Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm viên nang từ dược liệu hướng điều trị huyết khối, đau thắt ngực

Phương pháp định tính, định lượngĐịnh tính Xích thược bằng phương pháp SKLM Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol, lắc kỹ trong 5 phút, lọc.. Định lượng paeoniflorin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-TRẦN KHÁNH DUY

GÓP PHẦN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG TỪ DƯỢC LIỆU HƯỚNG ĐIỀU TRỊ HUYẾT KHỐI, ĐAU THẮT NGỰC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-TRẦN KHÁNH DUY

GÓP PHẦN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG TỪ DƯỢC LIỆU HƯỚNG ĐIỀU TRỊ HUYẾT KHỐI, ĐAU THẮT NGỰC

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN THỊ MINH THUẬNPGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực vàchưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Luận văn Thạc sĩ - Khóa: 2016 - 2018

Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất - Mã số: 8720210

GÓP PHẦN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG

TỪ DƯỢC LIỆU HƯỚNG ĐIỀU TRỊ HUYẾT KHỐI, ĐAU THẮT NGỰC

Trần Khánh Duy Thầy hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Minh Thuận, PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ

Mở đầu: Huyết phủ trục ứ (HPTƯ) là bài thuốc nổi tiếng của y học cổ truyền Trung Hoa,

được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về tim mạch như huyết khối, đau thắt ngực,nhồi máu cơ tim, đột qụy… Nhiều dạng thuốc hiện đại của bài thuốc này đã ra đời như viênnén, viên nang Để đáp ứng nhu cầu điều trị hiện nay, một số công ty dược phẩm tại ViệtNam đã tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm viên nang có thành phần gồm 11 dược liệunhư trong bài thuốc HPTƯ Bên cạnh việc nghiên cứu sản xuất thì công tác kiểm tra đánhgiá chất lượng là yếu tố không thể thiếu Trước những yêu cầu xuất phát từ thực tế đó, chúngtôi tiến hành đề tài “Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm viên nang từ dượcliệu hướng điều trị huyết khối, đau thắt ngực”

Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng: Các TCCS kiểm nghiệm bột Xích thược, cao HPTƯ và viên HPTƯ.

Phương pháp nghiên cứu: (1) Xây dựng quy trình định tính các dược liệu trong cao và viên

HPTƯ bằng SKLM (2) Xây dựng và thẩm định QTĐL amygdalin trong cao và viên HPTƯbằng phương pháp HPLC (3) Xây dựng và thẩm định QTĐL paeoniflorin trong bột Xíchthược và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC (4) Dự thảo TCCS kiểm nghiệm các bánthành phẩm (bột Xích thược, cao HPTƯ) và TCCS kiểm nghiệm thành phẩm (viên HPTƯ)

Kết quả nghiên cứu: Đương quy, Xuyên khung được chiết với n-hexan, dung môi khai triển

n-hexan - ethyl acetat (9 : 1), phát hiện bằng UV 365 nm Chỉ xác, Hồng hoa được chiết vớiethyl acetat, dung môi khai triển cloroform - methanol - nước - acid acetic (13 : 4 : 1 : 1,5),phát hiện: Nhúng dung dịch AlCl3 1% rồi quan sát dưới UV 365 nm Xích thược được chiếtvới aceton, Đào nhân chiết với methanol, Cam thảo, Cát cánh, Sài hồ, Ngưu tất, Sinh địachiết với n-butanol, khai triển với hệ dung môi tương ứng và phát hiện bằng thuốc thử VS.Định lượng amygdalin với pha động methanol - nước (21,5 : 78,5), bước sóng phát hiện 210

nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 l Định lượng paeoniflorin với pha độngacetonitril - KH2PO4 0,05M (18 : 82), bước sóng phát hiện 230 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút,thể tích tiêm mẫu 20 l TCCS quy định hàm lượng paeoniflorin trong bột Xích thược khôngdưới 2,0% Hàm lượng amygdalin trong cao không dưới 1,0% Hàm lượng amygdalin trongviên không dưới 3,0 mg và hàm lượng paeoniflorin trong viên không dưới 2,0 mg

Bàn luận: Quy trình định tính các dược liệu Đương quy, Xuyên khung, Chỉ xác, Sài hồ,

Cam thảo và định lượng paeoniflorin là điểm cải tiến của đề tài so với như CP 2010 Quytrình định lượng amygdalin, định tính Xích thược, Đào nhân, Hồng hoa, Cát cánh, Ngưu tất,Sinh địa là điểm mới của đề tài so với CP 2010

Kết luận: Đề tài đã xây dựng được quy trình định tính tất cả 11 dược liệu gồm Xích thược,

Đào nhân, Đương quy, Xuyên khung, Hồng hoa, Sài hồ, Sinh địa, Chỉ xác, Cát cánh, Ngưutất, Cam thảo có trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp SKLM Xây dựng được quytrình định lượng amygdalin trong cao và viên HPTƯ Xây dựng được quy trình định lượngpaeoniflorin trong bột Xích thược và viên HPTƯ đạt các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống,tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng

Từ khóa: Đào nhân, Xích thược, amygdalin, paeoniflorin, sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Master’s Thesis - Academic course: 2016 - 2018

Specialty: Drug Quality Control & Toxicology - Code: 8720210

THE STANDARDIZATION OF THE CAPSULE PREPARATED FROM MEDICINAL PLANTS FOR TREATMENT THROMBOSIS, ANGINA PECTORIS

Tran Khanh Duy Supervisor: PhD Nguyen Thi Minh Thuan, Assoc Prof PhD Vo Thi Bach Hue Introduction: Huyet phu truc u (HPTU) is a famous remedy of traditional Chinese

medicine, widely used in the treatment of cardiovascular diseases such as thrombosis, anginapectoris, myocardial infarction, stroke Many forms of this remedy had been developed such

as tablets, capsules To meet today’s treatment needs, some pharmaceutical companies inViet Nam have conducted research and production of capsules containing 11 medicinalplants as in HPTU remedy Besides the production research, quality inspection is anindispensable factor From that fact, we conducted research “The standardization of thecapsule preparated from medicinal plants for treatment thrombosis, angina pectoris”

Materials and methods: (1) Development the process to identify the presence of medicinal

plants in HPTU extract and capsule by thin layer chromatography (TLC) (2) Developmentand validation the quantitative process of amygdalin in HPTU extract and capsule by HPLC

(3) Development and validation the quantitative process of paeoniflorin in Radix Paeoniae

powder and HPTU capsule by HPLC (4) Development the standardization for analyzing the

Radix Paeoniae powder, HPTU extract and capsule.

Results: Radix Angelica sinensis, Rhizoma Ligustici wallichii was extracted with n-hexan,

the solvent developed is n-hexan - ethyl acetate (9 : 1), detected by UV 365 nm Fructus Aurantii, Flos Carthami tinctorii was extracted with ethyl acetate, the solvent developed is

chloroform - methanol - water - acetic acid (13 : 4 : 1 : 1,5), spray AlCl3 1% solution then

observed under UV 365 nm Radix Paeoniae was extracted with acetone, Semen Pruni was extracted with methanol, Radix et Rhizoma Glycyrrhizae, Radix Bupleuri chinensis, Radix Platycodi grandiflori, Radix Achyranthis bidentatae, Radix Rhemanniae glutinosae was

extracted with n-butanol, detected by VS reagent Quantitative amygdalin with mobile phase

is methanol - water (21,5 : 78,5), the detective wavelength is 210 nm, flow rate is 1 ml/min,injective volume is 20 l Quantitative paeoniflorin with mobile phase acetonitril - KH2PO4(18 : 82), the detective wavelength is 230 nm, flow rate is 1 ml/min, injective volume is 20

l The content of paeoniflorin in the Radix Paeoniae powder is not less than 2,0% Thecontent of amygdalin in the HPTU extract is not less than 1,0% The content of amygdalin

is not less than 3,0 mg, the content of paeoniflorin is not less than 2,0 mg calculated on theaverage weight of the capsule

Discussion: The process to identify the presence of Radix Angelica sinensis, Rhizoma

Ligustici wallichii, Fructus Aurantii, Radix et Rhizoma Glycyrrhizae, Radix Bupleuri chinensis, quantitative of paeoniflorin is the improvement of the research compared to CP

2010 The process to identify the presence of Radix Paeoniae, Semen Pruni, Flos Carthami tinctorii, Radix Platycodi grandiflori, Radix Achyranthis bidentatae, Radix Rhemanniae glutinosae and quantitative of amygdalin is freshness of the research compared to CP 2010

Conclusions: The research had developed the process to identify the presence of 11

medicinal plants in HPTU extract and capsule by TLC Hading developed the quantitativeprocess of amygdalin in HPTU extract and capsule Hading developed the quantitative

process of paeoniflorin in the Radix Paeoniae powder and HPTU capsule by HPLC to meetthe requirements of system suitability, specificity, linearity, precision and accuracy

Key words: Semen Pruni, Radix Paeoniae, amygdalin, paeoniflorin, HPLC.

