Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm trichoderma và xạ khuẩn streptomyces đối kháng với một số vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh (vigna radiate l ) tại xã điện hồng – điện bàn quảng nam

ỌC N N ỌC SƯ P M KHOA SINH K ÓA LUẬN TỐT N ỆP ỌC Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đối kháng với một số vi nấm gây bệnh trên

ỌC N N

ỌC SƯ P M KHOA SINH

K ÓA LUẬN TỐT N ỆP ỌC

Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đối kháng với một số vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh (Vigna radiate L.) tại xã iện Hồng – iện Bàn - Quảng Nam

Sinh viên thực hiện : Bùi Thị Minh Hiệp

Chuyên ngành : Cử nhân Sinh Môi Trường Người hướng dẫn : TS ỗ Thu Hà

à Nẵng, tháng 5/ 2013

LỜI CẢM ƠN

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn TS Đỗ Thu Hà đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh – Môi trường – Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong

4 năm học

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Bùi Thị Minh Hiệp

DAN MỤC CÁC BẢN

Số hiệu

3.1 Thành phần nấm bệnh hại trên cây đậu xanh 24

3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm bệnh gây hại 24

3.3 Lây nhiễm các chủng nấm Fusarium NB2 và

3.4 Hoạt tính kháng VSVKĐ của 14 chủng XK chi Streptomyces 28

3.5 Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của chủng XK 2 và XK 15 30

3.6

Khả năng sinh enzym ngoại bào của 2 chủngxạ khuẩn XK 2,

3.7

Hoạt tính KS của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn trên 2 môi

3.8 Sự phát triển của các chủng nấm Trichoderma sau 3 ngày

3.9 Kết quả mức đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm

3.13 So sánh khả năng phát triển của xạ khuẩn qua các công thức 41

3.14 Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Collectotrichum sau khi rắc

3.15 Số lượng cây con mắc bệnh và chết trên 4 công thức sau khi

DAN MỤC CÁC ÌN

Số hiệu

2.1 Cách cấy nấm Trichoderma và nấm bệnh trên đĩa petri 19

2.2 Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm xạ khuẩn

2.3 Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm

2.4 Mô hình bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 1 22

2.5 Mô hình bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 2 23

3.1 Hình ảnh phân lập nấm bệnh trên môi trường WA 25

3.2 Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng nấm bệnh hại đậu xanh 25

3.3 Cuống sinh bào tử và bào tử của các vi nấm bệnh gây hại

3.4 Nhân sinh khối nấm trên MT PDA để lây bệnh nhân tạo

3.5 Dịch bào tử của các chủng nấm NB 02; NB 03; NB 04 27

3.6 Các triệu chứng bệnh khi lây nhiễm nấm Collectotrichum

3.7 Hình ảnh ống giống của một số chủng xạ khuẩn có hoạt

3.8

Vòng vô khuẩn của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn XK 02

và XK 15 với nấm gây bệnh trên cây đậu xanh trên môi trường Gauze I

29

3.9 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XK 02 31

3.10 Hình ảnh ống giống của chủng xạ khuẩn XK 02 31

3.11 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XK15 31

3.12 Hình ảnh ống giống của chủng xạ khuẩn XK 15 31

3.13 Khả năng sinh enzym amylaza và xenlulaza của XK 02,

3.14 Phân lập các chủng Trichoderma trên môi trường PDA 33

3.15 Hình ảnh khuẩn lạc các chủng nấm Trichoderma sau 3 34

Số hiệu

ngày nuôi cấy trên môi trường giá đỗ

3.16 Khả năng đối kháng của một số chủng nấm Trichoderma

đối với nấm bệnh Fusarium sau 10 ngày nuôi cấy 36

3.17 Khả năng đối kháng của một số chủng nấm Trichoderma đối với nấm Collectotrichum sau 10 ngày nuôi cấy 37

3.18 Cuống sinh bào tử, bào tử và ống giống của chủng Tri 03 37

3.19 Cuống sinh bào tử, bào tử và ống giống của chủng Tri 07 37

3.20 Nhân giống xạ khuẩn trên môi trường A4-H tạo dịch cấp 1

3.21 Chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces sản xuất bằng phương

pháp lên men xốp trên môi trường trấu cám 39

3.22 Chế phẩm nấm Trichoderma sản xuất bằng phương pháp

lên men xốp sau 3 ngày và 5 ngày nuôi cấy 40

3.23 Khả năng đối kháng của chế phẩm đối với nấm bệnh gây

3.24 Khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma đốivới nấm bệnh Collectotrichum qua 3 và 4 ngày 43

3.25 Cây đậu xanh 15 ngày tuổi ở 4 công thức thí nghiệm 44

3.26 Nấm Collectotrichum xuất hiện ở xung quanh gốc cây đậu

xanh ở CT 2 sau 10 ngày lây nhiễm nấm bệnh 45

3.27 Biễu hiện bệnh trên cây đậu xanh ở CT2 sau 10 ngày lây

3.28 Cây đậu xanh ở CT 3, CT 4 sau 15 ngày lây nhiễm nấm

MỞ ẦU

1 LÝ DO C ỌN Ề T

Khi xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu của con người về lương thực, thực phẩm đảm bảo chất lượng càng được nâng cao và trở nên rất cấp thiết Sự tăng trưởng của hóa học nông nghiệp và thâm canh sản xuất đang thay đổi rất nhiều đến điều kiện môi trường sinh thái chúng ta đang sống Trước tình hình đó, biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại bằng phương pháp sinh học đã được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn Đáng chú ý là các nghiên cứu về một số loại vi sinh vật (VSV) có khả năng đối kháng với nấm bệnh trên cây trồng Vi sinh vật đối kháng không những ngăn chặn được một số bệnh hại trên cây mà còn không gây ảnh hưởng đến những loài thiên địch bản xứ trong tự nhiên và không gây ô nhiễm

môi trường Sự bảo tồn các loài thiên địch tự nhiên này là “chìa khóa” vững chắc

để phòng trừ sâu bệnh hại trên cây trồng an toàn và hiệu quả.Trong đó tác nhân

được chú ý là một số loại xạ khuẩn Streptomyces và nấm Trichoderma có khả năng

đối kháng với vi nấm gây bệnh trên cây trồng

Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm sinh học trong bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn và

nấm Trichoderma có khả năng chống nấm gây bệnh ở thực vật Tuy nhiên việc sử

dụng chế phẩm trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định

Cây đậu xanh (Vigna radiate L.) là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, đứng

