Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế tyrosinase của một số dược liệuthu hái ở miền nam việt nam

Trongbối cảnh tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng ức chế tyrosinase và điều kiện thử nghiệm in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase chưa thống nhất, nghiên cứu được thực hiện n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN PHÚ LỘC

SÀNG LỌC IN-VITRO TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE

CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆUTHU HÁI Ở MIỀN NAM VIỆT NAM

Chuyên ngành: Dược học cổ truyền

Mã số: 60 72 04 06

Luận văn Thạc sĩ Dược học

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy

Thành phố Hồ Chí Minh–2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2018

Người viết cam đoan

Nguyễn Phú Lộc

Luận văn thạc sĩ – Khóa: 2015 – 2017

Chuyên ngành: Dược liệu – dược cổ truyền – Mã số: 60720406

SÀNG LỌC IN-VITRO TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE

CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THU HÁI Ở MIỀN NAM VIỆT NAM

NGUYỄN PHÚ LỘC Thầy hướng dẫn: PGS.TS HUỲNH NGỌC THỤY

Mở đầu và đặt vấn đề: Nhu cầu tìm kiếm sản phẩm có tác dụng ức chế tyrosinase gần gũi từ

tự nhiên là một hướng phát triển tiềm năng cho lĩnh vực mỹ phẩm có tác dụng làm sáng dakhi tyrosinase là enzym tham gia chuyển hóa L-tyrosin và L-DOPA thành melanin Trongbối cảnh tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng ức chế tyrosinase và điều kiện

thử nghiệm in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase chưa thống nhất, nghiên cứu được thực hiện

nhằm tìm kiếm các loại dược liệu trong nước có tiềm năng phát triển thuốc làm sáng da vàtìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến mô hình thử nghiệm

Đối tượng nghiên cứu: một số dược liệu thu hái tại An Giang, Lâm Đồng và TP.HCM Phương pháp nghiên cứu:

Áp dụng quy trình cố định tyrosinase trên gel để định tính tác dụng ức chế tyrosinase trênsắc ký lớp mỏng (SKLM), đồng thời định tính tác dụng chống oxy hóa, mô hình DPPH

Khảo sát điều kiện thử nghiệm in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng và sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase để xác định dược liệu tiềm năng.

Khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các phân đoạn thu được từ cao toàn phần trongethanol 96% của dược liệu tiềm năng Xác định IC50 của các phân đoạn tiềm năng, so sánhvới thuốc chuẩn acid kojic

Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng:

Ở mô hình đo quang trên đĩa 96 giếng, nồng độ tyrosinase và L-tyrosin cho thời điểm đọc đĩa

ổn định được xác định lần lượt là 37,5 U/ml và 1 mM, đọc đĩa sau 20 phút Cao chiết thânSa-kê được chọn là dược liệu tiềm năng với giá trị IC50 đo được là 5,870 ± 0,573 µg/ml Từ

thân Sa-kê thu được 3 phân đoạn C4, E4, E5 cho tác dụng ức chế tyrosinase mạnh với IC50

lần lượt là 1,7843 ± 0,4403 μg/ml, 1,7298 ± 0,2109 µg/ml, 1,296 ± 0,0850 μg/ml, thấp hơnthuốc chuẩn acid kojic (IC50 = 2,9637 ± 0,0726 µg/ml)

Kết luận và kiến nghị: Cao chiết ethanol 96% từ thân Sa-kê được xác định là dược liệu

tiềm năng, từ đó tìm được ba phân đoạn ức chế tyrosinase hiệu quả Kết quả mở ra hướngnghiên cứu thành phần hóa học có hoạt tính từ dược liệu này

Từ khóa: tyrosinase, sàng lọc in-vitro, đĩa 96 giếng, sắc ký lớp mỏng, Artocarpus altilis.

