Hiệu quả tái khoáng của kemđánh răng chứa f tcp kết hợp fluor trên răng sữa sâu đánh giá qua phổ tán sắc năng lượng tia x và kính hiển vi điện tử quét

Một nghiên cứu khác tương tự đối với kem đánh răng trên sâu men “đốmtrắng” nhân tạo cho thấy lợi ích chống sâu răng của sự kết hợp fTCP với fluor được so sánh với kem đánh răng có fluor

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- -LÝ KIM TRIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ RĂNG – HÀM – MẶT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- -LÝ KIM TRIỆU

Ngành: Răng – Hàm – Mặt

Mã số: 8720501

LUẬN VĂN THẠC SĨ RĂNG HÀM MẶT

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS NGÔ THỊ QUỲNH LAN

2 TS HUỲNH CÔNG NHẬT NAM

TP.HỒ CHÍ MINH – NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trongbất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả

LÝ KIM TRIỆU

0 MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT i

ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ iv

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cấu trúc ngà răng sữa 4

1.2 Sâu răng 5

1.2.1 Khử khoáng ngà răng 7

1.2.2 Tái khoáng ngà răng 7

1.2.3 Sự khác nhau giữa sâu ngà răng nhân tạo và tự nhiên 8

1.3 Các tác nhân khoáng hóa 10

1.3.1 Fluor 10

1.3.2 fTCP kết hợp fluor 10

1.4 Các phương pháp phân tích sang thương ngà răng mất khoáng và tái khoáng trong nghiên cứu 15

1.4.1 Phân tích thành phần hóa học theo phương pháp phổ tán sắc năng lượng tia X hay gọi là phân tích EDS (Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy) 15

1.4.2 Kính hiển vi điện tử quét (SEM) 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Thiết kế nghiên cứu 18

2.2 Mẫu nghiên cứu 18

2.3 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu 18

2.4 Qui trình thực hiện 20

2.4.1 Giai đoạn chuẩn bị và phân bố mẫu thử nghiệm 20

2.4.2 Giai đoạn tác động mẫu với 2 loại kem đánh răng được mã hóa A, B 22

2.5 Phương pháp quan sát trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) và đo trên phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS) 23

2.6Các biến số nghiên cứu 24

2.7 Phân tích dữ liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 26

3.1So sánh sự thay đổi phần trăm khối lượng của (Ca, P, F, O) trên từng nhóm và giữa 2 nhóm sử dụng kem đánh răng 26

3.1.1 Nhóm sử dụng kem đánh răng A (950 ppm F + fTCP) 26

3.1.2 Nhóm sử dụng kem đánh răng B (1100 ppm F) 32

3.1.3 Giữa 2 nhóm trước và sau thử nghiệm 37

3.2So sánh phần trăm tăng lên của tỉ lệ Ca/P giữa 2 nhóm 41

3.3Đánh giá hình thái bề mặt ngà răng sâu trước và sau thử nghiệm kem đánh răng giữa 2 nhóm 43

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 47

4.1Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 47

4.2Thành phần phần trăm khối lượng của các nguyên tố (Ca, P, F, O) trong ngà răng sữa sâu 50

4.2.1 Phần trăm khối lượng các nguyên tố trong nhóm A (950 ppm F + fTCP) trước và sau thử nghiệm 50

4.2.2 Phần trăm khối lượng các nguyên tố trong nhóm B (1100 ppm F) trước (T) và sau (S) thử nghiệm 53

4.2.3 Phần trăm khối lượng các nguyên tố giữa 2 nhóm trước (T) và sau (S) thử nghiệm… 55

4.3 Sự thay đổi hình thái vi thể của bề mặt ngà răng sữa sâu 56

HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU 57

KẾT LUẬN 59

ĐỀ XUẤT 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

%gCaP Phần trăm tăng lên của tỉ lệ Ca/P

%mCa Phần trăm khối lượng nguyên tố Calci

%mF Phần trăm khối lượng nguyên tố Fluor

%mO Phần trăm khối lượng nguyên tố Oxy

%mP Phần trăm khối lượng nguyên tố Phospho

fTCP functionalized Tri-Calcium Phosphate

functionalized ß-TCP

ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH

Kính hiển vi điện tử quét Scaning Electron Microscopy

Kính hiển vi phân cực Polarizedlight microscopy

Kính hiển vi quét đồng tiêu Confocal laser scanning microscopyPhân tích phổ quang hồng ngoại IR Analysis

Phân tích phổ tán sắc năng lượng tia X Energy – Dispersive X-ray SpectroscopyPhân tích phổ tia X X- ray microanalysis

Thang đánh giá đau tương đồng nhìn được Visual analogue scale

Tri-calcium phosphate hoạt hóa functionalized Tri-calcium phosphate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân tích đỉnh phổ hồng ngoại của dao động liên kết P-O trong xói mòn men răng

được điều trị với 225 và 1100 ppm F (NaF) có hoặc không có fTCP 12

Bảng 1.2 Các nghiên cứu có kem đánh răng fTCP + 950ppm F 13

Bảng 3.1 Tỉ lệ mol Ca/P (T) và (S) thử nghiệm ở tổng các khoảng đo của nhóm A 31

Bảng 3.2 Tỉ lệ mol Ca/P (T) và (S) thử nghiệm ở tổng các khoảng đo của nhóm B 37

Bảng 3.3 Tỉ lệ mol Ca/P (T) thử nghiệm ở tổng các khoảng đo của hai nhóm 38

Bảng 3.4 Tỉ lệ mol Ca/P sau thử nghiệm của hai nhóm 41

Bảng 3.5 Phần trăm tăng lên của tỉ lệ Ca/P giữa hai nhóm 43

Bảng 4.1 Kết quả %m (Ca, P) và tỉ lệ Ca/P trước thử nghiệm trong nghiên cứu được so với nghiên cứu của Arnold và cộng sự (2001), Arnold và cộng sự (2003) 49

Bảng 4.2 Tóm tắt các kết quả so sánh (T) và (S) thử nghiệm của nhóm A 51

Bảng 4.3 Tóm tắt các kết quả so sánh (T) và (S) thử nghiệm của nhóm B 54

DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phần trăm khối lượng (%m) các nguyên tố (Ca, P, F, O) trước (T) và (S) thử

trong tổng các khoảng đo từ 0 - 25 µm của nhóm A 30

Biểu đồ 3.7 Phần trăm khối lượng (%m) các nguyên tố trước (T) và sau (S) thử nghiệm trong

tổng các khoảng đo từ 0 - 45 µm của nhóm A 30

Biểu đồ 3.8 Tỉ lệ mol Ca/P trước (T) và sau (S) thử nghiệm của nhóm A 31 Biểu đồ 3.9 Phần trăm khối lượng (%m) các nguyên tố (Ca, P, F, O) trước (T) và sau (S)