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa ii

Lời cam đoan iii

Bản tóm tắt toàn văn luận văn bằng Tiếng Việt iv

Bản tóm tắt toàn văn luận văn bằng Tiếng Anh v

Mục lục vi

Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt viii

Danh mục bảng ix

Danh mục hình xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ BÀI THUỐC HUYẾT PHỦ TRỤC Ứ 3

1.1.1 Thành phần 3

1.1.2 Tác dụng dược lý, công dụng 3

1.1.3 Chuyên luận viên nang Huyết phủ trục ứ - CP 2010 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC DƯỢC LIỆU 7

1.3 ĐỊNH TÍNH CÁC DƯỢC LIỆU TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM 17

1.4 ĐỊNH LƯỢNG AMYGDALIN VÀ PAEONIFLORIN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Xây dựng quy trình định tính các dược liệu trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp SKLM 24

2.2.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng amygdalin trong cao và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC 26

2.2.3 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng paeoniflorin trong bột Xích thược và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC 29

2.2.4 Dự thảo TCCS kiểm nghiệm bột Xích thược, cao và viên HPTƯ 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH CÁC DƯỢC LIỆU TRONG CAO VÀ VIÊN HPTƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SKLM 33

3.1.1 Định tính Xích thược trong bột Xích thược và viên HPTƯ 33

3.1.2 Định tính Đào nhân trong cao và viên HPTƯ 34

3.1.3 Định tính Đương quy, Xuyên khung trong cao và viên HPTƯ 35

3.1.4 Định tính Chỉ xác trong cao và viên HPTƯ 36

3.1.5 Định tính Hồng hoa trong cao và viên HPTƯ 37

3.1.6 Định tính Cam thảo trong cao và viên HPTƯ 38

3.1.7 Định tính Cát cánh trong cao và viên HPTƯ 39

3.1.8 Định tính Sài hồ trong cao và viên HPTƯ 40

3.1.9 Định tính Ngưu tất trong cao và viên HPTƯ 41

3.1.10 Định tính Sinh địa trong cao và viên HPTƯ 42

3.2 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QTĐL AMYGDALIN TRONG CAO VÀ VIÊN HPTƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 43

3.2.1 Khảo sát các điều kiện HPLC để tách được pic amygdalin 43

3.2.2 Thẩm định quy trình định lượng amygdalin 45

3.3 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QTĐL PAEONIFLORIN TRONG BỘT XÍCH THƯỢC VÀ VIÊN HPTƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 55

3.3.1 Khảo sát các điều kiện HPLC để tách được pic paeoniflorin 55

3.3.2 Thẩm định quy trình định lượng paeoniflorin 57

3.4 DỰ THẢO TCCS BỘT XÍCH THƯỢC, CAO VÀ VIÊN HPTƯ 67

3.4.1 Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm bột Xích thược 67

3.4.2 Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao HPTƯ 68

3.4.3 Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm viên HPTƯ 69

3.4.4 TCCS kiểm nghiệm bột Xích thược, cao và viên HPTƯ 71

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 86

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

2 CFU Colony Forming Unit Số đơn vị khuẩn lạc

3 CP Chinese Pharmacopoeia Dược điển Trung Quốc

4 DĐVN V Dược điển Việt Nam V

5 ELSD Evaporative Light Scattering

Detector

Đầu dò tán xạ ánh sángbay hơi

6 GC-MS Gas Chromatography - Mass

Spectrometry Sắc ký khí ghép khối phổ

8 HPGPC High Performance Gel

Permeation Chromatography

Sắc ký thẩm thấu gel hiệunăng cao

9 HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

10 HPTƯ Huyết phủ trục ứ

11 PDA Photo Diode Array Đầu dò dãy diod quang

12 QTĐL Quy trình định lượng

16 SKLM Sắc ký lớp mỏng

17 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

18 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

20 VS Vanilin/acid sulfuric Vanilin trong acid sulfuric

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Định tính Xích thược trong một số chế phẩm bằng SKLM 17

Bảng 1.2 Định tính Đương quy, Xuyên khung trong các chế phẩm bằng SKLM 17

Bảng 1.3 Định tính Hồng hoa trong một số chế phẩm bằng SKLM 19

Bảng 1.4 Định tính Cam thảo trong một số chế phẩm bằng SKLM 19

Bảng 2.5 Chất đối chiếu sử dụng để nghiên cứu 22

Bảng 2.6 Hóa chất - dung môi sử dụng để nghiên cứu 23

Bảng 2.7 Trang thiết bị sử dụng để nghiên cứu 23

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống đối với amygdalin 45

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu đối với amygdalin 49

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính tuyến tính đối với amygdalin 50

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với amygdalin trong cao 51

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian đối với amygdalin trong cao 51 Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với amygdalin trong viên 52

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của amygdalin trong viên 52

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ đúng đối với amygdalin trong cao 53

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ đúng đối với amygdalin trong viên 54

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống đối với paeoniflorin 57

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu đối với paeoniflorin 61

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát tính tuyến đối với paeoniflorin 62

Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với paeoniflorin trong bột Xích thược 63

Bảng 3.21 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian đối với bột Xích thược 63

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với paeoniflorin trong viên 64

Bảng 3.23 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian paeoniflorin trong viên 64

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát độ đúng đối với paeoniflorin trong bột Xích thược 65

Bảng 3.25 Kết quả khảo sát độ đúng đối với paeoniflorin trong viên 66

Bảng 3.26 Kết quả khảo sát tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của bột Xích thược 67 Bảng 3.27 Kết quả khảo sát độ mịn của bột Xích thược 67

Bảng 3.28 Kết quả khảo sát hàm lượng paeoniflorin trong bột Xích thược 67

Bảng 3.29 Kết quả khảo sát tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của cao 68

Bảng 3.30 Kết quả khảo sát chỉ tiêu kim loại nặng trong cao 68

Bảng 3.31 Kết quả khảo sát hàm lượng amygdalin trong cao 68

Bảng 3.32 Kết quả khảo sát độ đồng đều khối lượng của viên 69

Bảng 3.33 Kết quả khảo sát độ rã của viên 70

Bảng 3.34 Kết quả khảo sát hàm lượng amygdalin và paeoniflorin trong viên 70

Bảng 4.35 So sánh tiêu chuẩn của CP 2010 và TCCS……… 87

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức khai triển của paeoniflorin 7

Hình 2.2 Công thức khai triển của amygdalin 9

Hình 3.3 Các sắc ký đồ định tính Xích thược trong bột Xích thược và viên 33

Hình 3.4 Các sắc ký đồ định tính Đào nhân trong cao và viên 34

Hình 3.5 Các sắc ký đồ định tính đồng thời Đương quy và Xuyên khung 35

Hình 3.6 Các sắc ký đồ định tính Chỉ xác trong cao và viên 36

Hình 3.7 Các sắc ký đồ định tính Hồng hoa trong cao và viên 37

Hình 3.8 Các sắc ký đồ định tính Cát cánh trong cao và viên 39

Hình 3.9 Các sắc ký đồ định tính Sài hồ trong cao và viên 40

Hình 3 10 Các sắc ký đồ định tính Ngưu tất trong cao và viên 41

Hình 3.11 Các sắc ký đồ thẩm định quy trình định tính Sinh địa 42

Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch thử cao HPTƯ khi rửa giải với pha động I và II 43

Hình 3.13 Sắc ký đồ dung dịch thử viên HPTƯ khi rửa giải với pha động I và II 44 Hình 3.14 Phổ UV của amygdalin (a), của pic trong cao (b) và viên (c) 45

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu amygdalin (a), mẫu thử (b), mẫu placebo (c) và mẫu thử thêm đối chiếu (d) của cao HPTƯ 46

Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu amygdalin đối chiếu (a), mẫu thử (b), mẫu placebo (c) và mẫu thử thêm đối chiếu (d) của viên HPTƯ 47

Hình 3.17 Độ tinh khiết của pic amygdalin trong cao (a) và viên HPTƯ (b) 48

Hình 3.18 Đường tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic amygdalin 50

Hình 3.19 Sắc ký đồ dung dịch thử bột Xích thược khi rửa giải với các pha động 55 Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch thử viên HPTƯ khi rửa giải với các pha động 56

Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu paeoniflorin đối chiếu (a), mẫu thử (b), mẫu trắng (c) và mẫu thử thêm đối chiếu (d) của bột Xích thược 58

Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu paeoniflorin đối chiếu (a), mẫu thử (b), mẫu placebo (c) và mẫu thử thêm đối chiếu (d) của viên HPTƯ 59

Hình 3.23 Độ tinh khiết của pic paeoniflorin trong bột Xích thược (a) và viên Huyết phủ trục ứ (b) 60

Hình 3.24 Phổ UV của paeoniflorin (a), của pic trong bột Xích thược (b) và viên

Huyết phủ trục ứ (c) 61

Hình 3.25 Đường tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic paeoniflorin 62

MỞ ĐẦU

Từ lâu, huyết khối, đau thắt ngực là những bệnh lý mà người trung niên, cao tuổi rấtngại mắc phải vì những biến chứng nguy hiểm của nó Ước tính mỗi năm trong 100người bị đau thắt ngực ổn định sẽ có một người bị biến chứng nhồi máu cơ tim hoặcđột quỵ Đã có nhiều thuốc điều trị huyết khối, đau thắt ngực được sản xuất từ hóadược như aspirin, warfarin, heparin…, bên cạnh đó nhiều thuốc từ dược liệu cũng đãcho thấy hiệu quả điều trị trong các bệnh lý này

