Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và phân lập phân đoạn các chất có trong dịch chiết của cây thầu dầu (ricinus communis) tại quảng nam

NGUYỄN THỊ THÙY HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CÁC CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CỦA CÂY THẦU DẦU RICINUS COMMUNIS TẠI QUẢ

NGUYỄN THỊ THÙY HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CÁC CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CỦA CÂY

THẦU DẦU (RICINUS COMMUNIS) TẠI QUẢNG NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng, năm 2019

NGUYỄN THỊ THÙY HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CÁC CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CỦA CÂY

THẦU DẦU (RICINUS COMMUNIS) TẠI QUẢNG NAM

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số: 8 44 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS TRẦN MẠNH LỤC

Đà Nẵng, năm 2019

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

6 Bố cục của luận văn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ HỌ THẦU DẦU 4

1.1.1 Họ thầu dầu 4

1.1.2 Các chi thuộc họ thầu dầu 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ THẦU DẦU 5

1.2.1.Tên gọi, phân loại thực vật 5

1.2.2 Đặc điểm hình thái thực vật học 6

1.2.3 Thuộc tính dược lý 7

1.2.4 Thành phần hóa học 16

1.2.5 Một số bài thuốc từ cây thầu dầu Error! Bookmark not defined.8 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 21

2.2 KHẢO SÁT KHỐI LƯỢNG CAO CHIẾT VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 21

2.2.1 Khảo sát khối lượng cao chiết trong mỗi loại nguyên liệu 21

2.2.2.Thử hoạt tính kháng khuẩn 21

2.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THU NHẬN CÁC MẪU CAO CHIẾT 23

ethanol 24

2.4 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN NHÓM CHỨC VÀ ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT TỪ TỔNG CAO ETHANOL 25

2.4.1.Phân tích định tính thành phần nhóm chức các phân đoạn cao chiết từ tổng cao ethanol 25

2.4.2 Định danh thành phần hóa học các phân đoạn cao chiết từ tổng cao ethanol bằng phương pháp GC/MS 27

2.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 28

2.5.1 Sắc ký bản mỏng 28

2.5.2 Phương pháp sắc ký cột 31

2.5.3 Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH LƯỢNG CAO VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC TỔNG CAO ETHANOL 38

3.1.1 Kết quả khảo sát khối lượng cao chiết ethanol từ các bộ phận của cây thầu dầu tía 38

3.1.2 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết ethanol củatừ các bộ phận của cây thầu dầu tía 38

3.2 KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ TỔNG CAO ETHANOL VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TÁCH TỪ TỔNG CAO ETHANOLTỪ RỄ CÂY THẦU DẦU TÍA 41

3.2.1 Kết quả điều chế tổng cao ethanol bằng phương pháp ngâm chiết 41

3.2.2 Kết quả điều chế các cao phân đoạn từ tổng cao ethanol bằng phương pháp phân bố 41

3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH NHÓM CHỨC CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TÁCH TỪ TỔNG CAO ETHANOL BẰNG THUỐC THỬ ĐẶC TRƯNG 43 3.3.1 Kết quả định tính nhóm chức có trong phân đoạn cao hexane tách từ

từ tổng cao ethanol 46

3.3.3 Kết quả định tính nhóm chức có trong phân đoạn cao nước tách từ tổng cao ethanol 48

3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC CHẤT TRONG CÁC PHÂN ĐOẠN CAO TÁCH TỪ TỔNG CAO ETHANOL CỦA RỄ THẦU DẦU TÍA 52

3.4.1 Kết quả định danh thành phần hóa học các chất trong phân đoạn cao hexane tách từ tổng cao ethanol của rễ thầu dầu tía 52

3.4.2 Kết quả định danh thành phần hóa học các chất trong phân đoạn cao ethyl acetate tách từ tổng cao ethanol của rễ thầu dầu tía 57

3.4.3 Kết quả định danh thành phần hóa học các chất trong phân đoạn cao ethyl acetate tách từ tổng cao ethanol của rễ thầu dầu tía 59

3.5 KẾT QUẢ PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CÁC CHẤT TRONG CÁC PHÂN ĐOẠN CAO HEXANE TÁCH TỪ TỔNG CAO ETHANOL 62

3.5.1 Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng các cao phân đoạn tách từ tổng cao ethanol 62

3.5.2 Kết quả phân tích sắc ký cột phân đoạn cao hexan tách từ tổng cao ethanol 66

3.5.1 Kết quả định danh các chất trong phân đoạn cao làm giàu 70

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 800

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao)

PHỤ LỤC

AAS: Atomic Absorption Spectrophotometric

Số hiệu

2.1 Các hóa chất sử dụng trong luận văn 20 3.1 Kết quả khảo sát khổi lượng cao chiết mỗi loại nguyên liệu 38 3.2 Kết quả điều chế cao ethanol của rễ thầu dầu tía 41

3.3 Thể tích dịch chiết và khối lượng cao hexane từ tổng cao

3.10 Thành phần hóa học định danh được trong phân đoạn

hexane tách từ tổng cao ethanol của rễ thầu dầu tía 53

3.11 Thành phần hóa học định danh được trong phân đoạn cao

ethyl acetate tách từ tổng cao ethanol của rễ thầu dầu tía 57

3.12 Thành phần hóa học định danh được trong phân đoạn cao

nước tách từ tổng cao ethanol của rễ thầu dầu tía 59

3.13 Thành phần hóa học trong các phân đoạn cao tách từ tổng

cao ethanol của rễ thầu dầu tía 61

3.14

Kết quả giá trị Rf của các chất xuất hiện trên bản mỏng của

phân đoạn cao hexane giải ly bằng hệ dung môi hexane –

ethyl acetate tỷ lệ 6:4 (d)

63

3.15

Kết quả xác đinh giá trị Rf của các chất xuất hiện trên bản

mỏng của phân đoạn cao ethyl acetate, giải ly bằng ethyl

acetate

64

3.16 Kết quả xác đinh giá trị Rf của các chất xuất hiện trên bản

mỏng của phân đoạn cao nước, giải ly bằng ethyl acetate 65

3.17 Thành phần hóa học định danh được trong phân đoạn

3.18 Thành phần hóa học định danh được trong phân đoạn

3.19 Tổng hợp thành phần hóa học các chất trong một số phân

đoạn sau sắc ký cột của phân đoạn cao n - hexane 77

2.1 Cây cây thầu dầu tía và các bộ phận thu hái từ cây thầu dầu

2.2 Buồng cấy vi sinh vô trùng (a) và đĩa peptri đã được đỗ (b) 22 2.3 Sơ đồ nguyên tác chiết lỏng - lỏng 24

2.4 Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS 7890A/5975C

của hãng Agilent và chương trình nhiệt độ lò cột 28 2.5 Bảng mỏng slicagel Kieselgel 60F254 28 2.6 Các bình triển khai cho sắc ký lớp mỏng 29 2.7 Các cột sắc ký dùng cho sắc ký cột 31 2.8 Các bình hứng dung dịch giải ly 32 2.9 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 37

