Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học của hợp chất tanin từ lá chè xanh ở hòa sơn, hòa vang, thành phố đà nẵng

Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học của hợp chất tanin từ lá chè xanh ở Hòa Sơn, Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng.. Hiện nay, một số công trình khoa học công bố vi

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Ở HÒA SƠN, HÒA VANG, TP ĐÀ NẴNG

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hồng Chương Giáo viên hướng dẫn: Th.S Võ Kim Thành

Lớp : 09CHD

Đà Nẵng, 5/2013

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc KHOA HÓA **************

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Hồng Chương

Lớp: 09CHD

1 Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học của hợp

chất tanin từ lá chè xanh ở Hòa Sơn, Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

2 Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất

- Nguyên liệu: lá chè xanh thu nhận từ Hòa Sơn, Hòa Vang, TP Đà Nẵng

- Dụng cụ và thiết bị:

+ Máy đo sắc kí lỏng cao áp kết nối khối phổ

+ Các dụng cụ thông thường: phễu chiết, bình tam giác, nồi cách thủy

- Hóa chất: etylaxetat, cloroform, ete dầu hỏa

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định một số chỉ số vật lí của nguyên liệu như độ ẩm, hàm lượng tro

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết như thời gian, nhiệt độ,

tỷ lệ rắn-lỏng, tỷ lệ etanol-nước

- Nghiên cứu thiết lập quy trình chiết tách tanin từ lá chè xanh

- Xác định thành phần hóa học của hợp chất tanin từ lá chè xanh

4 Giáo viên hướng dẫn: Th.S Võ Kim Thành

5 Ngày giao đề tài: 10/2012

ThS Võ Kim Thành Nguyễn Thị Hồng Chương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô trong khoa Hóa- trường Đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô đã dìu dắt tôi trong suốt bốn năm qua, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Võ Kim Thành- Thạc sĩ Khoa học Hóa học đã hướng dẫn nhiệt tình cho tôi trong suốt quá trình làm khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất về hóa chất và thiết bị để tôi hoàn thành khóa luận

Do thời gian và sự hiểu biết còn hạn chế nên chắc chắn khóa luận này còn nhiều sai sót, rất mong nhận được sự góp ý chân thành của các thầy

cô và các bạn sinh viên

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 10

1.1 Giới thiệu chung về cây chè 10

1.1.1 Đặc tính hình thái và sinh học cây chè 10

1.1.2 Phân lo ại thực vật cây chè 11

1.1.3 Thành phần hóa học và đặc điểm sinh hóa của cây chè 12

1.2 Tanin 17

1.2.1 Khái niệm chung 17

1.2.2 Phân lo ại 17

1.2.3 Tính chất cơ bản của polyphenol thực vật 20

1.2.4 Vai trò của polyphenol 21

1.3 Một số phương pháp chiết tách hợp chất hữu cơ 24

1.3.1 Phương pháp chưng cất 24

1.3.2 Phương pháp chiết 25

1.3.3 Phương pháp kết tinh 25

1.3.4 Phương pháp sắc ký 26

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ THỰC NGHIỆM 27

2.1 Nguyên liệu 27

2.1.1 Lá chè 27

2.1.2 Tìm hiểu gieo trồng, chăm sóc và thu ho ạch 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Phương pháp trực quan 29

2.2.2 Phương pháp phân tích trọng lượng 29

2.2.3 Phương pháp vật lí xác định một số thành phần và cấu trúc hóa học trong mẫu tanin chè 32

2.4 Chiết tách tanin từ lá chè xanh 33

2.4.1 Xây dựng quy trình chiết tách tanin 33

2.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tanin từ lá chè xanh 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Một số chỉ tiêu hóa lí 39

3.1.1 Độ ẩm 39

3.1.2 Hàm lượng tro 39

3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chiết tách 40

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian 40

3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ rắn-lỏng 41

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 43

3.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước:etanol 44

3.5 Xác định thành phần hóa học của dịch chiết bằng sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ 46

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của cây chè 12

Bảng 1.2 Hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1000g chất khô 16

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm nguyên liệu khô 39

Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng tro của nguyên liệu 39

Bảng 3.3 Mật độ quang với thời gian khác nhau (λmax= 277nm) 40

Bảng 3.4 Mật độ quang với tỷ lệ rắn-lỏng khác nhau (λmax= 276nm) 42

Bảng 3.5 Mật độ quang với nhiệt độ khác nhau (λmax= 277nm) 43

Bảng 3.6 Mật độ quang với tỷ lệ nước:etanol khác nhau (λmax= 278nm) 44

Bảng 3.7 Các hợp chất tanin trong lá chè xanh 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ chiết tách tanin từ lá chè xanh 35