Huyết phủ trục ứ gồm các dược liệu Đào nhân, Hồng hoa, Đương quy, Xuyên khung,Xích thược, Sài hồ, Chỉ xác, Cam thảo, Ngưu tất, Cát cánh, Sinh địa là một bài thuốcnổi tiếng của nền y học cổ truyền Trung Hoa, đã được sử dụng rộng rãi trong điều trịcác bệnh lý về tim mạch như huyết khối, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, đột qụy…Từlâu, hiệu quả trị liệu của bài thuốc này đã được chứng minh qua các bằng chứng lâmsàng Cùng với đó, sự giải thích cơ chế bảo vệ hệ tim mạch bởi các nghiên cứu dược

lý gần đây, đã góp phần làm cho bài thuốc này được ứng dụng rộng rãi hơn Từ dạngdùng ban đầu là thuốc sắc, một dạng thuốc xuất phát từ nền y học cổ truyền, cho đếnnay, một số dạng thuốc hiện đại như viên nén, viên nang của Huyết phủ trục ứ đãđược phát triển Những chế phẩm này giúp cho việc dùng thuốc của bệnh nhân đượcthuận tiện hơn và đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Trung Quốc chophép lưu hành Trong đó dạng bào chế viên nang đã được đưa vào thành một chuyênluận của CP 2010 [18], [19]

Để đáp ứng nhu cầu điều trị hiện nay, một số công ty dược phẩm tại Việt Nam đã tiếnhành nghiên cứu sản xuất chế phẩm viên nang có thành phần gồm 11 dược liệu nhưtrong bài thuốc Huyết phủ trục ứ Chế phẩm được sản xuất với quy trình sơ bộ nhưsau: Xích thược được nghiền thành bột mịn, rây, sấy khô đến độ ẩm quy định Cácdược liệu Đào nhân, Đương quy, Xuyên khung được chiết bằng ethanol 50%; Hồnghoa, Sài hồ, Sinh địa, Chỉ xác, Cát cánh, Ngưu tất, Cam thảo được chiết bằng nước,gộp chung dịch chiết ethanol 50% và dịch chiết nước, cô đến độ ẩm quy định thuđược cao Huyết phủ trục ứ Phối hợp bột Xích thược, cao Huyết phủ trục ứ và các tádược, đóng vào nang

Bên cạnh việc nghiên cứu sản xuất thì công tác kiểm tra đánh giá chất lượng là yếu

tố không thể thiếu Trước những yêu cầu xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành

đề tài “Góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm viên nang từ dược liệu

hướng điều trị huyết khối, đau thắt ngực” với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Xây dựng quy trình định tính các dược liệu trong cao và viên HPTƯ bằngphương pháp SKLM

2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng amygdalin trong cao và viên HPTƯbằng phương pháp HPLC - PDA

3 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng paeoniflorin trong bột Xích thược

và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC - PDA

4 Dự thảo TCCS kiểm nghiệm các bán thành phẩm (bột Xích thược, cao HPTƯ)

và TCCS kiểm nghiệm thành phẩm (viên HPTƯ)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ BÀI THUỐC HUYẾT PHỦ TRỤC Ứ

1.1.1 Thành phần

Huyết phủ trục ứ là bài thuốc nổi tiếng của nền y học cổ truyền Trung Hoa được sửdụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về tim mạch như: Huyết khối, đau thắt ngực,nhồi máu cơ tim, đột qụy Bài thuốc này được sáng chế bởi Wang Qingren và đãđược ghi lại lần đầu tiên trong cuốn sách “Yilin Gaicuo” vào năm 1850, bao gồm 11dược liệu với thành phần các vị thuốc như sau:

Quân

Đào nhân (Semen Pruni) 12 g

Hồng hoa (Flos Carthami tinctorii) 9 g

Thần

Đương quy (Radix Angelicae sinensis) 9 g

Xuyên khung (Rhizoma Ligustici wallichii) 5 g

Xích thược (Radix Paeoniae) 6 g

Sài hồ (Radix Bupleuri) 3 g

Tá

Sinh địa (Radix Rehmanniae glutinosae) 9 g

Chỉ xác (Fructus Aurantii) 5 g

Cát cánh (Radix Platycodi grandiflori) 6 g

Ngưu tất (Radix Achyranthis bidentatae) 9 g

hiệp đồng thúc đẩy tuần hoàn máu, loại trừ huyết ứ và giảm đau Hỗ trợ làm tăng tácdụng của vị quân là các vị: Xích thược giúp tăng cường lưu thông máu, loại trừ huyết

ứ, Xuyên khung thúc đẩy khí huyết lưu thông, Ngưu tất có đặc tính đắng và chua giúpthúc đẩy dòng máu lưu thông êm ái bên trong thành mạch từ đó làm giảm nguy cơgây ra huyết ứ, Chỉ xác và Cát cánh điều hòa dòng khí ở phổi, Sài hồ điều hòa chứcnăng gan, Sinh địa và Đương quy giúp nuôi dưỡng máu, Cam thảo có vai trò dẫnthuốc và điều hòa các vị thuốc khác [24], [30]

1.1.3 Chuyên luận viên nang Huyết phủ trục ứ - CP 2010

1.1.3.1 Quy trình bào chế

Xuất phát từ bài thuốc Huyết phủ trục ứ, nhiều chế phẩm được bào chế theo phươngpháp của nền y học hiện đại đã ra đời như viên nén, viên nang…Trong đó dạng bàochế viên nang đã được đưa vào thành một chuyên luận của CP 2010 với quy trình bào

chế như sau: Cân các dược liệu Đào nhân 108 g, Hồng hoa 81 g, Đương quy 81 g,

Xuyên khung 40 g, Xích thược 54 g, Sài hồ 27 g, Sinh địa 81 g, Chỉ xác 54 g, Cátcánh 40 g, Ngưu tất 81 g, Cam thảo 27 g Sau đó, Đương quy, Xích thược, Chỉ xác,Xuyên khung, Sài hồ và một phần hai Đào nhân được nghiền thành bột mịn, rây vàtrộn đều Một phần hai Đào nhân và 5 thành phần còn lại được chiết với nước 3 lần,lọc, gộp chung dịch lọc, cô đặc thành cao Cao được trộn với phần bột ở trên sau đósấy khô, nghiền mịn, rây và đóng vào 1000 nang [9]

1.1.3.2 Phương pháp định tính

Theo CP 2010 các dược liệu Đương quy, Xuyên khung, Chỉ xác, Sài hồ, Cam thảotrong viên Huyết phủ trụ ứ được định tính bằng phương pháp SKLM

- Định tính đồng thời Đương quy và Xuyên Khung: Cân 3 g chế phẩm, thêm 10 ml

ether dầu hỏa (60 - 90 oC), siêu âm trong 10 phút, lọc, sử dụng dịch lọc làm mẫu thử.Dùng 1 g bột Đương quy đối chiếu và 1 g bột Xuyên khung đối chiếu chuẩn bị theoquy trình giống mẫu thử để được hai dung dịch đối chiếu tương ứng Pha động là n-hexan - ethyl acetat (9 : 1), mỗi dung dịch chấm 2 - 5 l Sau khi khai triển, để khô

tự nhiên và quan sát dưới ánh sáng UV 365 nm

- Định tính Chỉ xác: Cân 5 g chế phẩm, thêm 20 ml methanol, siêu âm trong 1 giờ,

để yên 2 giờ, lọc Cô dịch lọc đến khoảng 10 ml, sử dụng làm dung dịch thử Dùng 1

g bột Chỉ xác, thêm 10 ml methanol, siêu âm 30 phút, lọc, sử dụng dịch lọc làm dungdịch đối chiếu Pha động ethyl acetat - ethanol - nước (8 : 2 : 1), mỗi dung dịch chấm

5 - 10 l Sau khi khai triển, để khô tự nhiên, phun thuốc thử nhôm (III) clorid, quansát dưới ánh sáng UV 365 nm

- Định tính Sài hồ: Cân 4 g chế phẩm, thêm 30 ml methanol, siêu âm trong 30 phút.

Để nguội, lọc, bốc hơi dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong 30 ml nước Lắc phân bốvới n-butanol bão hòa nước 3 lần, mỗi lần 20 ml, gộp chung dịch chiết n-butanol, rửavới 50 ml amoni hydroxyd 10% và 50 ml nước bão hòa n-butanol, loại bỏ lớp nước

Cô dịch chiết n-butanol đến cắn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol làm dung dịch thử.Dung dịch đối chiếu được chuẩn bị từ 0,5 g Sài hồ đối chiếu và tiến hành với quytrình giống mẫu thử Pha động cloroform - methanol - nước (13 : 7 : 2, lớp dưới) Mỗidung dịch chấm 5 - 10 l, sau khi khai triển, để khô tự nhiên Quan sát dưới ánh sáng

UV 365 nm, phun thuốc thử là dung dịch 2% của 4-dimethylaminobenzaldehyd trongacid sulfuric 40%, hơ nóng đến khi xuất hiện các vết trên sắc ký đồ

- Định tính Cam thảo: Cân 4 g chế phẩm thêm 40 ml methanol, siêu âm 30 phút Để

nguội, lọc, cô dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong 20 ml nước, lắc phân bố với ether

2 lần mỗi lần 20 ml, loại bỏ lớp ether Tiếp tục lắc phân bố với n-butanol bão hòanước, 2 lần mỗi lần 20 ml, gộp chung dịch chiết n-butanol, rửa với nước bão hòa n-butanol 2 lần, mỗi lần 20 ml, loại bỏ lớp nước Cô dịch chiết n-butanol đến cắn, hòatan cắn trong 2 ml methanol làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu được chuẩn bị

từ 0,5 g Cam thảo đối chiếu với quy trình giống dung dịch thử Pha động cloroform methanol - nước (13 : 6 : 2, lớp dưới) Mỗi dung dịch chấm 5 - 10 l, sau khi khaitriển, để khô tự nhiên, phun thuốc thử là dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol,