3.1 Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol lá

3.2 Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol

3.3 Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol

3.4 Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ethanol rễ

3.5 Kết quả điều chế cao ethanol của rễ thầu dầu tía 41 3.6 Chiết phân bố lỏng- lỏng bằng hexane từ cao tổng ethanol 42

3.7

Kết quả chạy sắc ký bản mỏng phân đoạn cao hexane giải ly

bằng các dung môi đơn: hexane (a), ethyl acetate (b),và các

hệ dung môi hexane – ethyl acetate tỷ lệ 8:2 (c), 6:4 (d), 4:6

(e), 2:8 (f)

63

3.8

Kết quả chạy sắc ký bản mỏng phân đoạn cao

dichloromethane giải ly bằng các dung môi đơn: hexane (a),

ethyl acetate (b),và các hệ dung môi hexane – ethyl acetate

tỷ lệ 2:8 (c), 4:6 (d), 6:4 (e), 8:2 (f)

64

3.9

Kết quả chạy sắc ký bản mỏng phân đoạn cao nước giải ly

bằng các dung môi đơn: hexane (a), ethyl acetate (b),và các

hệ dung môi hexane – ethyl acetate tỷ lệ 2:8 (c), 4:6 (d), 6:4

Kết quả chạy sắc ký bản mỏng phân đoạn cao hexane giải ly

bằng các hệ dung môi hexane – ethyl acetate (khởi đầu với

tỷ lệ hexane : ethyl acetate = 8:2 sau đó là 6:4 và kết thúc

bằng dung môi đơn ethyl actate)

3.14 Sắc ký bản mỏng của các bình hứng gộp chung cho phân

3.15 Phân đoạn TDT.H1: khởi đầu với benzene, sau đó là

chloroform kết thúc bằng ethyl actate) 68

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đời sống con người ngày càng không ngừng được nâng cao Bên cạnh đó, sự lam dụng thái quá các sản phẩm công nghiệp lại ảnh hướng đến chất lượng của cuộc sống Vấn đề sức khỏe đang được mọi người hết sức quan tâm, chính vì vậy mà con người có xu hướng quay về với thiên nhiên, thích dùng những sản phầm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo

Hợp chất thiên nhiên, đặc biệt là các hợp chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, các chất bảo vệ, điều tiết sinh trưởng thực vật và là nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm cũng vì thế mà các nhà khoa học không ngừng tìm tòi, nghiên cứu để tìm ra những chất trong tự nhiên mà có lợi cho cuộc sống của con người

Việt Nam nằm ở vùng nhiệt đới có thảm thực vât phong phú, trong đó họ thầu dầu (Euphorbiaceae) là một họ lớn, rất đa dạng Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L., thuộc họ Đại kích (Euphorbiaceae) Thầu dầu thuộc loại cây thảo niên hàng năm (loài trồng tại Trung Âu) hay lưỡng niên (loài trồng tại Nam Âu) và lưu niên (loài trồng tại vùng nhiệt đới), xuất phát từ vùng Đông Phi Châu, sau đó được trồng tại nhiều nơi trên thế giới và đã được thích ứng hóa để trồng tại các vùng ôn đới ở Hoa Kỳ Ở Việt Nam, thầu dầu thường mọc hoang tại các tỉnh như Hà Giang, Bắc ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Đà Nẵng Về công dụng trong y học, mỗi bộ phận của cây thầu dầu có tác dụng y học riêng như chữa phong thấp, đau nhức khớp, đòn ngã sưng đau, sài uốn ván, động kinh, tâm thần phân liệt , Việc nghiên cứu xác định thành phần hóa học, ứng dụng các phương pháp hiện đại để xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất các cây thuộc họ thầu dầu ở Việt Nam là một hướng nghiên cứu triền vọng, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao Nhưng cho đến nay việc nghiên cứu các bộ phận của cây thầu dầu vẫn chưa được nghiên cứu kỹ

Vì vậy, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa

học, hoạt tính sinh học và phân lập phân đoạn các chất có trong dịch chiết của cây thầu dầu (Ricinus communis) tại Quảng Nam” làm luận văn tốt nghiệp của

mình nhằm đóng góp thông tin khoa học về loại cây này

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm hiểu về cây thầu dầu tía (Ricinus communis L) tại Quảng Nam

- Nghiên cứu chiết tách, phân lập và xác định thành phần hóa học chất thu được từ các bộ phận của cây thầu dầu tía

- Thử hoạt tính sinh học của các cao chiết thu được

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Các bộ phân cây thầu dầu (Ricinus communis L) được thu hái vào tháng 8

năm 2018, tại tỉnh Quảng Nam

- Thành phần hóa học trong một số dịch chiết của các bộ phận cây thầu dầu ở Quảng Nam

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về đặc điểm hình thái thực vật, nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học, ứng dụng của các bộ phân cây thầu dầu

- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và phân lập các hợp chất thiên nhiên

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Phương pháp thu hái và xử lý mẫu dược liệu

- Phương pháp chiết rắn – lỏng, lỏng – lỏng bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau

- Thăm dò hoạt tính sinh học các cao chiết

- Phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản mỏng để phân lập một số hợp chất trong cao chiết

- Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) xác định thành phần hóa học trong cao chiết

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Cung cấp các thông tin khoa học về quy trình chiết tách các chất trong các

bộ phận của cây thầu dầu

- Cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phân và hoạt tính của

loài Ricinus communis L Từ đó nâng cao giá trị ứng dụng của chúng trong ngành

dược liệu, đồng thời có hướng quy hoạch, canh tác, khai thác và sử dụng loại thực vật này trên địa bàn tỉnh Quảng Nam

6 Bố cục luận văn

Ngoài phần mở đầu, danh mục các chữ viết tắt, danh mục các bảng, danh mục các hình, kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo và phụ lục Luận văn được chia làm các chương như sau:

Chương 1 Tổng quan (16 trang)

Chương 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (18 trang)

Chương 3 Kết quả và thảo luận (42 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ HỌ THẦU DẦU

1.1.1 Họ thầu dầu

Họ thầu dầu hay còn gọi là họ Đại kích (Euphorbiaceae) là một họ lớn của

thực vật có hóa với 240 chi và khoảng 6000 loài Họ này phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới, với phần lớn các loài tập trung trong khu vực Indonesia, Malaysia và sau

