransferase, alanin aminotransferase, lactat dehydrogenase và phosphatase kiềm (p <0,05) trong huyết tương và ngăn ngừa chứng gan nhiễm mỡ so với nhóm chứng Curcumin đã làm đảo ngược tác động ức chế của rượu do làm tăng hoạt tính của alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, kích hoạt cytochrome P450 2E1 (p <0,05) Curcumin làm tăng AMPK trên gan và đồng thời ức chế hoạt tính phosphase và phosphatidate

phosphohydrolase so với nhóm chứng (p <0,05) Hơn nữa, curcumin làm giảm đáng

kể axit béo tự do, triglycerid và lipid ở gan (p <0,05) [18]

- Tác dụng hạ lipid máu

Curcumin ức chế biểu hiện PCSK9 có liên quan đến sự gia tăng LDL-receptor trên

bề mặt tế bào gan cũng như làm tăng hoạt tính của LDL-receptor dẫn đến tác dụng

hạ lipid máu [49]

Những phát hiện gần đây cho thấy các cơ chế giải thích cho tác dụng hạ LDL-C của curcumin Curcumin có thể chuyển đổi sinh tổng hợp apolipoprotein B (apoB) từ apoB-100 sang apoB-48 thông qua việc tạo ra polypeptid 1 xúc tác phiên mã mRNA apoB Tăng phiên mã mRNA apoB sẽ dẫn đến lợi thế vượt trội của apoB-48

so với các hạt chứa apoB-100 Hạt apoB-48 được loại bỏ khỏi huyết tương nhanh hơn, làm giảm nguy cơ lắng đọng lipoprotein ở thành động mạch, giảm sự hình thành tế bào bọt Curcumin cũng giảm oxy hóa LDL và ngăn ngừa sự biến đổi các đại thực bào thành các tế bào bọt [51]

Nghiên cứu tiến hành trên chuột cống gây mô hình bệnh động mạch vành trong vòng 12 tuần bằng chế độ ăn giàu lipid và được điều trị với curcumin liều 100 mg/kg/ngày trong vòng 4 tuần tiếp theo Kết quả cho thấy curcumin ức chế sự biểu hiện của MMP-9, CD40L, TNF-α và CRP, giảm tính thấm của thành động mạch vành [55]

Một nghiên cứu khác đã phát hiện thêm cơ chế tiềm năng trong tác dụng hạ cholesterol máu của curcumin bằng cách tăng biểu hiện của cholesterol 7a-hydroxylase, enzym này hạn chế quá trình sinh tổng hợp acid mật từ cholesterol Kết quả điều trị bằng curcumin trong vòng 8 tuần trên chuột cống gây mô hình tăng lipid máu bằng chế độ ăn giàu lipid cho thấy nồng độ triglycerid huyết thanh giảm 27%, cholesterol toàn phần giảm 33,8% và LDL-C giảm 56% so với nhóm đối chứng (p <0,05) [33]

Ngoài ra curcumin còn được chứng minh là có tác dụng chống oxy hoá Nghiên cứu tiến hành trên lipoprotein tỉ trọng thấp được phân lập từ huyết tương người và bị

gây oxy hóa bằng cách ủ với CuSO4 5M ở 370C trong vòng 4 giờ Curcumin cho thấy hiệu quả làm giảm các hợp chất có liên kết dien, lipid peroxid và lysolecithin, đồng thời làm tăng nồng độ acid béo không bão hòa Hiệu quả này tăng theo liều curcumin và đạt mức tối đa ở nồng độ 5 µM [34]

1.4 TIỂU PHÂN NANO VÀ NANO CURCUMIN

1.4.1 Khái niệm

Tiểu phân nano (nano particle) là các tiểu phân phân tán có kích thước từ 1 nm đến 1.000 nm, với một cấu trúc thiết kế thích hợp, có vai trò như một phương tiện vận chuyển riêng biệt, đảm bảo chuyển giao hoạt chất đến đích sinh học, theo một đường dẫn phù hợp với cơ thể người Dạng bào chế này thường được gọi là thuốc điều trị tại đích (drug targeting) và các tiểu phân phân tán được gọi là tiểu phân vận chuyển (vector) Nhìn chung, thuốc điều trị tại đích là một giá mang nano (nano carrier) cấu tạo đặc biệt giúp chuyển giao hoạt chất đến đích sinh học [3]