-hơ nóng đến khi hiện rõ vết

Định tính amygdalin: Thực hiện bằng phương pháp HPLC, hòa tan amygdalin đối

chiếu trong methanol 50% để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 60 g/mldùng làm dung dịch đối chiếu Dung dịch thử được chuẩn bị như phần định lượng

Sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, bước sóng phát hiện ở 210 nm, thể tích tiêm mẫu

20 l Pha động gồm methanol và nước, rửa giải theo chương trình pha động như sau:Thời gian (phút) Methanol (% tt/tt) Nước (% tt/tt) Ghi chú

Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác một lượng paeoniflorin hòa tan trong methanol

50% để thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 70 g/ml

Dung dịch thử: Cân chính xác 0,5 g bột chế phẩm cho vào bình nón có nút mài, thêm

chính xác 25 ml methanol 50% đậy nút, cân khối lượng, siêu âm trong 30 phút Đểnguội, cân lại khối lượng, bổ sung khối lượng hao hụt bằng methanol 50%, lắc đều,lọc, sử dụng dịch lọc làm dung dịch thử

Tiến hành sắc ký dung dịch đối chiếu và dung dịch thử Số đĩa lý thuyết của cột sắc

ký không được nhỏ hơn 2500 tính trên pic paeoniflorin

Hàm lượng paeoniflorin (C23H28O11) trong viên không được ít hơn 1,0 mg [9].1.1.3.4 Liều dùng

Liều được khuyến cáo của chế phẩm là ngày uống 2 lần, mỗi lần 6 viên, điều trị kéodài trong 1 tháng [9]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC DƯỢC LIỆU

1.2.1 Tổng quan về Xích thược

Xích thược Radix Paeoniae là rễ đã phơi hay sấy khô của cây Thược dược (Paeonia

lactiflora Pall.), hoặc cây Xuyên xích thược (Paeonia veitchii Lynch), họ Hoàng

Liên (Paeoniaceae) [2]

1.2.1.1 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chính của Xích thược là paeoniflorin, một monoterpen glycosid,hàm lượng khoảng 0,05 – 6,01% Thành phần này cũng được chỉ định là chất đánhdấu để đánh giá chất lượng dược liệu Xích thược trong các Dược điển [2] [21], [26]

Hình 2.1 Công thức khai triển của paeoniflorin [26].

1.2.1.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Xích thược với tác dụng loại trừ nhiệt từ máu, loại trừ huyết khối, giảm đau thườngđược chỉ định cho các trường hợp đau thắt ngực, đau do chấn thương Cao chiết Xíchthược có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu do adenosyl diphosphat, arachidonic acid

và collagen gây ra, đồng thời ngăn chặn sự đông máu nội mạch gây ra bởi endotoxin.Thành phần chính paeoniflorin có tác dụng hạn chế tình trạng tăng đông máu, tiêuhủy huyết khối bằng cách tăng biểu hiện của plasminogen activator urokinase, mộtprotease serin tạo điều kiện cho sự phân giải huyết khối bình thường Paeoniflorincòn có tác dụng làm giảm fibrinogen, D-dimer và thromboxan B2 Trong đóthromboxan B2 là chất hoạt hóa tiểu cầu, fibrinogen làm tăng nguy cơ huyết khối tĩnhmạch và việc giảm nồng độ D-dimer phản ánh hoạt động tiêu sợi huyết Tất cả nhữngthay đổi đối với các phân tử này cho thấy tình trạng huyết khối được cải thiện sauđiều trị với paeoniflorin [10], [23], [26]

1.2.1.3 Phương pháp định tính, định lượng

Định tính Xích thược bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol, lắc kỹ trong 5 phút, lọc.

Bốc hơi dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong 2 ml ethanol, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 2 mg paeonilorin đối chiếu trong 1 ml ethanol 96%.

Hoặc dùng 0,5 g bột Xích thược đối chiếu, chiết như dung dịch thử

Pha động: Cloroform - ethyl acetat - methanol - acid formic (40 : 5 : 10 : 0,2) Phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng UV 254 nm hoặc dùng thuốc thử VS [2], [11] Định lượng paeoniflorin trong Xích thược bằng phương pháp HPLC

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan paeoniflorin đối chiếu trong methanol để được dungdịch có nồng độ chính xác khoảng 50 μg/ml

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu vào bình nón nút mài, thêmchính xác 25 ml methanol, đậy nút, cân xác định khối lượng Ngâm trong 4 giờ, siêu

âm trong 20 phút, để nguội, cân lại và bổ sung methanol để được khối lượng ban đầu.Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, được dung dịch thử

Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký pha đảo C18, bước sóng phát hiện 230 nm, tốc độ dòng

1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 μl

Pha động: Methanol - KH2PO4 0,05M (40 : 65).

Số đĩa lý thuyết của cột sắc ký tính theo pic paeoniflorin không được dưới 3000.Hàm lượng paeoniflorin trong Xích thược không được thấp hơn 1,8% [2]

1.2.2 Tổng quan về Đào nhân

Đào nhân Semen Pruni là hạt lấy ở quả chín của cây Đào [Prunus persica (L.) Batsch] hoặc cây Sơn đào [Prunus persica Batsch var Davidiana Maximowicz], họ Hoa hồng

(Rosaceae), được bỏ hạch cứng và phơi hoặc sấy khô [2]

1.2.2.1 Thành phần hóa học

Đào nhân chứa đến 50% là dầu béo, tỷ trọng 0,9114 - 0,9325, chỉ số xà phòng 190.Bên cạnh đó còn có amygdalin một cyanogenic glycosid chiếm tỷ lệ khoảng 3,5%đây cũng là thành phần được chọn làm chất đánh dấu để đánh giá chỉ tiêu định tính

và định lượng Đào nhân trong các Dược điển [2], [5], [15]

Hình 2.2 Công thức khai triển của amygdalin [4].

1.2.2.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Đào nhân có tác dụng phá huyết, hành ứ dùng trong chữa trị huyết ứ Trong các bàithuốc y học cổ truyền, Đào nhân thường được dùng với mục đích tăng tuần hoàn máu,loại trừ huyết khối Amygdalin trong Đào nhân có tác dụng làm giảm đáng kể độ nhớthuyết tương, kéo dài thời gian hoạt hóa thromboplastin và giảm lượng fibrinogen giúpkhắc phục tình trạng tăng đông máu Ngoài ra Amydalin còn có tác dụng bảo vệ tếbào nội mạch và ức chế quá trình kết tập tiểu cầu Độc tính trên người của amygdalinxuất hiện khi sử dụng liều 4 g/ngày trong 15 ngày bằng đường uống, với liều hàngngày thấp hơn có thể tránh được các độc tính này [5], [20], [22]

1.2.2.3 Phương pháp định tính, định lượng

Định tính Đào nhân bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 1 g dược liệu, chiết với 10 ml methanol, lọc, được dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Đào nhân đối chiếu, chiết như dung dịch thử.

Một số hệ dung môi khai triển: Ethyl acetat - methanol - nước (20 : 5 : 4), ethyl acetat

- methanol - nước (40 : 15 : 6), cloroform - ethyl acetat - ethanol (2 : 1 : 2)

Cách phát hiện: Phun dung dịch thymol hoặc anisaldehyd, sấy 105 oC [1], [2], [15]

Định lượng amygdalin trong Đào nhân bằng phương pháp HPLC

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan amygdalin đối chiếu trong methanol để được dung dịch

có nồng độ chính xác khoảng 20 μg/ml

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,4 g bột dược liệu vào một bình nón nút mài

thêm chính xác 20 ml methanol, đậy nút và cân Đun hồi lưu 1 giờ, để nguội cân lại

Bổ sung khối lượng mất đi bằng methanol, lắc đều, lọc Hút chính xác 1 ml dịch lọcpha loãng thành 10 ml với methanol, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm

Điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 m), bước sóng phát hiện 210 nm, phađộng acetonitril - nước (12 : 88), tốc dộ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 μl.

Số đĩa lý thuyết của cột tính trên pic amygdalin phải không dưới 5000 Hàm lượngamygdalin trong nhân hạt Đào hoặc Sơn đào không được dưới 1,2% [2]

1.2.3 Tổng quan về Đương quy

Đương quy Radix Angelicae sinensis là rễ đã phơi hay sấy khô của cây Đương quy [Angelica sinensis (Oliv.) Diels.], họ Hoa tán (Apiaceae) [2].

1.2.3.1 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chính của Đương quy là tinh dầu Tinh dầu Đương quy chứa chủyếu các mono phthalid như Z-ligustilid, E-ligustilid, senkyunolid A, butylphthalid,Z-butylidenephthalid, E-butylidenephthalid Một số dimer phthalid như: riligustilid,levistolid A, senkyunolid O…

Ngoài ra trong Đương quy còn chứa acid hữu cơ và dẫn xuất ester của chúng có hoạttính sinh học như: acid ferulic, coniferyl ferulat, acid succinic, acid nicotinic, acidfolic, acid valerophenon-O-carboxylic, acid oleic và một số polysaccharid [10], [25].1.2.3.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Các polysaccharid trong Đương quy có tác dụng điều trị thiếu máu, bệnh phụ khoa

và các bệnh về gan Acid ferulic có tác dụng chống oxi hóa, kháng viêm Trong khi

đó, ligustilid và n-butylidenphthalid có tác dụng ức chế co thắt tử cung, ức chế kếttập tiểu cầu, giảm đau, kháng viêm [25]

1.2.3.3 Định tính Đương quy bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 4 g bột dược liệu, thêm 20 ml ethanol 95%, ngâm trong 1 giờ,

thỉnh thoảng lắc, lọc Bốc hơi dịch lọc còn khoảng 10 ml, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 4 g bột Đương quy đối chiếu, chiết như dung dịch thử.