đó là khu vực nhiệt đới châu Mỹ Tại khu vực nhiệt đới châu Phi cũng có nhiều loài, giống, thứ nhưng không đa dạng như các khu vực kể trên Tuy nhiên nhiều loài có trong các khu vực không nhiệt đới như Địa Trung Hải, Trung Đông, miền Nam châu Phi hay miền Nam Hoa Kỳ [8] Trong hệ thực vật Việt Nam, Thầu dầu được

coi là họ lớn, giàu thứ tư sau các họ Lan (Orchidaceae), họ Đậu (Leguminosae), họ Lúa (Graminae) trong số 305 loài thực vật bậc cao có mạch Ở Việt Nam, họ Thầu

dầu hiện đã biết có 75 chi cùng khoảng trên 450 loài và 16 thứ, trong số đó có chi

Noi (Oligoceras) với 131 loài (chiếm 31,58% số loài của cả họ) và 9 thứ (khoảng

56,25%) được coi là đặc hữu Phần lớn các loài và các thứ đạc hữu đều chỉ gặp phân

bố rất hạn chế ở một vài địa phương trong cả nước [1]

Hầu như tất cả các loài trong họ Thầu dầu đều có chứa nhựa mủ và chứng

thường rất độc Nhựa mủ từ Cao su (Hevea braziliensis) là nguồn nguyện liệu quan

trọng trong công nghiệp Song nói chung nhựa mủ của nhiều loài có thể gây dị ứng, gây ngưng kết hồng cầu, gây độc đối với người và gia súc Tuy vậy nhựa mủ của nhiều loài là nguồn dược liệu có giá trị do có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao Hiện nay, những ngiên cứu về mặt khoa học đối với các loài, các chi trong

họ Thầu dầu ở Việt Nam tuy còn trong giai đoạn đầu và chưa nhiều, nhưng cũng đã phát hiện thêm hàng loạt các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao, trong đó

có nhiều hợp chất mới có giá trị Đáng chú ý trong số đó là hợp chất malloapelta B

từ loài Ba bét (Mallotus apelta) có hoạt tính ức chế mạnh quá trình hoạt hóa yếu tố

phiên mã NF – KB, có thể ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư người (ung thử biểu mô KB, ung thư màng tử cung FL, ung thư gan Hep-G2 và ung

thư màng tim RD) [9]

1.1.2 Các chi thuộc họ thầu dầu

Các hợp chất tự nhiên ở các loài, các chi thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

lần lượt là: Me (Phyllanthus) – 48 loài, Ba đậu (Croton) – 45 loài, Ba bét (Mallotus) – 37 loài, Chòi mòi (Antidesma) – 29 loài, các chi Cò sữa (Euphorbia), Bọt ếch

(Glochidion) và Mòng lông (Trigonostemon) đều có 26 loài, Rau ngót (Sauropus) –

23 loài Các chi có trên 10 loài gồm: Bồ cu vẽ (Breynia), Ba soi (Macaranga), Cách hoa (Cleistanthus), Thàu táu (Aporosa), Thổ mật (Bridelia), Da gà (Actephila), Tai tượng (Acalypha) – 8 loài Tới 30 chi chỉ có một loài duy nhất Các chi có số loài được coi là đặc hữu phong phú lần lượt là Me rừng (Phyllanthus) – 26 loài, Ba đậu

(Croton) – 19 loài, Mòng lông (Trigonostemon) – 10 loài, Rau ngót (Sauropus) – 9

loài, Bồ cu vẽ (Breynia) -8 loài, Cách hoa (Cleistanthus) – 7 loài, Ba bét (Mallotus) – 6 loài, Bọt ếch (Glochidion) – 5 loài và Vông đỏ (Alchornea) – 4 loài Các dạng sống gặp ở Thầu dầu (Euphorbiaceae) có thể là có hằng năm, cỏ nhiều năm, bụi,

bụi trườn, dây leo, gỗ nhỏ hoặc gỗ lớn Chúng phân bố khá rộng rãi ở các hệ sinh thái khác nhau từ các vùng ven biển, ruộng vườn, đồng cỏ đến các thảm cây bụi và các loại hình rừng thứ sinh hoặc nguyên sinh trên núi cao [8]

1.2 TỔNG QUAN VỀ THẦU DẦU

1.2.1 Tên gọi, phân loại thực vật

Tên khoa học: Ricinus communis L

Tên thông thường: Thầu dầu, Thầu dầu tía, Đu đủ tía

Theo phân loại thực vật:

- Giới (regnum) : Thực vật ((Plantae)

- Ngành (phylum) : Thực vật có hoa (Angiospermae)

- Lớp (class) : Thực vật 2 lá mầm (Eudicots)

- Họ (familia) : Đại kích (Euphorbiaceae)

- Tông (tribus) : Cỏ Tai tượng (Acalypheae)

- Chi (genus) : Ricinus

- Loài (species) : Bét (R communis)

Hình 1.1.Cây thầu dầu mọc ở vùng đất bị bỏ hoang [Nguồn: internet]

Thầu dầu Ricinus communis L., họ Đại kích (Euphorbiaceae) là thành viên

duy nhất trong chi Ricinus cũng như của phân tông Ricinae Ricinus là một từ trong

tiếng La – tinh để chỉ các loài bét (thuộc bộ Acarina)

Thầu dầu là một cây thuốc mọc cao tới 6m và phân bố quanh các lục địa khác nhau bao gồm Bán đảo Ả Rập Cây thầu dầu đã được trồng từ 6000 năm trước [29] Tên thực vật của R.Communis được đặt ra bởi nhà tự nhiên học Thụy Điển Carlos Linnaeus vào thế kỷ 18 [24] Một số học giả tin rằng nguồn gốc của nó là từ Châu Phi nhiệt đới Ở Ả Rập Saudi, nó thường được gọi là Kherwa [29] Đây là một loại cây bụi angiosperm Hạt thầu dầu là một loại cây có hạt, cây phát triển nhanh, hút thảo mộc lâu năm thuộc họ spurge (Euphorbiaceae), bao gồm khoảng 6300 loài [27] Thầu dầu đã là một tác nhân trị liệu trong 4000 năm, được sử dụng như một loại thuốc thảo dược để điều trị nhiều bệnh khác nhau, rối loạn và cũng có nhiều bệnh nhiễm trùng Lá, rễ, vỏ cây và các bộ phận khác nhau của thầu dầu đã được sử dụng cho mục đích y học Nó đã được sử dụng như thuốc nhuận tràng trong 2500 năm ở Hy Lạp và Rome [29]