hàng thứ ba sau đậu tương và lạc Cây đậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn, mỗi chu kỳ sinh trưởng kéo dài từ 60-90 ngày Mặt khác, yêu cầu kỹ thuật canh tác đơn giản, vốn đầu tư ít, thu hồi nhanh, có thể trồng nhiều vụ trong một năm nên được người dân lựa chọn để canh tác trên diện tích rộng Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng trong cải tạo và bồi đưỡng đất, cung cấp nguồn đạm sinh học quan trọng Quảng Nam có khí hậu nóng, mưa nhiều là điều kiện thích hợp cho việc trồng đậu xanh Tuy nhiên, sự phát triển mạnh của nấm gây bệnh đã làm ảnh hưởng đến

năng suất và chất lượng thu hoạch Do đó để khắc phục tình trạng trên, cần có những biện pháp sinh học phòng trừ bệnh để kiểm soát sự gây hại của chúng

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng

thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đối kháng với một số vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh (Vigna radiate L.) tại xã Điện Hồng – Điện Bàn - Quảng Nam”

2 MỤC T ÊU N ÊN CỨU

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma và xạ khuẩn

Streptomyces để tạo chế phẩm sinh học có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh

trên cây đậu xanh, làm cơ sở cho việc ứng dụng chế phẩm sinh học vào thực tiễn tại địa phương

3 NỘ DUN N ÊN CỨU

- Phân lập các chủng vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh tại xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam

- Phân lập, tuyển chon các chủng xạ khuẩn Streptomyces và nấm Trichoderma

có khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh tại xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam

- Lựa chọn môi trường thích hợp để tạo chế phẩm thô từ các chủng nấm

Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đã tuyển chọn

- Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm thô đối kháng với các chủng vi nấm gây

bệnh trên cây đậu xanh

4 Ý N ĨA K OA ỌC V T ỰC T ỄN CỦA Ề T

- Tuyển chọn và lưu giữ các chủng xạ khuẩn Streptomyces và nấm

Trichoderma có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây trồng phân lập tại xã

Điện Hồng - Đại Lộc- Quảng Nam

- Xác định một số môi trường thích hợp có hiệu quả cao để lên men tạo ra chế phẩm Góp phần tạo sản phẩm cải tạo đất, chống bệnh cho cây trồng ứng dụng tại địa phương

C ƢƠN 1 TỔN QUAN T L ỆU

1.1 SƠ LƢỢC VỀ X K UẨN

1.1.1 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu tạo tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh học khác nhau Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau như:

đỏ, da cam, vàng, nâu, tím, xanh … tùy thuộc vào loài và điều kiện môi trường Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài mặt môi trường thạch tạo thành hệ sợi khí sinh (HSKS) và hệ sợi cơ chất (HSCC) Phần cuối của HSKS thường biến thành cuống sinh bào tử có nhiều loại hình dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc đơn…

Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử với phương pháp phân đoạn hay cắt khúc, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que Hình dạng và kích thước cuống sinh bào tử, hình dạng, kích thước và bề mặt bào tử là một tiêu chuẩn quan trọng trong phân loại xạ khuẩn [21]

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn… khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau

1.1.2 Tình hình nghiên cứu CKS trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu CKS trên thế giới

Năm 2007 từ các mẫu đất tại phía đông nam Serbia đã phân lập được loài XK

Streptomyces hygroscopicus sinh CKS nhóm polyen có khả năng chống lại nấm Botrytis cinerea gây bệnh thối xám hại nho và kháng virus Herpes simplex Tại Hàn

Quốc phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin,

chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin, kháng được nấm gây bệnh trên thực vật

Năm 2008 từ 7 mẫu đất nông nghiệp ở Sarawak, Kuala Lumpur đã phân lập

được 62 XK thuộc chi Streptomyces trong đó có 37 chủng sinh CKS đối kháng với nhiều VSVKĐ: Fusarium palnivora, Bacillus subtilis, Ralstonia solanacerarum

Làm cơ sở để tạo ra các CKS kháng nấm với vi khuẩn, hướng tới một nền nông nghiệp sinh thái bền vững [25]

Năm 2011, tại Thái Lan đã phân lập được chủng XK Streptomyces cavurensis

từ đất ở vùng rễ cây trồng ức chế chống lại nấm Collectotrichum spp, tác nhân gây

bệnh thán thư Đã thu được 304 chủng XK trong đó có 202 chủng có hoạt tính KS chiếm 73% kháng được ít nhất một loại nấm mốc hoặc nấm men; 17,8% chống lại

3 loại nấm gây bệnh thán thư [43]

Mới đây nhất, tháng 01 năm 2012 tại Ấn Độ đã phân lập và xác định đến loài

XK Pseudonocardia azurea sp từ vùng đất trầm tích của các hệ sinh thái rừng

ngập mặn Ninzampatnam tại vùng ven biển phía nam của Andhra Pradesh Đây là chủng xạ khuẩn hiếm tiết ra CKS azureomycin A và B có hiệu quả chống nấm gây

bệnh trên phạm vi rộng [42]

1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu CKS ở Việt Nam

Trường Đại học Tổng Hợp Hà Nội (nay thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội), Đại học Sư Phạm Hà Nội đã nghiên cứu sự phân bố, sự lên men các chủng XK sinh CKS có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng từ đất Việt Nam Viện Khoa học Việt Nam

đã nghiên cứu sản xuất và khả năng ứng dụng của chế phẩm Biovit, Teravit, Baxitraxin vào chăn nuôi và bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp Trong nhiều năm qua Trường Đại học Dược và các Xí nghiệp Dược đã thực hiện hàng trăm các thí nghiệm lên men các CKS: Clotetraxillin, oxytetraxillin, erythromyxin, neomyxxin, dekamixin, fumajilin… đã thu được những kinh nghiệm nhất định về công nghệ sinh học và công nghệ kháng sinh [11]

Năm 2004, Kiều Hữu Ảnh đã xác định đến loài chủng xạ khuẩn Streptomyces

hygroscopius có khả năng sinh CKS chống các nấm gây bệnh trên thực vật:

F.oxysporum, Scierotifum tolfsii và bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng

1.1.3 Ứng dụng của CKS trong bảo vệ thực vật

Để khắc phục các nhược điểm trên do thuốc hóa học gây ra thì ngoài các biện pháp như thay đổi mùa vụ, thay đổi cơ cấu cây trồng, tuyển chọn các giống cây trồng có khả năng kháng lại sâu bệnh v.v… thì biện pháp sử dụng CKS đã và đang được nghiên cứu CKS có nhiều ưu điểm hơn so với thuốc hóa học như: có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao chỉ tiêu diệt một hoặc một số loài sâu nhất định nên không ảnh hưởng đến những VSV có ích khác Đồng thời, CKS có độ độc thấp, không gây ô nhiễm môi trường và đặc biệt là nó còn có khả năng ức chế cả những VSV đã kháng lại thuốc hóa học

Trong vòng vài chục năm trở lại đây, Nhật Bản đã sản xuất ở quy mô công

nghiệp 10 loại CKS chống bệnh ở thực vật như blastisidin từ xạ khuẩn S

griseochromogenes, kasugamixin từ S kusugaensis, validamixin từ S hygroscopicus Các CKS này có khả năng chống bệnh đạo ôn, khô vằn hại lúa rất

có hiệu quả, độ độc thấp Ở Anh và các nước Châu Âu khác đã sử dụng KS

griseofulvin, Ấn Độ sử dụng aureofunvin chống bệnh thối cổ rễ [25]

Tháng 1 năm 2003 khoa Bệnh học Thực vật Trường Đại học Quốc Gia Chung

Hsing ở Taichung Đài Loan đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces

padanus PMS-702 có khả năng sinh kháng sinh fungichromin Chất KS

fungichromin có khả năng kháng khuẩn mạnh tiêu diệt được Rhizotonia solani AG -

4, một tác nhân làm chết cây cải bắp khi bị ngập nước Nếu xử lý hạt cải bắp với

dịch lọc của chủng xạ khuẩn Streptomyces padanus PMS - 702 có tác dụng làm

giảm khả năng bị chết do ngập nước của cây cải bắp Nồng độ để kiềm chế tối thiểu của CKS này là 72 mg/ml, kiềm chế được hơn 90% [40]

Năm 2008, chế phẩm Antiforhis được Viện Công Nghệ Sinh Học- Bộ Nông Nghiệp – Phát triển nông thôn đã nghiên cứu và sản xuất bằng phương pháp lên men xốp thanh trùng trên nền giá thể dinh dưỡng Chế phẩm này có nguồn gốc từ 5

chủng vi sinh vật chọn lọc đối kháng nấm gây bệnh Pseudomonas fluorescens

chống bệnh héo vàng trên cây cà chua và lở cổ rễ cây bắp cải

1.2 K Á QUÁT VỀ NẤM TRICHODERMA

1.2.1 ặc điểm hình thái, sinh trưởng của nấm Trichoderma

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử

Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn, trong suốt hoặc có màu lục Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm [22]

Bào tử của hầu hết nấm Trichoderma có hình bầu dục, kích thước khoảng (3 –

5μm) x (2 – 4μm), rất hiếm khi bào tử của nấm này có hình cầu Vách bào tử trơn

láng, tuy nhiên ở một vài loài Trichoderma (như T viride) bào tử có vách xù xì như

có nhiều mụn cơm (Mecray, 2002) Tất cả các loài Trichoderma đều có khả năng

sinh bào tử áo (Chlamydospore) Bào tử áo có hình cầu méo và ở dạng đơn bào, tuy nhiên cũng có một số loài có khả năng hình thành nên các bào tử áo đa bào [38]

Kubicek và Harman đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng: tùy

từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau Trong đó, một số

loài Trichoderma đã được ứng dụng trong phòng trừ sinh học [30]

1.2.1.2 Sự sinh trưởng của nấm Trichoderma

Trichoderma có khả năng sử dụng nguồn hỗn hợp cacbon và nitơ Nguồn

cacbon và năng lượng Trichoderma sử dụng được là monosaccharit và disaccharit,

cùng với hỗn hợp polysaccgarit, purin, pyrinidin, axít amin, tanmin, andehit và axít hữu cơ Đặc biệt là axít béo, methanol methylamin và NH3 là nguồn đạm bắt buộc

phải có trong môi trường nuôi cấy Trichoderma [26]

1.2.2 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma

Cơ chế đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác được phân loại như

sau: kí sinh lên cơ thể của nấm bệnh (mycoparasitism), tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis), cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với nấm bệnh (competition for nutrient) Những cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối kháng thực tế có thể là một trong những loại cơ chế này Ví dụ, sự kiểm soát nấm

Botrytis cinerea (gây bệnh mốc xám) trên nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh

tranh dinh dưỡng và sự kí sinh lên hạch nấm, cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh [27], [28], [31], [36]

* Cơ chế ký sinh lên nấm bệnh

Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng kí sinh gồm 4 giai đoạn Giai đoạn 1, sự tăng trưởng có tính chất hướng hóa, trong giai đoạn này tác nhân kích thích hóa học

từ nấm gây bệnh hấp dẫn nấm đối kháng Giai đoạn 2, sự nhận dạng đặc hiệu, có lẽ trung gian bởi lectin trên bề mặt tế bào của cả tác nhân gây bệnh và nấm đối kháng

Giai đoạn 3, sự tấn công và xoắn vòng của sợi nấm Trichoderma xung quanh vật

chủ Giai đoạn 4, sự bài tiết các enzim phân giải vách tế bào chất Hệ enzim phân giải vách tế bào bao gồm chitinaza, glucanaza, proteaza [24]

* Cơ chế tiết chất kháng sinh

Các chủng Trichoderma sản xuất đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp dễ bay

hơi và không bay hơi, một vài chất loại này ức chế VSV khác mà không có sự

tương tác vật lí Chất ức chế được coi là chất kháng sinh Các chủng Trichoderma

sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi trường cũng tác động vào sự sản xuất

cả về chất lượng và số lượng Hơn nữa các kháng sinh đặc hiệu tác động vào các tác nhân gây bệnh khác nhau thì khác nhau [31]

Bên cạnh sự tác động qua lại trong quần thể giữa nấm đối kháng và nấm bệnh,

trong hoạt động sống nấm Trichoderma sản sinh ra các men phân hủy glucoza,

xenluloza làm chất hữu cơ có trong đất được phân hủy nhanh hơn tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt [15]