Biểu đồ 3.14 Phần trăm khối lượng (%m) các nguyên tố trước (T) và sau (S) thử nghiệm

trong tổng các khoảng đo từ 0 - 25 µm của nhóm B 35

Biểu đồ 3.15 Phần trăm khối lượng (%m) các nguyên tố (T) và (S) thử nghiệm trong tổng

các khoảng đo từ 0 - 45 µm của nhóm B 36

Biểu đồ 3.16 Tỉ lệ mol Calci/Phospho trước (T) và sau (S) thử nghiệm của nhóm B 36 Biểu đồ 3.17 Phần trăm khối lượng (%m) các nguyên tố (Ca, P, F, O) trước thử nghiệm của

hai nhóm 37

Biểu đồ 3.18 Tỉ lệ mol Ca/P trước thử nghiệm giữa hai nhóm 38

Biểu đồ 3.19 Phần trăm khối lượng (%m) các nguyên tố (Ca, P, F,O) 39

Biểu đồ 3.20 Phần trăm khối lượng (%m) Fluor sau thử nghiệm của hai nhóm 40

Biểu đồ 3.21 Tỉ lệ mol Ca/P sau thử nghiệm giữa hai nhóm 40

Biểu đồ 3.22 Phần trăm tăng lên của tỉ lệ Ca/P ở hai nhóm 42

Biểu đồ 3.23 Phần trăm tăng lên của tỉ lệ Ca/P giữa hai nhóm 42

Sơ đồ 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu để phân tích SEM/EDS trước thử nghiệm 21

Sơ đồ 2.2 Quy trình tác động mẫu với kem đánh răng của hai nhóm trong 28 ngày 22

Sơ đồ 2.3 Tóm tắt quy trình thử nghiệm 24

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Trạng thái cân bằng giữa khử khoáng và tái khoáng năng động tại giao diện men

răng-mảng bám Nước bọt đóng vai trò như một nguồn cung cấp ion khoáng và fluor thúcđẩy tổn thương tái khoáng 5

Hình 1.2 Ảnh phóng đại kỹ thuật số của tổn thương sâu ngưng tiến triển được nhuộm bằng

Caries Detector (A) Tổn thương phân thành 4 vùng: màu hồng, hồng nhạt, trong suốt, ngàgần như bình thường (B) Tổn thương có màu nâu xẫm và bị nhuộm ít với Caries Detector.(P: vùng màu hồng, LP: vùng màu hồng nhạt, T: vùng trong suốt, AN: vùng ngà răng gầnnhư bình thường) 6

Hình 1.3 Ảnh phóng đại kỹ thuật số của tổn thương sâu hoạt động trung bình (A) Tổn

thương không được nhuộm, mô răng hơi đổi màu và một số mô răng mất do sâu răng (B)Tổn thương được nhuộm, mô bắt màu nhuộm hơn tổn thương ngưng tiến triển (P: vùng màuhồng, AN: vùng ngà răng gần như bình thường) 7

Hình 1.4 Cấu trúc vô cơ của ngà răng khử khoáng nhân tạo của răng người ở đường liên

kết của lớp thứ nhất và lớp thứ hai quan sát qua hình ảnh hiển vi điện tử (It D: ngà gian ống,

Pt D: ngà quanh ống) 8

Hình 1.5 Cấu trúc vô cơ của lớp thứ nhất ở ngà răng sâu tự nhiên của người khi ống ngà

không bị lấp bởi vi khuẩn Ống ngà được lấp bởi những tinh thể nằm lỏng lẻo dạng hạtthường từ trung tâm hốc (a) Hốc bị lấp một phần, (b) Hốc bị lấp hoàn toàn, (c) Hốc bị lấpbởi tinh thể dạng lá hoặc dạng dĩa lớn hơn 9

Hình 1.6 Quan sát trên SEM (x100000) tổn thương đốm trắng trên men răng bò thử nghiệm

với kem đánh răng qua chu kỳ pH 10 ngày: (a) không fluor, (b) 500 ppm F (NaF), (c) 500ppm F kết hợp fTCP 13

Hình 2.1 Mẫu thử nghiệm gồm 9 răng sữa sâu lộ ngà 18 Hình 2.2 Mẫu được quét cách ly và cố định trên các đầu que trên nắp ống nghiệm 21 Hình 2.3 Mẫu được được đặt trong nước bọt nhân tạo và bảo quản trong tủ lạnh ở 4OC 22

Hình 2.4 Minh họa phân tích EDS 23 Hình 3.1 Bề mặt ngà răng sâu quan sát qua SEM (x2000) trước thử nghiệm của hai nhóm (mũi tên vàng: lỗ ống ngà mở rộng, không có ngà quanh ống; mũi tên trắng: ngà gian ống

lồi lõm) 43

Hình 3.2 Bề mặt ngà răng sâu quan sát qua SEM (x2000) trước thử nghiệm của hai nhóm (mũi tên trắng: lỗ ống ngà mở rộng; mũi tên xanh: lớp hỗn hợp vô định hình phủ lên ngà

gian ống và lỗ ống ngà) 44

Hình 3.3 Bề mặt ngà răng sâu quan sát qua SEM (x2000) trước thử nghiệm của hai nhóm

(mũi tên xanh: dạng sợi collagen của ngà gian ống) 44

Hình 3.4 Bề mặt ngà răng sâu quan sát qua SEM (x2000) sau thử nghiệm của hai nhóm (mũi

tên vàng: lỗ ống ngà bị bít hoàn toàn hoặc một phần; mũi tên trắng: ngà quanh ống) 45

Hình 3.5 Bề mặt ngà răng sâu quan sát qua SEM phủ vàng (x2000) sau thử nghiệm của hai nhóm (mũi tên vàng: lỗ ống ngà bị bít hoàn toàn hoặc một phần) 45 Hình 3.6 Bề mặt ngà răng sâu quan sát qua SEM/EDS phủ vàng (x10000) sau thử nghiệm của hai nhóm (mũi tên vàng: lắng đọng khoáng chất trên bề mặt 46

MỞ ĐẦU

Sâu răng là sự phá hủy tại chỗ mô cứng của răng nhạy cảm với tác nhân acidsinh ra từ quá trình lên men của vi khuẩn đối với carbonhydrat trong miệng Quá trìnhsâu răng bắt đầu từ trong mảng bám phủ trên bề mặt răng [33], acid sẽ gây ra pH tạichỗ giảm đến giá trị ngưỡng, dẫn đến sự khử khoáng của mô răng [12] Khi pH giảmdưới 5,5 thì bề mặt men và ngà bắt đầu bị khử khoáng (quá trình mất ion calci vàphosphate); nhưng khi pH tăng trên 5,5 thì tái khoáng có thể xảy ra (quá trình hấp thuion calci và phosphate) [22] Sự khử khoáng và tái khoáng là hai quá trình thuậnnghịch, mà sự cân bằng phụ thuộc vào khả năng đệm và bicarbonat trong nước bọtchống lại sự thay đổi pH; nước bọt đóng vai trò quan trọng trong trung hòa acid vàcung cấp ion calci và phosphate hỗ trợ trong tái khoáng hóa [47]

Sâu răng là một bệnh mạn tính phổ biến nhất trên thế giới của con người; bệnh

có thể phát sinh từ thời thơ ấu khi răng sữa đầu tiên hiện diện trong miệng [50] Đây

là nguyên nhân chính gây đau răng ở trẻ em [10] Khi có sự phá hủy men răng làm lộngà răng, tổn thương này có thể khắc phục bằng cách trám lại, tuy nhiên nhóm răngtrước sữa thường khó trong việc trám lại do hình thái men răng mỏng và răng nhỏ.Ngoài ra, có sự khác biệt trong vi cấu trúc của ngà răng sữa so với răng vĩnh viễn domật độ ống ngà cao hơn và đường kính ống ngà lớn hơn nên làm giảm vùng ngà răngđặc cần thiết cho sự dán dính [52] Vì thế, cần có một phương pháp ngăn ngừa tổnthương này tiến triển và duy trì răng sữa bị sâu đến tuổi thay răng

Nhờ cách tiếp cận dự phòng tại chỗ, sâu răng đã giảm trong 40 năm từ khi kemđánh răng có chứa fluor ra đời [55] Hiệu quả tái khoáng của kem đánh răng khôngchỉ cung cấp fluor với vai trò thúc đẩy tái khoáng mà còn phải cung cấp đầy đủ cácion calci, phosphate để thực hiện quá trình tái khoáng Việc sử dụng fluor nồng độcao trong kem đánh răng làm tăng nguy cơ nhiễm fluor cho trẻ em Do đó, công nghệsản xuất kem đánh răng có xu hướng hạ nồng độ fluor hoặc hoàn toàn không có fluor

mà vẫn có thể tăng cường hiệu quả khoáng hóa bằng những ion calci, phosphate có

trong kem đánh răng Tuy nhiên, hiện có ít nghiên cứu chứng minh hiệu quả của sảnphẩm không có fluor nhằm thay thế fluor [21].