1.2.2 Đặc điểm hình thái thực vật học

Mặc dù nó có thể có nguồn gốc từ Đông Phi, nhưng ngày nay nó đã phổ biến trên toàn thế giới Thầu dầu dễ thích nghi với môi trường sống mới và có thể tìm thấy ở các vùng đất bị bỏ hoang và gần đây được trồng nhiều để làm cảnh trong công viên hay các nơi công cộng khác Ở Việt Nam thầu dầu mọc hoang và được

trồng ở nhiều tỉnh: Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Quảng Nam, Đà Nẵng [1]

Trồng trọt và thu hoạch: trồng bằng hạt vào tháng 12 đến tháng 1, thu hoạch

và tháng 4 đến tháng 5, mỗi ha cho khoảng 375 – 750 kg hạt Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 40 vạn tấn thầu dầu

Hình 1.2 Thầu dầu [Nguồn: internet]

Hiện nay ở Quảng Nam cây thầu dầu hoang mọc rất nhiều, đặc biệt là ở các vùng Hội An và Điện Dương Tuy nhiên việc trồng cây thầu dầu để thu hoạch thì chưa có và cũng không có một cơ sở doanh nghiệp nào ở Quảng Nam thu mua để sản xuất

Hình dáng: Thầu dầu hiện diện dưới dạng một cây thân thảo hay một tiểu

mộc, nhất niên hoặc đa niên tùy theo điều kiện khí hậu vùng cây mọc Cây sống dai, chiều cao có thể đạt từ 2 – 5m (ở một số nước phần gốc có thể đạt tới 10m) [5]

Hình 1.3 Lá thầu dầu [Nguồn:internet]

Trong lá chứa một alkaloid – chất ricinin, chất này có thể gây ngộ độc cho thú vật chăn nuôi Trong dân gian lá thầu dầu được dùng để trị viêm mủ da, eczema, mẩn ngứa, ung nhọt, viêm tuyến vú, viêm đau khớp, diệt dòi, giết bọ gậy Theo kinh nghiệm y học dân tộc cổ truyền, lá tươi giã đắp vào lòng bàn chân để chữa sót nhau, hoặc đem lăn vào trước ngực và sau lưng để chữa bệnh sởi không mọc [27] Dầu có nguồn gốc từ lá thầu dầu được sử dụng để làm giảm chứng đầy hơi ở trẻ sơ sinh Đắp lá thầu dầu vào ngực để tăng tiết sữa cho phụ nữ Chiết xuất từ lá của cây thầu dầu đang được bán trên thị trường dưới tên thương mại “Spra Kast” tại Hoa Kỳ [35]

b Hoa thầu dầu

Cụm hoa mọc chùm Hoa đơn tính không cánh Hoa đực ở phía dưới cụm hoa Hoa đực có 5 lá đài và nhiều nhị phân nhánh mang một ô của bao phấn Hoa cái có 3 lá đài và 3 noãn Bầu thượng 3 ô, mỗi ô chứa 1 noãn, ngoài có gai mềm, hoa đồng chu tức hoa đực và hoa cái trên cùng một cây, nhiều tiểu nhụy, màu vàng, đơm thành như một cây chia nhánh; hoa cái cũng vô cánh, noãn sào có gai [7]

Hình 1.4 Hoa thầu dầu [Nguồn:internet]

c Quả và hạt thầu dầu

Quả thầu dầu được tạo thành từ các nang, sắp thành bông dạng quả Khi chín, các nang này tách ra để lộ các hạt Thông thường các quả thầu dầu không chín hẳn cùng một lúc, tuy nhiên có thể thu hoạch hạt thầu dầu khi chúng bắt đầu chín Khi thu hoạch nên dùng tay và nếu cần có thể tiếp tục phơi nắng để quả thầu dầu khô hẳn, sao cho hạt thầu dầu tách rời khỏi các nang bao bọc Quả khô gồm có 3 ngăn vỏ cứng, trên mỗi ngăn có một rãnh nông, khi chín nứt thành 6 mảnh Hạt hình trứng, có vỏ bên ngoài cứng trông giống con ve chó, hơi dẹt, dài khoảng 8 mm, rộng khoảng 6 mm, ở đầu có mồng (chính là áo hạt của noãn khổng) Mặt hạt nhẵn bóng màu nâu xám, có vân đỏ nâu hay đen, nội nhũ chứa nhiều dầu [6]

Hình 1.5 Quả thầu dầu [Nguồn:internet]

Hạt thầu dầu có kích cỡ không giống nhau phụ thuộc vào nhiều điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây Trọng lượng hạt thông thường nằm trong khoảng

từ 0.3 – 0.5 g, trong đó vỏ và nhân (chiếm khoảng 75% trọng lượng hạt), cho khoảng 45% dầu Thành phần chủ yếu là xenluloza và hemixenluloza, hầu như không chứa dầu hoặc rất ít, hơn nữa vỏ đảm nhiệm chức năng bảo vệ cơ học cho quả hoặc hạt dầu nên có độ bền lớn

Thành phần: hạt chứa 50% dầu, 26% protein trong đó có ricin là một protein độc, 0,2% ricin, ngoài ra còn có enzim lipase, vitamin, …

Hình 1.6 Hạt thầu dầu [Nguồn:internet]

Đặc điểm vi phẫu hạt: lớp vỏ hạt gồm 1 hàng tế bào biểu bì mang màu sắc

khác nhau tạo thành vân trên vỏ hạt, lớp mo mềm gồm vài hang tế bào hình giậu, một lớp mô cứng gồm các tế bào hình giậu chiều dài gấp 12-15 lần chiều rộng, màu nâu thẫm, thành rất dày Một lớp màng trong gồm các tế bào hình dẹt có chứa tinh thể canxi oxalat Nội nhũ cấu tạo bởi những tế bào đa giác có chứa giọt dầu và hạt alơron Các đặc điểm trên có thể dùng phát hiện khô dầu thầu dầu trộn trong thức ăn gia súc gây ngộ độc

d Rễ thầu dầu

Rễ nhạt, hơi cay, tính bình, có tác dụng khƣ phong hoạt huyết, giảm đau trấn tĩnh Rễ dùng chữa phong thấp đau nhức khớp, đòn giã sƣng đau, sài uốn ván, động kinh, tinh thần phân liệt

Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của Abhishek Mathur và các cộng sự thì dịch chiết từ rễ thầu dầu bằng dung môi n-hexan cho thấy hoạt tính kháng khuẩn nổi bật với chủng nấm Albicans Candida và Aspergillus Niger, dịch chiết rễ thầu dầu bằng dung môi metanol cho thấy có hoạt tính kháng khẩn đối với chủng E.coli và Aspergillus Niger [9]

Theo một số nghiên cứu thì thành phần cấu tạo của rễ gồm hợp chất sterol: cholesterol (C27H46O), campesterol (C28H48O), gama-sitosterol, stigmasterol