Hình 2.2 Loại cafein bằng cloroform 31

Hình 2.3 Chiết tanin bằng etylaxetat 36

Hình 2.4 Chiết kiệt tanin 31

Hình 2.5 Tanin sau khi cô cạn etylaxetat 37

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian 40

Hình 3.2 Phổ hấp phụ phân tử của dịch chiết chè với thời gian khác nhau 41

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỷ lệ rắn-lỏng 42

Hình 3.4 Phổ hấp phụ phân tử của dịch chiết chè với tỷ lệ rắn-lỏng khác nhau 42

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nhiệt độ 43

Hình 3.6 Phổ hấp phụ phân tử của dịch chiết chè với nhiệt độ khác nhau 44

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang tỷ lệ nước:etanol 45

Hình 3.8 Phổ hấp phụ phân tử của dịch chiết chè với tỷ lệ nước:etanol khác nhau 45

Hình 3.9 Kết quả sắc ký HPLC-MS 46

MỞ ĐẦU

Từ xưa đến nay, con người đã biết đến chè không chỉ như một loại thức uống mà còn được dùng để phòng và chữa một số bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh về tim mạch và ung thư Bên cạnh đó, khả năng chống béo phì trên người của hợp chất catechin trong trà cũng được nghiên cứu và chứng minh Hiện nay, trên thực tế cũng có nhiều sản phẩm có sử dụng hay

bổ sung các chất trích li từ trà mà chủ yếu là các hợp chất polyphenol với nhiều mục đích khác nhau như tạo hương, diệt khuẩn, chống oxi hóa

Do đó, việc trích li các hợp chất polyphenol từ chè sẽ giúp nâng cao giá trị thương mại của cây chè Đồng thời góp phần không nhỏ vào việc giữ gìn và bảo vệ sức khỏe con người Việt Nam là một nước có diện tích trồng chè chiếm thị phần tương đối lớn và ngày càng gia tăng trong thị phần sản lượng chè thế giới Tuy nhiên, các sản phẩm chè của nước ta hiện nay chủ yếu vẫn là các sản phẩm truyền thống như trà đen, trà ô long, trà xanh hay sản phẩm trà túi lọc, trà ướp hương , còn các sản phẩm sử dụng polyphenol rất ít thấy

Ngoài ra, từ lâu, người ta đã sử dụng tanin trong các ngành thuộc da, công nghiệp nhuộm và cả trong y học[9] Hiện nay, một số công trình khoa học công bố việc sử dụng tanin được chiết tách từ một số loài thực vật để làm chất ức chế xanh, thân thiện với môi trường trong chống ăn mòn kim loại nhằm thay thế các chất ức chế truyền thống gây ô nhiễm môi trường như cromat, photphat.[16][17][18]

Ở nước ta, việc nghiên cứu chiết tách tanin chưa nhiều và chưa đầy

đủ Một số công trình chủ yếu tập trung vào nghiên cứu chiết tách tanin cho công nghiệp nhuộm, y học[2] Vì vậy, việc nghiên cứu chiết tách tanin từ chè để ứng dụng làm chất ức chế xanh chống ăn mòn kim loại sẽ có ý nghĩa lớn về mặt khoa học và thực tiễn

Việc tìm ra những phương pháp chiết tách mới hay đi sâu vào nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách từ một phương pháp cụ thể sẽ góp phần nâng cao khả năng và hiệu quả chiết tách các hợp chất polyphenol trong chè Tuy nhiên, do thời gian và điều kiện thí nghiệm,

đề tài khóa luận tốt nghiệp này được tiến hành trong phạm vi khảo sát một

số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thu polyphenol từ lá chè tươi bằng phương pháp chiết tách với dung môi hữu cơ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây chè

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis, có nguồn gốc ở khu vực Đông Nam Á Ngày nay, nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Đây là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thường được xén tỉa để thấp hơn 2 mét khi được trồng để lấy lá Nó có rễ cái dài Hoa của nó màu trắng ánh vàng, đường kính từ 2.5–4 cm, với 7-8 cánh hoa Hạt của nó có thể ép

để lấy dầu.[1]

1.1.1 Đặc tính hình thái và sinh học cây chè [8]

Thân và cành: cây chè có thân thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và chồi Tùy theo chiều cao, kích thước của thân

và cành mà cây chè được chia thành ba loại: cây bụi, cây gỗ nhỏ và cây gỗ vừa Thân cành và lá tạo thành tán cây chè; tán chè để mọc tự nhiên có dạng vòm đều Có thể nói tán lá là một tiêu chuẩn quan trọng để chọn giống chè Với những cây chè có tán lá to, rộng thì cây có điểm sinh trưởng nhiều, cho búp nhiều và sản lượng cao

