Sự đề kháng kháng sinh của các chủng trực khuẩn gram âm gây bệnh thường gặp tại bệnh viện quân y 175 từ 11 2017 đến 6 2018

Trong cơ cấu vi khuẩn gây bệnh, trực khuẩn Gram âm chiếmmột tỉ lệ cao vượt trội và được đánh giá là tác nhân nguy hiểm hàng đầu gây nhiễmkhuẩn bệnh viện, nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-LÊ THÙY DƯƠNG

SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG TRỰC KHUẨN GRAM ÂM GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP TẠI BỆNH VIỆN QUÂN Y 175

TỪ 11/2017 ĐẾN 6/2018

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-LÊ THÙY DƯƠNG

SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG TRỰC KHUẨN GRAM ÂM GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP TẠI BỆNH VIỆN QUÂN Y 175

TỪ 11/2017 ĐẾN 6/2018

Ngành: KHOA HOC Y SINH

Mã số: 8720101

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS CAO MINH NGA

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu vàkết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì côngtrình nào khác

Tác giả luận văn

LÊ THÙY DƯƠNG

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Trực khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp 4

1.1.1 Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae 4

1.1.2 Nhóm trực khuẩn Gram âm không lên men đường 7

1.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 9

1.2.1 Cơ chế kháng sinh tác động đến vi khuẩn 10

1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 12

1.3 Vấn đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm 15

1.4 Kháng sinh nhóm carbapenem và men carbapenemase 17

1.4.1 Kháng sinh nhóm carbapenem 17

1.4.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem 18

1.4.3 Các carbapenemase 18

1.5 Kỹ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn mang gen KPC và NDM-1 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Thiết kế nghiên cứu 22

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.3 Đối tượng nghiên cứu 22

2.4 Phương pháp chọn mẫu 22

2.4.1 Cỡ mẫu 22

2.4.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 23

2.4.3 Phương pháp thu thập 23

2.4.4 Tiêu chuẩn loại trừ 23

2.5 Phương pháp tiến hành 24

2.5.1 Vật liệu 24

2.5.2 Kỹ thuật nghiên cứu 25

2.6 Kiểm soát và xử lý số liệu 32

2.6.1 Kiểm soát sai lệch số liệu 32

2.6.2 Xử lý số liệu 32

2.7 Vấn đề y đức 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Một số đặc điểm của mẫu nghiên cứu 34

3.1.1 Phân bố theo giới 34

3.1.2 Phân bố theo tuổi 35

3.1.3 Tỉ lệ các loại bệnh phẩm phân lập được 36

3.1.4 Tỉ lệ nhóm vi khuẩn phân lập được 37

3.1.5 Tỉ lệ vi khuẩn nhóm trực khuẩn đường ruột 38

3.1.6 Tỉ lệ vi khuẩn nhóm trực khuẩn Gram âm không lên men đường 39

3.2 Tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh theo từng loại bệnh phẩm 40

3.2.1 Nhóm bệnh phẩm dịch và mủ - vết thương 40

3.2.2 Nhóm bệnh phẩm đường hô hấp 42

3.2.3 Nhóm bệnh phẩm máu 44

3.3 Đặc điểm đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn 45

3.3.1 Tỉ lệ kháng kháng sinh của K pneumoniae 45

3.3.2 Tỉ lệ kháng kháng sinh của E coli 46

3.3.3 Tỉ lệ kháng kháng sinh của A baumannii 48

3.3.4 Tỉ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa 49

3.3.5 Tỉ lệ kháng kháng sinh của B cepacia 50

3.3.6 Đặc điểm kháng nhóm carbapenem 51

3.4 Kết quả thử nghiệm vi khuẩn mang gen sinh men carbapenemase 51

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 56

4.1 Một số đặc điểm của mẫu nghiên cứu 56

4.1.1 Đặc điểm phân bố giới và tuổi 56

4.1.2 Tỉ lệ các loại bệnh phẩm phân lập được 56

4.1.3 Tỉ lệ các loại vi khuẩn phân lập được 57

4.1.4 Tỉ lệ các loại vi khuẩn theo từng loại bệnh phẩm 58

4.2 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn 60

4.2.1 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của K pneumoniae 60

4.2.2 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của E coli 62

4.2.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của A baumannii 63

4.2.4 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của P aeruginosa 65

4.2.5 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của B cepacia 66

4.3 Đặc điểm kháng kháng sinh nhóm carbapenem và vi khuẩn mang gen sinh men carbapenemase 67

HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU 70

KẾT LUẬN 71

KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3

RNA Ribonucleic AcidSMART Study for Monitoring Antimicrobial Resistance TrendsTP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Phân bố theo giới 34

Bảng 3.2 Phân bố theo nhóm tuổi 35

Bảng 3.3 Tỉ lệ các loại bệnh phẩm 36

Bảng 3.4 Tỉ lệ nhóm vi khuẩn phân lập 37

Bảng 3.5 Tỉ lệ vi khuẩn nhóm trực khuẩn đường ruột 38

Bảng 3.6 Tỉ lệ vi khuẩn nhóm Gram âm không lên men đường 39

Bảng 3.7 Tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh nhóm bệnh phẩm dịch và mủ - vết thương 40

Bảng 3.8 Tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh nhóm bệnh phẩm đường hô hấp 42

Bảng 3.9 Tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh nhóm bệnh phẩm máu 44

Bảng 3.10 Kết quả phát hiện gen mã hóa carbapenemase 52

Bảng 3.11 Đề kháng kháng sinh của các chủng mang gen mã hóa KPC và NDM-1 53

Bảng 4.1 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của K pneumoniae ở một số Bệnh viện 61

Bảng 4.2 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của E coli ở một số Bệnh viện 63

Bảng 4.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của A baumannii ở một số Bệnh viện 64

Bảng 4.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của P aeruginosa ở một số Bệnh viện 66

Bảng 4.4 So sánh đề kháng kháng sinh của B cepacia giữa 2 Bệnh viện 67

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ phân bố giới tính 34

Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ phân bố theo nhóm tuổi 35

Biểu đồ 3.3 Phân bố các loại bệnh phẩm 36

Biểu đồ 3.4 Tỉ lệ nhóm vi khuẩn phân lập 37

Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ vi khuẩn nhóm trực khuẩn đường ruột 38

Biểu đồ 3.6 Tỉ lệ vi khuẩn nhóm Gram âm không lên men đường 40

Biểu đồ 3.7 Tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh nhóm bệnh phẩm dịch và mủ-vết thương 41