(C29H48O),phytol (C20H40O), Ngoài ra còn có các hợp chất khác nhƣ: Ethanon

(C9H10O3), n-hexadecanoic axit (Palmitic Acid) (CH3-(CH2)14-COOH) và axit oleic (CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH), các axit stearic (CH3-(CH2)16-COOH),9,12-

Octadecadienoic acid (Z,Z)- (Axit linoleic)(C19H34O2), 1,2,3-Benzenetriol (Tamin)(C6H6O3), Furfural(C5H4O2), 3-Pyridinecarbonitrile-1,2-dihydro-4-methoxy-1-methyl-2-oxo- (Ricinine) (C8H8N2O8)…[19]

e Dầu thầu dầu

Dầu thầu dầu được tách ra từ hạt thầu dầu bằng ép cơ học hay trích ly với dung môi Nó là chất lỏng không màu hoặc hơi vàng, rất sánh, mùi đặc biệt, vị khó chịu và buồn nôn So với nhiều loại dầu khác thì dầu thầu dầu có độ nhớt cao nhất (khoảng 1,000 cP ở nhiệt độ 200C), trọng lượng riêng cao nhất: 0,956 – 0,970 ở nhiệt độ 150C và tính tan cao nhất trong cồn và các dung môi phân cực [3]

Theo một số nghiên cứu thì thành phần cấu tạo của dầu: gồm acylglycerol của axit ricinoleic (C18H24O3) (90%), ngoài ra còn có các axit stearic, axitpalmitic và axit oleic Khoảng 0,12% (so với hạt) là các hợp chất phospholipids, trong đó inozitolphosphatid chỉ có với hàm lượng thấp còn 83% là phosphatidyletanolamin

và 13% là phosphatidylcolin, phosphatidylcerin Kết quả phân tích bằng sắc kí khí

cho thấy trong cấu tạo của phospholipids có 27,7% axit panmitic, 12,9 % axit stearic, 18,5% axit oleic và 33,2% axit linoleic, không thấy axit ricinoleic Ngoài ra còn có các hợp chất sterol: cholesterol (C27H46O), campesterol (C28H48O), stigmasterol (C29H48O) v.v [17]

Nghiên cứu của các nhà khoa học Stefan Offermanns và Sorin Tunaru thuộc Viện Max Planck ở Bad Nauheim là một khám phá hết sức quan trọng Sorin Tunaru, người chủ trì dự án nghiên cứu này nói “Dầu thầu dầu được biết đến từ lâu

có chứa thành phần cơ bản làaxit ricinoleic, axit này gây tác động ở ruột và đóng vai trò chính trong việc tạo ra các tác dụng dược lý Mặc dù, trước đây nhiều tác giả cho rằng axit ricinoleic có tác động lên niêm mạc ruột nhưng đó chỉ là giả thuyết Nhưng đến này chúng tôi có thể công bố chính thức rằng dầu thầu dầu thực sự có hiệu quả dược lý” [27]

Đặc điểm nổi bật trong nghiên cứu của Stefan Offermanns là việc chỉ ra một thực thể gắn protein G tác động trực tiếp đến việc truyền tín hiệu trong tế bào Sorin Tunaru đã lần đầu tiên tìm thấy hiệu ứng đặc trưng của thụ thể trong một thí nghiệm với axit ricinoleic từ việc nuôi cấy các tế bào khác nhau Trên cơ sở này, các nhà

nghiên cứu tại Bad Nauheim đã tiếp tục các nghiên cứu chi tiết hơn Các nhà nghiên cứu đã sử dụng kĩ thuật để tắt hoạt tính của tất cả các cụ thể một cách hệ thống, sau

đó tiến hành phản ứng với axit ricinoleic Kết quả cuối cùng cho thấy thụ thể EP3 như là một “công tắc” được “bật lên” sau khi tiếp xúc với axit ricinoleic [27]

Hình 1.7 Dầu và hạt thầu dầu [Nguồn:internet]

1.2.3 Thuộc tính dược lý

- Hoạt tính kháng khuẩn: Cây thầu dầu có đặc tính kháng khuẩn chống lại các

vi sinh vật khác nhau Một số hoạt tính kháng khuẩn được tìm thấy ức chế các loại

vi khuẩn khác nhau như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis và Staphylococcus aureus kháng methicillin [11] Một nghiên cứu được thực hiện để kiểm tra hoạt động kháng khuẩn chỉ ra rằng dịch chiết nước thầu dầu cho thấy hoạt tính cao nhất chống lại Staphylococcus aureus và hoạt động thấp nhất được chỉ ra đối với bệnh viêm phổi Klebsiella [22] Một nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên cho thấy hoạt tính chống lại mầm bệnh vi khuẩn hoàn toàn là do sự có mặt của natri ricinoleate trong dầu thầu dầu gây tổn thương thành tế bào và dẫn đến chết tế bào do mất các thành phần tế bào chất [28]

- Hoạt tính chống nấm

Các bộ phận khác nhau của thầu dầu bao gồm cả rễ, lá và thân cây được biết

là có hoạt tính kháng nấm Cả hai dịch chiết từ methanol và dịch nước của thầu dầu được tìm thấy có hoạt tính chống lại nhiều loài nấm Một nghiên cứu đã được thực hiện để thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của dịch chiết thầu dầu chống lại các loài nấm khác nhau, hoạt tính kháng nấm tối đa chống lại Candida albicans và hoạt động

thấp nhất được phát hiện chống lại Alternaria solani [35] Một trong những nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol có hoạt tính ức chế nổi bật chống lại Aspergillus niger và Aspergillus fumigatus [18] Một nghiên cứu khác, được thực hiện với dịch chiết lá thầu dầu dạng nước đã cho thấy hoạt động thấp nhất chống lại Aspergillus fumigates và Aspergillus flavus [10]

- Hoạt tính chống tiểu đường

Bệnh tiểu đường là một bệnh mãn tính xảy ra hoặc khi tuyến tụy không sản xuất insulin theo yêu cầu của cơ thể hoặc do sự phát triển của tình trạng kháng insulin Một nghiên cứu đã được thực hiện để kiểm tra hoạt động chống đái tháo đường của dịch chiết etanol của rễ thầu dầu và đã được tìm thấy là có hiệu quả chống hạ đường huyết ở chuột [31] Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của thầu dầu như là một tác nhân trị liệu để kiểm soát bệnh tiểu đường

- Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của cây thầu dầu đã được nghiên cứu và báo cáo bởi một số nhà nghiên cứu Các nghiên cứu ban đầu cho thấy tác dụng gây độc tế bào của các thảo dược từ cây thầu dầu trên ba dòng tế bào khác nhau của tế bào HeLa, sarcoma 180 và hồng cầu của con người [16] Lin và Liu đã quan sát thấy sự gia tăng tuổi thọ của những con chuột được điều trị bằng ricin A [20] Trong một nghiên cứu, dịch chiết của cây thầu dầu được tìm thấy có tác dụng gây độc tế bào trên các dòng tế bào A375 (dòng tế bào ung thư khối u ác tính ở người) với giá trị IC50 là 48 μg/mL [30]