Hoa chè: hoa chè bắt đầu nở khi chè đạt 2-3 tuổi Hoa mọc từ chồi sinh thực ở nách lá Cây chè là một loại thực vật có hoa lưỡng tính, tràng hoa có 5-9 cánh màu trắng hay phớt hồng Bộ nhị đực của hoa có 100-400 cái, trung bình có 200-300 cái Các bao phấn của hoa chè gồm hai nửa bao, chia làm bốn túi phấn Hạt phấn có hình tam giác, màu vàng nhạt, khi chín chuyển sang màu vàng kim

Qủa chè: quả chè có 1-4 hạt, hình tròn, tam giác hoặc hình vuông Quả chè thường mọc thành từng chùm ba, ban đầu có màu xanh của chồi

Khi tăng trưởng, quả chè cứng dần, chuyển sang màu nâu và nứt ra Hạt bên trong quả có thể dùng để gieo trồng

Lá chè: mọc cách nhau trên cành, mỗi đốt có một lá Hình dạng và kích thước của lá chè thay đổi theo từng giống Với giống chè Trung Quốc thì lá dài 4-14cm, rộng 2-2.5cm, có màu xanh nhạt và bóng Còn với chè Assam thì lá chè dài 8-20cm, rộng khoảng 3.5-7.5cm, mỏng và mềm Có thể nói lá chè là một bộ phận quan trọng trong việc khai thác cây chè và được ứng dụng trong việc chế biến các sản phẩm chè thương mại như chè xanh, chè đen và các loại thực phẩm thương mại khác

Hình 1.1 Búp chè Hình 1.2 Hoa chè

1.1.2 Phân loại thực vật cây chè [8]

Năm 1753, Carl Von Linné, nhà thực vật học người Thụy Điển đã thu thập, phân loại các mẫu chè giống ở Trung Quốc, và lần đầu tiên đặt tên khoa học cây chè là Thea sinensis, phân thành 2 giống chè: chè đen (Thea bohea ) và chè xanh (Thea viridis )

Trải qua nhiều tranh luận, tên cây chè cuối cùng đã thống nhất là Camellia

sinensis, xếp trong phân loại thực vật:

- Ngành hạt kín : Angiospermae

- Lớp hai lá mầm : Dicotyledonea

- Bộ chè : Theales

- Họ chè : Theacea

- Chi chè : Camellia

- Loài chè : Sinensis

Loài Camellia sinensis ở Việt Nam được chia nhỏ thành 4 giống:

- Trung Quốc lá nhỏ: (Camellia sinensis Var Bohea) năng suất thấp, búp nhỏ, hái mất nhiều công

- Trung Quốc lá to: (Camellia sinensis Var Macrophylla) trồng ở Thanh Ba (Phú Thọ), Yên Bái, Bắc Thái

- Chè Tuyết: (Camellia sinensis Var Shan hay chè Shan) trồng ở Hà Giang (Cao Bồ), Suối Giàng (Nghĩa Lộ), Mộc Châu, Cam Đường và Bảo Lộc

- Chè Ấn Độ: (Camellia sinensis Var Assamica) trồng ở trại chè Phú Hộ (Phú Thọ), Bầu Cạn (Pleiku), Cầu Đất (Lâm Đồng)

1.1.3 Thành phần hóa học và đặc điểm sinh hóa của cây chè

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của cây chè [6]

Thành phần %db* Chức

năng

Thành phần %db* Chức

năng Tổng polyphenol 25-30 Tạo vị

glycozit

3-4 Amino axit 4-5 Hậu vị

ngọt (+) Catechin 1-2 polysaccarit 14-22

Leuco anthocyanin 2-3 pectin 5-6

Polyphenolic axit 3-4 protein 14-17

Clorophyl và các chất

màu khác

0.6

0.5-Màu sắc lipit 3-5

Các hợp chất bay hơi

0.001-0.002

Hương thơm

Khoáng 5-6

Chú thích : * (Dry basic) : hàm lượng chất khô

1.1.3.1 Nước [8]

Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè (75-82%) Nước có quan

hệ trong quá trình biến đổi sinh hóa trong búp chè và đến sự hoạt động của các enzym, là chất quan trọng không thể thiếu để duy trì sự sống của cây Khi chế biến, nước là môi trường xảy ra tương tác giữa các chất có trong nguyên liệu Ngoài ra, nước còn tham gia trực tiếp vào quá trình phản ứng thủy phân và oxy hóa khử xảy ra trong quá trình chế biến Khi hàm lượng nước trong chè <10% thì các enzym trong nguyên liệu chè bị ức chế

1.1.3.2 Khoáng [14]

Hàm lượng khoáng trong chè tươi khoảng 4-5% chất khô và trong chè khô khoảng 5-6% chất khô Trong chè, khoáng chia thành hai nhóm: hòa tan trong nước và không hòa tan trong nước Chè thành phẩm loại tốt hàm lượng khoáng ít hơn so với loại chè xấu nhưng tỷ lệ chất khoáng hòa tan lại nhiều hơn Thành phần khoáng chính trong chè là kali, chiếm hơn 50% khoáng trong lá chè

