Nghiên cứu chiết tách axit hữu cơ và xác định một số thành phần hóa học trong nhân hạt gấc thu nhận trên địa bàn huyện núi thành tỉnh quảng nam

Nội dung nghiên cứu - Điều tra sơ bộ, thu gom và xử lí nguyên liệu; - Dùng phương pháp chiết soxhlet để chiết tách chất; - Xác định một số chỉ số hóa lý của nguyên liệu: độ ẩm, hàm lượn

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên : Đỗ Thị Mến

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu chiết tách axit hữu cơ và xác định một số thành

phần hóa học trong dịch chiết hạt gấc trên địa bàn huyện Núi Thành - tỉnh Quảng Nam”

2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị

Nguyên liệu: nhân hạt gấc

a Thiết bị

- Máy sắc ký khí kết hợp với khối phổ GS-MS

- Máy quang phổ hồng ngoại IR

b Dụng cụ

- Bình định mức các loại

3 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra sơ bộ, thu gom và xử lí nguyên liệu;

- Dùng phương pháp chiết soxhlet để chiết tách chất;

- Xác định một số chỉ số hóa lý của nguyên liệu: độ ẩm, hàm lượng tro

- Khảo sát dung môi và thời gian chiết tối ưu

- Định danh thành phần hóa học trong dịch chiết thu được

4 Giáo viên hướng dẫn: ThS Võ Kim Thành

5 Ngày giao đề tài: 01/07/2012

tận tình hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, đô ̣ng viên và ta ̣o mo ̣i điều kiê ̣n thuâ ̣n lợi cho em

trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiê ̣p này Đồng thời em xin cảm ơn các anh chị và bạn bè đã ủng hộ, giúp đỡ và động viên em trong thời gian học tập và nghiên cứu

Bước đầu làm quen với nghiên cứu khoa học, không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến góp ý của các thầy cô và bạn bè để đề tài này được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Đà nẵng, tháng 5 năm 2013

Đỗ Thị Mến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của hạt gấc 42 Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng tro trong hạt gấc 43 Bảng 3.3 Kết quả chuẩn độ dịch chiết hạt gấc với các loại dung môi khác nhau 44 Bảng 3.4 Bảng kết quả chuẩn độ để khảo sát thời gian chiết tối ưu 45 Bảng 3.5 Kết quả giải phổ hồng ngoại 46 Bảng 3.6 Kết quả định danh một số thành phần hóa học có trong dịch chiết hạt gấc 49

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng các cây cỏ thiên nhiên để làm thuốc cũng như các chế phẩm sinh học nhằm tăng cường và bảo vệ sức khỏe của mình Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới, gió mùa, thuận lợi cho nhiều loại thảo dược phát triễn, trong đó có cây gấc Các nhà khoa học, gọi gấc là “trái cây đến từ thiên đường” bởi nguồn dinh dưởng dồi dào có trong quả gấc

Nó thường được dùng để nấu xôi - một món ăn truyền thống, ăn có vị rất ngon và chứa nhiều chất bổ dưỡng Tuy nhiên, khi ăn xôi, ta thường bỏ

đi hai vị thuốc quý đó là màng bọc hạt gấc và nhân hạt gấc Màng bọc hạt gấc có chứa một vị thuốc quý là carotene (tiền sinh tố A), có tác dụng điều trị quáng gà, làm sáng mắt, giúp trẻ con mau lớn, người già thêm cứng cáp, giúp các vết thương mau liền sẹo Ngoài ra dầu gấc là một loại thực phẩm

chức năng nhằm tăng cường sức đề kháng, chống lão hóa tế bào, cung cấp vitamin,…cho cơ thể

Còn nhân hạt gấc là một vị thuốc rất quý có tác dụng làm tan các vết bầm do chấn thương, làm vết thương mau lành Theo bác sĩ Trần Danh Tài - Chủ tịch Hội Đông y tỉnh Lâm Đồng thì: "Tác dụng của tinh dầu hạt gấc chẳng kém gì các loại mật gấu

Từ lâu, nhân dân ta đã biết cách chế dầu từ nhân hạt gấc theo phương pháp thủ công làm thuốc dùng trong gia đình, dùng được cho tất cả vết thương bị bầm dập, tụ máu, bị mụn nhọt, quai bị, viêm tuyến vú Ngoài ra còn có tác dụng chữa trĩ, chữa chai bàn chân Nhân hạt gấc chứa rất nhiều chất như axit béo, đường, tannin, protein, 1 số enzim song không thể không nhắc đến các axit có trong nhân hạt gấc có hoạt tính sinh học mạnh, chúng là

1 trong những dưỡng chất chính tạo nên tính năng chữa bệnh đặc biệt của nhân hạt gấc

Đó là lí do mà em đã lựa chọn đề tài này: “Nghiên cứu chiết tách axit hữu cơ và xác định một số thành phần hóa học trong nhân hạt gấc thu nhận trên địa bàn Huyện Núi Thành-Tỉnh Quảng Nam”