Một số nghiên cứu in vitro khác đã được thực hiện để kiểm tra tác dụng gây độc tế bào của cây thầu dầu trên các dòng tế bào khác nhau như ung thư ruột kết, ung thư gan, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư buồng trứng (OVCAR-5), u hắc tố da (B16F10) và tuyến tiền liệt ung thư Ở nồng độ thấp hơn khoảng 100 μg /

mL, dịch chiết từ cây thầu dầu đã được thử nghiệm chống lại các dòng tế bào ung thư này và được chứng minh là có hiệu quả [25]

- Hoạt tính chống viêm

Cây thầu dầu đã được chứng minh là có hoạt động chống viêm mạnh mẽ Các dịch chiết methanol cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể có thể là do flavonoid

có trong nó Trong nghiên cứu này, các dòng tế bào đại thực bào thô 264,7 đã đƣợc

sử dụng để kiểm tra hoạt động chống viêm [23]

Một nghiên cứu khác của Lindauer et al đã chứng minh hoạt động chống viêm của thầu dầu bởi ricinolein [19] Các nghiên cứu in vivo cho hoạt động chống viêm

đã đƣợc thực hiện trong hai mô hình động vật: mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan và mô hình u hạt viên bông Trong mô hình carrageenan, liều 100 mg/kg đã đƣợc tìm thấy để ức chế phù nề 26,47% [34] Dịch chiết methanol làm giảm phù nề 43,28% trong các mô hình u hạt viên bông với liều 250 và 500 g/kg [32]

- Hoạt tính chống oxy hóa

Nghiên cứu in vitro qua trung gian DPDH (1,1- diphenyl-2-picryohydrazyl) cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của cây thầu dầu do sự hiện diện của các hợp chất nhƣ axit gallic, quercitin, axit gentisic, rutin, epicatechin và axit ellagic trong lá và chiết xuất methanolic [12]

- Hoạt tính diệt muỗi

Thầu dầu thể hiện tác dụng diệt bọ gậy chống lại ấu trùng muỗi khác nhau Các nghiên cứu đã đƣợc thực hiện trên nhiều loài muỗi khác nhau nhƣ Anophele gambiae, Anophele stephens, Anophele albopictus và Culex quonthefasciatus , với

tỷ lệ tử vong gần 100% Nồng độ gây chết từ dịch chiết của hạt của thầu dầu giữa các loài ấu trùng khác nhau nhƣ sau: Culex quinque fasciatus (7.10μg/mL) > Anophele stephensi (11,64 g / mL) > Anophele albopictus (16,84 g/mL) [23] Cây thầu dầu đƣợc tìm thấy có hoạt tính cao nhất chống lại Anophele gambiae, một vector cho bệnh sốt rét Cả ấu trùng đực và cái của Anophele gambiae đều mẫn cảm với dịch chiết Hoạt tính này đƣợc cho là do sự hiện diện của hai hợp chất ricinine

và 3-carboxy-4methoxy-N-methyl-2-pyridone Dịch chiết từ cây thầu dầu đã ghi nhận tỷ lệ tử vong cao nhất với nồng độ gây chết 50 (LC 50) là 0,18 mg/mL [36] Ngoài ra, dịch chiết từ cây thầu dầu đƣợc tìm thấy là có hiệu quả chống lại Anophele arabiensis và Culex quinque fasciatus [15]

- Hoạt tính giảm đau

Các nghiên cứu khác nhau đã đƣợc thực hiện để chứng minh hoạt tính giảm

đau của dịch chiết từ cây thầu dầu Các tác dụng kích thích như tăng động, cải thiện trí nhớ và co giật là do ricinine trong cây thầu dầu [17]

Trong một nghiên cứu khác, hoạt động giảm đau của dịch chiết vỏ cây thầu dầu được đánh giá dựa trên một loại thuốc tiêu chuẩn diclofenac với liều 50 mg/kg Liều chiết xuất từ thầu dầu được sử dụng là 100 và 200 mg/kg ở chuột bạch tạng Hai phương pháp đã được sử dụng để xác định hoạt động giảm đau, đó là phương pháp tấm nóng của Eddy và phương pháp ngâm đuôi [17], [13]

- Hoạt tính chống co giật

Một số hợp chất phân lập từ cây thầu dầu đã được thử nghiệm cho hoạt động chống co giật và được đã chứng minh là có hoạt tính co giật Sau khi điều trị sốc điện, tất cả các động vật biểu hiện co giật Động vật nhận được một liều 60 mg / kg hợp chất từ hạt cây thầu dầu cho thấy sự ức chế co giật đến khoảng 82% so với một loại thuốc tiêu chuẩn có biểu hiện ức chế co giật 8,89% [37]

- Hoạt tính chống loét

Cây thầu dầu đã được tìm thấy để sở hữu các đặc tính chống loét đáng kể Một nghiên cứu được thực hiện với liều ban đầu 500 mg/kg đã chứng minh tính chất chống loét của cây thầu dầu Cơ chế hoạt động chống loét của thầu dầu là hoạt động bảo vệ tế bào và tăng cường niêm mạc dạ dày cuối cùng dẫn đến việc tăng cường bảo vệ niêm mạc [26]

- Hoạt tính chống hen suyễn

Trong một nghiên cứu của Dnyaneshwar và Patil đã cho thấy hoạt tính chống hen suyễn đáng kể của cây thầu dầu, tác dụng ổn định tế bào mast do hàm lượng saponin trong rễ của nó, trong khi flavonoid chịu trách nhiệm cho sự giãn phế quản

và hoạt động giãn cơ trơn Hoạt động chống dị ứng được xác định bằng các nghiên cứu in vivo đóng vai trò quan trọng trong điều trị hen suyễn [14], [35]

- Tái tạo xương

Dầu của cây thầu dầu đã được sử dụng trong các bệnh liên quan đến xương trong thời kỳ cổ đại như một loại thảo dược và thuốc dân gian Các bệnh từng được điều trị bởi cây thầu dầu bao gồm biến dạng xương, viêm tủy xương cấp tính, đau khớp và chân tay bị ảnh hưởng [29] Thầu dầu có khả năng tái tạo xương duy nhất

mà không hình thành bất kỳ vết sẹo nào sau khi bị tổn thương Nghiên cứu trên động vật được thực hiện để điều trị viêm xương khớp bằng cách sử dụng Lawsonia inermis và thầu dầu trên chuột trong 14 ngày và đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong điều trị mà không có tác dụng phụ A [38] Tất cả các dữ liệu trên đã xác nhận hoạt tính cải tạo xương của dầu thầu dầu và nó có thể là một chất cải tạo xương mới để điều trị viêm khớp và viêm xương khớp