Master thesis – Academic course: 2015 – 2017

Speciality: Pharmacohnosy – Traditional pharmacy – Speciality code: 60.720406

IN-VITRO SCREENING FOR TYROSINASE INHIBITORY ACTIVITY

OF PLANTS COLLECTED IN SOUTHERN VIETNAM

NGUYEN PHU LOC Supervisors: Dr HUYNH NGOC THUY Introduction: Requirement for natural products with tyrosinase inhibitory activity is a

promising strategy for development of skin whitening cosmetics as tyrosinase takes part inthe biometabolism of L-tyrosine and L-DOPA to melanin Because there were not manyreports about tyrosinase inhibitory in Vietnam and test conditions were not unified amongreferences, the purpose of this study was to search for herbal materials which are potential forskin whitening cosmetics and to learn about factors which affect test procedures

Materials: Herbal materials collected in An Giang, Lam Dong and Ho Chi Minh city.

Methods:

Qualitative screening on TLC for tyrosinase inhibitory with enzyme immobilisation, togetherwith antioxidant activity on DPPH assay

Investigating test conditions for in-vitro screening on 96 well plates and screening for

tyrosinase inhibitory activity to find potential materials

Investigating anti-tyrosinase activity of fractions from the most potential material, using kojicacid as standard drug

Results:

Qualitative screening on TLC

Tyrosinase immobilisation procedure could be applied in Vietnam with Himedia RM-201 at

1,2 % Ethanol extracts from Ramulus Artocarpi altilis, Caulis Gneti latifolii and Caulis

Gneti montani showed impressive active spots No relationship was found between main

active components for anti-tyrosinase activity and antioxidant activity in total extracts

In-vitro screening for tyrosinase inhibitory activity on 96 well plates.

Tyrosinase and L-tyrosine concentration which provided stable plate reading time was found

to be 37,5 U/ml and 1 mM, respectively, whereas plate reading time was 20 minutes Ethanol

96% extract from Ramulus Artocarpi altilis was chosen to be the most potential material; the

IC50 value was 5,870 ± 0,573 µg/ml 3 solid-liquid extraction fractions C4, E4, E5 expressed

effective anti-tyrosinase activity with IC50 values about 1,7843 ± 0,4403 μg/ml, 1,7298

± 0,2109 µg/ml, and 1,296 ± 0,0850 μg/ml, respectively, lower than that of kojic acid(IC50 = 2,9637 ± 0,0726 µg/ml)

Conclusion: Ramulus Artocarpi altilis as defined to be the most potential material, from

which 3 active fractions was found for effective anti-tyrosinase activity These results

suggested further studies for active components of this material

DANH MỤC HÌNH ẢNH i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC KÍ HIỆU iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, mô hình DPPH trên SKLM 5

1.1.3 Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM 6

1.1.4 Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase bằng phương pháp đo quang 7

1.1.5 Những dược liệu được sàng lọc có tác dụng ức chế tyrosinase 14

1.1.6 Vấn đề mẫu thử cho tỉ lệ ức chế tyrosinase <0% 17

1.1.7 Tương quan giữa tác dụng ức chế tyrosinase và tác dụng chống oxy hóa 17

1.1.8 Các dược liệu được quan tâm nghiên cứu 18

1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI ARTOCARPUS 19

1.2.1 Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật 19

1.2.2 Mô tả thực vật 19

1.2.3 Thành phần hóa học 19

1.2.4 Tác dụng dược lý 19

1.2.5 Công dụng 21

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÂY SA-KÊ 22

1.3.1 Mô tả thực vật 22

1.3.2 Thành phần hóa học 22

1.3.3 Tác dụng dược lý 23

1.3.4 Công dụng 24

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.2 DUNG MÔI, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25

2.2.1 Dung môi, hóa chất 25

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 26

2.2.3 Nơi thực hiện đề tài 26

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 26

2.3.2 Chuẩn bị các dung dịch mẹ 27

2.3.3 Thiết kế thí nghiệm 28

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43

3.1 CHUẨN BỊ MẪU THỬ 43

3.2 KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA TRÊN SKLM 48

3.5. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THỬ NGHIỆM SÀNG LỌC IN-VITRO TÁC

DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG 53

3.5.1 Thí nghiệm 4: Khảo sát bước sóng quan sát 54

3.5.2 Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ cuối cùng của tyrosinase và L-tyrosin 57

3.5.3 Thí nghiệm 6: Khảo sát dung môi pha mẫu 58

3.6. SÀNG LỌC IN-VITRO TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG: 60

3.7 XÁC ĐỊNH NGUYÊN LIỆU CÀNH SA-KÊ 63

3.7.1 Thí nghiệm 8: Khảo sát thực vật học 63

3.7.2 Thí nghiệm 9: Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật 67

3.7.3 Thí nghiệm 10: Xác định nguyên liệu: 67

3.7.4 Thí nghiệm 11: So sánh mẫu cành Sa-kê ở TpHCM và ở Long Xuyên: 68

3.8 KHẢO SÁT TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ CÀNH SA-KÊ (Ramulus Artocarpi altilis) 69

3.8.1 Chuẩn bị cao chiết từ cành Sa-kê cho thử nghiệm sinh học 69

3.8.2 Thí nghiệm 12: Sàng lọc các phân đoan chiết phân bố lỏng-lỏng 70

3.8.3 Thí nghiệm 13: Sàng lọc các phân đoan chiết phân bố rắn-lỏng 71

3.8.4 Xác định IC50 của các phân đoạn tiềm năng: 73

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN 76

4.1 Khảo sát điều kiện thí nghiệm định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM 76 4.2 Định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM 76

4.3 Khảo sát điều kiện thí nghiệm sàng lọc tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng 76

4.4 Khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng 77

4.5 Vấn đề mẫu thử cho tỉ lệ ức chế tyrosinase < 0% trên đĩa 96 giếng 78

4.6 Tương quan giữa tác dụng ức chế tyrosinase và tác dụng chống oxy hóa 78

4.7 Giả thiết về tương quan giữa kết quả khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM và trên đĩa 96 giếng 79

4.8 Vị trí, vai trò của các mô hình thử nghiệm 79

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC PL 1

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp melanin 2

Hình 1.2 Cơ chế phản ứng oxy hóa L-DOPA với xúc tác tyrosinase 3

Hình 1.3 Cơ chế phản ứng oxy hóa L-tyrosin với xúc tác tyrosinase 4

Hình 1.4 Phản ứng khử hóa gốc tự do DPPH 5

Hình 1.5 Bản mỏng minh họa mô hình TLC-DPPH 5

Hình 1.6 Một số kết quả định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM 6

Hình 1.7 Phản ứng ức chế tyrosinase 7

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thử cho sàng lọc sinh học 27

Hình 2.2 Thiết kế bản mỏng cho thí nghiệm khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase 29

Hình 2.3 Bố trí đĩa cho thử nghiệm 2.2 34

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của DMSO 36

Hình 2.5 Bố trí mẫu thử trên vi đĩa 96 giếng 37

Hình 2.6 Quy trình chuẩn bị các cao chiết phân bố lỏng – lỏng từ cành Sa-kê 40

Hình 3.1 SKLM thành phần hóa học của các cao chiết chloroform 45

Hình 3.2 SKLM thành phần hóa học của các cao chiết ethanol 46

Hình 3.3 SKLM thành phần hóa học của các cao chiết nước 47

Hình 3.4 SKLM tác dụng chống oxy hóa của các cao chiết chloroform 48

Hình 3.5 SKLM tác dụng chống oxy hóa của các cao chiết ethanol 49

Hình 3.6 SKLM tác dụng chống oxy hóa của các cao chiết nước 49

Hình 3.7 SKLM khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các mẫu chloroform 51

Hình 3.8 SKLM khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các cao chiết ethanol 52

Hình 3.9 SKLM khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các cao chiết nước 53