Biểu đồ 3.8 Tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh nhóm bệnh phẩm đường hô hấp 43

Biểu đồ 3.9 Tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh nhóm bệnh phẩm máu 44

Biểu đồ 3.10 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của K pneumoniae 45

Biểu đồ 3.11 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của E coli 46

Biểu đồ 3.12 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của A baumannii 48

Biểu đồ 3.13 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của P aeruginosa 49

Biểu đồ 3.14 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của B cepacia 50

Biểu đồ 3.15 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem 51

Biểu đồ 3.16 Tỉ lệ vi khuẩn mang gen sinh carbapenemase 54

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh trực khuẩn Gram âm 4

Hình 1.2 Hình ảnh cấu trúc và nhuộm Gram của vi khuẩn E coli 6

Hình 1.3 Hình ảnh khuẩn lạc và nhuộm Gram Klebsiella pneumoniae 6

Hình 1.4 Hình ảnh khuẩn lạc và nhuộm Gram Acinetobacter baumannii 7

Hình 1.5 Hình ảnh khuẩn lạc và nhuộm Gram Pseudomonas aeruginosa 8

Hình 1.6 Hình ảnh khuẩn lạc và nhuộm Gram Burkholderia cepacia 9

Hình 1.7 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 10

Hình 1.8 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn 14

Hình 1.9 Cấu tạo phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem 18

Hình 1.10 Biểu đồ khuếch đại kết quả của phản ứng real-time PCR 20

Hình 2.1 Máy Phoenix-100 24

Hình 2.2 Panel định danh và kháng sinh đồ 25

Hình 2.3 Máy real-time PCR hãng BioRad 31

Hình 2.4 Hình ảnh kết quả phát hiện gen blaKPC và blaNDM-1của K.pneumoniae 31

Hình 2.5 Hình ảnh kết quả phát hiện gen blaKPC 32

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.2 Xử lí bệnh phẩm dịch, mủ - vết thương 28

Sơ đồ 2.3 Bệnh phẩm máu 28

Sơ đồ 2.4 Bệnh phẩm dịch cơ thể 29

MỞ ĐẦU

Y học hiện đại ngày càng phát triển, các thế hệ kháng sinh khác nhau ngàycàng được nghiên cứu và chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho công tác điều trị.Tuy nhiên hiện nay, các vi khuẩn không ngừng gia tăng mức độ đề kháng khángsinh trong các cơ sở y tế và cộng đồng[61] Do sự gia tăng tỉ lệ các vi khuẩn khángthuốc, đa kháng thuốc và siêu kháng thuốc gây nên sự gia tăng tỉ lệ mắc, tỉ lệ tửvong và chi phí điều trị, đe dọa toàn bộ hệ thống y tếvà để lại nhiều hậu quả nặng nềtrên nhiều lĩnh vực Trong cơ cấu vi khuẩn gây bệnh, trực khuẩn Gram âm chiếmmột tỉ lệ cao vượt trội và được đánh giá là tác nhân nguy hiểm hàng đầu gây nhiễmkhuẩn bệnh viện, nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn tiết niệu[4].Trực khuẩn gram âm gây bệnh phân chia thành hai nhóm lớn: nhóm vi khuẩn đường

ruột Enterobacteriaceae, điển hình hay gặp là Klebsiella và Escherichia; nhóm vi khuẩn không lên men đường điển hình là Acinetobacter và Pseudomonas Bệnh lý

do trực khuẩn Gram âm gây ra thường có tỉ lệ tử vong cao do cơ chế gây bệnh phứctạp, vi khuẩn có khả năng đề kháng khá cao với các kháng sinh mạnh và phổ rộngnhư cephalosporin, penicillin, aztreonam, đồng thời sản xuất carbapenamase khánglại carbapenem[48][31] Tổ chức y tế thế giới đã đưa ra khuyến cáo và công bố danhsách vi khuẩn kháng thuốc nghiêm trọng chia thành 3 nhóm trong đó các vi khuẩnGram âm kháng carbapenem thuộc nhóm ưu tiên hàng đầu về việc cần thiết nhanhchóng tìm ra kháng sinh mớ[33] Do đó việc sử dụng kháng sinh hợp lý có ý nghĩahết sức quan trọng là phải dựa trên kết quả xét nghiệm vi sinh và kháng sinh đồ Vìvậy viêc xác định cơ cấu gây bệnh và đặc tính kháng thuốc của các chủng trựckhuẩn Gram âm là vô cùng cần thiết, góp phần quan trọng vào công tác kiểm soátnhiễm khuẩn bệnh viện, nâng cao hiệu quả, chất lượng điều trị và chăm sóc bệnhnhân

Tại Việt Nam, do nhiều nguyên nhân khách quan và chủ quan của thầy thuốckhiến tỉ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng trực khuẩn Gram âm là khá cao.Những thế hệ kháng sinh mới và mạnh nhất như carbapenem cũng đã giảm tác dụng

và có dấu hiệu ngày càng kháng trên nhiều chủng vi khuẩn phân lập được mà đứng

đầu nguyên nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp là Pseudomonas ginosa và Acinetobacter baumannii Bên cạnh đó nhiều báo cáo cũng chỉ ra rằng sự

aeru-gia tăng sản xuất ESBL và carbapenemase là yếu tố gây đa kháng thuốc (MDR) ở

các chủng vi khuẩn đường ruột mà phần lớn là E.coli và Klebsiella pneumoniae[24]

Có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về thực trạng đề kháng khángsinh tại Việt Nam, đó thực sự hữu ích và cần thiết trong giai đoạn hiện nay Tuynhiên tại Bệnh viện Quân y 175, một bệnh viện quân đội tuyến cuối tại khu vựcmiền Nam đảm nhiệm công tác khám chữa bệnh cho quân dân trên đất liền và biểnđảo vẫn còn ít những nghiên cứu về vấn đề này Để góp phần giúp các bác sỹ có cáinhìn rõ ràng hơn về thực trạng vi khuẩn đề kháng kháng sinh cũng như định hướng

sử dụng kháng sinh hợp lí trong điều trị, hạn chế sự lây lan tính đề kháng khángsinh trong cộng đồng, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Sự đề kháng kháng sinh của các chủng trực khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp tại bệnh viện Quân y 175

từ 11/2017 đến 6/2018”.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xác định tỉ lệ các chủng trực khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp theo từng loại

bệnh phẩm phân lập được tại Bệnh viện Quân y 175

2 Xác định tỉ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng trực khuẩn Gram âm gây bệnh

thường gặp phân lập được trong các loại bệnh phẩm

3 Khảo sát gen mã hóa carbapenemase ở một số chủng K pneumoniae không nhạy

với kháng sinh nhóm carbapenem phân lập được

CHƯƠNG 1

1.1 Trực khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp

Dựa vào phương pháp nhuộm Gram, trực khuẩn Gram âm là những vi khuẩn

có dạng hình que (hình gậy), bắt màu hồng của thuốc nhuộm safranin do lớp màngpeptidoglycan mỏng không giữ được màu tím gentian khi tẩy bằng cồn Phía ngoàilớp màng chứa lipopolysaccharides - chính là nội độc tố endotoxin của vi khuẩnGram âm, phía trong là lớp phospholipid với các kênh purin[8]