Một số hệ dung môi khai triển: Cyclohexan ethyl acetat (8 : 2), cyclohexan diclomethan - ethyl acetat - acid formic (4 : 1 : 1 : 0,5), toluen - ethyl acetat - acidacetic (90:10:1), n-hexan - ethyl acetat (5 : 1)

-Phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng UV 254 nm; UV 365 nm, nhúng thuốc thử

anisaldehyd hoặc H2SO4 10% trong ethanol, sấy ở 105 oC [2], [10], [13]

1.2.4.Tổng quan về Xuyên khung

Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii là thân rễ đã phơi hay sấy khô của cây Xuyên khung (Ligusticum wallichii Franch.), Họ Hoa tán (Apiaceae) [1].

1.2.4.1 Thành phần hóa học

Nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của Xuyên khung và Đương quy rấtgiống nhau Bằng các phương pháp phân tích hiện đại như GC-MS, HPGPC, HPLCcác nhà nghiên cứu đã xác định tinh dầu là thành phần chính của cả hai dược liệu này,các chất trong tinh dầu Xuyên khung và Đương quy cũng giống nhau, trong đó Z-ligustilid là chất có hàm lượng cao nhất, tuy nhiên hàm lượng tinh dầu trong Xuyênkhung cao hơn Đương quy [17]

Tinh dầu Xuyên khung bao gồm các alkylphthalid như Z-ligustilid, senkyunolid A,butylphthalid, neocnidilid, Z-butylidenphthalid, cnidilid, các hydroxyphthalid làsenkyunolid B-M, dimer phthalid: wallichilid, levistolid A, tokinolid B, các hợp chấtchứa nitơ: tetramethylpyrazin, perlolyrin Ngoài ra còn một số acid hữu cơ và dẫnxuất của chúng như acid ferulic, coniferyl ferulat, acid chrysophanic [10], [27].1.2.4.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Xuyên khung dùng trong phòng ngừa và điều trị xơ vữa động mạch, giảm nồng độcholesterol trong huyết tương, tác dụng này của Xuyên khung tăng lên đáng kể khiđược phối hợp với Xích thược Các phthalid có tác dụng chống loạn nhịp và làm giãnđộng mạch vành Xuyên khung còn được sử dụng cho các trường hợp bị ứ huyết vàđiều trị nhức đầu, chóng mặt, đau do tắt nghẽn [10], [27]

1.2.4.3 Định tính Xuyên khung bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 20 ml ether, đun hồi lưu trên cách thủy

trong 1 giờ, để nguội, lọc Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong

2 ml ethyl acetat, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Xuyên khung đối chiếu, chiết như dung dịch thử.

Một số hệ dung môi khai triển: nHexan ethyl acetat (3 : 1), toluen ethyl acetat acid acetic (90:10:1), dicloromethan - diethyl ether (2 : 1)

-Phát hiện: UV 254 nm; 365 nm, H2SO4 10% trong ethanol [2], [10], [14].

Theo H Wagner và cộng sự, trên sắc ký đồ SKLM, Đương quy và Xuyên khung chocác vết hoàn toàn giống hệt nhau về Rf và màu sắc [10].

Phân tích dấu vân tay trên HPLC:

- Dung dịch thử: Lấy 5 g dược liệu được chiết với 50 ml n-hexan bằng soxhlet trong

1 giờ, dịch chiết được cô đến cắn, hòa tan cắn trong 2,5 ml ethanol

Điều kiện sắc ký: Cột C18 (125 x 4 mm, 5 m), bước sóng phát hiện 210 nm, thể tíchtiêm mẫu 10 l, tốc độ dòng 1 ml/phút Rửa giải theo chương trình pha động [10].Thời gian (phút) Acetonitril (% tt/tt) Nước (% tt/tt) Ghi chú

Dung dịch thử: Lấy 1,0 g bột dược liệu, thêm 25 ml methanol, đun hồi lưu cách thủy

trong 10 phút, lọc lấy dịch chiết, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan hesperidin đối chiếu trong methanol để được dung dịch

có nồng độ 1 mg/ml bằng phương pháp đun hồi lưu Có thể dùng 1,0 g bột Chỉ xácđối chiếu và tiến hành chiết theo quy trình tương tự mẫu thử

Dung môi khai triển: Toluene - methanol (9 : 1).

Phát hiện: Nhúng thuốc thử AlCl3 1%, quan sát dưới ánh sáng UV 365 nm [2].

1.2.6.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Dịch chiết nước của Hồng hoa có tác dụng kéo dài thời gian đông máu và ức chế quátrình kết tập tiểu cầu Hồng hoa là một trong những vị thuốc được sử dụng rộng rãivới tác dụng tăng tuần hoàn máu, điều trị các bệnh về tim mạch như huyết khối, cothắt mạch vành, đau thắt ngực, xuất huyết não, xơ cứng động mạch não [4], [20].1.2.6.3 Định tính Hồng hoa bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, chiết bằng aceton 80%.

Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Hồng hoa đối chiếu, chiết như dung dịch thử.

Một số hệ dung môi khai triển: n-Butanol - nước - acid acetic (4 : 2 : 1), ethyl acetat

- acid formic - nước - methanol (7 : 2 : 3 : 0,4)

Phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng UV 365 nm [2], [11].

1.2.7.Tổng quan về Cam thảo

Cam thảo Radix et Rhizoma Glycyrrhizae là rễ và thân rễ còn vỏ hoặc đã cạo lớp bần, được phơi hay sấy khô của ba loài Cam thảo Glycyrrhiza uralensis Fisch.,

Glycyrrhiza inflata Bat hoặc Glycyrrhiza glabra L., họ Đậu (Fabaceae) [2].

1.2.7.1 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chủ yếu là saponin triterpen, trong đó acid glycyrrhizic là chấtquan trọng nhất, hàm lượng 10 - 14% trong dược liệu khô Ngoài ra còn có cácflavonoid như liquiritin và isoliquiritin [4]

1.2.7.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Cam thảo thường được dùng làm tá dược điều vị để làm giảm các vị khó uống củachế phẩm Ngoài ra dược liệu này cũng được dùng để trị ho, loét dạ dày tá tràng [4].1.2.7.3 Định tính Cam thảo bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 20 ml ether ethylic, đun hồi lưu trên

cách thủy 1 giờ, gạn bỏ dịch ether Thêm vào bã dược liệu 15 ml methanol, đun hồilưu trên cách thủy 1 giờ, để nguội, lọc lấy dịch chiết Bốc hơi dịch chiết đến cắn, hòatan cắn trong 20 nước Lắc phân bố với n-butanol 3 lần mỗi lần 20 ml Bay hơi dịchchiết n-butanol đến cắn, hòa tan cắn trong 5 ml methanol, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Cam thảo đối chiếu, chiết như dung dịch thử Dung môi khai triển: Ethyl acetat - acid formic - acid acetic - nước (15 : 1 : 1 : 2) Phát hiện: Nhúng thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol, sấy 105 oC [2], [12]

1.2.8.Tổng quan về Cát cánh

Cát cánh Radix Platycodi grandiflori là rễ để nguyên hoặc đã cạo vỏ ngoài, phơi hoặc sấy khô của cây Cát cánh [Platycodon grandiflorum (Jacq.) A DC.], họ Hoa chuông (Campanulaceae) [2].

Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 20 ml methanol 50%, đun hồi lưu cách

thủy 1 giờ Lọc, cô dịch lọc còn khoảng 10 ml, lắc với n-butanol 2 lần, mỗi lần 10 ml.Gộp chung dịch chiết n-butanol, bay hơi đến cắn, hòa tan cắn trong 0,5 ml methanol

Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Cát cánh đối chiếu, chiết như dung dịch thử Pha động: Cloroform - ether (1 : 1), cloroform - methanol - nước (64 : 50 : 10) Phát hiện: Nhúng thuốc thử VS, sấy ở 105 oC [2], [12]

1.2.9 Tổng quan về Ngưu tất

Ngưu tất Radix Achyranthis bidentatae là rễ đã phơi hay sấy khô của cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume), họ Rau Dền (Amaranthaceae) [2].