Hình 3.10 Phổ UV-Vis của phản ứng oxy hóa L-tyrosin với xúc tác tyrosinase 54

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ tyrosinase từ 80 U/ml đến 30 U/ml 57

Hình 3.12 Diễn biến độ hấp thu tại 490 nm theo nồng độ tyrosinase và L-tyrosin trong DMSO 57

Hình 3.13 Toàn cây, cụm lá, và quả non cây Sa-kê 63

Hình 3.14 Mủ trắng trên lá và rễ cây Sa-kê 63

Hình 3.15 Vi phẫu cuống lá Sa-kê 64

Hình 3.16 Vi phẫu gân chính lá Sa-kê 64

Hình 3.17 Vi phẫu phiến lá Sa-kê 65

Hình 3.18 Vi phẫu cành Sa-kê 65

Hình 3.19 Các cấu tử tìm được khi soi bột cành Sa-kê 66

Hình 3.20 SKLM cao chiết ethanol từ các mẫu cành Sa-kê ở TpHCM 68

Hình 3.21 SKLM cao chiết từ mẫu cành Sa-kê ở TpHCM và mẫu ở Long Xuyên 68

Hình 3.22 So sánh các phân đoạn LLE trên SKLM 70

Hình 3.23 So sánh các phân đoạn C- trên SKLM 71

Hình 3.24 So sánh các phân đoạn E- trên SKLM 71

Hình 3.25 SKLM khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các phân đoạn SLE 72

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các quy trình khảo sát in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase 8

Bảng 1.2 Điều kiện thí nghiệm từ các tài liệu tham khảo 14

Bảng 1.3 Một số dược liệu tại Việt Nam đã được kết luận cho tác dụng ức chế tyrosinase trong các công bố quốc tế 15

Bảng 1.4 Các dược liệu được quan tâm nghiên cứu 18

Bảng 1.5 Tổng quan tác dụng dược lý của các loài Artocarpus 20

Bảng 1.6 Một số hoạt chất đã được phân lập từ Sa-kê (Artocarpus altilis) 23

Bảng 2.1 Các mẫu dược liệu được dùng trong bài 25

Bảng 2.2 Giai mẫu khảo sát tỉ lệ nồng độ tyrosinase/L-tyrosin 33

Bảng 2.3 Danh sách mẫu thử khảo sát nồng độ tyrosinase và L-tyrosin 33

Bảng 2.4 Danh sách mẫu thử khảo sát ảnh hưởng của DMSO 35

Bảng 2.5 Điều kiện thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng 37

Bảng 3.1 Danh mục các chiết xuất thu được 43

Bảng 3.2 Giá trị Rf của các vết có tác dụng chống oxy hóa cao chiết chloroform 48

Bảng 3.3 Giá trị Rf của các vết có tác dụng chống oxy hóa ở cao chiết ethanol 49

Bảng 3.4 Giá trị Rf của các vết có tác dụng chống oxy hóa ở cao chiết nước 50

Bảng 3.5 Điểm đông đặc của gel thạch Himedia RM-201 50

Bảng 3.6 Giá trị Rf của các vết có tác dụng ức chế tyrosinase ở cao chiết chloroform 51

Bảng 3.7 Giá trị Rf của các vết có tác dụng chống oxy hóa ở cao chiết ethanol 52

Bảng 3.8 Độ hấp thu tại 490 nm theo thời gian trên mô hình UV-Vis 56

Bảng 3.9 Thời điểm đọc đĩa đề nghị của các mẫu 58

Bảng 3.10 Tỉ lệ DMSO tối thiểu để hòa tan mẫu cao chiết 59

Bảng 3.11 Trạng thái vật lý của hỗn hợp mẫu thử trong đĩa 96 giếng 59

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của %DMSO đến kết quả thí nghiệm 59

Bảng 3.13 Tỉ lệ ức chế tyrosinase của các mẫu cao chiết 60

Bảng 3.14 Tỉ lệ ức chế tyrosinase của các mẫu cao chiết 61

Bảng 3.15 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật trên mẫu cành Sa-kê 67