1.4.2 Tương quan giữa kích thước tiểu phân nano và một số thành phần sinh học cơ thể

Tiểu phân nano có kích thước 1-1.000 nm Trong khi đó, kích thước tế bào bình thường của người khoảng 10-100 µm Tế bào ung thư có thể tăng trưởng đến kích thước vài mm Lysosom bên trong tế bào có kích thước khoảng 0,1-0,2 µm Nhân tế bào có kích thước 5-7 µm Các loại virus có kích thước 20-400 nm và các loại vi khuẩn có kích thước 500 nm-10 µm Chính vì vậy, tiểu phân nano dễ dàng đi qua nhiều hàng rào sinh học, hướng đến đích tế bào và các bào quan bên trong tế bào [3]

1.4.3 Đặc điểm của các hoạt chất được nang hóa trong tiểu phân nano

- Tính tan thấp trong môi trường nước

- Tính thấm qua màng sinh học thấp

- Thời gian bán thải ngắn

- Độ ổn định kém, tác dụng phụ và độc tính cao

- Tính thấm vào bên trong tế bào kém

1.4.4 Nano curcumin

Các nghiên cứu trong 30 năm qua đã cho thấy curcumin đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh viêm mạn tính cũng như bệnh thoái hóa thần kinh, tim mạch, phổi, chuyển hóa, tự miễn dịch và ác tính Tuy nhiên yếu tố cản trở lớn nhất khi áp dụng trên người là curcumin rất ít tan trong nước (nồng độ tan tối đa là 0,0004 mg/mL ở pH 7,3) nên sinh khả dụng rất thấp, mặt khác curcumin còn bị chuyển hóa nhanh trong gan và bị thải trừ qua phân Nhiều biện pháp đã được đề xuất và thử nghiệm như bổ sung piperin để giảm sự giáng hóa của curcumin trong ruột; dạng curcumuin liposom; dùng dạng phức hợp phospholipid; tạo phức chelat với kim loại; sản xuất curcumin dưới dạng tiểu phân nano có kích thước từ 10 đến 200 nm Trong số các biện pháp trên, nanocurcumin được đánh giá là có hiệu quả nhất

Thử nghiệm của Zhongfa và cộng sự (2012) tiến hành so sánh dược động học của dạng nhũ tương nano curcumin có chứa 20% curcumin với dạng hỗn dịch curcumin trong methylcellulose 1% trên chuột nhắt trắng, kết quả cho thấy sau cùng một liều uống, ở nhóm chuột uống nhũ tương nano curcumin, diện tích dưới đường cong AUC (0→24 h) tăng 10 lần và Cmax tăng 40 lần so với nhóm uống hỗn dịch curcumin [57]

Một nghiên cứu khác so sánh nano curcumin (liều 100 mg/kg), hỗn dịch curcumin (liều 250 mg/kg) cho thấy sinh khả dụng của dạng tiểu phân nano cao hơn hẳn so với dạng hỗn dịch uống, với nồng độ đỉnh tương ứng là 260 ± 26,4 và 121,2 ± 23,1 ng/ml; trong khi đó sinh khả dụng của dạng nano cao hơn gần bốn lần so với dạng hỗn dịch, lần lượt là 3224 ± 329 và 872 ± 43 ng/ml.h [10]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng thử nghiệm:

Động vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino do Viện Kiểm nghiệm

Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Chuột đực nặng 28-30 g, khỏe mạnh, không dị tật, không có biểu hiện bất thường Chuột được nuôi ổn định trong lồng, mỗi lồng

chứa 8-10 con, được cung cấp đầy đủ thức ăn, nước uống sạch

Dòng tế bào HepG2: là dòng tế bào ung thư biểu mô gan người được phân lập từ

khối tế bào ung thư gan của một bệnh nhân nam da trắng người Mỹ 15 tuổi Tế bào HepG2 được cung cấp và hoạt hoá tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng

Tế bào gốc, trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia, Tp Hồ Chí Minh

Mẫu thử: trong đề tài này chúng tôi khảo sát tác động ức chế HMGR và hạ lipid máu của curcumin và nanocurcumin

Curcumin: đạt tiêu chuẩn cơ sở và được cung cấp bởi Bộ môn Hoá lý, Khoa Dược –

ĐH Y Dược TPHCM

Nano curcumin: đạt tiêu chuẩn cơ sở và được cung cấp bởi Bộ môn Hoá lý, Khoa Dược – ĐH Y Dược TPHCM Hàm lượng curcumin là 5%, hệ tinh thể nano curcumin có kích thước trung bình nằm trong khoảng 30-60 nm, kiểu phân bố một

đỉnh với dãy phân bố 15-300 nm

2.1.2 Hóa chất và thuốc thử nghiệm:

- Atorvastatin (PZ001-Sigma-Aldrich): dùng cho thí nghiệm in vitro

- Atorvastatin (Lipitor 10 mg, Pfizer, Pháp): dùng cho thí nghiệm in vivo

-  -Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat tetrasodium dạng khử (NADPH), độ tinh khiết ≥ 95% (Sigma-Aldrich)

- D,L-Dithiothreitol, độ tinh khiết ≥ 98% (D0632-Sigma-Aldrich)

- D,L-3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A sodium salt (HMG-CoA), độ tinh khiết ≥ 95% (N5130-Sigma-Aldrich)

- Dimethyl sulfoxid (DMSO- Trung Quốc)

- Ethylendinitrilo tetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA), độ tinh khiết ≥ 99% (N6505-Sigma-Aldrich)

- Sucrose (Merck - Đức)

- Tris base (Sigma-Aldrich)

- Thuốc thử Cholesterol (Human- Đức)

- Thuốc thử Triglycerid (Human- Đức)

- Tyloxapol- Triton WR-1339 (T0307-Sigma-Aldrich)

- Môi trường DMEM (Gibco)

- Huyết thanh bào thai bê (fetal calf serum) (Gibco)

- L-glutamin (Gibco)

- MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) (Sigma)

- Penicilin-Streptomycin (Gibco)

- Đệm phosphat (PBS) (Gibco)

- Acid oleic (Sigma-Aldrich)

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu:

- Cân phân tích (Sartorius - Đức)

- Máy nghiền đồng thể (Sonic Vibracell-Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh Hermel Z36HK

- Máy đo pH (Stuart -Đức)

- Tủ nuôi cấy mô tế bào (Binder- Đức)

- Máy đo quang UV-Vis

- Máy đo sinh hoá bán tự động

- Tủ thao tác vô trùng (Memmert – Đức)

- Kính hiển vi soi ngược (Olympus – Nhật)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm trong nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các thí nghiệm tiến hành trong nghiên cứu

2.2.1 Quy trình thu hỗn dịch enzym từ gan chuột nhắt và xác định hoạt tính của enzym trong hỗn dịch thu được

2.2.1.1 Quy trình thu dịch đồng thể enzym từ gan chuột nhắt

Phương pháp tạo dịch đồng thể theo quy trình của các tác giả trước đây [2], [6], [21]:

- Chuột được nuôi ổn định từ 10-15 ngày, cho nhịn đói 24 giờ trước khi bắt đầu thí nghiệm

- Chuẩn bị các dung dịch bảo quản gồm các thành phần : đệm Tris HCl 0,1M pH 7,4, dung dịch sucrose 0,25M lạnh (0-40C), dithothreitol 1 mM, dung dịch rửa gan NaCl 0,9%

- Chuột được gây mê bằng đá CO2, cố định trên bàn mổ, bơm rửa làm sạch máu và dịch trong gan bằng dung dịch NaCl 0,9%