1.2.9.1 Thành phần hóa học

Thành phần quan trọng trong rễ Ngưu tất là các saponin triterpen có phần sapogenin

là acid oleanolic như bidentatosid I, bidentatosid II, momordin IIa, momordin Ib,zingibroside R1 Bên cạnh đó còn có các saponin dammaran như chikusetsusaponinIVa, chikusetsusaponin V, các anthraquinon như emodin, physcion…[12]

1.2.9.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Ngưu tất thường được sử dụng để kháng viêm, chống thấp khớp, giãn mạch, hạ huyết

áp, lợi tiểu Ngoài ra, dược liệu này còn được dùng để hạ cholesterol huyết trong điềutrị xơ vữa động mạch [4]

1.2.9.3 Định tính Ngưu tất bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 30 ml n-hexan, đun hồi lưu cách thủy

trong 30 phút, lọc bỏ dịch n-hexan Thêm 30 ml methanol vào bã dược liệu, đun hồilưu trong 2 giờ, lọc, cô đến cắn, thêm 15 ml nước, lắc phân bố với 30 ml n-butanol,

2 lần Gộp chung dịch chiết n-butanol, bay hơi trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắntrong 2 ml ethanol, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Dùng 2 g bột Ngưu tất đối chiếu, chiết như dung dịch thử Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (40 : 1), cloroform - methanol - nước -

acid formic (14 : 6 : 1 : 0,1)

Phát hiện: Nhúng thuốc thử VS, sấy ở 105 oC [2], [12]

1.2.10.Tổng quan về Sài hồ

Sài hồ Radix Bupleuri chinensis là rễ đã phơi hay sấy khô của cây Bắc Sài hồ

(Bupleurum chinensis DC.), họ Hoa tán (Apiaceae) [2].

1.2.10.1 Thành phần hóa học

Chủ yếu là saponin triterpen khung oleanan bao gồm sakosaponin A, B1-4, D, E, F, H

và các hợp chất liên quan bao gồm các sakogenin A-G Bên cạnh đó còn có 2polysaccharid có hoạt tính sinh học là bupleuran 2IIb và 2IIc [10], [26]

1.2.10.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Sài hồ thường được sử dụng để điều trị sốt, giảm đau, kháng viêm liên quan đến cúm

và cảm lạnh thông thường Dược liệu này còn được dùng để giảm đau trong cơn đauthắt ngực, điều trị viêm gan mãn tính, hội chứng thận hư và các bệnh tự miễn [26].1.2.10.3 Định tính Sài hồ bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 20 ml methanol, đun hồi lưu ở 80 oCtrong 1 giờ, để nguội, lọc Bốc hơi dịch lọc còn khoảng 5 ml, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 0,5 g bột Sài hồ đối chiếu, chiết như mẫu thử Dung môi khai triển: Ethyl acetat - ethanol - nước (8 : 2 : 1).

Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm, thuốc thử p-dimethyl amino benzaldehyd 5%

trong acid sulfuric 40% hoặc thuốc thử VS [2], [10]

1.2.11 Tổng quan về Sinh địa

Sinh địa Radix Rhemanniae glutinosae là rễ củ đã phơi sấy khô của cây Địa hoàng [Rhemannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.], họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) [2].

1.2.11.1 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của Sinh địa gồm các iridoid glycosid như catapol,rehmannioside A, B, C, D, hai chất rehmaglutin B và C thuộc loại dẫn chất iridoidkhông có phần đường Bên cạnh đó các polysaccharide cũng đã được tìm thấy [4].1.2.11.2 Tác dụng dược lý, công dụng

Sinh địa có tác dụng kháng nấm, bảo vệ tế bào gan trên invitro và hạ huyết áp, hạđường huyết, lợi tiểu chống thấp khớp, đau tim trên invivo bên cạnh đó dược liệu nàycòn có tác dụng nuôi dưỡng và bổ sung máu thường được dùng trong các bệnh tiểuđường, thiếu máu, thể trạng dễ bị chảy máu, sốt, lưỡi đỏ [4], [10]

1.2.11.3 Định tính Sinh địa bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: Lấy 2 g dược liệu, đun hồi lưu cách thủy với 20 ml methanol

Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 g Sinh địa đối chiếu, tiến hành chiết như dung dịch thử.Một số hệ dung môi khai triển: Cloroform - methanol - nước (14 : 6 : 1), toluen -cloroform - methanol - nước (20 : 50 : 40 : 3)

Phát hiện: Nhúng thuốc thử anisaldehyd hoặc thuốc thử VS, sấy 105 oC [2], [10]

1.3 ĐỊNH TÍNH CÁC DƯỢC LIỆU TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM

Bảng 1.1 Định tính Xích thược trong một số chế phẩm bằng SKLM

Cao chiết và viên

nang Bổ dương

hoàn ngũ thang

Cloroform - ethyl acetat

- methanol - acid formic(40 : 5 : 10 : 0,2)

Thuốc thử VS[6]

Viên nang Bổ khí

hoạt huyết Ethanol 96%

Cloroform - ethyl acetat

- methanol – nước(40 : 5 : 10 : 0,2)

Thuốc thử VS[7]

Viên nang

Yangxue Shengfa Ethanol

Cloroform - ethyl acetat

- methanol - acid formic(40 : 5 : 10 : 0,2)

Thuốc thử VS[8]

Viên nén Fuke

Cloroform - ethyl acetat

- methanol - acid formic(40 : 5 : 10 : 0,5)

Thuốc thử VS[8]

Định tính Đào nhân trong viên Bổ khí hoạt huyết bằng SKLM

Dung dịch thử: Cân 20 g chế phẩm, thêm 200 ml nước, đun sôi 20 phút, cách thủy 30

phút, lọc, để nguội Lắc với ether ethylic, 3 lần, mỗi lần 100 ml Gộp chung dịchether, cô còn khoảng 2 ml, được dung dịch thử

Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (5 : 5).

Cách phát hiện: UV 365 nm, phun thuốc thử VS, sấy 105 oC [7]

Bảng 1.2 Định tính Đương quy, Xuyên khung trong một số chế phẩm

Định tính Đương quy

Hoàn bát trân, Hoàn

sâm nhung bổ thận Ether ethylic

n-Hexan - ethyl acetat

(9 : 1) UV 365 nm [2].Viên nang Bổ khí

n-Hexan - ethyl acetat

(9 : 1) UV 365 nm [8].

nang Bổ dương hoàn

ngũ thang

Toluen - ethyl acetat

(9 : 1) UV 365 nm [6].Viên nén

BuzhongYiqi Ethyl acetat

Cyclohexan - ethylacetat (9 : 2) UV 365 nm [8].Viên nén Zaizao

n-Hexan - ethyl acetat

(4 : 1) UV 365 nm [8].

Định tính Xuyên khung

Cao chiết và viên

nang Bổ dương hoàn

ngũ thang

Cloroform - methanol

- amoni hydroxyd(9 : 1 : 1 giọt)

UV 365 nm,H2SO4 10%trong ethanol [6]Thuốc bột

hoạt huyết Cloroform

Cloroform - ethylacetat (9 : 1) UV 365 nm [7].Viên nang Yangxue

Shengfa Ether ethylic

n-Hexan - ethyl acetat

(9 : 1) UV 365 nm [8].

Định tính Chỉ xác trong viên nén Jianpi, siro Jizhi bằng SKLM

Dung dịch thử: Chế phẩm được chiết với methanol hoặc ethyl acetat Cô dịch chiết

đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml methanol, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan naringin trong methanol để được dung dịch có nồng độ

khoảng 1 mg/ml Có thể dùng 0,6 g bột Chỉ xác đối chiếu, chiết như dung dịch thử

Dung môi khai triển: Cloroform - methanol - aceton - acid formic (10 : 5 : 3 : 1),

cloroform - methanol - nước (32 : 17 : 5, lớp dưới)

hoặc dùng thuốc thử FeCl3 1% trong ethanol [8]

Bảng 1.3 Định tính Hồng hoa trong một số chế phẩm bằng SKLM

Cao chiết và viên

Cao lỏng Huaji n-Butanol Cloroform - ether (3:2) UV 365 nm [8]

Thuốc bột Bawei

Tanxiang Acetone 80%

Ethyl acetat - methanol

- acid formic - nước(7 : 0,4 : 2 : 3)

Quan sát dướiánh sáng thường[8]

Viên nang Bổ khí

hoạt huyết Ether ethylic

Cloroform - ethyl acetat

(9 : 1)

UV 254/365 nm,thuốc thử VS [7]

Bảng 1.4 Định tính Cam thảo trong một số chế phẩm bằng SKLM

Cao lỏng tứ

nghịch, Hoàn

nhị trần

n-Butanol

Ethyl acetat - acid acetic

- acid formic - nước(15 : 1 : 1 : 2)

Thuốc thử VS,H2SO4 10%trong ethanol [2].Hoàn bổ trung

ích khí Methanol Cloroform - aceton (7 : 3)

UV 254/365 nm,thuốc thử VS [2].Hoàn ngân kiều

Cloroform - methanol

(95 : 5)

H2SO4 10%trong ethanol [2].Thuốc cốm

Kouyanqing Methanol

Toluen ethyl format acid formic (15 : 8 : 1,5) UV 365 nm [8].

-Định tính Cát cánh trong Cao Fufang, Cao Xianzhuli bằng phương pháp SKLM

Dung dịch thử: 20 ml chế phẩm được chiết 2 lần với n-butanol, mỗi lần 20 ml, gộp

chung dịch chiết, cô đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml methanol, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Cát cánh đối chiếu, chiết với 10 ml methanol bằng

siêu âm trong 15 phút, cô dịch chiết còn khoảng 2 ml, được dung dịch đối chiếu

Dung môi khai triển: Cloroform - methanol - acid formic (16 : 10 : 1).