Từ năm 2009 đến nay, công nghệ fTCP đã cho ra nhiều sản phẩm kết hợp fTCPvới fluor nhằm đạt được hiệu quả tái khoáng dựa trên nghiên cứu thực nghiệm tronglabo và trên lâm sàng bởi nhiều tác giả Thành phần fTCP là vật liệu thu được từ sựkết hợp của β-tricalcium phosphate (β-TCP) với gốc hữu cơ và/hoặc vô cơ β-TCPđược hoạt hóa nhằm: thứ nhất là tạo ra rào cản ngăn chặn sự tương tác sớm giữa ioncalci với ion fluor; thứ hai là tạo điều kiện cho sự phóng thích có mục tiêu khi được

áp dụng cho răng qua những sản phẩm nha khoa thông thường (ví dụ như kem đánh

răng, nước súc miệng,…) [31] Trên nghiên cứu thử nghiệm tại chỗ (in situ) đối với

dung dịch súc miệng, cùng một nồng độ fluor thì sự kết hợp fTCP với fluor cho thấyhiệu quả tái khoáng trên men răng bị xói mòn lớn hơn so với dung dịch chỉ có fluor.Hiệu quả tái khoáng này có thể so sánh với nước súc miệng có nồng độ fluor cao gấpđôi [37] Một nghiên cứu khác tương tự đối với kem đánh răng trên sâu men “đốmtrắng” nhân tạo cho thấy lợi ích chống sâu răng của sự kết hợp fTCP với fluor được

so sánh với kem đánh răng có fluor với nồng độ cao gấp đôi trên lâm sàng [39].Những lợi ích từ sự kết hợp này nhằm làm giảm nồng độ fluor, ion calci, phosphatetrong sản phẩm và mang lại tính an toàn và tăng hiệu quả cao trong việc tái khoánghóa trên bề mặt và dưới bề mặt tổn thương của men ngà răng [31]

Những nghiên cứu thực nghiệm tại chỗ (in situ) và trong phòng thí nghiệm (in

vitro) hiện có đối với kem đánh răng chứa thành phần fTCP kết hợp với fluor cho

thấy hiệu quả tái khoáng được đánh giá trên những tổn thương sâu men hoặc sâu ngànhân tạo Hiện nay chưa có nghiên cứu đánh giá trên răng sữa có tổn thương đã hìnhthành xoang sâu lộ ngà bằng phương pháp chải răng với kem đánh răng Trong nghiên

cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thử nghiệm in vitro nhằm tìm hiểu hiệu quả

của kem đánh răng kết hợp fTCP với fluor trên tổn thương sâu ngà ở răng sữa so vớikem đánh răng thông thường bằng phân tích phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS) vàkính hiển vi điện tử quét (SEM)

Câu hỏi nghiên cứu: Sự kết hợp fTCP với 950 ppm fluor trong kem đánh răng

có làm tăng hiệu quả tái khoáng so với kem đánh răng thông thường có 1100 ppmfluor trên răng sữa có tổn thương sâu ngà không ?

Giả thuyết nghiên cứu:

Kem đánh răng có kết hợp fTCP với 950 ppm fluor làm tăng hiệu quả tái khoáng

có ý nghĩa so với kem đánh răng thông thường có 1100 ppm fluor trên răng sữa cótổn thương sâu ngà

Mục tiêu tổng quát:

Đánh giá hiệu quả tái khoáng của kem đánh răng có fTCP kết hợp 950 ppmfluor so với kem đánh răng thông thường có 1100 ppm fluor trên răng sữa có tổnthương sâu ngà

Mục tiêu cụ thể:

1 Xác định và so sánh thành phần phần trăm khối lượng của các nguyên tố (calci,phospho, fluor và oxy) trong ngà răng sâu trước và sau khi thử nghiệm với kem đánhrăng ở các nhóm

2 Xác định và so sánh độ sâu thâm nhập của các nguyên tố tái khoáng giữa các nhómsau khi thử nghiệm với kem đánh răng

3 Mô tả và so sánh hình thái vi thể trên bề mặt ngà răng sâu giữa các nhóm

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CẤU TRÚC NGÀ RĂNG SỮA

Ngà răng là một cấu trúc bao phủ và bảo vệ tủy răng từ thân răng đến chân răng.Ngà ở thân răng được che phủ bởi lớp men răng và ở chân răng bởi lớp xê măng Cấutrúc ngà răng là mô cứng khoáng hóa và mang lại hình dạng đặc trưng cho răng.Thành phần cấu tạo ngà răng tương tự xê măng và xương nhưng hoàn toàn khác vớimen răng Trong các lớp ngà khác nhau và trong các loại ngà khác nhau, thành phầnhữu cơ rất cao ở ngà vỏ và rất thấp ở ngà quanh ống và ngược lại thành phần vô cơ(hay thành phần khoáng) chủ yếu là tinh thể phosphat calci dạng apatite chiếm thểtích 90% ngà quanh ống và 50% ngà gian ống Các tinh thể của ngà răng nhỏ hơntinh thể của men răng Thành phần khoáng của ngà răng chứa calci và phospho với tỉ

lệ 2,13:1 theo % khối lượng, ngoài ra răng còn chứa một lượng nhỏ thành phần vô cơkhác như carbon, magnesium và fluor với nồng độ thay đổi Nồng độ fluor trong ngàcao hơn ở gần tủy so với vùng gần men răng và tăng lên theo tuổi [1]

Ngà răng sữa và răng vĩnh viễn tương tự về hình thái và thành phần, tuy nhiên

có một số bằng chứng gợi ý sự khác nhau có ý nghĩa về hóa học và hình thái giữachúng [52] Trong một nghiên cứu so sánh giữa thân răng vĩnh viễn và răng sữa,đường đi ống ngà hình chữ “s” hiện diện ở 100% răng vĩnh viễn và dưới 30% ở răngsữa; ống ngà thẳng hiện diện trên 70% ở thân răng sữa và không thấy ở răng vĩnhviễn [15]

Ống ngà là cấu trúc đi từ nơi tiếp giáp ngà-tủy xuyên qua lớp ngà đã khoánghóa đến đường nối men-ngà ở thân răng hoặc đường nối ngà - xê măng Ở ngà thânrăng, mật độ ống ngà và đường kính ống ngà giảm dần từ phía tủy răng đến đườngnối men-ngà [1] Mật độ ống ngà răng trước sữa nhiều hơn răng cối sữa và xuất hiệnnhiều hơn ngà răng vĩnh viễn; đường kính ống ngà răng sữa dường như lớn hơn răngvĩnh viễn khi về phía buồng tủy Sự khác nhau về cấu trúc này cho thấy răng sữa có

thể dễ nhạy cảm, chấn thương, và độc tố dễ di chuyển qua do sự gia tăng số lượngống ngà rộng hơn [52].