1.1.3.3 Gluxit [8]

Gluxit trong chè gồm các loại đường đơn đến đường đa, các loại đường hòa tan rất ít, loại không hòa tan thì nhiều hơn Đường hòa tan trong chè tuy ít nhưng có giá trị lớn trong việc điều hòa vị chè và tham gia trong quá trình caramen hóa dưới tác dụng của nhiệt độ, để tạo thành hương thơm

vị ngọt

1.1.3.4 Ancaloit

- Là các hợp chất không màu, có vị đắng, kích thích đầu lưỡi và ít hòa tan trong nước Trong lá chè có các chất chủ yếu là: theobromin, theofilin, cafein Trong đó, cafein chiếm 2-5% lượng chất khô, theobromin và theofilin với hàm lượng nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lượng cafein, chiếm khoảng 0.33% khối lượng chất khô Tuy vậy, vai trò của theobromin và theofilin trong dược tính của cây chè quan trọng hơn rất nhiều so với cafein Nguyên nhân là do so với cafein thì theobromin kích thích hệ thần kinh trung ương yếu hơn nhưng làm lợi tiểu tốt hơn[6]

- Tác dụng sinh lí của chúng là kích thích vỏ đại não thần kinh trung ương, làm tinh thần tỉnh táo minh mẫn, kích thích cơ năng hoạt động của tim, giảm mệt mỏi, kích thích thận, lợi tiểu…[8]

- Cafein là chất kích thích chính của chè Trong quá trình chế biến, nó thường liên kết với tanin tạo nên chất tanat cafein, có vị dễ chịu và mùi thơm, đây là chất kết tủa, không có lợi cho công nghệ sản xuất chè [13]

1.1.3.5 Protein và axit amin

- Các hợp chất protein chiếm đến 25-30% của lá chè, trong đó hàm lượng đạm là 4-5% trong công nghệ chè đen, protein kết hợp tanin tạo thành một chất không hòa tan, gây trở ngại cho chè đen lên men Trong công nghệ chè xanh, protein có tác dụng tốt điều hòa vị chè; búp chè nhiều protein dễ vò xoăn, giúp ngoại hình đẹp[8]

- Axit amin trong lá chè gồm 17 loại có tác dụng tốt với chất lượng chè xanh về hương vị và màu sắc nước, có hương thơm và dư vị ngọt hậu Có 3 loại quan trọng là: theanin (50%), axit glutamic (12%), axit asparagic (10%), có tác dụng sinh lí tốt với con người và tham gia sự hình thành của hương thơm chè [6]

- Hàm lượng protein có ý nghĩa quan trọng đối với việc hình thành chất lượng của chè, bởi chúng là nguồn cung cấp axit amin tự do trong suốt quá trình chế biến Dưới tác dụng của nhiệt, protein bị thủy phân tạo thành các axit amin và các axit amin này tham gia vào các phản ứng Maillard tạo

hương vị cho sản phẩm chè xanh Hàm lượng protein trong lá chè phụ thuộc vào giống chè, thời vụ thu hái, tuổi lá, điều kiện sinh trưởng, cách bón phân [1]

1.1.3.6 Polyphenol [15]

Polyphenol là các hợp chất tạo vị chát cho sản phẩm Trong lá chè, thành phần polyphenol quan trọng nhất là flavonoit Trong đó, thành phần chính của flavonoit được tìm thấy trong lá chè tươi là catechin và flavonol Hàm lượng polyphenol tổng dao động trong khoảng 20-30% khối lượng chất khô của lá chè Khi tiến hành khảo sát sự phân bố của catechin trong các bộ phận của búp chè, người ta phát hiện rằng, các catechin có nhiều nhất trong các phần non của cây chè như búp, lá thứ nhất, lá thứ hai Các búp chè bị sâu bệnh và các lá già chứa rất ít catechin

Trong quá trình chế biến, các flavonoit có những biến đổi sâu sắc bởi các phản ứng do xúc tác bởi enzym, hiện diện với các thành phần khác nhau trong các loại chè và tạo nên những hương vị và màu sắc đặc trưng cho mỗi loại chè

1.1.3.7 Dầu thơm [8]

- Là một hỗn hợp các chất bay hơi tập trung trong các cơ quan của cây chè Dầu thơm của chè được hình thành trong quá trình sinh trưởng phát dục cây chè và cả trong quá trình chế biến chè Hương thơm là một chỉ tiêu quan trọng nhất trong đánh gía chất lượng chè, được tạo nên từ 3 nguồn sau:

+ Dầu thơm có sẵn trong búp chè tươi

+ Sảm phẩm có mùi trong sự chuyển hóa của catexin và axit amin + Sản phẩm của sự caramen hóa trong quá trình chế biến chè