2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu các axit hữu cơ

- Xác định một số thành phần hóa học có trong nhân hạt gấc

- Đóng góp về nguồn tư liệu về hạt gấc, tạo nền tảng ban đầu trong việc nghiên cứu hạt gấc

3 Đối tượng nghiên cứu

Hạt gấc được thu nhận trên địa bàn Huyện Núi Thành-Tỉnh Quảng Nam”

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập tài liệu, tư liệu trong và ngoài nước

- Trao dồi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô

4.2 Nghiên cứu thực nghiệm

- Phương pháp lấy mẫu, thu hái và xử lý mẫu

- Phương pháp trọng lượng để xác định các đại lượng vật lý

- Phương pháp phân hủy mẫu phân tích (tro hóa mẫu)

- Phương pháp chiết Shoxlet

- Phương pháp quang phổ hồng ngoại kiểm tra nhóm chức axit

- Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC – MS) nhằm phân tích và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp những thông tin khoa học về quy trình chiết tách axit trong hạt gấc

- Cung cấp một tư liệu về các thành phần hóa học có trong hạt gấc làm

cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo

1.1.1 Đặc tính sinh thái:

a.Tên gọi

- Tên khoa học : Momordica Cochinchinesis (Lour) spreng

- Tên thường gọi : Gấc

Ở một số nước, Gấc được gọi là: Mộc Miết (Trung Quốc), Spiny bitter-cucumber, Chinese bitter-cucumber, Chinese cucumber (Anh), Margones à piquant (pháp), Makkao (khơ me)

b Phân loại khoa học

* Thu hái Qủa Gấc chín hái về, đem bỏ ngang, vét hạt với màng đỏ Nếu để nấu xôi thì dùng hạt với cả màng đỏ trộn với gạo Nếu để chế dầu thì phải phơi sấy khô hạt tới khi không còn dính tay Bóc lấy màng hạt rồi phơi hay sấy khô ở nhiệt độ thấp (600C – 700C)

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Gấc là loại cây thảo dây leo thuộc chi Mướp đắng Cây gấc leo khỏe, chiều dài có thể đến 15m Thân dây có tiết diện góc Lá gấc nhẵn, mọc so le,chia thùy hình chân vịt phân ra từ 3 đến 5 dẻ, dài 8-18cm

Gấc là loại đơn tính khác gốc (dioecious) Hoa nở tháng 4-5 đực cái riêng biệt, cánh hoa có màu vàng nhạt Qủa hình tròn, sắc xanh, khi chín chuyển sang màu đỏ cam, đường kính 15-20cm Vỏ gấc có gai đậm Bổ ra mỗi quả thường có sáu múi Thịt gấc màu đỏ cam

Hạt gấc màu nâu thẫm, hình dẹp, có khía Gấc trổ hoa vào màu hè thu, đến mùa đông mới chín Mỗi năm gấc chỉ thu hoạch được một mùa Do vụ thu hoạch tương đối ngắn (vào khoãng tháng 12 hay tháng 1), nên gấc ít phổ biến hơn các loại quả khác

Hình 1.1 Cây gấc Hình 1.2 Hoa gấc

Hình 1.3 Quả gấc Hình 1.4 Hạt gấc

1.1.3 Công dụng của gấc

- Rễ gấc: còn

gọi là phong kỷ nam sao vàng, tán mỏng, dùng uống chữa tê thấp sưng chân

- Lá gấc: viện đông y dùng lá gấc với lá tầm gửi đắp ngoài da làm thuốc tiêu

sưng tấy

- Màng gấc: Dùng để đồ xôi, ăn cả xôi và màng gấc Là nguyên liệu cơ bản để

chiết xuất dầu gấc Dầu gấc chứa lycopen thực vật nên có tác dụng chống lão hóa, phòng chữa sạm da, trứng cá, khô da, rụng tóc, nổi sần có tác dụng dưỡng da, bảo

vệ da, giúp cho da luôn hồng hào, tươi trẻ và mịn màng

- Dầu gấc: có tác dụng như những thuốc có vitamin A, dùng bôi lên các vết

thương, vết loét, vết bỏng làm cho chóng lành, lên da Uống dầu gấc người bệnh chóng lên cân, tăng sức chống đỡ bệnh tật của cơ thể

- Hạt gấc: Đông y gọi là mộc miết tử (con ba ba gỗ) vì nó dẹt, hình gần

như tròn, vỏ cứng, mép có răng cưa, hai mặt có những đường vân lõm xuống, trông tựa như con ba ba nhỏ Theo sách cổ, nhân hạt gấc có vị đắng, hơi ngọt, tính ôn, hơi độc, vào hai kinh can và đại tràng, có tác dụng chữa mụn nhọt, tiêu thũng

1.1.4 Giá trị của trái gấc trong đời sống

Trong gia đình, thịt Gấc được sử dụng chủ yếu để nhuộm màu các loại xôi, chế biến các món ăn, vừa có tác dụng thay phẩm màu trong chế biến thức ăn vừa có tác dụng phòng chống suy dinh dưỡng, thiếu vi chất, tăng sức