1.2 SÂU RĂNG

Sâu răng là bệnh nhiễm trùng, phổ biến và đa yếu tố ảnh hưởng gần như tất cảcon người trên thế giới Bệnh có tính chất mãn tính, quá trình sâu răng tiến triển chậmliên quan đến việc phá hủy tổ chức mô cứng của răng, xuất hiện ban đầu ở men và kếđến là ngà răng Đây là kết quả của sự tương tác phức tạp theo thời gian giữa acidhữu cơ được tạo ra từ quá trình vi khuẩn trong mảng bám lên men carbonhydrat từchế độ ăn và nhiều yếu tố ký chủ như răng, nước bọt [50] Sâu răng bao gồm mộtchuỗi các trạng thái của bệnh liên hệ mật thiết với cân bằng giữa khử khoáng và táikhoáng hóa có thể tìm thấy ở cận lâm sàng khu trú ban đầu ở men răng tiến triển sangngà hoặc tiến triển vào mô chân răng [24]

Hình 1.1 Trạng thái cân bằng giữa khử khoáng và tái khoáng năng động tại giao

diện men răng-mảng bám Nước bọt đóng vai trò như một nguồn cung cấp ionkhoáng và fluor thúc đẩy tổn thương tái khoáng (Mô phỏng từ Winston andBhaskar 1998) [24]

Mô ngà răng sâu khi được quan sát trên kính hiển vi điện tử gồm 2 lớp Lớp đầutiên thì nông và bị nhuộm với fushin, cho thấy các sợi collagen thoái hóa và các tinhthể vô cơ dạng hạt hay dạng lá không đều nằm rải rác Lớp thứ hai thì sâu và khôngnhuộm với fushin, cho thấy các đuôi nguyên bào ngà kéo dài, các sợi collagen lànhmạnh, và các tinh thể gắn với các sợi giống như các viền [42] Khi một răng sâungừng tiến triển được cắt dọc qua trung tâm xoang sâu thì có 4 vùng được xác địnhtrong tổn thương dựa trên hình dạng quan sát và mức độ nhuộm: màu hồng, hồngnhạt, trong suốt, và ngà răng gần như bình thường Trên răng có tổn thương sâu hoạtđộng trung bình thì nhìn không rõ được 4 vùng này khi nhuộm (Hình 1.2 và Hình 1.3)[59].

Hình 1.2 Ảnh phóng đại kỹ thuật số của tổn thương sâu ngưng tiến triển được nhuộm

bằng Caries Detector (A) Tổn thương phân thành 4 vùng: màu hồng, hồng nhạt, trongsuốt, ngà gần như bình thường (B) Tổn thương có màu nâu xẫm và bị nhuộm ít vớiCaries Detector (P: vùng màu hồng, LP: vùng màu hồng nhạt, T: vùng trong suốt,AN: vùng ngà răng gần như bình thường) [40]

1.2.1 Khử khoáng ngà răng

Khử khoáng răng là quá trình loại bỏ các ion khoáng có trong tinh thể HA củacác mô cứng của răng như men răng, ngà răng, xê măng dẫn đến thiếu sự toàn vẹntrong mạng lưới tinh thể của HA [4] Quá trình này xảy ra khi acid hữu cơ sinh ra từmảng bám vi khuẩn trên bề mặt răng làm pH mảng bám giảm dưới 5,5 [22], [33].Theo đó, acid khuếch tán từ phía mảng bám vào bề mặt men răng và làm các ionkhoáng được phóng thích về phía mảng bám [24] Phương trình hóa học của sự khửkhoáng như sau:

Ca10(PO4)6(OH)2 + 8H+ 10Ca2++ 6HPO42- + 2H2OKhử khoáng ngà răng bắt đầu khi tổn thương sâu men tiếp xúc với đường nốimen ngà với dấu hiệu ngà răng chuyển sang màu nâu [33] Khi vi khuẩn xâm nhậpvào vùng khử khoáng đầu tiên này thì vùng này di chuyển về các vùng ngà xơ hóađược hình thành trước đó [40]

1.2.2 Tái khoáng ngà răng

Tái khoáng hóa là quá trình khôi phục lại các khoáng chất ở dạng ion khoángcho cấu trúc mạng lưới tinh thể HA đã bị khử khoáng trước đó [4] Khi pH tăng trên

Hình 1.3 Ảnh phóng đại kỹ thuật số của tổn thương sâu hoạt động trung bình (A)

Tổn thương không được nhuộm, mô răng hơi đổi màu và một số mô răng mất do sâurăng (B) Tổn thương được nhuộm, mô bắt màu nhuộm hơn tổn thương ngưng tiếntriển (P: vùng màu hồng, AN: vùng ngà răng gần như bình thường) [40]

5,5 tái khoáng có thể xảy ra làm tăng các ion calci và phosphate vào sang thương mấtkhoáng [22] Ở pH trung tính không có tác động của acid, có sự vận chuyển thụ độngcác ion calci và phosphate với nồng độ thấp từ nước bọt hoặc mảng bám vào tổnthương chính Calci phosphat từ trạng thái tan được chuyển thành dạng rắn và ít bịacid hòa tan thông qua sự kết tủa của fluorapatit (FAP) hay fluor hóa hydroxyapaptit(FHA) trên các tinh thể bị khử khoáng trước đó hoặc thông qua mầm của các tinh thểmới Đây là quá trình hóa học vô cơ tự nhiên mà không cần mô mềm hoặc quá trìnhsinh học tế bào [24].

Tái khoáng ngà răng khó khăn hơn tái khoáng men răng do hiện diện nhiềukhuôn hữu cơ trong ngà răng Ngà răng tái khoáng không phải do sự kết tủa tự nhiên

mà cũng không phải bởi mầm khoáng có trong khuôn hữu cơ, nhưng ngà răng táikhoáng bằng cách phát triển những tinh thể còn lại có trong tổn thương [13]

1.2.3 Sự khác nhau giữa sâu ngà răng nhân tạo và tự nhiên

Sâu ngà răng nhân tạo hình thành 2 lớp khi quan sát trên hình ảnh kính hiển viđiện tử, lớp thứ nhất cho thấy hiếm các tinh thể vô cơ ở cả ngà quanh ống và ngà gianống Trong khi lớp thứ hai cho thấy nhiều tinh thể apatite ở cả ngà quanh ống và ngàgian ống Sự khử khoáng ở ranh giới thì sâu dọc theo ngà quanh ống hơn ngà gianống Các tinh thể hình kim trong ngà gian ống ở lớp thứ hai khá thưa thớt trong vùnggần với lớp đầu tiên nhưng các tinh thể này liên kết các sợi collagen chéo giống nhưcác viền và bao phủ toàn bộ các sợi trong vùng gần với ngà bình thường [42]

Hình 1.4 Cấu trúc vô cơ của ngà răng khử khoáng nhân tạo của răng người ở đường

liên kết của lớp thứ nhất và lớp thứ hai quan sát qua hình ảnh hiển vi điện tử (It D:ngà gian ống, Pt D: ngà quanh ống) [42]

Ở ngà răng sâu tự nhiên, ở lớp thứ nhất thì ngà gian ống có các tinh thể dạnghạt nhỏ, dạng lá rộng nằm thưa thớt và không đều và ngà quanh ống biến mất để lạiống ngà mở rộng được lấp đầy bởi vi khuẩn Tuy nhiên, thường hơn trong sâu cấptính, ống ngà không bị vi khuẩn lấp mà các tinh thể dạng hạt nằm lỏng lẻo lấp hoàntoàn ống hay một phần ống từ trung tâm các hốc Lớp thứ hai thì ngà quanh ống cómật độ chất vô cơ đồng nhất nhưng do sự mở rộng của ống ngà nên nó có độ dày nhỏhơn so với lớp ngà bình thường và ngà gian ống cũng có những tinh thể hình kimgiống ngà bình thường nhưng ngắn hơn [42].