Hình 1.1: Hình ảnh trực khuẩn Gram âm (Nguồn Visinhyhoc.net)Hầu hết trực khuẩn gram âm có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thôngthường, pH kiềm nhẹ (7,2-7,6), nhiệt độ phát triển tốt nhất ở 370C, khí trường cóoxygen (hiếu khí tuyệt đối) và có hoặc không có oxygen (kỵ khí tùy nghi)

1.1.1 Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae

Là họ lớn gồm nhiều loại trực khuẩn Gram âm sống ở đường tiêu hóa ngườihay súc vật Chúng có thể gây bênh hay không gây bệnh nhưng có chung tính chấtsau[27]:

- Di động hay không di động, nếu di động thì có lông (chiên mao) bao quanh thân

- Hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi

- Không có men oxidase

- Lên men đường Glucose kèm sinh hơi hay không

- Khử Nitrate thành Nitrite

- Không sinh bào tử

- Mọc được trên các môi trường nuôi cấy thông thường

Các vi khuẩn đường ruột là căn nguyên hàng đầu gây bệnh tiêu chảy, viêmđại tràng Mỗi loài vi khuẩn có thể gây bệnh ở các vị trí khác nhau trên đường tiêuhoá và cơ chế gây bệnh cũng khác nhau[27]

Ngoài ra các vi khuẩn đường ruột còn gây bệnh ở ngoài đường tiêu hoá nhưviêm đường tiết niệu, viêm màng não, viêm phổi, phế quản và đặc biệt nhiễm khuẩnhuyết Có thể nói các vi khuẩn có thể gây bệnh được ở bất kỳ cơ quan nào của cơthể, bệnh có thể song hành hoặc độc lập với các bệnh ở đường tiêu hoá

Điển hình hay gặp trong nhóm này là Klebsiella spp và E coli.

E coli sống bình thường ở ruột người và loài vật, nhiều nhất trong ruột già.

Vi khuẩn theo phân ra ngoài thiên nhiên, do đó thường thấy trong nước, đất, không

khí Trực khuẩn E coli thuộc loại kị khí tùy nhiệm, dài hay ngắn phụ thuộc môi

trường nuôi cấy, một số di động, một số bất động, một số có nang, không sinh bào

tử Chúng được nuôi cấy trên môi trường phân biệt có chọn lọc như Mac Conkey,

EMB, cho khuẩn lạc màu hồng hoặc tím than có óng ánh kim loại.E coli có thể gây

nhiễm khuẩn đường tiểu (90% nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu ở phụ nữ), nhiễmkhuẩn huyết, viêm màng não, tiêu chảy (EPEC, ETEC, EIEC, EHEC là những

chủng E coli liên quan đến tiêu chảy)[4]

Hình 1.2 Cấu trúc và hình ảnh nhuộm Gram của vi khuẩn E coli

(Nguồn: pinterest.com)

Klebsiella spp là vi khuẩn thường trú ở đường ruột, chúng có mặt khắp nơi

trong tự nhiên như trong đất, nước, nước thải, các sản phẩm thực vật…, trong đó

K pneumoniae là tác nhân đáng chú ý, gây nhiễm khuẩn cộng đồng nghiêm trọng

trong thời gian gần đây[35] K pneumonia là trực khuẩn ngắn, bắt màu đậm ở hai

cực, có vỏ, không di động, không sinh nha bào Chúng dễ dàng phát triển trên môitrường nuôi cấy thông thường, cho khuẩn lạc nhầy, bóng Trong canh thang chúng

phát triển nhanh, đục đều và ở đáy ống có lắng cặn K pneumoniae có thể gây

nhiễm khuẩn huyết, gây viêm đường tiết niệu, gây viêm phổi (đặc biệt với người già

và trẻ sơ sinh), gây viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm phúc mạc[58]

Hình 1.3 Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường Mac Conkey và nhuộm Gram

K pneumoniae (Nguồn: Medical images)

1.1.2 Nhóm trực khuẩn Gram âm không lên men đường

Là nhóm vi khuẩn không sử dụng glucose như là nguồn năng lượng hoặc chỉ

có thể phân hủy carbonhydrate qua quá trình oxy hóa hơn là quá trình lên men.Chúng thường trú trong môi trường tự nhiên, trong bệnh viện và là những tác nhân

gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu Điển hình hay gặp là ter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, S maltophilia.

Acinetobac-Acinetobacter baumannii có hình dạng cầu trực khuẩn Gram âm, là vi khuẩn

hiếu khí tuyệt đối, dễ mọc trên các môi trường thông thường Trên môi trường thạch

máu, khuẩn lạc Acinetobacter baumannii đường kính khoảng 1,5-3mm, nhẵn, màu

xám trắng, không tiêu huyết, không bao giờ tạo sắc tố (là yếu tố giúp phân biệt vớimột số vi khuẩn không lên men khác) Chúng có thể gây nhiễm khuẩn huyết, viêmphổi, nhiễm khuẩn vết thương, nhiễm khuẩn tiết niệu và là một tác nhân quan trọng

gây nhiễm khuẩn bệnh viện Trên thực tế, khi phân lập được Acinetobacter mannii từ máu, dịch não tủy, đàm, nước tiểu hoặc từ mủ phải coi như có ý nghĩa

bau-bệnh lý, trừ khi không có bằng chứng về bau-bệnh cảnh lâm sàng của nhiễm khuẩn[9]

Hình 1.4 Hình ảnh khuẩn lạc và nhuộm Gram Acinetobacter baumannii

(Nguồn: MicrobioSaroj)

Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh) bắt màu gram âm, có dạng

thẳng hoặc hơi cong, có lông duy nhất ở một đầu, hiếu khí tuyệt đối, dễ dàng mọctrên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch thường, thạch máu, thạchMac Conkey, canh thang…, cho khuẩn lạc màu xanh vàng ánh kim Tính chất đặctrưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố và chất thơm (có hai loại sắc tố chính:sắc tố pyocyanin và pyoverdin) Trực khuẩn mủ xanh có thể gây nhiễm khuẩn ngoài

da, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm đường ruột, viêm đường tiết niệu, viêmmàng não, viêm nội tâm mạc, viêm giác mạc, viêm xoang…và được xem là mộttrong những nguyên nhân chủ yếu của các trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện ởbệnh nhân nằm viện lâu ngày[28]

Hình 1.5 Hình ảnh khuẩn lạc và nhuộm Gram Pseudomonas aeruginosa

(Nguồn: Flickr.com)

Burkholderia cepacia là trực khuẩn Gram âm di động, có thể được tìm thấy

trong đất, nước và tồn tại thời gian dài trong môi trường ẩm ướt Trên những đốitượng có suy giảm hệ thống miễn dịch hoặc bệnh phổi mãn tính, đặc biệt là xơ

nang, có thể dễ bị nhiễm trùng hơn với Burkholderia cepacia Tác động của Burkholderia cepacia đối với con người rất khác nhau, từ không có triệu chứng nào

đến nhiễm trùng đường hô hấp nghiêm trọng, đặc biệt ở bệnh nhân xơ nang[36].

Hình 1.6 Hình ảnh khuẩn lạc và nhuộm Gram Burkholderia cepacia

(Nguồn: Researchgate)

1.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh

Thập niên 40 của thế kỉ XX, với sự ra đời của penicillin đã tạo ra trang sửmới trong nền y tế nhân loại, làm giảm đáng kể tỉ lệ tử vong do nhiễm khuẩn Tuynhiên những năm gần đây nhân loại đang phải đối mặt với nguy cơ không cònkháng sinh điều trị do vi khuẩn đề kháng kháng sinh ngày càng tăng, thậm chí xuấthiện nhiều vi khuẩn đa kháng, siêu kháng và toàn kháng Khoảng 70% các chủng vikhuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất một loại kháng sinh thường

dùng trong điều trị, đặc biệt một số vi khuẩn như E coli, K pneumoniae, P ginosa, A.baumannii đã kháng lại tất cả các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng

aeru-sinh mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và carbapenem Đây là mối lo ngại vàthách thức lớn với nền y học hiện đại [59]

1.2.1 Cơ chế kháng sinh tác động đến vi khuẩn

Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này Một số cơ chế đã biết kháchi tiết, một số khác chưa giải thích hoàn hảo và còn nhiều cơ chế chưa rõ Tuynhiên có thể chia làm 4 cơ chế chính[3]:

Hình 1.7 Cơ chế tác dụng của kháng sinh (Nguồn: Internet)

Giai đoạn tiếp theo có liên quan đến việc hoạt hóa các enzyme tự tiêu lytic enzyme) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương

(anto-Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của kháng sinh, các vikhuẩn gram dương biến thành dạng hình cầu không có vách (protoblast) và các vi

khuẩn gram âm có vách không hoàn chỉnh (spheroplast) Những hình thức này làm

tế bào dễ bị phá vỡ ở môi trường có trương lực bình thường

Tất cả các thuốc -lactam đều là những chất ức chế tổng hợp vách do thuốcgắn vào thụ thể PBPs (penicillin-binding-proteins) của tế bào Một số kháng sinhnhư bacitracin, teicoplanin, vancomycin, ristocetin và novobiocin ức chế giai đoạnđầu của việc tổng hợp peptidoglycan

- Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào (gây tổn thương màng tế bào)

Gồm amphotericin B, colistin, imidazole, nystatin, polymyxinĐại diện cho cơ chế này là các polymyxin tác động lên vi khuẩn gram âm vàcác polyene tác động lên vi nấm

Màng tế bào chất như một hàng rào có khả năng thẩm thấu chọn lọc, thựchiện chức năng vận chuyển chủ động và như vậy kiểm soát các thành phần bêntrong của màng tế bào Nếu sự toàn vẹn chức năng màng tế bào chất bị phá vỡ thìnhững đại phân tử và những ion sẽ thoát hỏi tế bào, làm chết tế bào

- Ức chế tổng hợp protein

Gồm các kháng sinh như chloramphenicol, erythromycin, lincomycin,tetracycline, amynoglycoside(amikacin, gentamycin, kanamycin, neomycin,netilmycin, streptomycin, tobramycin )

Trong việc tổng hợp protein vi khuẩn, thông tin của mRNA được một sốribosome đọc dọc theo chuỗi mRNA, đó là các polysome Kết quả tạo ra các proteinkhông có hoạt tính sinh học hoặc không hình thành các phân tử protein, làm ngừngtrệ quá trình sinh trưởng và phát triển

Kháng sinh ức chế tổng hợp RNA, ví dụ rifamycin gắn chặt vào RNA merase của vi khuẩn, ức chế vi khuẩn nhân lên.

poly-Ngoài 4 cơ chế chính đã nên trên, kháng sinh còn ức chế sinh tổng hợp cácchất chuyển hóa cần thiết cho tế bào, ví dụ p-aminobenzoic acid (PABA) là mộtchất biến dưỡng như là một tiền chất để tổng hợp acid folic, một giai đoạn quantrọng để tổng hợp nucleic acid Các loại sulfonamide cấu trúc tương tự như PABAnên có thể cạnh tranh với PABA, tạo ra những chất tương tự như acid folic nhưngkhông có chức năng dẫn đến cản trở sự phát triển của vi khuẩn