- Hương thơm của chè xanh do các chất lianol, gieraniol và xitranelol chủ yếu tạo nên mùi hoa hồng tươi ngát

- Hương thơm của chè đen do hàm lượng các chất andehit tăng lên, đó là kết quả oxi hóa của các chất rượu sẵn có trong búp chè tươi Trong quá trình chế biến chè đen, chất catexin và axit amin bị oxy hóa và tác dụng lẫn

nhau tạo thành các chất andehit có mùi thơm Các sản phẩm của đường

trong quá trình caramen hóa dưới tác dụng của nhiệt độ cao chuyển hóa

thành chất purpuran có mùi thơm ngọt mật ong

1.1.3.8 Vitamin [14]

Các loại vitamin có trong chè rất nhiều Chính vì vậy giá trị dược

liệu cũng như giá trị dinh dưỡng của chè rất cao Theo các tài liệu của

Trung Quốc, hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1000g chất

Đáng chú ý nhất là hàm lượng vitamin C ở trong chè nhiều hơn

trong cam, chanh từ 3 đến 4 lần tính theo phần trăm chất khô Quá trình chế

biến chè xanh và chè đen làm cho vitamin C giảm đi nhiều vì nó bị oxi hóa

do tác dụng của nhiệt

1.1.3.9 Ezym [14]

Trong lá chè có hai nhóm enzym quan trọng là nhóm enzym oxi hóa

khử và nhóm enzym thủy phân Trong đó, nhóm enzym oxi hóa khử với

đại diện là enzym polyphenol oxydazo hiện diện trong các tế bào biểu bì

của lá chè Đối với công nghệ sản xuất chè xanh, enzym này hoàn toàn

không có lợi và bị vô hoạt hoàn toàn trong giai đoạn diệt men

Bên cạnh enzym polyphenol oxydazo, trong lá chè còn tồn tại một

hệ gồm nhiều enzym khác Trong đó, các enzym quan trọng đối với tính

chất công nghệ là:

- Proteazo: xúc tác cho quá trình thủy phân protein trong quá trình làm héo Sản phẩm tạo ra của phản ứng thủy phân là các peptit và các axit amin tự

do Những sản phẩm này sẽ tham gia vào các phản ứng Maillard trong quá trình tạo ra hương vị cho chè

- Clorophylazo tham gia quá trình thủy phân clorophyl

1.2 Tanin

1.2.1 Khái niệm chung [2]

"Tanin" là từ được dùng đầu tiên vào năm 1976 để chỉ những chất có mặt trong dịch chiết thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền Do đó, tanin được định nghĩa là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát, được phát hiện dương tính với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn Định nghĩa này không bao gồm những chất phenol đơn giản hay gặp cùng với tanin như axit galic, các chất catechin , mặc dù những chất này ở những điều kiện nhất định có thể cho kết tủa với gelatin và một phần nào bị giữ trên bột da sống Chúng được gọi là pseudotanin

1.2.2 Phân loại [2]

Có thể chia làm hai loại chính:

1.2.2.1 Tanin thủy phân ( tanin pyrogallic)

Tanin thủy phân có những đặc điểm sau:

- Khi thủy phân bằng axit hoặc bằng enzim tanazo thì giải phóng ra phần đường, thường là glucozo Phần không phải là phần đường là các axit Axit hay gặp là axit galic Các axit galic nối với nhau theo dây nối depzit để tạo thành axit digalic, trigalic

Phần đường và phần không đường phải nối với nhau theo dây nối este nên người ta coi tanin loại này là những pseudoglycozit

- Khi cất khô ở 180-200oC thì thu được pyrogalol la chủ yếu

- Cho tủa bông với chì axetat 10%

- Thường dễ tan trong nước

Một số tanin thuộc loại pyrogalic:

+ Tanin của lá và vỏ cây Hamamelis virginiana L là hamamelitanin với phần đường là hamamelozo (= hydroxy-methyl-D-ribozo), công thức đã được Schmidt xác lập năm 1935 và đã được Mayer xác định lại năm 1965

+ Tanin trong một số cây thuộc chi Terminalia: axit chebulinic và axit chebulagic

+ Một số nguyên liệu khác có chứa tanin thủy phân được như đại hoàng, đinh hương, cánh hoa hồng đỏ, vỏ quả và vỏ cây lựu, lá cây bạch đàn

1.2.2.2 Tanin ngưng tụ (tanin pyrocatechic)

Tanin này có những đặc điểm sau:

- Dưới tác dụng của axit hoặc enzym dễ tạo thành phlobaphen Phlobaphen rất ít tan trong nước là sản phẩm của sự trùng hợp hóa kèm theo oxy hóa

Do đó, tanin pyrocatechic còn được gọi là phlobatanin Phlobaphen là đặc trưng của một số dược liệu như canh ki na, vỏ quế