Hình 1.5 Cấu trúc vô cơ của lớp thứ nhất ở ngà răng sâu tự nhiên của người khi

ống ngà không bị lấp bởi vi khuẩn Ống ngà được lấp bởi những tinh thể nằm lỏnglẻo dạng hạt thường từ trung tâm hốc (a) Hốc bị lấp một phần, (b) Hốc bị lấp hoàntoàn, (c) Hốc bị lấp bởi tinh thể dạng lá hoặc dạng dĩa lớn hơn [42]

Ngà răng sâu nhân tạo được tạo ra bởi quá trình khử khoáng nhân tạo thì chothấy mẫu hình mất khoáng đồng nhất và lượng khoáng thấp hơn ngà răng sâu tự nhiên.Sâu răng nhân tạo có quá trình tái khoáng hóa gần ngà bình thường và hướng về đáyxoang khi tiếp xúc với tác nhân tái khoáng và ngược lại, sâu răng tự nhiên có quátrình tái khoáng hóa tại bề mặt đáy xoang tiếp xúc với tác nhân tái khoáng và hướng

về phía tủy răng Quá trình lắng đọng khoáng chất diễn ra nhanh hơn trong khoảngthời gian 4 tuần đầu ở ngà răng sâu nhân tạo so với ngà răng sâu tự nhiên nhưng sau

4 tuần thì chậm lại và ít hơn ngà răng sâu tự nhiên [9]

1.3 CÁC TÁC NHÂN KHOÁNG HÓA

1.3.1 Fluor

Ảnh hưởng của fluor trên răng người được công nhận vào năm 1909 tạiColorado, Hoa Kỳ, khi Frederick McKay và Grant Black điều tra nguyên nhân nhữngđốm men “vết màu nâu Colorado” trên răng Những nghiên cứu tiếp theo của McKay

và cộng sự vào năm 1931 khẳng định mối liên hệ giữa đốm men và nồng độ fluortrong nước Từ năm 1931 và sau 10 năm nghiên cứu, tiến sĩ Trendley Dean và cộng

sự phát hiện fluor trong nước có nồng độ 1ppm có tác dụng chống sâu răng đồng thờigiảm thiểu mức độ nhiễm fluor trên răng Từ năm 1950, Hoa Kỳ là nước dẫn đầu tiếnhành chương trình fluor hóa nước máy được WHO chấp nhận là một can thiệp sứckhỏe răng miệng hiệu quả [45]

Nhiều nghiên cứu đã quan sát tác dụng phòng ngừa sâu răng của fluor thôngqua 3 cơ chế cụ thể [17]:

- Fluor làm giảm tính hòa tan men răng trong acid bằng cách chuyển đổihydroxyapatite thành fluorhydroxyapatite hay fluorapatite ít tan hơn

- Fluor tác động trực tiếp trên mảng bám răng bằng cách làm giảm khả năng tạo raacid của mảng bám vi khuẩn

- Fluor thúc đẩy sự tái khoáng hoặc sửa chữa vùng men răng bị acid khử khoáng.Trong phòng ngừa sâu răng và tái khoáng hóa là thường xuyên tiếp xúc với cácmức thấp của fluor có trong kem đánh răng, nước súc miệng, nhai kẹo cao su chứafluor, véc-ni có fluor…trong khi đó fluor toàn thân bị giới hạn [25]

1.3.2 fTCP kết hợp fluor

Năm 2009, fTCP được bổ sung vào kem đánh răng có chứa fluor được đánh giátrên in vitro cho thấy vai trò tái khoáng của fTCP trong công nghệ tương lai [28].fTCP là vật liệu thu được từ sự kết hợp của β-tricalcium phosphate với gốc gốc vôcơ/hữu cơ, như các acid cacboxylic và chất có hoạt tính bề mặt [29] β-TCP là thànhphần khoáng có hoạt tính sinh học, an toàn và không gây độc tính tại chỗ và toàn thân[53], và hấp dẫn do tính hòa tan giới hạn của nó so với các muối calci và khoáng chấtkhác, điều đó có ảnh hưởng vì tương thích với fluor trong những chế phẩm nền nước

[31] β-TCP được sử dụng hỗ trợ tái tạo xương trong những thủ thuật hàm mặt đượcFDA đưa vào xếp vào loại II (nhóm kiểm soát đặc biệt) [19].

Một tính năng quan trọng của β-TCP là biểu hiện khiếm khuyết mạng tinh thể,điều đó cho phép sự cải biến tinh thể Do tính tương thích với fluor nên là điều rấtquan trọng trong việc thiết kế với mục đích cải thiện liệu pháp chống sâu răng [28],[29] Vì có khả năng thay đổi hoặc hoạt hóa nên β-TCP cung cấp một con đường tiềmnăng trong nghiên cứu hoạt tính sinh học và những tác nhân khoáng hóa tương thíchvới fluor [31]

Hoạt hóa β-TCP nhằm tạo ra 2 chức năng, đó là tạo ra các rào cản ngăn chặn sựtương tác sớm giữa calci với fluor và tạo điều kiện phóng thích có mục tiêu khi ápdụng sản phẩm nha khoa thông thường như kem đánh răng, nước súc miệng [31].Thành phần fTCP được thiết kế bổ sung fluor để tăng cường hoạt động mầmfluor với sự tái khoáng theo sau chế độ ăn và nước bọt chứa calci và phosphate Đó

là nguyên lý mà mức độ fTCP thấp hơn mức độ fluor trong sản phẩm nha khoa Bởi

vì tương thích, fTCP chia sẽ cùng một ngăn chứa fluor để đảm bảo cung cấp tối ưucủa fluor và fTCP Điều quan trọng là fTCP không thay thế cho fluor hoặc nước bọt.Thay vào đó, nó là một tác nhân làm việc đồng bộ với fluor để tạo ra hiệu quả hơn,khoáng chống acid nhiều hơn so với một thành phần fluor hoặc β-TCP, hoặc fTCP[31]

Những nghiên cứu sau đây cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa của fluor kết hợpfTCP và fluor không kết hợp fTCP:

- Nghiên cứu sự hấp thu fluor và phosphate trên những tổn thương xói mònmen răng ở 2 nồng độ fluor (225 ppm và 1100 ppm) có kết hợp fTCP và không kếthợp fTCP (Bảng 1.1) Đo bằng quang phổ hồng ngoại cho thấy nhóm (fTCP + 225ppm F) thể hiện cường độ liên kết PO (phosphate - oxygen) mạnh so với nhóm chỉ

có 225 ppm fluor và điều này xuất hiện độc lập với sự hấp thu fluor Với sự hiện diệnfTCP trong thành phần không chỉ tạo ra liên kết mạnh mẽ của P-O mà còn tạo ra liênkết P-F so với nhóm chỉ có fluor, đây là sự hợp nhất khoáng vào mạng lưới PO4 độcđáo và có ý nghĩa [29], [31]

Bảng 1.1 Phân tích đỉnh phổ hồng ngoại của dao động liên kết P-O trong xói mòn

men răng được điều trị với 225 và 1100 ppm F (NaF) có hoặc không có fTCP(Karlinsey et al., 2010e)

Nhóm chất men răng

Cường độ đỉnh (A.U.)