1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

- Nguồn gốc không do di truyền: vi khuẩn vì lí do nào đó không nhân lên

được và có thể trở thành kháng thuốc nhưng những thế hệ sau có thể nhạy cảm trởlại Ví dụ những vi khuẩn tồn tại không đáp ứng điều trị nhưng khi chúng bắt đầunhân lên (do sau khi dùng corticoid) thì có thể nhạy cảm hoàn toàn với thuốc đã sửdụng trước đó Ngoài ra còn do vi khuẩn mất điểm gắn đặc biệt dành cho thuốc Ví

dụ vi khuẩn nhạy cảm penicillin có thể biến đổi thành dạng L trong quá trình sửdụng thuốc, vì thiếu phần lớn vách tế bào, chúng trở lên kháng các thuốc ức chếtổng hợp vách (penicillin, cephalosporin) Những vi khuẩn này tồn tại nhiều thế hệ

và khi chúng tổng hợp được vách thì lại hoàn toàn nhạy cảm với penicillin

-Nguồn gốc di truyền: phần lớn vi khuẩn kháng thuốc là do thay đổi về mặt

di truyền và là hậu quả của quá trình chọn lọc bởi thuốc kháng sinh

+ Đề kháng do nhiễm sắc thể: do đột biến ngẫu nhiên một đoạn gen kiểm

soát tính nhạy cảm đối với một loại kháng sinh mà thông thường nhất là thay đổicấu trúc thụ thể dành cho thuốc Ví dụ protein P12 ở tiểu đơn vị 30S ribosome của

vi khuẩn được dùng làm thụ thể gắn streptomycin Khi đột biến gen kiểm soát P12,

vi khuẩn sẽ kháng thuốc

+ Đề kháng ngoài nhiễm sắc thể: yếu tố R là một lớp của Plasmid mangnhững gen kháng một đến nhiều loại kháng sinh và những kim loại nặng Các gennày kiểm soát việc sản xuất những enzyme phá hủy thuốc Vật liệu di truyền và

plasmide có thể được truyền theo cơ chế chuyển thể, chuyển nạp, giao phối vàchuyển vị.

 Chuyển thể: mảnh DNA sau khi giải phóng từ vi khuẩn cho đượctruyền sang vi khuẩn nhận và thay thế một phần bộ gen của vi khuẩnnhận, quyết định những tính chất mới và có thể di truyền

 Chuyển nạp: DNA plasmid được gắn vào một phage và thông quaphage truyền sang vi khuẩn khác cùng loại

 Giao phối: vận chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn cho (có yếu tốgiới tính F+) sang vi khuẩn nhận (có yếu tố giới tính F-) khi có sự tiếpxúc giữa hai vi khuẩn Đây là hình thức thông thường nhất lan rộng sựkháng thuốc trong vi khuẩn gram âm cũng như trong một số cầukhuẩn gram dương

 Chuyển vị: là hình thức truyền một đoạn ngắn DNA từ plasmid nàysang plasmid khác hay từ một plasmid sang một phần nhiễm sắc thể.Ngoài ra có thể phân chia sự kháng thuốc thành 2 loại

+ Đề kháng tự nhiên:do đặc tính di truyền bình thường của loài, một số loài

vi khuẩn không có hệ thống vận chuyển kháng sinh hoặc không có đích tác độngcủa kháng sinh Ví dụ những vi khuẩn không có vách sẽ không chịu tác động củakháng sinh ức chế tổng hợp vách như -lactam

+ Đề kháng thu nhận: do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có gen

đề kháng trở thành có gen đề kháng Cơ chế này liên quan đến sự thay đổi nhiễmsắc thể của vi khuẩn hoặc do được truyền gen đề kháng trên các plasmid và inter-gron qua hình thức biến nạp và tiếp hợp giữa vi khuẩn cùng hoặc khác loài[52]

a Cơ chế kháng thuốc

Có nhiều cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn đã được nghiên cứu, cụ thể:

Hình 1.8 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn (Nguồn: Internet)

- Vi khuẩn sản xuất enzyme phá hủy hoạt tính của thuốc: các vi khuẩn gram

âm kháng được aminoglycosides là nhờ các enzyme adenylase, phosphorylase hayacetylase, còn kháng với chloramphenicol là do vi khuẩn tiết chloramphenicolacetyltransferase Hiện nay đã xác định hơn 890 loại enzyme kháng kháng sinh của

vi khuẩn và phần lớn các gen mã hóa enzyme này nằm trên plasmid có thể truyền dễdàng trong quần thể vi khuẩn cùng loài hay khác loài [57]

- Vi khuẩn làm thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc

do thuốc không tích tụ bên trong tế bào được

- Thay đổi cấu trúc điểm gắn của thuốc: một số vi khuẩn do đột biến nhiễmsắc thể làm mất hoặc thay đổi một loại protein đặc biệt trên tiểu đơn vị 30s hoặc 50shoặc thay đổi các PBPs

- Vi khuẩn thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc: ví dụ một

số vi khuẩn kháng sulfonamide không cần PABA ở ngoài tế bào mà có thể sử dụngacid folic có sẵn cho quá trình biến dưỡng

- Vi khuẩn có enzyme đã bị thay đổi: enzyme bị thay đổi vẫn còn thực hiệnđược chức năng biến dưỡng nhưng ít bị ảnh hưởng của thuốc so với enzyme ở vikhuẩn nhạy cảm

1.3 Vấn đề kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm

Rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy rằng cơ cấu vi khuẩn gâynhiễm khuẩn chủ yếu là nhóm trực khuẩn Gram âm và tình hình đề kháng khángsinh ngày càng nghiêm trọng, thậm chí đã xuất hiện nhiều vi khuẩn đa kháng gâyhậu quả vô cùng khó khăn trong điều trị

Kết quả báo cáo “Đánh giá mười năm nghiên cứu giám sát xu hướng đề

kháng kháng sinh từ năm 2002-2011” (SMART) đã cho thấy rằng K.pneumoniae và E.coli là hai tác nhân nổi cộm của nhiễm khuẩn gram âm ổ bụng và nhiễm khuẩn

tiết niệu hiện nay với tỉ lệ tương ứng 14,5% và 47,8% Tác nhân gây bệnh phổ biến

tiếp theo là Pseudomonas aeruginosa với tỉ lệ 9,4%[31], trong đó vi khuẩn sinh

ESBL đứng hàng đầu là châu Á với mức 40% Tác nhân E coli phân lập được từ

hai loại nhiễm khuẩn có ESBL vẫn còn nhạy cảm với carbapenem trong khi

K.pneumoniae gây nhiễm khuẩn ổ bụng đã có dấu hiệu đề kháng [44] ESBL lần đầu

tiên được xác định ở chủng K.pneumoniae, sau đó chúng nhanh chóng lan truyền qua các vi khuẩn đường ruột khác như E.coli và trở thành hai chủng vi khuẩn Gram

âm đường ruột sinh men ESBL thường gặp nhất Đây là dấu hiệu cảnh báo cho thấytình hình kháng kháng sinh của các chủng trực khuẩn Gram âm ngày càng phức tạp

và nguy hiểm

Bên cạnh đó việc các vi khuẩn Gram âm sinh men cephalosporinase cũng tạo

ra một bức tranh đề kháng kháng sinh đáng lo ngại không kém Đầu tiên, các men

này được xem là từ nhiễm sắc thể của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, chúng lây

truyền qua plasmid và xuất hiện cao ở các vi khuẩn đường ruột như

E.coli,K.pneumoniae Liên quan đến men cephalosporinase là gen AmpC, men này

tăng làm giảm số lỗ trên màng ngoài tế bào dẫn đến vi khuẩn có thể phân hủy kháng

sinh như cefotaxim và ceftazidime, chỉ nhạy cảm với cefepime và nhóm bapenem.