- Khi cất khô thì cho pyrocatechin là chủ yếu

- Cho tủa màu xanh lá đậm với muối sắt (III)

- Cho tủa bông với nước brom

- Khó tan trong nước hơn tanin pyrogalic

Tanin nhóm này được tạo thành do sự ngưng tụ từ các đơn vị 3-ol hoặc flavan-3,4-diol

flavan-Ngoài ra còn có một số tanin đặc biệt, những tanin này có sự kết hợp giữa tanin ngưng tụ và tanin thủy phân Đây là những gallo và ellagiflavotanin Ví dụ:

Trong cấu trúc của các tanin vừa nêu trên, ta thấy có đơn vị catechin hoặc epicatechin hoặc gallocatechin nối theo dây nối O-glycozit ở C-1 của đường, còn các dẫn chất hyroxydiphenic axit nối theo dây nối este với phần đường Một số nguyên liệu thực vật có thể có mặt cả hai loại tanin thủy phân và tanin ngưng tụ như lá cây thuộc chi Hamamelis, rễ đại hoàng

1.2.3 Tính chất cơ bản của polyphenol thực vật [7]

Polyphenol có những tính chất sau:

- Polyphenol tan trong nước và các dung môi hữu cơ như rượu metylic, rượu etylic, glixerin, etylaxetat; không tan trong benzen, ete dầu hỏa, cloroform, sunfua cacbon, tetraclorua cacbon

- Polyphenol tạo kết tủa với dung dịch gelatin, ancaloit, protein và một số chất hữu cơ khác có tính kiềm

- Polyphenol thường tạo muối polyphenolat khi phản ứng với các muối của kim loại Ca, Mg, Zn, Pb, Hg trong dung dịch; với FeCl3, polyphenol cho sản phẩm màu xanh đen, đây là phản ứng đặc trưng để định tính polyphenol nhóm tanin

- Polyphenol là chất có tính khử mạnh, dễ bị oxi hóa trong không khí, nhất

là trong môi trường kiềm Sản phẩm oxi hóa polyphenol là những chất màu

đỏ hoặc nâu gọi là phlobaphen

- Polyphenol nhóm tanin bị oxi hóa hoàn toàn dưới tác dụng của KMnO4

hoặc hỗn

hợp cromic trong môi trường axit Tính chất này dùng để định lượng polyphenol nhóm tanin với chất chỉ thị là indigocacmin

1.2.4 Vai trò của polyphenol

1.2.4.1 Dùng tạo phức với kim loại [2]

Các hợp chất polyphenol có khả năng tạo phức với các ion kim loại

Sự tạo phức đòi hỏi trong phân tử có các nhóm thế thích hợp và dung dịch

có pH dưới giá trị pKa của nhóm –OH phenol Các nhóm phenol có ái lực lớn với một số kim loại có từ tính thường gặp như sắt Sự giống nhau giữa các nhóm thế ortho-dihidroxy và các nhóm thế trong tanin thủy phân được

và tanin không thủy phân được cho thấy rằng tanin cũng có ái lực lớn với nhiều kim loại

Các phức chất giữa ion kim loại và polyphenol thường có màu Do

đó, dựa vào màu sắc riêng của mỗi phức chất, có thể xác định vị trí sắp xếp của các nhóm polyphenol Tuy nhiên, phương pháp này chưa được thử nghiệm để chính thức sử dụng Người ta cho rằng các ion kim loại đã tạo

phức với polyphenol hầu như không có sẵn hoạt tính sinh học Một ví dụ điển hình là khi sử dụng một hàm lượng lớn chè và các loại thực phẩm giàu polyphenol khác thì xuất hiện các chứng bệnh thiếu chất (như thiếu máu)

Sự tạo phức với các ion kim loại có thể làm thay đổi khả năng oxi hóa-khử của kim loại, hay làm giảm khả năng tham gia phản ứng oxi hóa-khử của chúng

1.2.4.2 Chất chống oxi hóa [2]

Polyphenol được xem là các hợp chất sinh học có khả năng chống oxi hóa Thông thường, chất chống oxi hóa được xem như một hàng rào quan trọng chống lại các tác hại phá hủy của quá trình oxi hóa, có liên quan đến một loạt các bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, chứng viêm khớp, đau nhức Có thể phân loại các hợp chất sinh học có khả năng chống oxi hóa thành ba nhóm: enzym (nhóm 1), chất ức chế các phản ứng tạo gốc (nhóm 2), các tác nhân dập tắt sự hình thành các gốc tự do (nhóm 3) Polyphenol

có vai trò như là các chất chống oxi hóa hữu hiệu do chúng có khả năng tham gia các phản ứng oxi hóa-khử dễ dàng Những chất chống oxi hóa này trung hòa các gốc tự do –thứ sản phẩm có hại trong quá trinh

trao đổi chất trong cơ thể Hoạt tính tiêu biểu nhất của polyphenol khi bảo

vệ cơ thể chống lại các gốc tự do chính là ngừa ung thư và làm giảm nguy

cơ mắc bệnh tim mạch Theo nghiên cứu, polyphenol có 3 tác dụng:

- Ngăn ngừa các gốc tự do phá hoại các ADN, mô thức khởi phát ung thư

- Ngăn ngừa hiện tượng phát triển không kiểm soát của tế bào, nghĩa là làm chậm phát triển ung thư

- Một số polyphenol có khả năng giết các tế bào ung thư mà không làm ảnh hưởng đến tế bào lành

Do vậy, loại thực phẩm này được khuyển khích sử dụng như một loại thuốc có thể phòng ngừa, bảo vệ cơ thể khỏi một số bệnh như: nhồi máu cơ tim, loãng xương ở phụ nữ, ung thư, giúp xương săn chắc, làm giảm nguy cơ ung thư buồng trứng, làm giảm tác hại của thuốc lá

Trong quá trình chế biến, hỗn hợp tanin trong chè tạo ra nhiều axit galic nâng cao tính đàn hồi của cơ thể

1.2.4.3 Dùng trong y học

- Tanin dùng để rửa vết thương, nhất là các vết thương để lâu bị gỉ nước vàng Ở đây, tanin vừa có tác dụng sát trùng, vừa có tác dụng cầm máu và giảm nước màu vàng chảy ra Người ta có thể pha các dung dịch tanin 2-5% dùng để súc miệng, thụt trực tràng, tử cung, bàng quang.[2]

- Polyphenol cho kết tủa với kim loại nặng và các ancaloit nên dùng uống khi bị ngộ độc đường tiêu hóa.[12]

- Dung dịch polyphenol nhóm tanin cho kết tủa với protein tạo thành một màng trên niêm mạc nên ứng dụng làm thuốc săn da Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên được dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng và họng bị viêm loét, chữa bỏng, loét do nằm lâu.[12]

- Hơn nữa, nó có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn.[12]

1.2.4.4 Sử dụng công nghiệp và trong công nghệ thuộc da [12]

- G.matamala, W.Smelter và G.Droguetl (1994) đã sử dụng tanin làm lớp lót cho sơn để chống ăn mòn kim loại nhằm cải thiện hệ thống lớp sơn phủ truyền thống Kết quả cho thấy, lớp sơn bằng tanin đã ngăn chặn được sự

ăn mòn nhờ việc cải thiện sự bám của lớp ngoài

Việc sử dụng tanin để chống ăn mòn trên quy mô lớn đã tốt hơn hẳn

so với lớp sơn cổ truyền (300%) tính theo tỉ lệ ăn mòn với cùng độ dày của lớp màng khô Đồng thời, tác giả còn cho thấy, sơn lót bằng tanin có thể sử dụng như một lớp sơn lót vạn năng hoặc có thể tẩy sáng gỉ thép và có thể thay đổi bề mặt xù xì của thép

- Da động vật chứa nhiều protein, nếu không qua xử lí thì các protein này rất dễ bị thay đổi Thuốc thuộc da có thể có nguồn gốc thực vật, khoáng vật

và dầu béo Polyphenol nhóm tanin là một chất thuộc da được sử dụng từ lâu Giai đoạn đầu tiên là xử lí ban đầu: ngâm tẩm, lấy mỡ, nhổ lông, rửa

da, ngâm axit hoặc kali nitrat, làm cho da sạch mỡ, sạch lông, hết vi khuẩn,

da trở nên mềm và sạch sẽ Các chất keo trong da vốn là protein dạng sợi sẽ duỗi ra và nở to ra Giai đoạn tiếp theo là quá trình thuộc da: tùy theo yêu cầu mà chọn các thuốc thuộc da khác nhau để gây biến đổi cho các protein dạng sợi, giữ cho da mềm, bền, không bị thối Cuối cùng là bước nhuộm màu, sấy khô, mài phẳng, vò mềm, đánh bóng

1.3 Một số phương pháp chiết tách hợp chất hữu cơ [9]

1.3.1 Phương pháp chưng cất

Khi đun sôi một hỗn hợp, chất nào có nhiệt độ sôi thấp hơn sẽ chuyển vào pha hơi sớm hơn và nhiều hơn Khi gặp lạnh, pha hơi sẽ ngưng

tụ thành pha lỏng chứa chủ yếu là chất có nhiệt độ sôi thấp hơn Quá trình

đó gọi là sự chưng cất Có các kiểu chưng cất sau:

1.3.1.1 Chưng cất thường

Khi cần tách một chất lỏng có nhiệt độ sôi không cao lắm ra khỏi các chất có nhiệt độ sôi khác biệt so với nó, người ta dùng phương pháp chưng cất đơn giản nhất gọi là chưng cất thường