Vị trí đỉnh (cm -1 )

[F - ]

và dưới bề mặt tổn thương so với chỉ có NaF [31] fTCP kết hợp fluor ảnh hưởng đếnhình thái tổn thương sau khi nó được tiếp xúc với tổn thương, cho thấy tinh thể đượctạo ra lớn và dày đặc so sánh với tinh thể nhỏ nhơn hoặc độ đặc thấp hơn của mẫukhông tiếp xúc hoặc tiếp xúc fluor, khi được quan sát trên SEM (Hình 1.6) [31] Mộtnghiên cứu khác về hiệu quả kháng acid của ngà răng bò sau khi tiếp xúc với nhữngloại kem bôi tại chỗ NaF chuyên dụng như (Clinpro 5000, Clinpro Tooth Crème, MIPaste Plus, Sensodyne NUPRO 5000, Topex Renew) cho thấy kem đánh răng chứa

fTCP + Fluor (Clinpro 5000, Clinpro Tooth Crème) bít ống ngà kháng acid trên ngàrăng sau khi khử khoáng, đây là tiềm năng cho hiện tượng quá cảm ngà [30], [31].

Hình 1.6 Quan sát trên SEM (x100000) tổn thương đốm trắng trên men răng bò

thử nghiệm với kem đánh răng qua chu kỳ pH 10 ngày: (a) không fluor, (b) 500ppm F (NaF), (c) 500 ppm F kết hợp fTCP

Ngoài ra, fTCP cũng đã được quan sát cho thấy ức chế đáng kể tổn thươngđang tiến triển được chứng minh lâm sàng nhưng 3M ESPE chưa công bố [31].Nghiên cứu in situ trên tình nguyện viên, kết quả đo độ cứng bề mặt sâu men đốmtrắng nhân tạo khi dùng kem đánh răng (500ppm + fTCP) phục hồi độ cứng bề mặtlớn hơn so với nhóm tương ứng 500ppm và 1100ppm và khả năng chống sâu răngđược so sánh với kem đánh răng chỉ có 1100ppm fluor dùng trên lâm sàng [39].Một số nghiên cứu in vitro, in situ và thử nghiệm lâm sàng có kem đánh răngfTCP + 950 ppm F theo Bảng 1.2

Bảng 1.2 Các nghiên cứu có kem đánh răng fTCP + 950 ppm F

hơn 5,000 ppm F + Novamin, 900ppm F + CPP-ACP.

CPP-ACP > nhóm chứng có ýnghĩa trong chống xói mòn menrăng

fTCP + 950 ppm F > CPP-ACP +

900 ppmF > CPP-ACP > nước bọtnhân tạo Cả ba nhóm có hiệu quảtái khoáng lớn hơn nước bọt nhântạo có ý nghĩa

Prabhakar và cộng sự

(2013) [46]

- Khử khoáng nhân tạotrên men và ngà răngngười

- Đánh giá tái khoángtrong men răng bằngPLM, bít ống ngà bằngSEM + phần mềmAdobe® Photoshop CS3

Hiệu quả liều F trong tái khoáng

có ý nghĩa so với fTCP + 950 ppm

F và 900 ppm F + CPP-ACP Hiệuquả bít ống ngà fTCP + 950 ppm

Độ sâu tái khoáng ở 20 ngày củaFluoride Varnish > CPP-ACP >fTCP + 950ppm F Độ sâu táikhoáng ở 40 ngày, CPP-ACP vàfTCP + 950 ppm có sự gia tăng cóý nghĩa độ sâu tái khoáng so với

20 ngày Trong khi đó Fluoride

Varnish không khác biệt không cóý nghĩa giữa hai thời điểm

Chải răng với fTCP + 950 ppm F+ bôi vào ban đêm > 1450 ppm F+ 3,75% KCl > chải răng với 950ppm F + fTCP > 1000 ppm F

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SANG THƯƠNG NGÀ RĂNG MẤT KHOÁNG VÀ TÁI KHOÁNG TRONG NGHIÊN CỨU

1.4.1 Phân tích thành phần hóa học theo phương pháp phổ tán sắc năng lượng tia X hay gọi là phân tích EDS (Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy)

Phân tích EDS là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học bằng thiết bị hiện đại,cho phép xác định nhanh chóng và chính xác thành phần các nguyên tố hóa học cấutạo bề mặt mẫu nghiên cứu [43] Kỹ thuật này phát triển từ những năm 1960 và thiết

bị xuất hiện trên thị trường vào đầu những năm 1970 [2]

EDS hoạt động theo nguyên lý là tạo ra một chùm electron năng lượng cao đến

bề mặt được xác định, electron xuyên sâu vào nguyên tử bề mặt mẫu và đẩy electrontrong lớp điện tử bên trong nguyên tử ra ngoài gây ra khác biệt năng lượng giữa hailớp điện tử làm tạo ra các tia X có bước sóng đặc trưng tỷ lệ với nguyên tử số (Z) củanguyên tử Phổ tia X tạo ra được đo bằng phổ kế tán sắc năng lượng, do đó xác địnhđược thành phần nguyên tố và tỉ lệ phần trăm trọng lượng giữa các nguyên tố có trên

bề mặt mẫu [2], [18] Kỹ thuật này không xác định được những nguyên tố như H, He,

Ba Mặc dù EDS chính xác hơn cho những nguyên tử có nguyên tử số cao nhưng cósai số là 0,1% và với nguyên tử số thấp (C, N, O) có sai số 1-5%, điều này phụ thuộcvào việc chuẩn bị mẫu và hiệu chỉnh phù hợp cho các tính toán định lượng [43]

1.4.2 Kính hiển vi điện tử quét (SEM)

SEM là một kỹ thuật đặc trưng được sử dụng rộng rãi cho tất cả các loại mẫu từvật liệu cứng như kim loại và gốm sứ đến các vật liệu mềm như polymer và các môsinh học [43] Đây là một kỹ thuật hiển vi điện tử rất hữu dụng trong phân tích bề mặt

và dưới bề mặt của cấu trúc nano Hình ảnh có độ phân giải rất cao giúp xác địnhhình thái bề mặt và kích thước các hạt [18], [26]

Nguyên tắc căn bản là một chùm electron được tập trung cao và quét qua khuvực phân tích và các tín hiệu được tạo ra do tương tác electron và chất trên bề mặtmẫu [43] Tín hiệu này bao gồm các electron thứ cấp, electron tán xạ ngược và nănglược tia X phân tán [18] SEM có thể cung cấp thông tin về hình thái của các bề mặtmẫu ở mức dưới µm từ một độ phân giải điểm - điểm tương đương 50nm Vi hìnhảnh là bức ảnh trắng đen vì vậy dễ quan sát [43]

Ứng dụng của SEM là một trong những kỹ thuật đầu tiên được sử dụng nghiêncứu tái hấp thu mô cứng của răng trong phòng thí nghiệm SEM là thiết bị được sửdụng thường xuyên đánh giá những thay đổi bề mặt men – ngà răng bị tổn thươngcũng như sau khi tác động các tác nhân khử khoáng/tái khoáng… Sử dụng SEM giảmthiểu nguy cơ tạo tác trên mẫu nghiên cứu, nhưng đánh giá bề mặt mẫu qua hình ảnh

do SEM tạo ra mang tính chất định tính [26] Do đó, SEM thường được trang bị với

kỹ thuật EDS để xác định được thành phần và tỷ lệ phần trăm trọng lượng các nguyên

tố có trong trong mẫu [18]

2 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thử nghiệm trong phòng thí nghiệm (In vitro).