car-Một vấn đề có tính thời sự cấp thiết hiện nay là vi khuẩn mang gen mã hóamen carbapenemase Sản xuất Carbapenem Enterobacteriaceae (CPE) là mối đe dọalớn với sức khỏe cộng đồng [55].Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa

Kỳ đã xác định Enterobacteriaceae kháng carbapenem là một trong ba mối đe dọa

MDR khẩn cấp nhất [38] Hai phân lớp carbapenemase đặc biệt là Klebsiella moniae carbapenemase (KPC) và New Delhi Metallo-β-lactamase-1 (NDM-

pneu-1) KPC được xác định vào năm 2001 và đã trở thành đặc hữu với một số khu vựkhông giáp danh biên giới như Hoa Kỳ, Israel, Hy Lạp, Nam Mỹ và TrungQuốc[35].Theo một nghiên cứu tại Mỹ năm 2007, Klebsiella pneumoniae car-

bapenemase (KPC) là men carbapenemase phổ biến nhất thuộc enzym nhóm A,chúng tạo ra serin tác động vào amino acide serin để thủy phân một loạt các -lactams [54]

NDM-1 lần đầu tiên được mô tả trong năm 2008, mặc dù các nghiên cứu hồicứu đã xác định NDM-1 từ năm 2006 [34] Hầu hết NDM-1 được phân tích có liênquan dịch tễ học đến tiểu lục địa Ấn Độ, nhưng gần đây cũng trở thành loài đặc hữucủa vùng Balkan và Trung Đông Một nghiên cứu tại Hoa Kỳ đã đưa ra dự đoánrằng việc sử dụng carbapenem toàn cầu sẽ khuyến khích chuyển gen ngang của cảhai carbapenemase này vào các chủng vi khuẩn và plasmid bổ sung, chúng sẵn sàngvượt qua ranh giới di truyền và địa lý [53]

Ngoài ra kết quả nghiên cứu của HUAPA (University Hospital Antonio

Patricio de Alcala) tại Cumana, Venezuela, trên 137 chủng Pseudomonas ruginosa gây bệnh có 65% kháng một hay nhiều loại kháng sinh với 36,5% kháng

aee-meropenem và 35,0% kháng imipenem[43]

Trong nước, theo kết quả nghiên cứu của tác giả Phạm Hùng Vân và nhómMIDAS thực hiện từ tháng 5/2008 đến tháng 11/2009 trên 16 bênh viện trong cảnước có 1602 chủng trực khuẩn Gram âm dễ mọc được ghi nhận Trong đó có

15,4% Pseudomonas aeruginosa kháng meropenem nhưng có đến 20,7% kháng

imipenem Có 47,3% Acinetobacter baumannii kháng meropenem và 51,1% kháng

imipenem Gần như đa số các chủng kháng meropenem đều kháng imipenem[24]

Bên cạnh đó nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga vàcộng sự thực hiện năm 2011 trên 1528 trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện tại

TP.HCM cũng cho kết quả vi khuẩn Acinetobacter spp 45,5% kháng imipenem, 43% kháng meropenem, cao hơn vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 32,6% kháng

imipenem và 21,7 % kháng meropenem[12]

Trong khi đó tại Bệnh viện nhi đồng 1 TP HCM, nghiên cứu của Nguyễn

Ngọc Tú Anh cho kết quả chưa thấy vi khuẩn E.coli kháng carbapenem, có 27,57% Klebsiella spp không sinh ESBL kháng meropenem và 14,28% kháng imipenem.

Tỉ lệ kháng carbapenem của vi khuẩnAcinetobacter spp là cao nhất, 73,2% kháng meropenem và 71,13% kháng imipenem, cao hơn tỉ lệ kháng carbapenem của Pseu- domonas aeruginosatương ứng là 28% và 31,6%[2]

1.4 Kháng sinh nhóm carbapenem và men carbapenemase 1.4.1 Kháng sinh nhóm carbapenem

Gồm: ertapenem, imipenem, meropenem, doripenem, biapenem vàrazupenem Trong đó các kháng sinh thường sử dụng nhiều nhất là imipenem,meropenem, ertapenem và doripenem

Carbapenem là các kháng sinh có vòng -lactam nhưng khác với penicillin ở

2 điểm: ở vị trí 1, nguyên tố C được thay bằng nguyên tố S và có nối đôi ở vị trí C2,C3 Do đó carbapenem bền vững được với các thế hệ enzyme -lactamase do vikhuẩn sinh ra, kể cả -lactamse phổ rộng (ESBL: Estended spectrum -lactamase,

là loại -lactamase có khả năng phá hủy tất cả các thế hệ cephalosporin) bapenem có phổ kháng khuẩn rộng và là lựa chọn cuối cùng trong điều trị cácchủng vi khuẩn đa kháng[14]

Car-Hình 1.9 Cấu tạo phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem

(Klebsiella pneumonia carbapenemase) Một số men được nhiễm sắc thể mã hóa và

một số do plasmid mã hóa Các enzym này có khả năng ly giải nhiều loại khángsinh nhóm - lactam Tuy nhiên chỉ có KPCcó tác động quan trọng trên lâm sàng vàđược ghi nhận là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện trên nhiều quốc gia KPC cónhiều biến thể khác nhau (từ KPC-1 đến KPC-22), trong đó các biến thể có đặcđiểm nổi bật nhất là KPC-2 và KPC-3 Gen mã hóa KPC được mang bởi transposontrên plasmid, có khả năng lan rộng nhanh qua hình thức tiếp hợp, có thể tạo thànhdịch [46]

- Nhóm B (MBLs): Phát hiện đầu tiên trên B cereus có khả năng ly giải hầu

hết các kháng sinh phổ rộng Các enzyme thường gặp bao gồm IMP, VIM, SPM-1,GIM-1, SIM-1, NDM-1 Trong đó NDM-1 đang tạo ra nhiều khó khăn lớn Gen mãhóa cho NDM-1 hiện diện trên intergron nhóm I mang các gen kháng kháng sinharr-2 (kháng rifampicin), ereC (erythromycin), aadA1 (gentamicin), cmlA7 (chlo-ramphenicol) và qacE (sulphomamide) [41] Do vậy vi khuẩn mang gen sản xuấtenzyme này có khả năng đề kháng với tất cả các loại kháng sinh hiện có trừ colistin

và khả năng lan truyền không chỉ giới hạn trong một loài mà còn lan truyền mộtcách nhanh chóng các gen mã hóa NDM-1thông qua các plasmid sang các loại vikhuẩn gram âm khác sống bình thường trong đường tiêu hóa của con người

- Nhóm C: nhóm này ít có ý nghĩa lâm sàng Được phân lập đầu tiên từ terobacter aerogenes trên plasmid.