1.2.4 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của cây thầu dầu tía được khám phá qua nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới Thành phần hóa học chủ yếu của thầu dầu gồm alkaloids, flavonoid, terpenes, saponin, các hợp chất phenolic như kaempferol, axit gallic, ricin, rutin, lupeol, axit ricinoleic, pinene,…[21]

Một số chất tiêu biểu [7]:

Nhóm Sterol gồm có Campesterol, gama-sitosterol và stigmasterol; các cấu

tử này chiếm hàm lượng cao trong rễ cây thầu dầu Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất Phytosterol có ích trong việc ức chế ung thư phổi, dạ dày và ung thư

vú Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Phytosterol có thể ức chế hấp thụ Cholesterol, làm giảm nồng độ Cholesterol trong máu và giảm nguy cơ bệnh tim mạch

* Stigmasterol

O H

* Gama-sitosterol

O H

O H

OH

* n-hexadecanoic axit (Palmitic Acid)

O

OH

* Octadecanoic acid (acid stearic)

1.2.5 Một số bài thuốc chữa bệnh từ cây thầu dầu

- Chữa bệnh động kinh: Lấy rễ cây thầu dầu đỏ (tía) 50g, trứng gà 2 quả,

dấm ăn 10ml Trước tiên lấy rễ thầu dầu đỏ sắc lấy 150ml nước, bỏ bã và cho trứng

gà vào khi nước đang còn nóng, đồng thời cho luôn cả dấm rồi đun tiếp Ăn trứng uống nước canh Mỗi ngày cần ăn hết 1 liều này Ăn liên tục 7 – 10 ngày là một liệu trình [3]

- Chữa đau đầu do cảm: lấy lá thầu dầu tía đắp lên trán và 2 bên thái dương, một lát sau sẽ thấy đầu nhẹ giảm hay khỏi đau

- Làm thuốc để tẩy nhẹ: lấy dầu hạt thầu dầu 10-30g, uống vào lúc đói, chỉ cần sau 3-4 giờ là sẽ đi tiêu nhiều lần mà không bị đau bụng Nếu muốn tẩy mạnh chỉ cần tăng liều dầu hạt thầu dầu lên 30-50g thì sẽ đi đại tiện kéo dài 5-6 giờ liền [4]

- Chữa sa tử cung và trực tràng: lấy hạt thầu dầu giã nát sau lấy đắp lên đầu

- Sinh khó hay sót nhau: lấy hạt thầu dầu 14 hạt, giã nát đem rịt vào lòng bàn chân cả 2 bên, nhưng khi đã sinh xong hay nhau sót đã ra hết phải tháo bỏ ngay thuốc ra và rửa sạch lòng bàn chân nơi đã đắp thuốc [8]

- Chữa liệt thần kinh mặt: lấy hạt thầu dầu giã nát đắp vào phía mặt nơi đối diện

- Chữa hen suyễn: Dùng lá thầu dầu tía 12 gam, phèn phi 8 gam; hai vị tán nhỏ, nhồi với 160 gam thịt lợn giã nhỏ, làm viên chả, gói lá sen non, đun nhỏ lửa nấu chín mà ăn

- Chữa viêm tuyến vú: Hái lá thầu dầu tươi, giã nát, chưng với giấm đắp vào chỗ bệnh; ngày đắp 2 lần

- Chữa lở ngứa ngoài da: Dùng lá thầu dầu nấu nước tắm rửa

- Chữa phong thấp viêm khớp đau nhức, chân tay mỏi: Dùng rễ thầu dầu 12 gam, dây đau xương 20 gam, lõi thông 15 gam, sắc nước uống trong ngày [2]

- Hạt thầu dầu giã nhỏ, chế thành thuốc cao dán để chữa viêm hạch cỏ, viêm tuyến vú, thuốc cao dán gồm nhân hạt thầu dầu kết hợp với ngũ bột tử theo tỉ lệ

98:2, dán vào huyệt bách hội có thể chữa sa dạ dày [3]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

2.1.1 Nguyên liệu

Các bộ phận của cây thầu dầu tía thu hái vào tháng 8 năm 2018 tại Hội an, Quảng Nam được thể hiện trên hình 2.1

Hình 2.1 Cây cây thầu dầu tía và các bộ phận thu hái từ cây thầu dầu tía

Nguyên liệu thô sau thu hái được rửa sạch, để khô trong không khí, nghiền mịn, bảo quản trong bao polyetylene và đựng trong hộp có nắp, để nơi râm mát theo quy định bảo quản bột dược liệu

2.1.2 Hóa chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (P), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu của luận văn này được đưa ra trên bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong luận văn

STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc

1 Hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc

2 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc

3 Ethanol 96% Tinh khiết TCCS Trung Quốc

4 Diclometan Tinh khiết TCCS Trung Quốc

5 H2SO4 (98%) Tinh khiết TCCS Trung Quốc

6 (Bi(NO3)3.H2O 98% TCCS Trung Quốc

8 HCl đặc Tinh khiết TCCS Trung Quốc

9 HgCl2 Tinh khiết TCCS Trung Quốc

10 NaOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc

12 NH4OH Tinh khiết TCCS Trung Quốc

13 Vanillin Tinh khiết TCCS Trung Quốc

14 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc

15 Fe2(SO4)3 Tinh khiết TCCS Trung Quốc

16 CH3COOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc

17 KOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc

18 Formol 36% Tinh khiết TCCS Trung Quốc

19 Na2SO4 Tinh khiết TCCS Trung Quốc

Sắc ký lớp mỏng dùng loại đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2

- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 100 Perkin Elmer

- Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS LAMBDA25

- Máy sắc ký kết hợp khối phổ GC – MS

2.2 KHẢO SÁT KHỐI LƯỢNG CAO CHIẾT VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

2.2.1 Khảo sát khối lượng cao chiết trong mỗi loại nguyên liệu

* Nguyên liệu: Bột lá Thầu dầu của cây lá to, lá nhỏ; Bột rễ Thầu dầu của cây

lá to, lá nhỏ; Bột cành, thân Thầu dầu của cây lá to, lá nhỏ

* Tiến hành: Cho vào 4 bình tam giác nút nhám mỗi bình 100g bột nguyên

liệu các loại, thêm vào 800ml ethanol 80o, chiết 3 lần, mỗi lần 24 giờ Dịch chiết được cô đuổi dung môi đến cao khô, cân đến khối lượng không đổi