đề kháng cho trẻ em, làm kẹo gôm gấc, sữa chua gấc, bột gấc dinh dưỡng … Gần đây quả gấc đã bắt đầu được tiếp thị ra ngoài khu vực Châu Á trong dạng nước ép trái cây bổ dưỡng và dạng dầu gấc do nó có chứa hàm lượng tương đối cao các dinh dưỡng thực vật.Trong mỹ phẩm cũng có thể dùng gấc Gấc có thể thay thế Sudan – một loại chất tạo màu cho thực phẩm và

mỹ phẩm đang thực sự là mối lo ngại cho nhiều người tiêu dùng với nguy cơ gây ung thư cao Ở Việt Nam việc chọn một chất tạo màu an toàn khác thay thế cho Sudan không khó khi dầu của trái Gấc hoàn toàn có thể thay thế cho phẩm màu hóa học độc hại Ngoài việc sử dụng trong ẩm thực, gấc còn được

sử dụng trong y học

1.1.5 Một số thành phần hóa học trong hạt gấc

Theo tài liệu “ Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” trong nhân hạt gấc có chứa khoảng 6% nước, 2,9% chất vô cơ, 55,3% acid béo 16,6% protit, 2,9% đường 1,8% tanin, 2,8% cellulose và 11% chất chưa xác định được.Ngoài ra trong hạt gấc còn có các men photphataza, invectaza và peroxydaza

Trong một số tài liệu gần đây, một số axit thuộc nhóm saponin có hoạt tính sinh học cao đặc biệt trong khả năng chống viêm đã được tìm thấy trong hạt gấc là acid momordic, gypsogenin, acid oleanolic, acid a- elacostearic, còn có acid amin, alcol

1.2 Saponin [3], [8], [15], [16]

1.2.1 Khái niệm

Saponin còn gọi là Saponosid do chữ latin sapo = xà phòng(vì tạo bột như xà phòng), là nhóm glycoside lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Người ta cũng phân lập saponin trong động vật như hải sâm, cá sao

Saponin có một số tính chất đặc biêt như:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất hydroxysteroid khác

3-b-Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin

Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol

Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt

Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do

đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin Saponin có thể bị tủa bởi chì acetat, bari hydroxyd, amoni sulfat

Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất

Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin

Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm

Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid

1.2.2 Cấu trúc hóa học

 Phần đường:

- Phần đường nối vào OH ở C-3 của aglycon

- Cho đến nay người ta biết khoảng 40 loại đường khác nhau như glucose, L-ramnose, D-fucose…

D Những đường này có các đặc tính sau: dễ bị thuỷ phân, cho phản ứng màu với thuốc thử Kele-Kiliani, thuốc thử Xanthydrol

- Mạch đường có thể là monosacarit hoặc oligosacarit

Người ta nhân thấy rằng glucose bao giờ cũng ở phía cuối mạch

 Phần aglycon (genin)

- Phần aglycon chia làm 2 loa ̣i và cũng dựa vào đó phân loa ̣i saponin

- Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có

30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:

+ Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan

+ Saponintriterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan

- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, piroalan, solanidan

- Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = -CH3, R3 = -COOH

b Nhóm Ursan

Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19 Các sapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3- hydroxy ursan 12-ene, tức là -amyrin Những saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean Cinchona glycosid A, Cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na, asiaticosid có trong rau má là những saponin của nhóm này

c.Nhóm Lupan

Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí 20-29

d Nhóm Hopan

Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng

A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác

vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và

nhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17

Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A

có trong cỏ thảm Mollugo hirta L

vòng tạo thành vòng tetrahydropyran Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật Hai genin chính là: protopanaxadiol và protopanaxatriol

Phần đường nối vào OH ở cabon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào

OH ở mạch nhánh

Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong hạt táo

(Ziziphus jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst

b Nhóm Lanostan

Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm -

Holothuria spp

c Nhóm cucurbitan

Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong

họ Cucurbitaceae Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí

hướng axial có cấu hình tuyệt đối 25S,

smilagenin thì nhóm methyl ở C-25 hướng equatorial có cấu hình tuyệt đối 25R

b Nhóm furostan

Nhóm này có cấu trúc tương tự như Spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi Trường hợp 1: Vòng F mở và nhóm ancol bậc một ở C-26 được nối với đường glucose Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzyme hoặc bởi acid) thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm Spirostan Ví dụ Sarsaparillosid dưới tác dụng của enzyme thủy phân cắt mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin

Trường hợp 2: Vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng do sự đóng vòng 22-25 epoxy ví dụ avenacosid có trong yến mạch Avenacosid A cũng

có mạch đường Khi thủy phân cắt đường glucose ở C-26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm Spirostan