En Nhóm D (CHDLs): gồm rất nhiều enzyme chủ yếu được phát hiện ở loài

Acinetobacter spp và Pseudomonas aeruginosa, hiện được xếp loại -lactamasenhóm D phổ hẹp[33]

Trong các carbapenemase, đáng lưu tâm hơn cả là KPC và NDM Tuy lúcđầu các gen này chỉ xuất hiện ở một số vùng nhất định nhưng đã nhanh chóng lanrộng trên toàn cầu do hiện tượng di truyền ngang Vi khuẩn sản xuất được KPC sẽđềkháng được tất cả các kháng sinh penicillin, cephalosporin, carbapenem, aztre-onam và chỉ nhạy với một vài kháng sinh như colistin, aminoglycoside, tigeci-cline[47].Tương tự, vi khuẩn mang gen NDM-1 đề kháng cao với carbapenem vàcephalosporin, chúng còn nhạy với aztreonam và tigecicline[62] Như vậy có thể thấy

Klebsiella pneumoniamang gen mã hóa KPC hoặc NDM-1 đã trở thành một trong

những mối lo ngại hàng đầu và là thách thức rất lớn đối với y tế, cần sàng lọc càngsớm càng tốt

1.5 Kỹ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn mang gen KPC và NDM-1

Real-time PCR là kĩ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng

tỉ bản sao dựa vào các chu kì nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng đượchiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra Kết quả nhân bản DNA của cácống phản ứng được hiển thị qua biểu đồ khuếch đại có trục tung (Y) là cường độhuỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trụchoành (X) là các chu kì nhiệt[25]

Hình 1.10 Biểu đồ khuếch đại kết quả của phản ứng real-time PCR

(Nguồn: Internet)Trong đó:

- Baseline: đường nền

- Ct: threshold cycle – chu kì ngưỡng là chu kì nhiệt mà tại thời điểm này thiết bịreal-time ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượtqua cường độ huỳnh quang nền

- Exponential phase: giai đoạn lũy thừa Khi số lượng bản sao DNA đích đạt đếnmột ngưỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để đượcmáy ghi nhận và đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu ngóc lên Cường độ huỳnh

quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kì nhiệt do

số lượng bản sao DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kì

- Plasteau: giai đoạn bình nguyên Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽtăng đến một mức độ nào đó thì độ tăng trưởng sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên

vì các bản sao của DNA đích không còn gia tăng số lượng theo cấp số 2 nữa do

phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme Taq polymerase không hoạt động hiệu quả

nữa[ 25]

Khi phân tích kết quả, khuếch đại trước 10 chu kì có ý nghĩa là mẫu nênđược pha loãng trước khi lặp lại, khuếch đại sau 30 chu kì có thể chỉ ra sự nhiễmcho mẫu[37] Sử dụng real-time PCR giúp tăng độ chính xác trong phát hiện cácchủng K.pneumoniae mang gen kháng carbapenem bao gồm KPC, NDM-1 vàOXA-48[47]

CHƯƠNG 2

2.1 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang

- Lấy mẫu toàn bộ trong thời gian nghiên cứu và phân tích kết quả theophương pháp thống kê mô tả

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Khoa vi sinh- Bệnh viện Quân y 175 Bộ Quốc phòng

- Thời gian: từ tháng 11/2017 đến 6/2018

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng trực khuẩn gram âm thường gặp phân lập được tại khoa Vi sinhBệnh viện Quân y 175 từ 11/2017 đến 6/2018

2.4 Phương pháp chọn mẫu 2.4.1 Cỡ mẫu

Cỡ mẫu được tính theo công thức:

Trong đó

n : cỡ mẫu tối thiểu

: giá trị phân phối chuẩn (= 1,96)

p : tỉ lệ nhóm trực khuẩn gram âm gây bệnh.

Theo tài liệu thống kê nội bộ 6 tháng cuối năm 2016 của khoa Vi sinh, Bệnhviện Đại học y dược TP HCM tỉ lệ nhóm trực khuẩn gram âm gây bệnh làkhoảng 70% (0,7)

d : sai số, lấy ở mức 5%, d= 0,05

Như vậy cỡ mẫu tối thiểu trong nghiên cứu cần thu thập được 323 trườnghợp để đảm bảo kết quả nghiên cứu có độ tin cậy.

2.4.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

- Các trực khuẩn gram âm được phân lập thường quy tại khoa Vi sinh Bệnhviện Quân y 175

- Ở mẫu đàm chỉ chọn các chủng trên mẫu đàm có độ tin cậy (bạch cầu 25, tếbào biểu mô 10 khi quan sát phết nhuộm Gram mẫu đàm dưới quang trường x100)

và chọn chủng gram âm chiếm ưu thế

- Không chọn mẫu bệnh phẩmnước tiểu do mẫu này có quy trình định danh,kháng sinh đồ khác với quy trình nghiên cứu

2.4.3 Phương pháp thu thập

- Người thu thập: người nghiên cứu và nhân viên khoa Vi sinh

- Mẫu được thu thập theo tình trạng hoạt động và cơ cấu bệnh thực tế tạiBệnh viện Quân y 175

- Dữ liệu được thu thập theo bảng dựa trên mục tiêu của nghiên cứu vớinhững nội dung cụ thể sau:

+ Mã số bệnh nhân, ngày nhập viện, giới, tuổi+ Loại bệnh phẩm

+ Kết quả định danh trực khuẩn gram âm gây bệnh+ Kết quả kháng sinh đồ

+ Kết quả phát hiện gen kháng carbapenem

2.4.4 Tiêu chuẩn loại trừ

- Không lấy các chủng vi khuẩn cùng loại được phân lập trên cùng một vị trínhiễm khuẩn ở cùng một bệnh nhân trong các lần phân lập sau

- Không lấy các chủng vi khuẩn trong trường hợp khảo sát môi trường để giámsát nhiễm khuẩn bệnh viện, cấy khuẩn định kì, bệnh phẩm từ nơi khác gửi tới