- Gan được tách nhanh, cho vào dung dịch sucrose 0,25 M lạnh trong nước đá, rửa sạch máu trên bề mặt

- Đặt gan đã xác định khối lượng lên đĩa petri đang được làm lạnh bằng đá bào Nhanh chóng làm nhuyễn sơ bộ mô gan bằng kéo

- Đưa mô gan vào ống falcon 15 ml, bổ sung dung dịch sucrose 0,25 M lạnh tương ứng 4 ml dung dịch trên 1 g mô gan, lắc đều để phân tán mô, bảo quản falcon trong

đá bào duy trì ở nhiệt độ 0-40

C

- Tiến hành đồng thể hóa mẫu mô bằng máy nghiền đồng thể cơ học Tiến hành trong khoảng 20 giây, sau đó ngưng 10 giây để tránh enzym bị mất hoạt tính bởi nhiệt Tiếp tục như vậy 3 lần, cho đến khi thu được dịch mô đồng nhất

- Ly tâm lần 1 ở 00C trong 15 phút với lực ly tâm 5000 g, bỏ cắn, thu dịch

- Bổ sung 0,1 ml dung dịch CaCl2 88 mM trên mỗi 1ml dịch thu được, thỉnh thoảng lắc đều, để ổn định trong 5 phút trong đá bào

- Ly tâm lần 2 ở 00C trong 35 phút với lực ly tâm 13.500 g, bỏ dịch thu cắn Hòa tan cắn trong dung dịch bảo quản enzym ở nhiệt độ 0-40C, vortex nhẹ

- Cắn được đồng thể hóa trở lại bằng máy nghiền đồng thể cơ học, tiến hành trong

20 giây, thu đ ược dịch mô đồng nhất, duy trì nhiệt độ bảo quản ở 0-40C

- Chia mẫu enzym thành nhiều phần nhỏ, mỗi phần khoảng 1 ml và bảo quản ở nhiệt độ -700C

2.2.1.2 Định lượng hàm lượng protein trong hỗn dịch enzym thu được bằng phương pháp Biuret

Nguyên tắc:

Định lượng protein toàn phần trong mẫu bằng phương pháp đo màu dựa trên phản ứng Biuret Protein tạo phức màu tím hồng với Cu2+ trong môi trường kiềm

Protein + Cu2+ Phức hợp Cu-Protein Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein toàn phần có trong mẫu

Bảng 2.1 Thành phần định lượng protein toàn phần bằng phương pháp Biuret

Trộn đều, ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 25ºC - 37ºC Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 550 nm của ống chuẩn và ống thử so với ống trắng

Tính nồng độ theo công thức:

C (g/L) = 40 x

2.2.1.3 Hoạt tính của HMG-CoA reductase trong hỗn dịch enzym thu được

Hoạt tính của enzym HMG-CoA reductase được thể hiện bằng mức giảm độ hấp thu của lượng NADPH trong quá trình xảy ra phản ứng khử HMG-CoA thành acid mevalonic nhờ xúc tác của HMG-CoA reductase Lượng NADPH còn lại được xác định dựa vào phương pháp định lượng UV-Vis (đo động học) ở bước sóng 340 nm Khi có mặt của chất ức chế HMGR, phản ứng bị ức chế

HMG-CoA + 2NADPH + 2H+ → Mevalonat + 2NADP+

+ CoA-SH Phản ứng được thực hiện trong cuvet với tổng thể tích 1 ml gồm các tác nhân sau:

- Dịch đồng thể enzym: tương đương 1mg protein

Tiến hành thêm thuốc thử vào phản ứng theo thứ tự sau:

- Thêm đệm định lượng pH 7,5 vào tất cả các mẫu

- Thêm dithiothreitol vào các mẫu

- Thêm dung dịch NADPH vào tất cả các mẫu

- Sau đó cho dung dịch cơ chất HMG-CoA vào tất cả các mẫu

- Thêm protein enzym vào ngoại trừ mẫu trắng

- Trộn đều mẫu thật kỹ, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng

- Tiến hành đo quang phổ động học ở bước sóng 340 nm