* Cơ chế cạnh tranh dinh dƣỡng và không gian sống

Sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng được xem như cơ chế hữu hiệu khi sử dụng

nấm Trichoderma trong kiểm soát nấm bệnh

Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đưa ra khái niệm cạnh tranh khai thác và cạnh tranh cản trở vào tương tác giữa quần thể nấm Sự cạnh tranh cản trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi VSV này giới hạn VSV khác tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tương tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác loài Sự cạnh tranh dinh dưỡng bao gồm: cạnh tranh cho mô hoại sinh, cho chất dịch

rỉ từ hạt và trên vị trí vết thương [31]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về nấm Trichoderma trên thế giới và ở Việt

Nam

1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1984, Hardar và ctv công bố nấm Trichoderma spp được sử dụng rộng rãi trong phòng trừ sinh học để quản lý bệnh hại do R solani gây ra Nấm

Trichoderma spp tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzim phân

hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây

trồng kháng lại bệnh Và cho rằng nấm Trichoderma spp sống ở rễ cây giúp biến

đổi vật chất vô cơ, giúp tăng cường khả năng sản xuất hóc môn ở cây trồng, làm tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng Khi dùng dịch huyền phù nấm

Trichoderma hazianum vào trong đất làm tăng sự nẩy mầm, tăng khả năng ra hoa,

tăng sinh khối và chiều cao cây bắp, ớt, hoa cúc, cà chua, thuốc lá Nòi T1290 của

nấm Trichoderma hazianum còn làm tăng số chồi và rễ cây bắp ngọt trong nhà lưới

66% so với đối chứng [32], [35]

Năm 2000, Okigbo và Ikediugw cho biết những loài Trichoderma spp có hệ

sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh học chống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch

1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam những nghiên cứu về sự phân bố của nấm Trichoderma chưa

nhiều, chủ yếu ở khu vực phía Nam

Năm 2005, Đinh Minh Hiệp nghiên cứu về enzym chitinaza và β-glucanaza từ

Trichoderma spp và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh

thực vật ở Viện Sinh học Nhiệt đới PGS.TS Phạm Thị Ánh Hồng và ThS Đinh Minh Hiệp ở khoa sinh, ĐH KHTN ĐHQG-HCM đã tiến hành đề tài “Điều tra khảo

sát sự phân bố của các chủng nấm Trichoderma tại TP Hồ Chí Minh và các tỉnh

Đông Nam Bộ” [10]

Gần đây nhất vào năm 2010, tại ĐBSCL đã sản xuất được hai dạng chế phẩm phân hủy rơm (dạng chế phẩm hoà tan trong nước và dạng chế phẩm không hoà tan

trong nước), mật số tồn tại của nấm Trichoderma của chế phẩm dạng bột hoà tan

trong nước mật số dao động từ 0,01 x 1012 đến 0,09 x 1012 và đối với chế phẩm dạng bột không hoà tan trong nước dao động từ 0,09 x 109 đến 420 x 1012 Xác định thời gian sử dụng chế phẩm tốt nhất trong vòng 3 tháng [4]

Năm 2011, Đào Thị Hồng Xuyến, Trương Trọng Ngôn, Dương Minh báo cáo

đề tài “Khảo sát sự đa dạng di truyền và khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase của

các chủng nấm Trichoderma có triển vọng trên đất trồng cam quít và dứa” ở Hội

thảo Quốc gia về Bệnh Hại Thực vật Việt Nam lần 10, Hà Nội, 20 - 22/7/11 [4]

1.2.4 Ứng dụng của nấm Trichoderma trong lĩnh vực bảo vệ thực vật

Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp được quan tâm

nhiều nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số

nấm gây bệnh ở thực vật Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại Trichoderma

spp khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau Kết quả là

Trichoderma spp kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau: Rhizoctonia spp.:

gây mục rễ, thân và hạt Pythium spp.: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây con;

Armillaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông; Botrytis cinerea: mốc xám gây

hỏng dâu và nho Phytophthora spp.:mục rễ, hỏng trái ở ca cao [19]

Hiện nay, các chủng nấm Trichoderma spp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thương mại, với thành phần chính là Trichoderma spp kiểm

soát có hiệu quả các nấm gây bệnh trên cây trồng Ở New Zealand, nhiều chủng

Trichoderma khác nhau được trộn chung để kiểm soát bệnh trên cây nho và các cây

dạng quả hạch Ở Mỹ, người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống

để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi trồng trọt [28]

Trong nước, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm

Trichoderma xử lí đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng

hoại mục trước khi bón ruộng 5 - 10 ngày, rồi rải trên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp [15]

1.3 K Á QUÁT VỀ NẤM BỆN ASPERGILLUS, FUSARIUM, RHIZOCTONIA, COLLECTOTRICHUM ÂY TRÊN RAU, MÀU

1.3.1 Khái quát về nấm bệnh Aspergillus

Giống Aspergillus có khoảng 200 loài trong tự nhiên, trong đó có các loài

Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae… có giá trị sử dụng trong

sản xuất enzim, rượu, axit hữu cơ… Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu

vào năm 1729 Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này

Vị trí phân loại: Thuộc lớp Deuteromyces, bộ Moniliales, họ Moniliaceace

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh bào tử thể bình phình lên rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu, màu nâu đen Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai; bào tử đính xòe, hình cầu xù xì, có gai nhọn, có màu nâu đen đến đen than

Nấm Aspergillus là nguyên nhân gây ra hư hại trái cây tươi sau thu hoạch như

táo, lê, đào, chanh, nho, dâu, xoài, lựu… Ngoài ra nó còn làm hư hại trái sake, hạt điều, các loại đâu đỗ, ngoài ra chúng còn sống bám trên đồ da, đồ gỗ

1.3.2 Khái quát về nấm bệnh Fusarium

Nấm Fusarium là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae, thuộc lớp

Hyphomycetes, nấm bất toàn Fungi imperfecti Loài nấm này gây hại nhiều loại cây

trồng trên tất cả các bộ phận đặc biệt bộ phận gốc, rễ của cây [9], [23]

Đặc điểm hình thái của nấm Fusarium là: hệ sợi nấm phân nhánh, có vách

ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già

Fusarium sinh sản vô tính bằng bào tử, có kiểu bào tử vô tính là bào tử đính

lớn, bào tử đính nhỏ và bào tử vách dày (hậu bào tử) Bào tử đính lớn dài, nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống bào tử, phân nhiều nhánh xếp thành tầng Đầu và cuối bào tử đính lớn thuôn nhọn Một vài loài bào tử lớn tách rời và không gắn trên cuống bào tử, những tế bào sinh bào tử lớn gọi là thể bình Bào tử