2.5 Phương pháp tiến hành 2.5.1 Vật liệu

2.5.1.1 Vật liệu dùng phân lập, định danh, kháng sinh đồ

- Môi trường nuôi cấy: Thạch máu BA (5% máu cừu), thạch Chrom agar, thạch CAXV(môi trường sản xuất tại Vương quốc Anh, nhập khẩu và pha chế tại Việt Nam)

- Môi trường giữ chủng: BHI + 10% glycerol (môi trường sản xuất tại Đức, nhậpkhẩu và pha chế tại Việt Nam)

- Hệ thống định danh, kháng sinh đồ tự động Phoenix 100- của hãng BD tics-Mỹ

Diagnos-Hình 2.1 Máy Phoenix-100

+ Panel định danh và kháng sinh đồ cho vi khuẩn gram

âm(NMIC/ID)

Hình 2.2 Panel định danh và kháng sinh đồ+ AST

+ ID broth+ AST Indication Solution+ Máy đo độ đục

2.5.1.2 Vật liệu dùng trong kĩ thuật real-time PCR

- Mix real-time PCR phát hiện gen mã hóa KPC và NDM-1

- chứng dương

- máy real-timeĐược cung cấp bởi công ty Nam Khoa

2.5.2 Kỹ thuật nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn hay tách rời vi khuẩn từ một hỗn hợp dựa trên nguyên tắclàm cạn dần mầm cấy bằng phương pháp vạch ba chiều

Bệnh phẩm sau khi nhận theo đúng quy trình nhận bệnh phẩm, kiểm tra đạttiêu chuẩn đối với bệnh phẩm đàm, tiến hành lấy một vòng cấy hỗn hợp bệnh phẩm.Mặt đáy hộp thạch được chia làm 4 phần bằng nhau, đánh số từ 1 đến 4

Cấy lần thứ nhất: Đặt khuyên cấy có bệnh phẩm trên mặt thạch ở vùng số 1,cấy vi khuẩn từ vùng 1 sang vùng 2 bằng cách chạm nhẹ đầu vòng cấy lên mặtthạch, kéo zic-zắc từ vùng 1 sang vùng 2, cấy khoảng 1/3 bán kính hộp thì dừng lại.

Cấy lần thứ 2: Xoay hộp thạch 900, để vùng 2-3 lên trên, khuyên cấy sau khiđốt đỏ, để nguội, đặt vào vùng 2 nơi đã cấy vi khuẩn, vạch zic-zắc từ vùng 2 sangvùng 3 Giống như lần cấy thứ nhất, sau khi cấy được 1/3 bán kính hộp thạch tadừng lại

Cấy lần thứ 3: Xoay hộp thạch 900, để vùng 3-4 lên trên, vòng cấy sau khiđốt đỏ, để nguội, đặt vào vùng 3 nơi đã cấy vi khuẩn, vạch zic-zắc từ vùng 3 sangvùng 4 Lần này ta cấy trên khắp diện tích mặt thạch còn lại

Cấy xong đặt ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ủ ấm 370.Sau 18-24h đọc kết quả

Quy trình cấy bệnh phẩm cụ thể

 Cấy bệnh phẩm đàm:

- Mẫu đàm được khảo sát đại thể bằng cách nhuộm Gram, đánh giá mức độ đạtchuẩn cấy theo thang điểm Barlett Thang điểm dựa trên tính chất nhầy, mủ, sốlượng tế bào bạch cầu và tế bào biểu mô khi soi dưới kính hiển vi quang trường

100 Chỉ tiến hành cấy những mẫu có 25 tế bào bạch cầu và  10 tế bào biểu mô

+ điểm Bartlett < 0 : không tin cậy ( từ chối mẫu)+ điểm Bartlett 1-2 : tin cậy vừa

+ điểm Bartlett  3: rất tin cậy

Sơ đồ 2.1Xử lí bệnh phẩm đàm

Nhuộm Gram, đánh giá mẫu theo thang điểm Barlett Lấy

mẫu tin cậy

Dùng khuyên cấy định lượng cấy bệnh phẩm trên BA, CAXV, Chrome agar Ủ 35-370C, 18-24 giờ

Đọc kết quả, chọn VK có số lượng ≥ 105CFU/ml

Sơ đồ 2.2Xử lí bệnh phẩm dịch, mủ - vết thương

Sơ đồ 2.3Bệnh phẩm máu

Bơm máu vào bình cấy máu hai pha BHI

ủ tủ ấm 35-370C Tráng pha lỏng lên pha đặc mỗi ngày

Không có VK mọc Chuyển mù ngày thứ 2 và thứ 5

VK mọc Nhuộm Gram

Thực hiện định danh và kháng sinh đồ trên máy

Trả kết quả không có VK mọc sau ngày thứ 5 chuyển mù

Cấy phân lập trên BA, Chrom agar

Ủ 35-370C, 18-24 giờ

Chọn khuẩn lạc VK đích Nhuộm Gram

Thực hiện định danh và kháng sinh đồ trên máy

Sơ đồ 2.4Bệnh phẩm dịch cơ thể

2.5.2.2 Kỹ thuật định danh và kháng sinh đồ

a Nguyên lí hoạt động của panel định danh và kháng sinh đồ

Dựa trên phản ứng sinh hóa đánh giá việc sử dụng nguồn carbon, hoạt độngcủa các enzyme được gắn mặc định trên các giếng nhỏ của panel, kết hợp với màusắc và chất chỉ thị huỳnh quang, hệ thống máy sẽ phân tích và cho kết quả địnhdanh tương ứng với mỗi chủng vi khuẩn được đưa vào chạy trên máy Trên cơ sở sosánh sự gia tăng của VK trong giếng chứng trong một khoảng thời gian xác định, từ

đó đưa ra kết quả MIC đối với từng kháng sinh trên thẻ và trả lời mức độ nhạy cảmkháng sinh theo CLSI

+ mức độ nhạy cảm: S (Succeptible)+ mức độ trung gian: I (Intermediate)+ mức độ đề kháng: R (Resistant)

Dịch não tủy: ly tâm lấy cặn nếu dịch trong Dịch khớp, dịch màng bụng, dịch màng phổi…

Cấy phân lập trên BA, CAXV (dịch não tủy) Tăng sinh trong BHI Ủ 35-370C, CA ủ CO2, 18-24 giờ

Đọc kết quả Nhuộm Gram

Thực hiện định danh và kháng sinh đồ trên máy