Sarsaparillosid và avenacosid A đều có 2 mạch đường Người ta gọi đây là các bidesmosid

c Nhóm aminofurostan: Ở đây vòng F như trường hợp Sarsaparillosid nói trên nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2 Trường hợp

jurubin, saponin có trong solanum paniculatum làm một ví dụ

d.Nhóm spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhau nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay bằng NH Một điểm cần chú ý là ở đây

có isomer ở C-22 (khác với nhóm spirostan) Ví dụ solasonin có trong cây cà

laciniatum có cấu trúc (25R) 22α còn tomatin là các saponin có trong cây cà

chua thì có cấu trúc (25R) 22β

Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin steroid có cấu trúc mạch nhánh khác ví dụ polypodosaponin và

oslandin được Jizba phân lập 1971 từ thân rễ cây Polypodium vulgare L

Oslandin là một bidesmosid có vị ngọt -spinasterol glycosid có trong cây

chè Camelia sinensis (L.) O K.tze

1.3 Phương pháp phân tích trọng lượng [6], [7],[8], [9], [11]

1.3.1 Bản chất của phương pháp phân tích trọng lượng

Phương pháp phân tích trọng lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân khối lượng của sản phẩm, hình thành sau phản ứng kết quả bằng phương pháp hóa học hay phương pháp vật lý Do chất phân tích chiếm một tỷ lệ xác định trong sản phẩm đem cân dễ dàng suy ra lượng chất phân tích trong đối tượng phân tích

Qúa trình phân tích một chất bằng phương pháp trọng lượng:

- Chọn mẫu và gia công mẫu

- Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các thành phần của nó khỏi sản phẩm phân tích dưới trạng thái tinh khiết hóa học Tuy nhiên trong trường hợp việc làm này rất khó khăn, nhiều khi không thực hiện được, do

đó chất cần xác định thường được tách ra thành kết tủa dưới dạng hợp chất

có thành phần xác định Để làm được các điều đó ta thực hiện như sau: Đưa mẫu vào dung dịch (phá mẫu) và tìm cách tách chất nghiên cứu ra khỏi dung dịch (làm phản ứng kết tủa hay điện phân)

- Xử lý sản phẩm đã tách bằng các biện pháp thích hợp (rửa, sấy, nung…) rồi đem cân để tính kết quả

1.3.2 Phân loại các phương pháp phân tích trọng lượng

- Phương pháp đẩy: Dực vào việc tách thành phần cần xác định ở dưới dạng đơn chất rồi cân

- Phương pháp kết tủa: Trong phương pháp này ta dùng phản ứng kết tủa để tách chất nghiên cứu ra khỏi dung dịch phân tích Các kết tủa tách ra

có thành phần hóa học được rửa, sấy hoặc đem nung Khi đó kết quả thường được chuyển thành một chất mới có thành phần chính xác rồi đem cân trên cân phân tích

- Phương pháp điện phân: Người ta dùng điện phân để tách kim loại cần xác định trên catot bạch kim Sau khi kết thúc điện phân, đem sấy điện cực rồi cân và suy ra lượng kim loại đã thất thoát ra trên điện cưc bạch kim Phương pháp này thường được dùng để xác định kim loại trong môi trường đệm pH = 7

- Phương pháp chưng cất: Trong phương pháp này chất đem phân tích được chưng cất trực tiếp hay gián tiếp Trong phương pháp chưng cất trực tiếp, chất đem phân tích được chuyển sang dạng bay hơi rồi hấp thụ nó vào chất hấp thụ thích hợp Khối lượng của chất hấp thụ tăng lên một lượng ứng với lượng chất đã hấp thụ vào

1.3.4 Ưu, nhược điểm của phương pháp phân tích trọng lượng

 Ưu điểm

Các phương pháp phân tích trọng lượng cho phép ta xác định được với độ chính xác cao, hàm lượng của các cấu tử riêng biệt trong một mẫu đã cho của chất phân tích hoặc nồng độ của chúng trong dung dịch Phân tích trọng lượng được dùng để xác định rất nhiều kim loại (các cation) và các phi kim (các anion), các thành phần của hợp kim, của các quặng silicat, các hợp chất hữu cơ Bằng phân tích trọng lượng, người ta tiến hành các xác định với độ chính xác đạt tới 0,01-0,005%, độ chính xác đó vượt xa độ chính xác của các phương pháp chuẩn độ

 Nhược điểm

Nhược điểm chủ yếu của phân tích trọng lượng là thời gian xác định kéo dài, dài hơn nhiều so với thời gian phân tích khi thực hiện các phương

pháp phân tích chuẩn độ Vì nguyên nhân này mà các phương pháp phân tích trọng lượng bị mất đi giá trị trước kia của mình và trong thực tiễn người

ta thay thế bằng các phương pháp phân tích hoá học và hoá lý hiện đại nhanh hơn nhiều

1.4 Phương pháp chiết [9], [10],[16]

1.4.1 Giới thiệu chung

Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan chất đang cần tách và tinh chế để tách đó ra khỏi môi trường rắn hoặc lỏng khác Thường người ta dùng một dung môi sôi thấp và ít tan trong nước (vì các chất hữu cơ cần tinh chế thường ít tan trong nước), chất đó sẽ chuyển phần lớn lên dung môi và ta có thể dùng phễu để tách riêng dung dịch thu được ra khỏi nước

Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một số lần, ta có thể tách hoàn toàn chất cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó cất loại dung môi và cất lấy chất tinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp

Người ta cũng thường chiết một chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi, với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt gọi là bình chiết shoxlet Dung môi được đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy vào bình chứa hỗn hợp cần chiết tách (thường gói trong giấy lọc), nó sẽ hòa tan chất rắn cần tinh chế và nhờ một ống xiphông, dung dịch chảy xuống bình cầu bên dưới, dung môi nguyên chất lại tiếp tục được cất lên Phương pháp này tiết kiệm được dung môi và hiệu quả tương đối cao

1.4.2 Kỹ thuật chiết Shoxlet

+ Nguyên tắc

Chiết Shoxlet là một kiểu liên tục đặc biệt thực hiện nhờ một trang bị riêng của nó Kiểu chiết này cũng như chiết lỏng – lỏng nên về bản chất của sự chiết vẫn là định luật phân bố chất trong hai pha không trộn vào nhau Song ở đây pha mẫu là ở trạng thái lỏng, bột, hoặc dạng lá Còn dung môi chiết (chất hữu cơ) là dạng lỏng

+ Các trang thiết bị

Trang thiết bị của bộ chiết shoxlet gồm 2 loại

1 Hệ shoxlet thường và đơn giản

2 Hệ shoxlet tự động (Auto – shoxlet) Cách chiết theo hệ (1) là đơn giản vận hành bằng tay, còn hệ (2) là vận hành một cách tự động Kỹ thuật này chủ yếu sử dụng để chiết tách hữu

cơ nằm trong pha rắn hay bột hay mảnh nhỏ, hay các vật liệu khô (lá), vì thế nên nó là hệ chiết dị thể

Ví dụ: Chiết shoxlet thường lấy một sô hóa chất bảo vệ thực vật từ mẫu rau quả: lấy 10g mẫu đã nghiền nhỏ và trộn đều vào cốc chiết của hệ chiết Thêm 25-30g Na2SO4 khan, 30ml dung môi chiết n-hexan có 20%

Cl2H2 Sau đó tiến hành chiết trong 180 phút

Kỹ thuật chiết này có ưu điểm là chiết triệt để, song các điều kiện chiết phải nghiêm ngặt thì mới có kết quả Vì thế hệ thống chiết tự động cho kết quả tốt hơn nhưng phải có hệ thống trang bị hoàn chỉnh Nó thích hợp chiết các chất hữu cơ từ các đối tượng mẫu khác nhau Chất phân tích có mẫu rắn, bột, vật mẫu xốp khô (lá cây)…kỹ thuật này được ứng dụng chủ yếu để tách các hợp chất hữu cơ từ các mẫu cây lá, rau quả hoặc mẫu đất như ví dụ trên

Hình 1.5 Hình ảnh bộ chiết shoxlet 1.4.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết shoxlet

 Ưu điểm :

Tiết kiệm được dung môi, không tốn các thao tác lọc và châm dung môi mới Chỉ cần cắm điện, mở nước hoàn lưu thì máy sẽ thực hiện sự chiết Chiết kiệt hợp chất có trong bột cây vì cây liên tục được chiết bằng dung môi tinh khiết

Trong quá trình chiết các hợp chất chiết ra từ bột cây được lưu trữ lại trong bình cầu A, nên chúng tôi bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi vì thế nếu có hợp chất nào kém bền nhiệt sẽ bị hư hại

Do toàn bộ hệ thống của thiết bị đều bằng thủy tinh và được gia công thủ công nên giá thành một thiết bị khá cao Thiết bị bằng thủy tinh nên dễ vỡ, chỉ cần vỡ một bộ phần nào đó thì khó tìm được một bộ phận khác có thể vừa khớp để thay thế

1.5 Phương pháp chuẩn độ Axit – bazơ [2],[10]

trong phương pháp này thường là các dung dịch axit mạnh hoặc bazơ mạnh Trong quá trình chuẩn độ, nồng độ của các ion H+ và OH- thay đổi, tức là

pH của dung dịch thay đổi Vì vậy, để xác định điểm tương đương người ta thường dùng những chất mà màu sắc của chúng thay đổi theo của dung dịch

pH Những chất này được gọi là chất chỉ thị axit – bazơ hoặc chất chỉ thị pH

Đường biểu diễn sự phụ thuộc cảu pH trong quá trình chuẩn độ vào thể tích dung dịch chuẩn thêm vào hoặc lượng chất định phân đã chuẩn độ được gọi là đường định phân Người ta thường dựa vào đường định phân để chọn chất chỉ thị thích hợp nhất

1.5.2 Chất chỉ thị axit – bazơ

Các chất chỉ thị axit – bazơ phần lớn là các chất nhuộm hữu cơ Chúng là các axit hoặc bazơ hữu cơ yếu trong đó dạng axit và bazơ liên hợp

có màu khác nhau, vì vậy màu của chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch

Ta kí hiệu chất chỉ thị là axit Hind và bazơ là IndOH Trong nước các chất chỉ thị đó phân ly như sau:

1.6 Phương pháp phân tích vật lý [6], [7], [8],[11], [15]

1.6.1 Phương pháp xác dịnh phổ hồng ngoại (IR)

1.6.1.1 Cơ sở của phương pháp

Các phân tử luôn dao dộng không ngừng Tần số dao động của các nguyên tử trong phân tử phụ thuộc vào hằng số lực liên kết và khối lượng của chúng, do đó các nhóm chức khác nhau sẽ dao động với các tần số khác nhau nằm trong vùng từ

5000 cm-1 đến 200 cm-1 Mỗi nhóm chức xác định có tần số hấp thụ xác định

và tần số này không đổi trong bất kỳ hợp chất nào chứa nhóm nguyên tử đó

Vì vậy khi phân tích trên quang phổ hồng ngoại ta có thể xác định được các nhóm nguyên tử (nhóm chức) của chất phân tích có được

Khi các phân tử hấp thụ năng lượng từ bên ngoài có thể dẫn đến quá trình quay, dao động xung quanh vị trí cân bằng của nó Tùy theo năng lượng kích hoạt lớn hay nhỏ có thể xảy ra quá trình quay, dao động hay cả quay và dao động đồng thời Để kích hoạt các quá trình trên có thể sử dụng tia sáng vùng hồng ngoại (phổ hồng ngoại) hoặc tia khuyến tán Raman

Bức xạ hồng ngoại liên quan đến phần phổ điện tử nằm giữa vùng khả kiến và vùng vi song có bước sóng nằm trong vùng : vùng hồng ngoại gần : 14290-4000 cm-1 và hồng ngoại xa : 700-200 cm-1 Vùng phổ có ý nghĩa quan trọng nhất là vùng giữa 4000-400 cm-1

Các máy hiện nay có thể mở rộng vùng bức xạ (1000 -100cm-1) Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR

Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một số nhóm chức

Nhiều nhóm chức có dải phổ hấp thụ đặc trưng Đây là cơ sở của việc phân tích bằng IR

Việc xác định được sự có mặt của các nhóm chức trong phân tử giúp chúng ta có thể sử dụng phổ IR để định tính một chất

1.6.1.2 Sơ đồ máy đo phổ hồng ngoại

(2) Mẫu nghiên cứu

(2’) Môi trường đo

Sơ đồ phổ kế hồng ngoại hai chùm tia tán sắc từ nguồn sang S1 phát

ra hai chùm tia song song Một đi qua mẫu, một đi qua cuvet so sánh, sau đó

chập lại qua khe vào S3 đến lăng kính rồi đi qua khe ra S4 đi đến detector

+ Nguồn sáng cho máy phổ hồng ngoại thường dùng đèn Nernst Nhiệt độ đốt nóng khoảng 700 – 8000C

+Lăng kính : Gồm 3 cái được chế tạo từ các vật liệu KBr, NaCl

và liti vì mỗi loại chỉ cho một vùng ánh sang hồng ngoại đi qua

+ Detector : Thường hay dùng là loại detector tế bào quang điện, cặp nhiệt điện hay tỏa nhiệt

+ Cuvet : Thường có hai loại cuvet đo mẫu lỏng và đo mẫu rắn

- Phổ kế hồng ngoại hiện nay gồm các loại : Phổ kế hồng ngoại một

chùm tia dùng kính lọc, phổ kế hồng ngoại hai chùm tia tán sắc và phổ kế

hồng ngoại biến đổi Fourier

( 2 ) (

1

)

( 3 )

( 4 )

( 5 )

( 6 )

- Phổ kế hồng ngoại một chùm tia tán sắc là loại phổ biến trước đây, máy ghi phổ quét cả vùng từ 4000 cm-1 đến 200 cm-1 có nối với bộ tự ghi máy vi tính

- Phổ kế hồng ngoại biến đổi Fourier

Phổ kế hồng ngoại hiện đại là loại phổ kế biến đổi Fourier Loại phổ mới này khác loại phổ kế tán sắc là thay bộ đơn sắc (lăng kính hoặc màng cách tử) bằng một giao thao kế

1.6.1.3 Ứng dụng của phương pháp đo phổ hồng ngoại

- Phương pháp phổ hồng ngoại có thể được ứng dụng trong phân tích định lượng một chất trong dung dịch hay hỗn hợp Cơ sở của phương pháp này là dựa vào định luật Lambert – Beer biểu hiện mối quan hệ giữa sự hấp thụ ánh sang và nồng độ chất

- Phương pháp phổ hồng ngoại chủ yếu được ứng dụng trong định tính các chất hữu cơ Cơ sở của phương pháp này dựa vào 2 nguyên tắc sau:

+ So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử và phổ chuẩn có trong thư viện phổ