Nghiên cứu tại labo Kỹ thuật y sinh trường đại học Quốc Tế - đại học QuốcGia Tp.HCM và thời gian nghiên cứu từ ngày 11/04/2018 đến 21/06/2018

2.2 MẪU NGHIÊN CỨU

18 mẫu răng sữa, có được từ cắt 9 răng sữa sâu có cửa sổ sâu lộ ngà (mỗi răngđược cắt thành 2 khối đi qua qua trung tâm cửa sổ sâu và được phân bố vào 2 nhómthử nghiệm) (Hình 2.1)

Những răng sữa sâu này được nhổ theo chỉ định của bác sĩ và yêu cầu của phụhuynh đến thời điểm thay răng và được chọn vào thử nghiệm theo tiêu chuẩn sau:

- Tiêu chuẩn chọn mẫu:

+ Thân răng có xoang sâu lộ ngà có kích thước ≥ 2x2mm+ Xoang sâu nằm ở mặt ngoài của nhóm răng trước hoặc mặt nhai củanhóm răng cối ở hệ răng sữa

- Tiêu chuẩn loại trừ:

+ Vỡ trên 2/3 thân răng

2.3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

A Vật liệu, dụng cụ chuẩn bị mẫu

- Đĩa cắt kim cương mỏng 0,15mm

Hình 2.1 Mẫu thử nghiệm gồm 9 răng sữa sâu lộ ngà

- Chổi đánh bóng

- Giấy nhám KOVAX (P800, P1000, P1200, P1500, P2000, TOKYO JAPAN)

- Dung dịch formalin 10% (pH 7,0)

- Nước sơn móng tay cách ly (OPI, top coat, 533422, USA)

- Aceton 99.82% (Xilong Scientific, China)

- Tay khoan khuỷu và thẳng lowspeed

- NaOCl 3% (Parcan, Septodont, France)

Water(Aqua), Sorbitol, Hydrated Silica, Glycerin, Poloxamer

407, Aroma, PEG-12, Sodium Lauryl Sulfate, Titanium

Dioxide, Cellulose Gum, Sodium Saccharin, Tri-calcium Phosphate, Sodium Fluoride (950 ppm F-, 0.21% w/w,0.12%w/v fluoride ion)

- Nước bọt nhân tạo có thành phần theo Yamaguchi, K., et al (2006) [57].

C Vật liệu, thiết bị chuẩn bị cho đánh giá

- Dung dịch cồn 30%, 50%, 70%, 90%, 96%, 100% (Ethanol absolute, AnalaRNORMAPUR, France)

- Máy đông khô (Freeze dry system, LABCONCO)

- Kính hiển điện tử quét và máy đo phổ tán sắc năng lượng tia X (JSM-IT100)

- Bồn siêu âm (Utrasonic P Elma)

2.4 QUI TRÌNH THỰC HIỆN

2.4.1 Giai đoạn chuẩn bị và phân bố mẫu thử nghiệm

- Mỗi răng sữa sâu được chọn sau khi vừa mới nhổ, sau đó răng được làm sạch hoàntoàn các mô mềm xung quanh và làm sạch tủy bằng NaOCL 3%, tiếp theo đem ngâmvào dung dịch formalin 10% (pH 7,0) trong 5 ngày ở 37OC [49] Sau đó mẫu đượcbảo quản trong lọ ống nghiệm với 5ml nước cất ở ngăn lạnh 4OC cho đến khi đủ mẫu

- Dùng đĩa cắt kim cương với tay khoan chậm có phun nước lạnh (nước cất được làmlạnh 4OC) để cắt bỏ phần chân răng còn lại ngay đường nối men xê măng và khối thânrăng còn lại được cắt vuông góc với bề mặt thân răng đi qua trung tâm xoang sâuthành 2 khối, được phân bố ngẫu nhiên vào 2 nhóm (A, B) được mã hóa theo (Phụlục 1)

- Các khối răng của hai nhóm được làm bóng mặt cắt với các giấy nhám có độ mịntăng dần (800 - 2000) với nước cất lạnh và làm sạch mặt sâu với cách thức mô phỏnggiống trên lâm sàng là dùng chổi đánh bóng với nước cất trong 15 giây từ phần xoangsâu để loại bỏ những mảnh vụn còn bám trên bề mặt

- Các mẫu sau đó được chải rửa lại với nước cất trong 1 phút và ngâm với nước cấttrong ống nghiệm bảo quản ở ngăn mát lạnh 4OC cho đến khi mẫu được phân tíchSEM/EDX lần thứ nhất.

- Các mẫu của 2 nhóm được làm ấm lên 37OC, sau đó rửa lại với nước cất và thựchiện qui trình khử nước làm khô mẫu trước khi đưa vào máy đo SEM/EDX

- Sau khi được phân tích SEM/EDS trước thử nghiệm, mẫu được cố định lên đầu quetrên nắp ống nghiệm bằng composite và quét sơn cách ly phủ lên tất cả các mặt củamẫu, trừ mặt xoang sâu (Hình 2.2)

Sơ đồ 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu để phân tích SEM/EDS trước thử nghiệm

Hình 2.2 Mẫu được quét cách ly và cố định trên các đầu que trên nắp ống nghiệm

- Sau quét sơn cách ly mẫu được đặt trở lại ống nghiệm có chứa nước bọt nhân tạobảo quản ở 4OC để chuẩn bị đủ số lượng mẫu cho tác động KĐR cùng một thời điểm(Hình 2.3).

2.4.2 Giai đoạn tác động mẫu với 2 loại kem đánh răng được mã hóa A, B.

- Nhóm A, B: mẫu được đem ra khỏi ống nghiệm, sử dụng bàn chải chỉnh nha riêngcho mỗi mẫu với kem đánh răng và chải trong thời gian 2 phút, mỗi ngày chải 2 lần.Sau mỗi lần chải, mẫu được rửa lại bằng nước cất và ngâm trong nước bọt nhân tạo

ở 37OC Dung dịch nước bọt được thay mới mỗi 24 giờ Quy trình thực hiện trong 28ngày (Sơ đồ 2.2)

2.4.3 Giai đoạn đo mẫu sau 28 ngày thực hiện qui trình

- Tất cả mẫu của 2 nhóm được đem ra khỏi ống nghiệm rửa lại với aceton để làm sạchsơn còn dính trên bề mặt mẫu Sau đó tất cả các nhóm đều được rửa với nước cấttrong 1 phút nhằm loại bỏ vật liệu thừa trên bề mặt

- Thực hiện qui trình đo mẫu như trước khi tác động mẫu bằng kem đánh răng

Sơ đồ 2.2 Quy trình tác động mẫu với kem đánh răng của hai nhóm trong 28 ngày Hình 2.3 Mẫu được được đặt trong nước bọt nhân tạo và bảo quản trong tủ

lạnh ở 4OC

2.5 PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT (SEM) VÀ ĐO TRÊN PHỔ TÁN SẮC NĂNG LƯỢNG TIA X (EDS)

- Thực hiện qui trình khử nước, ngâm lần lượt các mẫu trong cồn (30% trong 10 phút,

50% trong 10 phút, 70% trong 10 phút, 90% trong 10 phút, 96% trong 10 phút và100% trong 20 phút) theo Azevedo (2014) [9] Tiếp theo, mẫu được đặt trong tủ đông