đính nhỏ thường đơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ một thể bình hay những cuống bào tử phân nhánh hoặc không phân nhánh và

thường được giữ trong một nhóm nhỏ Bào tử đính nhỏ của Fusarium rất giống bào

tử của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường được quy vào nấm

Cephalosporium Bào tử vách dày, hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận

cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả, chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi Hậu bào tử hay bào tử vách dầy rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài

1.3.3 Khái quát về nấm bệnh Rhizoctonia

Thuộc lớp Nấm Trơ (Mycelia Steliria); ở giai đoạn hữu tính là Thanatephorus

cucumeris thuộc lớp nấm Đảm, là loài nấm đa thực có phổ ký chủ rất rộng, ký sinh

trên các cây: lúa, ngô, khoai tây, thuốc lá, lạc, cà chua, cải bắp, đậu đỗ, bèo tây

Đặc điểm về hình thái: Nấm Rhizoctonia khi còn non có sợi nấm không màu,

khi trưởng thành có màu nâu vàng nhạt, có vách ngăn không liên tục (Ou, 1983) Trên mô ký chủ hoặc vách ống nghiệm nuôi cấy, sợi nấm đôi khi mọc ra những tế bào ngắn, phình to và phân nhiều nhánh

Theo Phạm Hoàng Oanh (1998), thời gian bắt đầu tạo hạch nấm nhanh nhất là sau khi nuôi cấy và chậm nhất là 240 giờ Hạch nấm bám sát vào mô nuôi cấy, bề mặt sần sùi, sợi nấm to, không màu, phân nhánh vuông góc

Khi chúng nhiễm vào cây sẽ gây ra các triệu chứng bệnh như: nấm bệnh tấn công vào phần gốc, thân gần mặt đất làm cây con héo rũ, phần gốc và rễ cây có vết bệnh màu nâu hơi đỏ Những nghiên cứu về sự sinh trưởng trong phòng thí nghiệm cho thấy, nấm rhizoctonia gây hại cho nhiều loại cây trồng khác nhau bao gồm: bông vải, củ cải, khoai tây, ngô, đậu đỗ và lúa mì

1.3.4 Khái quát về nấm bệnh Collectotrichum

Nấm Collectotrichum thuộc lớp nấm Deuteromycetes, bộ Melanconiales, họ

Melanconiaceae Collectotrichum được mô tả có 11 loài (von Arx,1957; Sutton,

1973) Theo ý kiến gần nhất của Baxter và cộng sự (1985), Collectotrichum được giới thiệu có 21 loài: C coccodes, C dematium, C gloeosporioides, C graminicola, C

falcatum và C capsici… là những loài thường gây bệnh thán thư [2]

Collectotrichum có hệ sợi nấm nội sinh, sợi nấm mảnh, phân nhánh, không

màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào; nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm, khi chín sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng [2]

Nấm Collectotrichum chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát

triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử Cụm cuống bào tử

có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh [2]

Những bệnh do nấm Aspergillus, Fusarium, Rhizoctonia và Collectotrichum

gây ra rất phổ biến ở nước ta và trên thế giới, gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp và nền kinh tế đất nước Vì vậy, biện pháp ngăn chặn và hạn chế 4 loại nấm bệnh này hoạt động gây bệnh trên đồng ruộng là rất cần thiết

1.4 TỔN QUAN VỀ CÂY ẬU XAN

Cây đậu xanh có nguồn gốc từ Trung Á, được trồng ở nhiều nơi trên thế giới như Mỹ, Úc và nhiều nước Châu Á Ở nước ta cây đậu xanh được xác định là một trong những cây trồng họ Đậu quan trọng, về giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị về kinh tế của nó Đậu xanh được trồng tập trung ở các tỉnh phía Nam, một ít ở phía Bắc và duyên hải Trung Bộ [14]

Đặc điểm nổi bật của cây đậu xanh là về giá trị dinh dưỡng, hàm lượng protein cao chiếm 20 - 40 % trọng lượng khô của hạt, chứa đầy đủ các axitamin không thay thế Ngoài ra hạt còn chứa các chất dinh dưỡng khác như lipit 2,4 %, các chất khoáng (Ca, Fe, P, Na, Mg, K ) 3,5 %, các vitamin 0,03%

Về thực phẩm, hạt đậu xanh là nguồn nguyên liệu quan trọng trong ngành chế biến thực phẩm như sản xuất bột đậu, bột dinh dưỡng, làm giá đỗ, làm nguyên liệu chế biến bánh kẹo

Về y học, đậu xanh là vị thuốc giải nhiệt, mát gan bổ thận

Đối với nông nghiệp, cây đậu xanh có vai trò tích cực trong việc cải tạo đất sau mỗi vụ trồng cây họ Đậu để lấy hạt, đất được giàu thêm một lượng lớn nitơ dễ

sử dụng nhờ vi khuẩn sống cộng sinh cố định nitơ ở rễ cây

Như vậy, trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp ở nước ta cây đậu xanh có giá trị về nhiều mặt, trong tương lai sẽ được mở rộng diện tích gieo trồng trên cả nước

1.5 VỊ TRÍ ỊA LÝ V ỀU K ỆN TỰ N ÊN XÃ ỆN ỒN - B - QN 1.5.1 Vị trí địa lý

Điện Hồng là xã đồng bằng thuộc về phía Tây của huyện Điện Bàn, nằm trên tuyến ĐT 609 (Vĩnh Điện đi đường Hồ Chí Minh (Nam Giang), cách thị trấn Vĩnh Điện 12 km, ranh giới hành chính được xác định:

- Phía Đông giáp : xã Điện Thọ

- Phía Tây giáp : thị trấn Ái Nghĩa, xã Đại Hòa

- Phía Nam giáp : xã Điện Quang

- Phía Bắc giáp : xã Điện Tiến

1.5.2 iều kiện tự nhiên

- Địa hình, địa mạo

Xã có địa hình tương đối bằng phẳng, ít chia cắt, hướng dốc chính từ Tây sang Đông theo dòng chảy của sông Thu Bồn và sông Bình Phước Do vậy diện tích đất sản xuất nông nghiệp trên địa bàn xã tập trung, nhiều cánh đồng rộng lớn, năng suất cao và ổn định