+ So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử và phổ chuẩn được ghi trong cùng điều kiện

+ Nếu pha tĩnh là một chất hấp phụ rắn thì kĩ thuật phân tích được gọi

là sắc ký khí – rắn

+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng được gắn lên bề mặt của chất mang trơ hoặc được phủ dưới dạng một lớp phim mỏng lên thành trong của cột mao quản thì kỹ thuật này gọi là sắc ký khí – lỏng

c Cấu tạo và mô hình của sắc ký

Hai bộ phận quan trọng nhất của sắc ký là hệ thống cột tách và detector

 Cột tách: Có 2 loại cột tách là cột nhồi và cột mao quản

+ Ở cột nhồi, cột được nhồi đầy pha tĩnh xốp hay bằng các viên chất mang có phủ lên bề mặt một lớp mỏng pha lỏng tương ứng có khối lượng từ 0,1 – 0,25% khối lượng so với chất mang Khi dòng khí mang len lỏi qua các khe hở trong cột tách, các cấu tử phân tích trong dòng khí mang sẽ được lưu giữ ở pha tĩnh với mức độ khác nhau Nhưng với cột nhồi, chiều dài cột không thể kéo dài một cách tùy ý vì độ chênh lệch áp suất giữa đầu và cuối cột tăng tỉ lệ với chiều dài cột Do đó để khắc phục điều này, người ta đã chế tạo ra cột mao quản

+ Cột mao quản là loại cột tách với đường kính nhỏ hơn 1mm, thành trong của cột được tẩm pha tĩnh, Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đưa mẫu đi qua cột tách rất dài (làm cho năng suất tách cao) mà không gặp trở kháng lớn (về độ chênh lệch áp suất) Các cấu tử sẽ

tương tác với pha tĩnh bám trên thành cột và được lưu giữ lại với mức độ khác nhau Hiện nay người ta hay sử dụng 2 loại cột mao quản phim mỏng

và cột mao quản lớp mỏng

 Detector

Detector là bộ phận có nhiệm vụ chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện Hiện nay tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có nhiều loại detector khác nhau Một số detector thông dụng của GC được liệt kê trong bảng sau:

Detector

Giới hạn phát hiện (g.s-1)

 Bộ phận ghi và hiển thị kết quả

Sơ đồ sắc ký khí

Hình 1.7 Mô hình thu gọn của sắc ký khí

Mẫu được bơm vào trong và theo dòng khí mang (khí mang thường là

N2) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh) Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi đầu dò Từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử

lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ Các chất được xác định nhờ giá trị

thời gian lưu trên sắc ký đồ

- Nguồn cung cấp khí mang: Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…)

- Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích

- Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi Khi đưa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless)

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace)

- Cột phân tích : Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản

+ Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 2-4mm và chiều dài 2-3m

+ Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0.5µm), cột có đường kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m

0.2-1.6.2.2 Phương pháp khối phổ MS

a Khái niệm

Phương pháp phổ khối: Là một kĩ thuật dùng để đo đạt tỉ lệ khối lượng trên điện tích của ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, bao gồm:

+ Xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó

+ Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất + Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách riêng của nó

+ Định lượng hợp chất trong một mẫu dùng các phương pháp khác + Nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thể khí

+ Xác định các thuộc tính vật lý, hóa học ngay cả sinh học của hợp chất với nhiều hướng tiếp cận khác nhau

Một khối phổ kế là một thiết bị dùng cho phương pháp phổ khối, cho

ra phổ khối lượng của một mẫu để tìm ra thành phần của nó Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông tin dựa vào việc đo đạt cường độ dòng ion Một khối phổ kế thông thường gồm

3 phần: phần nguồn ion, phần phân tích khối lượng, và phần đo đạt

Hình 1.8 Mô hình cơ bản của một khối phổ kế

* Cấu tạo của khối phổ kế:

Máy gồm một đĩa đựng mẫu, máy bắn laster, một ống tròn đảo chiều điện cực liên tục và detector

Bất kỳ máy khối phổ nào cũng có bốn chức năng sau đây:

+ Hệ thống nạp mẫu

+ Bộ phân tích + Bộ ghi tín hiệu

Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760 mmHg, áp suất môi trường

xử lý ion thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg (thấp hơn một phần tỷ của áp suất khí quyển)

Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài

Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo

ra sẽ được phân tích và lưu trữ trong một máy vi tính

1.6.2.3 Sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS

Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ (viết tắt là GC-MS hoặc GCMS) là một phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí

Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas Chromatography)

và Khối phổ (Mass Spectometry)

Hình 1.9 Máy GC-MS

a Nguyên tắc hoạt động

Sắc ký khí là quá trình tách các chất trong cột tách ở trạng thái khí

Cơ sở của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố của mẫu thử giữa 2 pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua toàn bộ bề mặt đó

Nếu pha tĩnh là rắn thì gọi là sắc ký khí rắn Chất rắn là nhồi cột thường là silicagel, rây phân tử hoặc than hoạt tính Qúa trình này chủ yếu là hấp phụ