2.2.2 Thử hoạt tính kháng khuẩn

Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch với các chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) tại Phòng Nghiên Cứu Vi Sinh – khoa Sinh – Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng

* Nguyên liệu:

- Dịch chiết từ bột các bộ phận cây thầu dầu trong dung môi ethanol 80o

- Một số chủng vi sinh vật kiểm định

* Kiểm định khả năng kháng khuẩn gây bệnh

Vi khuẩn Gram (-) : Escherichia coli; Salmonella typhi

Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis

- Đĩa peptri - Que cây, que gắp

- Dụng cụ chiết - Giá để ống nghiệm

- Đũa thủy tinh - Máy hiệu chỉnh pH

Hình 2.2 Buồng cấy vi sinh vô trùng (a) và đĩa peptri đã được đỗ

môi trường cấy vi sinh(b)

Nguyên tắc: Ức chế tăng trưởng của vi sinh vật chỉ thị bằng dịch chiết từ các

bộ phận của cây thầu dầu Kiểm tra bằng khả năng khuếch tán qua giếng thạch

Cách thực hiện:

- Trên môi trường agar trải vi sinh vật chỉ thị vào

- Dùng ống nhôm đục 2 lỗ thạch đường kính 8 mm

- Lấy 0,1ml dịch chiết các bộ phận cây thầu dầu cho vào hai lỗ

- Cho vào tủ lạnh 4oC trong thời gian 5 -6 giờ để dịch chiết khuếch tán ra môi trường

- Ủ hiếu khí trong tủ ấm với nhiệt độ và thời gian phù hợp với từng vi sinh vật

- Quá trình đục lỗ: Tất cả quá trình thực hiện bên trong tủ cấy vô trùng, mở nắp đĩa peptri, dùng ống nhôm đường kính 8mm khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn Đục lỗ thạch Đậy nắp đĩa lại.Hơ qua ngọn lửa đèn cồn và bảo quản bằng màng bọc thực phẩm

2.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THU NHẬN CÁC MẪU CAO CHIẾT 2.3.1 Phương pháp ngâm dầm (chiết rắn – lỏng) điều chế tổng cao ethanol

a Mục đích:Ngâm chất rắn (đã được nghiền nhỏ) vào dung môi thích hợp ở

nhiệt độ và thời gian xác định Sau đó lọc lấy phần dung dịch rồi cô đuổi dung môi

ở áp suất thấp nhằm mục đích lấy lượng chất có khả năng hòa tan trong dung môi

đó Có thể lặp lại vài lần để lấy hết lượng chất

b Cách tiến hành:Lấy 1500g bột mẫu nghiên cứu ngâm chiết bằng ethanol

96o ở nhiệt độ phòng, thời gian ngâm chiết 24 giờ, sử dụng máy khuấy (hoặc lắc đều sau mỗi 15 phút) để đảm bảo cho sự khuyếch tán tốt Lọc gạn lấy phần dịch chiết rồi tiếp tục lọc qua giấy lọc trên phễu Buschle Lặp lại 4 lần, lần đầu dùng 10 lít ethanol, những lần sau mỗi lần dùng 5 lít ethanol Gộp các dịch chiết và cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp thu được tổng cao ethanol của mẫu nghiên cứu Cân xác định khối lượng cao thu được và tính % khối lượng cao chiết so với khối lượng mẫu ban đầu

c Tính toán kết quả:Hàm lượng tổng cao ethanol được tính theo công thức:

% mcao ethano l = x 100

mcao ethanol

mbột mẫu nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng tách các phân đoạn cao từ tổng cao ethanol

a Mục đích:

Tổng cao ethanol thu được chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng được áp dụng để phân chia các chất có trong đó thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Hình 2.3 Sơ đồ nguyên tác chiết lỏng - lỏng

Dùng các dung môi có tính phân cực khác nhau để phân tách và thu nhận các loại cao chứa các nhóm hợp chất có độ phân cực khác nhau từ tổng cao ethanol (chứa hầu như tất cả các hợp chất hữu cơ của trong mẫu)

b Cách tiến hành:Lấy cao ethanol (50 – 200g) thu được đem phân tán vào

200 – 300ml nước cất (vì cao ethanol khó tan ngay trong nước nên ban đầu ta hòa nhuyễn bằng 20ml ethanol 960, sau đó thêm dần nước, dùng đũa thủy tinh hay thìa inox loại nhỏ khuấy đều để cao phân tán đều trong nước) rồi cho vào bình thủy tinh

có nút kín loại 1 lít Sau đó tiến hành chiết lỏng- lỏng lần lượt với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần là hexane, dichloromethane và ethyl acetate Mỗi loại dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi, thời gian lắc chiết mỗi lần là 3 giờ ở nhiệt độ phòng Sau khi chuyển vào phễu chiết, khi thấy tách lớp hoàn toàn (chừng 1 – 2 giờ), chiết riêng phần dung môi và phần dịch nước, xác định thể tích phần dung môi (bằng ống đong), cho vào chai chứa loại 500ml, làm khan bằng cách thêm vào

1 thìa Na2SO4 khan, lắc nhẹ, để lắng rồi trích mẫu thử Gộp dịch chiết của cả 3 lần (với từng dung môi), cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp thu được phân đoạn cao hexane, cao dichloromethane, cao ethyl acetate và cao nước từ cao tổng ethanol

c Tính toán kết quả: Hàm lượng các cao phân đoạn tách từ tổng cao ethanol

được tính theo công thức:

2.4 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN NHÓM CHỨC VÀ ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT TỪ TỔNG CAO ETHANOL

2.4.1 Phân tích định tính thành phần nhóm chức các phân đoạn cao chiết từ tổng cao ethanol

a Định tính alkaloid

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml dung dịch HCl, khuấy đều, lọc qua giấy

lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml

- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thửMayer, nếu xuất hiện kết tủa trắng là phản ứng dương tính

- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt thuốc thửDragendorff, nếu xuất hiện màu cam đỏ

là phản ứng dương tính

- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Wagner, nếu xuất hiện kết tủa màu cam nâu là phản ứng dương tính

b Định tính flavonoid

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml methanol, đun nóng cho tan và lọc qua

giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml

- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt axit sunfuric đậm đặc, đun trong bình cách thủy vài phút, dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là phản ứng dương tính

- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt NaOH 1%/etanol, nếu xuất hiện màu đỏ nâu hoặc

đỏ tím là phản ứng dương tính

- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt AlCl3/etanol 1%, nếu xuất hiện màu xanh lục là phản ứng dương tính

c Định tính terpenoid - steroid

Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml clorofom, khuấy đều, lọc qua giấy lọc,lấy

vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml

- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch đổi sang màu đỏ

% mcao phân đoạn = x 100

mcao phân đoạn

mcao ethanol