Tổng số giờ nắng trung bình trong năm là 2.371 giờ, tập trung từ tháng 2 đến tháng 8 hàng năm Các tháng có giờ nắng nhiều nhất là 4, 5, 6, 7, các tháng có giờ nắng ít nhất 9, 10, 11, 12

Nhìn chung, xã nằm trong khu vực có kiểu khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, có hai mùa rõ rệt Với kiểu khí hậu thời tiết này sẽ thuận lợi cho việc phát triển nhiều loại cây trồng Tuy nhiên, cũng có nhiều bất lợi cho việc bố trí mùa vụ sản xuất, dịch bệnh xảy ra nhiều là những hạn chế cần quan tâm để khắc phục

- Các nguồn tài nguyên đất: Trên địa bàn xã có một số nhóm đất chính sau:

Đất phù sa sông được bồi: diện tích 543,04 ha, chiếm 35,06 % tổng diện tích

tự nhiên Đất có thành phần cơ giới thịt nặng, thịt nhẹ, thịt trung bình tầng dày trên

100cm, đang sản xuất lúa và cây hoa màu Phân bố tập trung ở thôn 3 và thôn 5 dọc theo sông Thu Bồn và sông Bình Phước

Đất phù sa không được bồi: diện tích 356 ha, chiếm 22,98 % tổng diện tích,

phân bố tập trung ở các khu vực thôn 6, thôn 7 và thôn 8 Loại đất này ở địa hình cao hơn, tầng dày trên 100 cm thành phần cơ giới từ thịt nặng đến trung bình và thịt nhẹ hiện đã được khai thác sử dụng để sản xuất nông nghiệp, năng suất cây trồng ổn định và có chiều hướng gia tăng

Đất phù sa Glây: diện tích 471,35 ha, chiếm 30,43 % tổng diện tích, phân bố ở

khu vực các thôn 1, thôn 2, thôn 4, thôn 9, thôn 11 và dọc theo tỉnh lộ ĐT 609 đoạn Đồng Tứ đi Vĩnh Điện Thành phần cơ giới từ thịt nhẹ đến trung bình, thích hợp cho việc trồng các loại hoa màu, lúa

Cồn cát và bãi cát trắng vàng: diện tích 45,38 ha, chiếm 3,25 % tổng diện

tích, đất cồn cát thường phân bố liền dãi dọc theo bờ sông Thu Bồn

C ƢƠN 2

P ƢƠN P ÁP N ÊN CỨU

2.1 Ố TƢỢN N ÊN CỨU

2.1.1 Xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn Streptomyces được phân lập các mẫu đất tại xã Điện

Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam

trên cây đậu xanh bị bệnh tại xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam

2.1.3 Cây đậu xanh (Vigna radiate L.)

2.2 ỊA ỂM, P M V V T Ờ AN N ÊN CỨU

2.2.1 ịa điểm thu mẫu ngoài thực địa

Tiến hành lấy mẫu nghiên cứu tại xã Điện Hồng – Điện Bàn - Quảng Nam

2.2.2 ịa điểm và phạm vi nghiên cứu thí nghiệm

* Địa điểm nghiên cứu thí nghiệm

Phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh của khoa Sinh - môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng

* Phạm vi nghiên cứu

- Phân lập các chủng vi nấm gây hại chính trên cây đậu xanh

- Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có khả năng sinh

CKS chống vi nấm gây bệnh trong đất tại xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam

- Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với

nấm gây bệnh ở thực vật trong đất tại xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam

- Lên men tạo chế phẩm sinh học từ nấm và xạ khuẩn trên môi trường bán rắn

- Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và xạ khuẩn

Streptomyces đến khả năng đối kháng nấm Collectotrichum gây bệnh thán thư trên

cây đậu xanh

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2012 đến tháng 05/2013

2.3 P ƯƠN P ÁP N ÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa

- Nguyên tắc lấy mẫu đất: mẫu được lấy theo phương pháp lấy điểm theo đường chéo, ở tầng đất từ 5 – 15cm ở các vị trí khác nhau (4 - 5 vị trí) trong một vùng 100m2 Sau đó các mẫu đất đem trộn đều, đựng trong túi nilông đã khử trùng

- Xử lý đất tại chỗ: thực vật, động vật sống trong đất và đất sỏi được loại bỏ trước khi rây qua rây cỡ lỗ 2mm để tạo thuận lợi cho sự trao đổi khí giữa các hạt đất Đất được bóp vụn bằng tay và đảo đều để tránh lớp đất bề mặt bị quá khô (công việc được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ không đổi xung quanh)

- Lưu giữ, vận chuyển và bảo quản mẫu: thắt túi hơi lỏng để tạo điều kiện hiếu khí Mẫu đất không để chồng lên nhau Mẫu đất đem về được phân lập ngay, càng sớm càng tốt hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở 4ºC

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

2.3.2.1 Phương pháp phân lập

* Phân lập xạ khuẩn Streptomyces và nấm Trichoderma

Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorov: xạ khuẩn được

phân lập trên môi trường Gauze I; Trichoderma trên môi trường PDA

- Cách tiến hành: Cân 1 gam mẫu đất đem nghiền, cho vào bình tam giác

250ml chứa 99ml nước cất vô trùng, lắc đều được độ pha loãng 10-2 Hút ra 1ml cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước vô trùng, lắc đều ta có độ pha loãng 10-3 Và tiếp tục cho đến độ pha loãng 10-6 Dùng pipet vô trùng hút ở mỗi độ pha loãng 0,1ml dịch mẫu và nhỏ vào hộp petri có chứa môi trường phân lập vô trùng, dùng que trang dàn đều trên mặt thạch Mỗi độ pha loãng cấy trên 3 đĩa petri, gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C Sau 5 – 7 ngày nuôi cấy, chọn

những khuẩn lạc riêng rẽ, mọc tốt, cấy truyền sang thạch nghiêng chứa cùng môi

trường phân lập đến khi thuần chủng [6]

* Phân lập mẫu bệnh cây [3], [12], [18]

- Phân lập từ lá, thân, rễ

Rửa mẫu lá, thân, rễ trong nước, khử trùng bề mặt mô lá hoặc thân, rễ bằng cách nhúng nhanh lá vào cồn 70% trong 5 giây, rửa lại trong nước cất vô trùng và