Phát hiện: Nhúng thuốc H2SO4 10% trong ethanol, sấy 105 oC [8]

Định tính Sài hồ trong các chế phẩm viên nén Jiawei Xiaoyao, Cao Saikokeishito cao Saireito bằng SKLM

Dung dịch thử: Lấy 2 g chế phẩm, thêm 10 ml natri hydroxyd 1N, thêm tiếp 5 ml

n-butanol, lắc đều, ly tâm, sử dụng lớp trên làm dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Sài hồ đối chiếu, chiết như dung dịch thử.

Dung môi khai triển: Ethyl acetat ethanol nước (8 : 2 : 1), cloroform methanol

-nước (30 : 10 : 1)

Phát hiện: Dùng thuốc thử 4-dimethylamino benzaldehyd [8], [16].

Định tính Sinh địa trong các chế phẩm Hoàn bát vị, Hoàn lục vị, Hoàn sâm nhung

bổ thận, Hoàn thập toàn đại bổ bằng SKLM

Dung dịch thử: Chế phẩm được chiết với methanol bằng cách đun sôi trên cách thủy,

gạn và lọc lấy dịch chiết Bã được chiết như trên 2 lần nữa, gộp chung dịch chiếtmethanol, cô đến cắn Khuấy kỹ cắn với n-butanol 3 lần, mỗi lần 5 ml, gộp chungdịch chiết n-butanol, cô đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml ethanol

Dung dịch đối chiếu: Lấy bột Sinh địa đối chiếu, chiết như dung dịch thử.

Dung môi khai triển: Cloroform - ethyl acetat (9 : 1).

Phát hiện : Nhúng thuốc thử VS, sấy ở 105 oC [2]

Một số nhận xét được rút ra

- Định tính Đương quy, Xuyên khung thường chiết bằng dung môi kém phân cực nhưether dầu hỏa, n-hexan, ether ethylic Khai triển với các hệ dung môi có độ phân cựcthấp như n-hexan - ethyl acetat (9 : 1), toluen - ethyl acetat (9 : 1), n-hexan - ethylacetat (4 : 1), phát hiện bằng UV 365 nm

- Các dược liệu chứa flavonoid như Chỉ xác, Hồng hoa có thể chiết với ethyl acetat,aceton, phát hiện bằng UV 254 nm; UV 365 nm hoặc nhúng thuốc thử AlCl3 1% rồiquan sát dưới ánh sáng UV 365 nm

- Các dược liệu có thành phần chính là monoterpen hoặc saponin như Xích thược,Cam thảo, Cát cánh, Ngưu tất, Sài hồ, Sinh địa thường được chiết bằng n-butanol.Khai triển trên các hệ dung môi có độ phân cực lớn, phát hiện bằng thuốc thử VS

1.4 ĐỊNH LƯỢNG AMYGDALIN VÀ PAEONIFLORIN TRONG

MỘT SỐ CHẾ PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU

Định lượng paeoniflorin trong viên nén Bazhen bằng phương pháp HPLC

Dung dịch thử: Cân 0,3 g chế phẩm chiết với 20 ml ethanol bằng siêu âm trong 1 giờ.

Định lượng paeoniflorin trong viên nén Bazhen Yimu bằng phương pháp HPLC

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm được chiết với 25 ml ethanol

bằng siêu âm trong 40 phút Lọc qua màng lọc 0,45 m

Dung dịch đối chiếu: Dung dịch paeoniflorin 15 μg/ml trong ethanol.

Điều kiện sắc ký: Cột C18, pha động acetonitril - acid phosphoric 0,1% (13 : 87),bước sóng phát hiện 230 nm, thể tích tiêm mẫu 10 μl [8]

Định lượng đồng thời 5 thành phần amygdalin, paeoniflorin, naringin,

hesperidin và neohesperidin trong viên Huyết phủ trục ứ

Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột thuốc cho vào bình định

mức 25 ml, thêm 20 ml hỗn hợp methanol 50%, siêu âm 30 phút, để nguội và điềnđến vạch với cùng dung môi, lọc qua màng lọc 0,45 m

Điều kiện sắc ký: Đầu dò ELSD, cột C18 (150 x 4,6 mm, 5 m), nhiệt độ cột 30 oC.Pha động gồm acid acetic 1% và acetonitril, rửa giải theo chương trình dung môi.Thời gian

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các TCCS kiểm nghiệm bột Xích thược, cao và viên HPTƯ

2.1.2 Nguyên vật liệu

Bột Xích thược, cao và viên Huyết phủ trục ứ từ 3 lô sản xuất 17001, 17002 và 17003được cung cấp bởi công ty sản xuất thuốc từ dược liệu Công thức cho 1 viên nang:

Bột Xích thược (Radix Paeoniae) 108,0 mg

Cao Huyết phủ trục ứ 300 mg, tương ứng với:

Đương quy (Radix Angelicae Sinensis) 162,0 mg

Xuyên khung (Rhizoma Ligustici wallichii) 80,0 mg

Hồng hoa (Flos Carthami tinctorii) 162,0 mg

Cam thảo (Radix et Rhizoma Glycyrrhizae) 54,0 mg

Cát cánh (Radix Platycodi grandiflori) 80,0 mg

Ngưu tất (Radix Achyranthis bidentatae) 162,0 mg

Sài hồ (Radix Bupleuri chinensis) 54,0 mg

Sinh địa (Radix Rhemanniae glutinosae) 162,0 mg

Tá dược (cellulose, magnesium stearate, talc) vừa đủ 1 viên

2.1.3 Chất đối chiếu

Bảng 2.5 Chất đối chiếu sử dụng để nghiên cứu

Paeoniflorin 99,0% Sigma Aldrich - Mỹ

2.1.4 Dược liệu đối chiếu

Các dược liệu đối chiếu gồm Xích thược, Đào nhân, Đương quy, Xuyên khung, Chỉ xác, Hồng hoa, Cam thảo, Cát cánh, Ngưu tất, Sài hồ, Sinh địa do Viện kiểm nghiệm

thuốc thành phố Hồ Chí Minh cung cấp tháng 8/2017

2.1.5 Hóa chất - dung môi

Bảng 2.6 Hóa chất - dung môi sử dụng để nghiên cứu

Aceton, acid acetic, acid formic, acid sulfuric, amoni hydroxyd,

n-butanol, cloroform, 4-dimethyl amino benzaldehyd, ethanol,

ether ethylic, ether dầu hỏa (60 - 90 oC), ethyl acetat, n-hexan,

methanol, nhôm (III) clorid, toluen, vanilin

Xilong Chemical(Trung Quốc)

Acetonitril, acid acetic, methanol, KH2PO4, H3PO4 Merck (Đức)Thuốc thử VS: Hỗn hợp đồng thể tích của dung dịch vanilin 1% pha trong ethanol vàdung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol

2.1.6 Trang thiết bị - dụng cụ

Bảng 2.7 Trang thiết bị sử dụng để nghiên cứu

Cân phân tích Practum 224-1S độ nhạy 0,1 mg Đức

Đèn soi UV 254/365 nm Vilber CN-6 Pháp

Hệ thống lọc áp suất giảm Gast DOA-P504-BN Mỹ

Máy khuấy từ gia nhiệt Velp AREC Italia

Máy thử độ rã Pharmatest PTZ-S/DIST3 Đức

Dụng cụ: Bản mỏng Silica gel F254, bình khai triển sắc ký (10 × 5 × 10 cm), bình

định mức 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml; pipet chính xác 10 ml; buret 25 ml và một

số dụng cụ thí nghiệm thường quy

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng quy trình định tính các dược liệu trong cao và viên

HPTƯ bằng phương pháp SKLM

2.2.1.1 Chuẩn bị các dung dịch thử và dung dịch đối chiếu

Định tính Xích thược

Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột Xích thược (mẫu bán thành phẩm) hoặc 3 g bột thuốc,

thêm 20 ml aceton, siêu âm 15 phút, lọc, được các dung dịch thử tương ứng

Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g Xích thược đối chiếu, chiết như dung dịch thử.

Định tính Đào nhân

Dung dịch thử: Lấy 3 g cao hoặc 5 g bột thuốc, thêm 20 ml methanol, siêu âm trong

15 phút, lọc Dịch lọc để bay hơi còn khoảng 2 ml, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 g bột Đào nhân, chiết như dung dịch thử.