15 phút và sau đó đặt trong máy đông khô 30 phút

- Các mẫu sau đó được đưa vào buồng chứa và quan sát bề mặt cắt dưới kính hiển viđiện tử quét với chế độ quan sát không phủ (điện thế gia tốc 20kV, lowvacuum) Bềmặt mẫu được kỹ thuật viên quan sát từ độ phóng đại nhỏ đến lớn, chụp những ảnh

có tính đại diện cho mẫu quan sát ở độ phóng đại x30, x250, x1000 Sau khi quan sátSEM, mẫu thử nghiệm tiếp tục được phân tích thành phần hóa học theo kỹ thuật EDSvới độ phóng đại x1000 với 4 nguyên tố can-xi, phospho, fluor và oxy Mỗi bề mặtcắt của mẫu được đo bắt đầu từ đường giao diện cắt và diện xoang sâu với 5 vùngliên tiếp bằng nhau (mỗi vùng có kích thước là 5x50 micromet) (0-5, 5-10, 10-15, 15-

20, 20 -25) µm và một vùng (25 - 45) µm có kích thước 20x50 micromet theo trụchướng ống ngà Tất cả hình ảnh và dữ liệu được thu thập lưu vào đĩa CD (Hình 2.4)

- Tiếp theo mẫu được chụp SEM bề mặt sâu ở độ phóng đại x2000 với chế độ quansát không phủ (điện thế gia tốc 20 kV, lowvacuum) Tất cả hình ảnh và dữ liệu đượcthu thập lưu vào đĩa CD

Hình 2.4 Minh họa phân tích EDS

2.6 CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU

Biến số độc lập, phụ thuộc

- %mCa: phần trăm khối lượng nguyên tố Calci

- %mP: phần trăm khối lượng nguyên tố Phospho

- %mF: phần trăm khối lượng nguyên tố Fluor

- %mO: phần trăm khối lượng nguyên tố Oxy

- Tỉ lệ mol Ca/P có công thức: Ca/P = %mCa × 30,974

%𝑚𝑃 × 40,078 với 40,078 là khối lượngnguyên tử Calci và 30,974 là khối lượng nguyên tử Phospho

- %gCaP: phần trăm tăng lên của tỉ lệ Ca/P sau thử nghiệm có công thức:

Khoảng đo (đơn vị: µm): 0 – 5µm, 5 – 10 µm, 10 – 15µm, 15 20µm, 20 25µm, 25 - 45µm

Tổng các khoảng đo: (0 – 25µm) = (0 – 5µm + 5 – 10 µm + 10 – 15µm + 15 20µm + 20 - 25µm); (0 - 45µm) = (0 – 5µm + 5 – 10 µm + 10 – 15µm + 15 - 20µm+ 20 - 25µm + 25 - 45 µm)

- Các số liệu được kiểm định phân phối bằng phép kiểm Sharpiro – Wilk test

- Kiểm định bắt cặp: t bắt cặp (Paired-samples t-test) hoặc kiểm định phi tham

số (Wilcoxon signed rank) để so sánh sự khác biệt vệ %mCa, %mP, %mF,

%mO, tỉ lệ mol Ca/P của mỗi nhóm trước và sau thử nghiệm trong các khoảng

đo, tổng các khoảng đo

- Kiểm định 2 nhóm độc lập: kiểm định t độc lập (Independent - samples t test)

và kiểm định phi tham số (Mann – Whitney) để so sánh sự khác biệt về

%mCa, %mP, %mF, %mO, tỉ lệ mol Ca/P giữa hai nhóm trước và sau thửnghiệm, %gCaP giữa hai nhóm sau thử nghiệm trong các khoảng đo, tổngcác khoảng đo

- Các phép kiểm thống kê được tính với độ tin cậy 95% (p<0,05)

3 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ

Thử nghiệm được thực hiện trên 18 mẫu ngà răng sâu từ 9 răng sữa sâu lộ ngàcủa trẻ em, được chia thành 2 nhóm thử nghiệm (mỗi nhóm gồm 9 mẫu), đánh giá sosánh mẫu trước và sau khi tác động với kem đánh răng trong nhóm A (950ppm F +fTCP) và nhóm B (1100ppm F), so sánh mẫu giữa 2 nhóm sau khi tác động kem đánhrăng Kết quả thử nghiệm được phân tích gồm:

- Phân tích định lượng thành phần phần trăm khối lượng (%m) của (Ca, P, F, O)trong các khoảng đo từ 0 đến 45 µm trước và sau thử nghiệm

- Phân tích hình thái bề mặt ngà răng sâu trước và sau can thiệp kem đánh rănggiữa 2 nhóm

3.1 SO SÁNH SỰ THAY ĐỔI PHẦN TRĂM KHỐI LƯỢNG CỦA (Ca, P, F, O) TRÊN TỪNG NHÓM VÀ GIỮA 2 NHÓM SỬ DỤNG KEM ĐÁNH RĂNG 3.1.1 Nhóm sử dụng kem đánh răng A (950ppm F + fTCP)

Sau khi phân tích %m của nguyên tố (Ca, P, F, O) trong các khoảng đo trênmặt cắt dọc từ bề mặt đáy xoang sâu đến 45 micromet ở thời điểm trước (T) và sau(S) thử nghiệm được thể hiện chung qua Biểu đồ 3.1 Kết quả cho thấy có sự thay đổithành phần trăm các nguyên tố giữa hai thời điểm

Kết quả so sánh mỗi thành phần nguyên tố nguyên tố như sau:

- Thành phần phần trăm khối lượng Calci (%mCa):vị trí khoảng đo (10 – 15 µm) thờiđiểm (T) – (S) lần lượt là 23,81 (±4,18%) - 18,36 (±5,18%), có sự khác biệt có ýnghĩa thống kê (p= 0,043) và T>S (p<0,05) Các khoảng đo (0 – 5 µm, 5 – 10 µm, 15– 20 µm, 20 – 25 µm, 25 – 45 µm) có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)(Biểu đồ 3.2)

Biểu đồ 3.1 Phần trăm khối lượng (%m) các nguyên tố (Ca, P, F, O) trước (T)

và (S) thử nghiệm của nhóm A

Biểu đồ 3.2 Phần trăm khối lượng (%m) Calci trước (T) và (S) thử nghiệm

- Thành phần phần trăm khối lượng Phospho (%mP): ở các khoảng đo khác biệt không

có ý nghĩa thống kê giữa giữa hai thời điểm trước và sau thử nghiệm (p>0,05) (Biểu

đồ 3.3)

- Thành phần phần trăm khối lượng Fluor (%mF): vị trí khoảng đo (0 – 5 µm) thờiđiểm trước (T) – sau (S) lần lượt là 0,63 (±1,15%) - 2,22 (±2,96%), có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê (p=0,04) và T<S (p<0,05) Các khoảng đo (5 – 10 µm, 10 – 15

µm, 15 – 20 µm, 20 – 25 µm, 25 – 45 µm) có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê(p>0,05) (Biểu đồ 3.4)

- Thành phần phần trăm khối lượng Oxy (%mO): ở khoảng đo (10 –15 µm) ở thờiđiểm trước (T) – sau (S) lần lượt là 60,16 (±6,56%) - 68,36 (±9,61%), có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê (p=0,04) và T<S (p<0,05) Các khoảng đo (0 – 5 µm, 5 – 10 µm,

20 – 25 µm, 25 - 45 µm) có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Biểu

đồ 3.5)

Biểu đồ 3.3 Phần trăm khối lượng (%m) Phospho trước (T) và (S) thử nghiệm

của nhóm A