để khô trên giấy thấm vô trùng Sau đó dùng kéo cắt thành từng đoạn nhỏ 2 x 2mm

từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, tiến hành cấy mẫu trên môi trường

WA Đặt các đĩa petri đã cấy mẫu bệnh trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C trong 2 - 3 ngày

để cho sợi nấm phát triển trên môi trường Khi nấm bệnh đã mọc, cấy chuyền sang môi trường PDA

- Phân lập nấm bệnh cây từ đất:

Tương tự như phân lập xạ khuẩn và nấm Trichoderma

2.3.2.2 Phương pháp giữ giống

Để bảo quản giống cho những nghiên cứu tiếp theo, tiến hành cấy truyền định

kỳ 2 tháng 1 lần trên môi trường thạch nghiêng Nuôi cấy ở tủ ấm 28 - 300C trong 2

- 7 ngày, sau đó để vào tủ lạnh bảo quản ở 40C Trước khi mang ra sử dụng cần cấy truyền qua ống nghiệm mới đã có sẵn môi trường [6]

2.3.2.3 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh

* Phương pháp khối thạch

Cấy xạ khuẩn trên môi trường Gauze I; Gauze II, ISP – 4 trong hộp petri sau 5

– 7 ngày, khi xạ khuẩn mọc tốt, dùng khoan nút chai khoan các khối thạch đặt vào hộp petri đã cấy VSV kiểm định Để vào tủ lạnh từ 5 – 7 giờ cho KS kịp khuếch tán rồi nuôi cấy ở nhiệt độ 28 – 30◦C Đọc kết quả sau 3 ngày Hoạt tính kháng nấm được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn (D-d; mm)

* Phương pháp đục lỗ

Dùng để thử hoạt tính kháng sinh trong dung dịch Dùng khoan nút chai khoan các lỗ trên bề mặt môi trường đã trộn VSVKĐ ở hộp petri Nhỏ vào các lỗ khoan dung dịch cần thử kháng sinh Các bước tiến hành theo giống phương pháp khối thạch[6]

2.3.2.4 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học

* Đặc điểm nuôi cấy

Cấy xạ khuẩn trên 6 môi trường MT Gauze I, MT Gauze II, Czapek tinh bột, Czapek nguyên gốc, Saccaroza và ISP-4, nuôi cấy ở nhiệt độ 28 - 30ºC Sau 7, 14,

21 ngày đem ra quan sát khả năng sinh trưởng, màu sắc khuẩn lạc, sắc tố tiết ra môi trường theo phương pháp Shirling và Gottlieb [39], so với bảng màu của Bondarsev, Tresner và Backus [41]

* Đặc điểm hình thái

- Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh:

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gauze I, Gauze II, Czapek tinh bột, Czapek nguyên gốc, Saccaroza, ISP-4, nhiệt độ nuôi cấy 28 - 30°C, sau thời gian 7,

14, 21 ngày quan sát màu sắc của HSKS và HSCC Dựa theo tài liệu Gauze và cộng

sự [29], Krasilnikov [34], xác định màu sắc dựa theo bảng màu của Bondarsev, Tresner và Backus [41]

- Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất

Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Tresner và Backus (1961) [41], của Bondarsev

- Phương pháp xác định khả năng sinh amylaza và xenlulaza

Sử dụng phương pháp khối thạch bằng cách đục lỗ, nhỏ dịch lên men rồi đo vòng phân giải (D - d, mm), D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ khoan Đối với CMC và tinh bột hiện bằng thuốc thử lugol

2.3.2.5 Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp chất KS

Nhằm lựa chọn môi trường lên men thích hợp để xạ khuẩn có khả năng sinh

tổng hợp các CKS cao nhất Sử dụng 4 môi trường lên men Gauze I, Gauze II, ISP-

4, A- 4H Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được lên men trong các môi trường dịch thể trên Nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 - 30°C Lấy mẫu định kỳ sau 2, 3, 4, 5 ngày, xác định hoạt tính chất kháng sinh và các thông số lên men nhằm lựa chọn chủng và môi trường lên men thích hợp [6]

2.3.2.6 Phương pháp thử tính đối kháng của nấm Trichoderma đối với các chủng nấm gây bệnh [16]

- Môi trường thử tính đối kháng (môi trường giá đỗ)

- Cách tiến hành: rót môi trường nước giá đỗ vào đĩa petri, để nguội và kiểm

tra nhiễm tạp sau 24 giờ Kẻ 1 đường ở giữa đĩa petri Cấy nấm Trichoderma và 1

trong 2 chủng nấm bệnh đã chọn trên 2 điểm đối xứng nhau trên đường vừa kẻ như hình 2.1

Hình 2.1 Cách cấy nấm Trichoderma và nấm bệnh trên đĩa petri

Thí nghiệm được thực hiện với 2 công thức:

CT1: TR và NB cấy đồng thời; CT2: NB cấy cấy độc lập (đối chứng)

Mỗi công thức được thực hiện với 3 lần lặp lại, mỗi đĩa petri là một công thức,

ủ ở nhiệt độ 25oC Theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển của Trichoderma và

chủng nấm gây bệnh

- Chỉ tiêu theo dõi: bán kính khuẩn lạc nấm bệnh theo thời gian

- Quy ước về khả năng đối kháng của Trichoderma đối với các chủng nấm

bệnh [20]: sau khi tiến hành thử đối kháng, theo dõi các đĩa đã cấy cho đến khi hai

khuẩn lạc của Trichoderma và nấm bệnh tiếp xúc nhau

2.3.2.7 Phương pháp tạo chế phẩm [16]

* Chế phẩm xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy được nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở nhiệt

độ 30°C trong môi trường A4-H, sau 4 ngày được giống cấp 1, nhân tiếp trên môi trường A4-H trên với 1 % giống cấp 1, sau 4 ngày được giống cấp 2 Tiếp tục lên men rắn trên môi trường trấu : cám : nước với tỉ lệ 1 : 1 : 2 với 10% giống cấp 2 Sau 3 ngày đem sấy khô, nghiền bột