1.3.1.2 Chưng cất phân đoạn

Chưng cất đơn giản một lần thường không thu được chất tinh khiết, nhất là đối với các hỗn hợp các chất có nhiệt độ sôi khác nhau không nhiều

Để không phải chưng cất nhiều lần, người ta thay bình Wurtz bằng bình cầu nối với cột cất phân đoạn Cột cất phân đoạn gồm nhiều nấc, ở mỗi nấc, pha hơi được ngưng tụ thành lỏng rồi lại chuyển thành hơi liên tục Như thế, mỗi nấc là một lần chưng cất và chưng cất phân đoạn thực chất là chưng cất liên tiếp nhiều lần trên cùng một dụng cụ Nhờ vậy mà thu được các chất có

độ tinh khiết cao

1.3.1.3 Chưng cất dưới áp suất thấp

Khi áp suất trên mặt thoáng giảm thì nhiệt độ sôi của chất lỏng sẽ giảm theo Vì vậy, đối với những chất có nhiệt độ sôi cao, cần phải chưng cất dưới áp suất thấp để giảm nhiệt độ và tránh sự phân hủy

Đối với dung môi có nhiệt độ sôi thấp như hexan, benzen, cloroform , người ta thường cất loại chúng bằng máy cất quay, thực chất là cất ở áp suất 20-40mmHg Đối với các chất có nhiệt độ sôi cao hơn thì còn phải dùng bơm làm giảm áp suất xuống còn một vài mmHg Đối với những chất sôi ở nhiệt độ cao và dễ bị tác động bởi nhiệt, người ta dùng phương pháp chưng cất lớp mỏng và chưng cất phân tử ở áp suất tới 10-3-10-4

mmHg Khi đó nhiệt độ sôi có thể giảm đi 200-3000C

1.3.1.4 Chưng cất lôi cuốn hơi nước

Những chất hữu cơ không tan hoặc ít tan trong nước, mặc dù có nhiệt độ sôi cao nhưng khi trộn với nước sẽ tạo ra hỗn hợp sôi ở nhiệt độ xấp xỉ 1000C (ở áp suất thường) Khi đó ở pha hơi số mol chất hữu cơ (nchc)

và số mol nước (nnước) sẽ tỉ lệ thuận với áp suất riêng phần của chúng ở nhiệt độ sôi của hỗn hợp

nchc: nnước = Pchc: Pnước

Làm lạnh pha hơi sẽ thu được pha hữu cơ (lỏng hoặc rắn) cùng với nước lỏng Sau khi chiết hoặc lọc, sẽ thu được pha hữu cơ Đó là nội dung của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

1.3.2 Phương pháp chiết

Chiết là phương pháp dùng dung môi thích hợp hòa tan chất cần tách thành một pha lỏng (gọi là dịch chiết) phân chia khỏi pha lỏng (hoặc pha rắn) chứa hỗn hợp các chất còn lại Tách lấy dịch chiết, giải phóng dung môi sẽ thu được chất cần tách

Người ta thường dùng phương pháp này để tách lấy hợp chất khi nó

ở dạng nhũ tương hoặc huyền phù trong nước, hay để tách lấy chất hữu cơ

ra khỏi một hỗn hợp ở thể rắn Dung môi thường dùng là ete, benzen, cloroform, hexan

1.3.3 Phương pháp kết tinh

Kết tinh là phương pháp đơn giản nhưng rất hiệu quả để tinh chế các chất hữu cơ ở thể rắn Dựa vào sự thay đổi độ tan theo nhiệt độ, người ta hòa tan chất cần tinh chế vào dung môi thích hợp thường là nhiệt độ sôi của dung môi, lọc nóng, bỏ cặn không tan rồi để nguội hoặc làm lạnh từ từ, chất

rắn sẽ tách ra dưới dạng tinh thể nằm cân bằng với dung dịch bão hòa của

nó Lọc, rửa, làm khô sẽ thu được tinh thể chất cần tinh chế Vì mạng tinh thể chỉ chứa những phần tử giống nhau nên nếu một chất thu được ở dạng tinh thế đồng nhất thì nó đã được xem là tương đối sạch Một chất rắn được coi là tinh khiết nếu sau nhiều lần kết tinh trong những dung môi khác nhau

mà nhiệt độ nóng chảy của nó vẫn không thay đổi

1.3.4 Phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký lúc đầu chỉ được dùng để phân tích các chất có màu, ngày nay đã được ứng dụng rộng rãi để tách biệt, tinh chế, phân tích định tính, định lượng các hỗn hợp từ đơn giản đến phức tạp Phương pháp sắc ký dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh Nguyên nhân của sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và bị phản hấp phụ khác nhau hoặc khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh

Có nhiều kiểu sắc ký khác nhau: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký trao đổi ion