Nếu pha tĩnh là lỏng gọi là sắc ký khí lỏng Chất lỏng bao bọc quanh

bề mặt chất rắn trơ, gọi là chất mang, tạo nên một lớp phim mỏng Cơ sở của sự tách ở đây chính là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng này

Người ta bơm tiêm vào buồng hay hóa hơi mẫu cần phân tích nhờ có khí mang mà mẫu (dạng khí) được dẫn vào cột tách nằm trong lò điều hòa nhiệt, quá trình tách xảy ra ở đây nhờ các cấu tử của hỗn hợp mẫu phân tích rời cột tách ở các thời điểm khác nhau và lần lượt đi vào bộ dò detector ở đây chúng được chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu điện của detector được khuếch đại ở bộ phận ghi rồi chuyển sang bộ phận chỉ thị kết quả

Trên sắc ký nhận được ta có các tín hiệu ứng với các cấu tử gọi là pic, thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng định tính cho cấu tử phân tích, còn diện tích hay chiều cao của pic là đại lượng đặc trưng định lượng cho cấu tử cần phân tích

b Cấu tạo của máy sắc ký kết hợp khối phổ GC-MS

+ Hệ thống cung cấp khí mang

+ Hệ thống tiêm mẫu

+ Cột tách sắc ký

+ Dectector

+ Bộ phận ghi nhận và hiển thị kết quả

c Ưu điểm và nhược điểm

 Ưu điểm

- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

- Không cần làm bay hơi mẫu

- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

- Độ nhạy cao nhờ đầu dò

- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)

 Nhược điểm:

Phương pháp này ít chọn lọc do không loại trừ hết được ảnh hưởng của nền mẫu

d Ứng dụng của sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS

Đây là phương pháp có thể dùng để định tính và định lượng

- Phân tích: GC-MS có thể phân tách các hỗn hợp hóa chất phức tạp trong không khí hay trong nước Ở đây, tốc độ được quyết định bởi tính bay hơi Chất nào có tính bay hơi cao sẽ di chuyển nhanh hơn chất có tính bay hơi thấp

- Định lượng: GC-MS có thể định lượng một chất bằng cách so sánh với mẫu chuẩn, là chất biết trước và đã được định lượng chuẩn bằng GC-

MS

- Nhận dạng: Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc của các chất đã biết Nếu không tìm được chất tương ứng trong thư viện ,ta thu được một dữ liệu mới và đóng góp vào thư viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định được chính xác loại hợp chất mới này

+ Phân tích các hỗn hợp khí có thành phần phức tạp

+ Phân tích các sản phẩm khí dầu mỏ, không khí, các sản phẩm khí thải và khí công nghiệp Ngoài ra còn được ứng dụng nhiều trong y học, sinh học, công nghiệp và nông nghiêp

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị dụng cụ

2.1.1 Nguyên liệu

- Hạt gấc thu nhận trên địa bàn Huyện Núi Thành - Tỉnh Quảng Nam

- Tên khoa học: Momordica Cochinchinesis

Hình 2.1 Hạt gấc thu nhận Hình 2.2 Nhân hạt gấc sau khi xử lý

2.1.2 Hóa chất

- Các loại dung môi: Nước cất, axeton, etanol và ete dầu hỏa

- Dung dịch chuẩn NaOH 0,01N, dung dịch HCl 0,01N, dung dịch NaOH 0,1N

- Chất chỉ thị Phenolphalein

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

a Thiết bị

- Máy sắc ký khí kết hợp với khối phổ GS-MS

- Máy quang phổ hồng ngoại IR

b Dụng cụ

- Bình định mức các loại

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hạt gấc 1.Là

m sạch 2.X

ử lý

Bột hạt gấc

Xác định

độ ẩm

Xác định hàm lượng tro

Ngâm ete dầu hỏa

nhiều lần

Bột hạt gấc loại béo

Ngâm với các

dung môi

Chiết shoxlet với các thời

2.2.2 Thuyết minh quy trình

a Làm sạch và xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu được nghiên cứu là hạt gấc thu nhận trên địa bàn huyện Núi Thành - tỉnh Quảng Nam Hạt gấc tươi, vỏ ngoài cứng đen, chắc, mép có răng cưa tù rộng

Qủa gấc sau khi thu hái về bổ ngang lấy hạt ra, rửa sạch, tách loại vỏ cứng bên trong Qúa trình tách vỏ phải giữ nguyên phần nhân bên trong, không được vỡ nát và chọn những hạt không thối nhân, không lẫn tạp chất Phần nhân bên trong được băm nhuyễn gần như thành bột hạt gấc để dung môi dễ dàng tiếp xúc với dược chất Lúc này bột hạt gấc có màu trắng hơi đục, có mùi rất khó chịu, nồng, khi sờ vào có cảm giác rất nhờn

Nhận xét :Bằng cảm quan ta có thể nhận thấy trong bột hạt gấc có

hàm lượng chất béo khá lớn

b Loại bỏ chất béo