ình 2.2 Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm xạ khuẩn

Streptomyces

* Chế phẩm Trichoderma

Các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh đối với nấm

Fusarium và Colletotrichum trên môi trường giá đỗ, trong điều kiện phòng thí

nghiệm được sử dụng để lên men xốp tạo chế phẩm

- Môi trường lên men xốp: có thành phần theo tỉ lệ: 15g cám; 15g trấu

- Cách tiến hành: cân thành phần cơ chất theo đúng tỷ lệ, cho thêm vào 15ml nước cất, khử trùng các loại cơ chất ở nhiệt độ 120oC, áp suất 1atm, trong thời gian

30 phút Sử dụng các hộp xốp kích thước 15cm x 20cm để chứa sản phẩm lên men

Cắt 10 khoanh thạch (đường kính 0,5cm) nấm Trichoderma được chọn nghiền nát

cho vào môi trường và trộn đều Ủ các hộp xốp trong phòng kín cho đến khi bào tử nấm mọc xanh đầy mặt hộp đem đi sấy khô ở nhiệt độ 30oC cho đế khi độ ẩm còn khoảng 12% cho vào máy xay nhuyễn và để vào bao ni lông giữ ở nhiệt độ phòng (25oC)

=>

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma

2.3.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo xác định chủng nấm gây bệnh

Chúng tôi sử dụng phương pháp lây bệnh nhân tạo theo Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero và Phan Thúy Hiền (2009) [3]

- Chuẩn bị sinh khối nấm bệnh:

Lắc tiếp tục trong MT trên với 1% giống cấp

1  giống cấp 2

10% giống cấp 2 lên men trên MT rắn  sấy, nghiền bột

+ Ngâm hạt thóc trong nước sạch khoảng 12 - 14 giờ để hạt thóc ngấm nước Chắt bỏ phần nước, vớt thóc ra Sau đó luộc chín sao cho độ nở hạt thóc khoảng 1/3, kiểm tra không còn lõi trắng ở giữa là đạt yêu cầu Để thóc nguội và cho vào bình tam giác, làm nút bông và hấp thanh trùng ở chế độ nhiệt 1210C/1,5 - 2giờ Cấy nấm bệnh vào môi trường hạt đã chuẩn bị ở trên, nuôi sinh khối nấm bệnh ở 25

- 300C trong thời gian 7 ngày, trộn sinh khối nấm bệnh vào đất và chuẩn bị lô đối chứng: không trộn sinh khối nấm bệnh vào đất

- Kiểm tra và so sánh những cây được lây bệnh với những cây đối chứng Quan sát, ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng được quan sát được trên đồng ruộng

2.3.4 ánh giá hiệu quả phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh

2.3.4.1 Trong phòng thí nghiệm trên đĩa petri

a Chế phẩm xạ khuẩn

Chuẩn bị môi trường A4-H dịch thể, hấp khử trùng 121oC trong 15 phút, để nguội, cho vào bình tam giác 250ml, mỗi bình 150ml, sau đó cho chế phẩm dạng bột vào, mỗi bình 10g Tiếp tục cho các bình môi trường lên máy lắc, nuôi trong điều kiện bình thường nhiệt độ từ 28 - 30oC trong 5-7 ngày Tiến hành lọc dịch nuôi cấy bằng bông thấm nước đã khử trùng, thử hoạt tính với vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh bằng phương pháp dục lỗ

b Chế phẩm nấm Trichoderma:

+ Nguyên tắc: lên men xốp thu nhận chế phẩm dạng bào tử đính có khả năng chống lại các loại nấm gây bệnh hại cây trồng Sau đó thử nghiệm khả năng chống các loại nấm bệnh trên môi trường tốt nhất

Chuẩn bị môi trường đối kháng (giá đỗ), hấp khử trùng 121oC trong 15 phút,

để nguội 50 - 60oC rồi đổ 20ml vào đĩa peptri vô trùng có kích thước bằng nhau (10cm) Các đĩa đối chứng: nấm bệnh được cấy một chấm ở giữa đĩa peptri Các đĩa thí nghiệm: nấm bệnh được cấy một chấm ở giữa đĩa peptri Sau 1 ngày, lấy chế

phẩm Trichoderma rắc đều xung quanh và cách nấm bệnh khoảng 0,5 cm Mỗi công

thức nhắc lại 3 lần Các đĩa đối chứng và thí nghiệm đươc nuôi ở nhiệt độ 25 -

30oC Quan sát đường kính khuẩn lạc nấm bệnh sau 24, 48, 72, 96, 120 giờ sau khi rắc chế phẩm

2.3.4.1 Trên cây đậu xanh:

Thí nghiệm được tiến hành theo 4 công thức:

CT 1: Hạt giống đậu xanh + Đất + Môi trường lên men xốp

CT 2: Hạt giống đậu xanh + Đất + Nấm bệnh

CT 3: Hạt giống đậu xanh + Đất + Chế phấm XK + Nấm bệnh

CT 4: Hạt giống đậu xanh + Đất + Chế phẩm Trichoderma + Nấm bệnh

+ Phương pháp tiến hành:

Cho đất vào thùng xốp(25kg/thùng), đập nhỏ, trộn đều với chế phẩm xạ khuẩn

Streptomyces ở công thức 3 và chế phẩm nấm Trichoderma ở công thức 4, cung cấp

ẩm độ cho nấm phát triển Tiến hành gieo hạt, hạt đậu xanh được gieo thành hàng trên chậu (50 hạt/ thùng) Sau khi gieo 15 ngày (cây đậu xanh xuất hiện 2 – 3 lá

thật), tiến hành chủng nấm Collectotrichum (gây bệnh thán thư) đã được nhân sinh

khối trên môi trường PDA vào công thức 2, công thức 3 và công thức 4, vị trí chủng bệnh cách gốc 0,5cm và sâu 0,5cm dưới mặt đất, cung cấp ẩm độ thường xuyên cho nấm bệnh phát triển

Quan sát mức độ gây hại trên cây đậu xanh con tại thời điểm 5, 10 và 15 ngày sau lây nhiễm nấm bệnh

+ Chỉ tiêu theo dõi: ghi nhận tỉ lệ cây bệnh, tỉ lệ cây chết trên cây đậu xanh con tại thời điểm 5, 10 và 15 ngày sau khi chủng nấm bệnh

+ Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Giai đoạn 1: (Khi chưa lây chủng nấm bệnh)

Hình 2.4: Mô hình bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 1

Tri

Chế phẩm

XK

Giai đoạn 2: (Sau khi lây chủng nấm bệnh)

Hình 2.5: Mô hình bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 2 2.3.5 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu trong luận văn được xử lí bằng xác suất thống kê