Định tính Đương quy, Xuyên khung

Dung dịch thử: Lấy 3 g cao hoặc 5 g bột thuốc, thêm 20 ml n-hexan, siêu âm 15 phút,

lọc Bay hơi dịch lọc ở nhiệt độ phòng còn 2 ml, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 g bột Đương quy và 1 g bột Xuyên khung, chiết như dung

dịch thử, được 2 dung dịch đối chiếu tương ứng

Định tính Chỉ xác, Hồng hoa

Dung dịch thử: Lấy 3 g cao hoặc 5 g bột thuốc, khuấy kỹ với 20 ml nước, lọc Dịch

lọc được lắc với 20 ml ethyl acetat, 2 lần, gộp chung dịch chiết ethyl acetat, cô đếncắn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Chỉ xác và 1,5 g bột Hồng hoa, thêm 30 ml nước,

cách thủy ở 80 ºC trong 1 giờ, lọc Dịch lọc được chiết như đối với dung dịch thử

Định tính Cát cánh, Sài hồ

Dung dịch thử: Lấy 3 g cao hoặc 5 g bột thuốc, khuấy kỹ với 20 ml nước, lọc Lắc

với 20 ml n-butanol bão hòa nước 2 lần, gộp chung dịch chiết n-butanol, rửa với 40

ml amoni hydroxyd 10%, sau đó rửa lại với 40 ml nước bão hòa n-butanol 2 lần, bỏlớp nước Dịch chiết n-butanol được cô đến cắn, hòa tan trong 2 ml methanol

Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Cát cánh và 0,5 g bột Sài hồ, thêm 30 ml nước đem

cách thủy ở 80 ˚C trong 30 phút, lọc Dịch lọc được chiết như đối với dung dịch thử

Định tính Cam thảo

Dung dịch thử: Cao hoặc bột thuốc sau khi đã chiết với n-hexan để định tính Đương

quy và Xuyên khung, được hòa tan trong 20 ml nước Lắc với 20 ml ether ethylic 2lần, bỏ lớp ether Lớp nước được lắc tiếp với 20 ml n-butanol bão hòa nước 2 lần,gộp chung dịch chiết n-butanol, rửa với 40 ml với nước bão hòa n-butanol 2 lần, bỏlớp nước Dịch chiết n-butanol được cô đến cắn, hòa tan trong 2 ml methanol

Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Cam thảo, thêm 30 ml nước, cách thủy ở 80 ˚C

trong 30 phút, lọc Dịch lọc được chiết như đối với dung dịch thử

Định tính Ngưu tất, Sinh địa

Dung dịch thử: Lấy 3 g cao hoặc 5 g bột thuốc, khuấy kỹ với 20 ml nước, lọc Lắc

với 20 ml n-butanol, 2 lần, gộp chung dịch chiết n-butanol, cô đến cắn, hòa tan cắntrong 2 ml methanol, được dung dịch thử

Dung dịch đối chiếu: Lấy 1,5 g bột Ngưu tất và 1,5 g Sinh địa, thêm 30 ml nước, cách

thủy ở 80 ˚C trong 1 giờ, lọc Dịch lọc được chiết như đối với dung dịch thử

2.2.1.2 Khảo sát điều kiện SKLM để định tính các dược liệu

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt 5 - 10 l dung dịch đối chiếu và các dung dịch thửlên bản mỏng Khảo sát trên một số hệ dung môi khai triển

Phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng UV 254 nm; UV 365 nm hoặc nhúng thuốc thử

VS, sấy ở 105 oC đến khi hiện rõ vết Với Chỉ xác, Hồng hoa có thể nhúng thuốc thửAlCl3 1% trong ethanol rồi quan sát dưới ánh sáng UV 365 nm

Chọn hệ dung môi tách được các vết tốt nhất, chọn cách phát hiện có thể quan sátđược vết dễ dàng

2.2.1.3 Thẩm định tính đặc hiệu

Viên placebo: Cân các dược liệu (trừ dược liệu cần định tính) và tá dược ứng với

công thức cho 50 viên nang, tiến hành pha chế theo quy trình sản xuất, thu được viênplacebo của dược liệu tương ứng

Dung dịch placebo: Lấy viên placebo, pha chế như dung dịch thử.

Chấm riêng biệt 5 - 10 l dung dịch đối chiếu, các dung dịch thử và dung dịch placebolên bản mỏng Tiến hành SKLM theo điều kiện đã chọn

2.2.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng amygdalin trong cao

và viên HPTƯ bằng phương pháp HPLC

2.2.2.1 Pha chế các dung dịch thử nghiệm

Dung dịch đối chiếu gốc: Cân chính xác khoảng 120,0 mg amygdalin đối chiếu cho

vào bình định mức 200 ml, hòa tan với pha động để được dung dịch đối chiếu gốc cónồng độ khoảng g/ml

Dung dịch đối chiếu: Lấy chính xác 1 ml dung dịch đối chiếu gốc, pha loãng thành

25 ml với pha động, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Dung dịch thử (cao HPTƯ): Cân chính xác khoảng 300,0 mg cao, cho vào bình định

mức 50 ml, thêm 30 ml methanol 50%, siêu âm 30 phút, điền đến vạch với cùng dungmôi, lắc đều Lọc, lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 25 ml, thêmpha động đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Dung dịch thử (viên HPTƯ): Cân 20 viên nang, tính khối lượng trung bình bột thuốc

trong viên, nghiền trộn đều Cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương khốilượng trung bình viên (mv = 524,8 mg), pha chế như dung dịch thử của cao

Cao placebo: Cân các dược liệu (trừ Đào nhân) ứng với công thức cho 30 g cao Huyết

phủ trục ứ, chiết và cô đặc theo quy trình sản xuất, thu được cao placebo

Viên placebo: Cân bột Xích thược, cao placebo và các tá dược ứng với công thức cho

50 viên nang, pha chế theo quy trình sản xuất, thu được viên placebo

Dung dịch placebo (cao HPTƯ): Cân chính xác khoảng 300,0 mg cao placebo, tiến

hành pha chế như dung dịch thử

Dung dịch placebo (viên HPTƯ): Cân chính xác một lượng bột viên placebo tương

đương khối lượng trung bình viên, pha chế như dung dịch thử

Dung dịch thử thêm đối chiếu (cao HPTƯ): Cân chính xác khoảng 300,0 mg cao, cho

vào bình định mức 50 ml, thêm 1 ml dung dịch đối chiếu gốc, pha như dung dịch thử

Dung dịch thử thêm đối chiếu (viên HPTƯ): Cân chính xác một lượng bột thuốc tương

đương khối lượng trung bình viên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm 1 ml dungdịch đối chiếu gốc, tiến hành pha chế như dung dịch thử

2.2.2.2 Khảo sát các điều kiện HPLC để tách được pic amygdalin

Khảo sát các điều kiện sắc ký như cột sắc ký, nhiệt độ cột, bước sóng phát hiện, tốc

độ dòng, thể tích tiêm mẫu, pha động để tách được pic amygdalin đạt yêu cầu về độphân giải, hệ số đối xứng, hệ số dung lượng, độ tinh khiết của pic amygdalin

2.2.2.3 Thẩm định QTĐL amygdalin trong cao và viên Huyết phủ trục ứ

Tính phù hợp hệ thống

Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu theo điều kiện sắc ký đã chọn Ghi nhận thờigian lưu, diện tích pic, hệ số dung lượng, hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết, tính giá trịtrung bình, RSD Yêu cầu:

- RSD của thời gian lưu và diện tích pic không quá 2,0%

- Hệ số dung lượng 1 ≤ k’ ≤ 5

- Hệ số đối xứng 0,8 ≤ As ≤ 1,5

- Số đĩa lý thuyết N ≥ 5000 [2], [3]

Tính đặc hiệu

Tiêm các dung dịch sau vào hệ thống HPLC với điều kiện sắc ký đã chọn:

- Dung dịch đối chiếu: Đã thực hiện trong phần tính phù hợp hệ thống.

- Dung dịch thử, dung dịch placebo, dung dịch thử thêm đối chiếu

Ghi nhận thời gian lưu, diện tích pic, phổ UV, độ tinh khiết của pic Yêu cầu:

- Dung dịch thử cho pic có thời gian lưu và phổ UV tương ứng với pic amygdalin trênsắc ký đồ dung dịch đối chiếu

- Sắc ký đồ dung dịch placebo không có pic cùng thời gian lưu với pic amygdalin

- Sắc ký đồ dung dịch thử thêm đối chiếu cho pic cùng thời gian lưu với amygdalin

và diện tích pic tăng lên so với dung dịch thử

- Độ tinh khiết của pic amygdalin trong sắc ký đồ dung dịch thử đạt yêu cầu

Tính tuyến tính

Từ dung dịch đối chiếu gốc, pha 7 dung dịch khảo sát tính tuyến tính với nồng độtương ứng 10%, 40%, 70%, 100%, 130%, 160%, 200% so với nồng độ định lượng.Tiêm các dung dịch này vào hệ thống HPLC, ghi nhận diện tích pic amygdalin.Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic amygdalin,xác định hệ số tương quan tuyến tính Yêu cầu: Hệ số tương quan r ≥ 0,999

Sử dụng phân tích hồi quy “Regression” trong Ms - Excel với trắc nghiệm F để kiểmtra tính thích hợp của phương trình hồi quy ŷ = ax + b và trắc nghiệm t để kiểm tra ýnghĩa của các hệ số trong phương trình này

Độ chính xác

Độ lặp lại: Chuẩn bị 6 dung dịch thử, tiêm vào hệ thống HPLC theo điều kiện đã

chọn Ghi nhận thời gian lưu và diện tích pic amygdalin Tính hàm lượng amygdalintrong cao và viên Huyết phủ trục ứ

- Hàm lượng (%) amygdalin trong cao Huyết phủ trục ứ:

mc : Khối lượng amygdalin đối chiếu (mg)

Cc : Hàm lượng của amygdalin đối chiếu (%, tính trên nguyên trạng)

Dt, Dc : Lần lượt là độ pha loãng của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu

mv : Khối lượng trung bình viên (mg)

mt : Khối lượng cao hoặc bột thuốc đã cân để định lượng (mg)

Yêu cầu: RSD của hàm lượng amygdalin qua 6 lần định lượng không quá 2,0%

Độ chính xác trung gian: Hai kiểm nghiệm viên, thực hiện vào 2 ngày khác nhau.

Mỗi kiểm nghiệm viên chuẩn bị 6 dung dịch thử, tiến hành phân tích theo điều kiệnsắc ký đã chọn Ghi nhận diện tích pic amygdalin

Tính hàm lượng amygdalin trong cao và viên Huyết phủ trục ứ