Bảng 3.16 Các phân đoạn chiết rắn - lỏng 69

Bảng 3.17 Tỉ lệ ức chế tyrosinase (%) của các phân đoạn chiết lỏng - lỏng 70

Bảng 3.18 Tỉ lệ ức chế tyrosinase (%) của các phân đoạn chiết rắn-lỏng 73

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các mẫu tiềm năng 73

SKC: sắc kí cột

SKGĐC: sắc kí giấy điều chế

SKLM: sắc kí lớp mỏng

SKLMĐC: sắc kí lớp mỏng điều chế

HPLC: sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

RP-TLC: sắc kí lớp mỏng pha đảo (Reversed-Phase Thin Layer Chromatography) UV-Vis: phổ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet-Visible spectroscopy)

Cf: cloroform

H 2 O, DW: nước, nước cất (distilled water)

EA:ethyl acetat

EtOH, Et: ethanol

KA: acid kojic

BS: mẫu trắng (blank sample)

BC: mẫu chứng trắng (blank control)

CS: mẫu chứng (controlsample)

TC: mẫu chứng thử (test control)

TS: mẫu thử (test sample)

IC 50: nồng độ ức chế 50%

Gel 8:100: gel thử mang 8 U/cm2 tyrosinase và 100 nmol/cm2 L-tyrosin với thạchHimedia RM-201 1,2% trong PBS 50 mM, pH 6,5

ĐẶT VẤN ĐỀ

Làn da trắng hồng là một nhu cầu làm đẹp quan trọng của phụ nữ Việt Nam Để cólàn da sáng, lượng melanin trong da phải được kiểm soát Tyrosinase, một enzymquan trọng tham gia vào giai đoạn đầu chuyển hóa L-tyrosin và L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) thành melanin [50], trở thành mối quan tâm chính trongcông cuộc tìm kiếm sản phẩm giúp cải thiện làn da, làm sáng da Các chất tổng hợp

có tác dụng ức chế tyrosinase tổng hợp như hydroquinon, arbutin, acid azeloic…thường gặp các tác dụng không mong muốn như kích ứng, ban đỏ, ngứa, nhạy cảmda… cản trở đáng kể đến quá trình điều trị [23] Qua quá trình sàng lọc, những sảnphẩm dùng ngoài từ tự nhiên tỏ ra an toàn hơn và thật sự hiệu quả [23] Tuy nhiên,các liệu pháp trị nám da có tác dụng tốt, an toàn nguồn gốc từ nước ngoài gặp hạnchế về giá thành khiến người dùng tiếp tục tìm các sản phẩm từ tự nhiên

Trong quá trình tham khảo tài liệu tìm hiểu về các qui trình thử nghiệm tác dụng ứcchế enzym tyrosinase, nhận thấy cómột số vấn đề sau:

- Các tác giả sử dụng quy trình với những điều kiện thí nghiệm khác nhau, đặcbiệt là sự khác biệt về nồng độ cuối của tyrosinase và chất nền

- Kết quả thử nghiệm cho thấy có một số mẫu tăng tác dụng ức chế tyrosinasekhi giảm nồng độ

- Các dược liệu và các chất có tác dụng ức chế tyrosinase đáng kể đồng thời cũng

có tính chống oxy hóa tốt, gợi ý khả năng dùng thử nghiệm tác dụng chống oxihóa làm thử nghiệm tiền sàng lọc tác dụng trước khi thực hiện thử nghiệm ứcchế enzym tyrosinase

Nhằm góp phần tìm kiếm các loại dược liệu trong nước có tiềm năng phát triển

thuốc làm sáng da, chúng tôi đặt vấn đề "Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase của một số dược liệu được thu hái ở miền Nam Việt Nam" với

mục tiêu chính là tìm một số cây thuốc có tác dụng ức chế tyrosinase để sau nàyphát triển các sản phẩm làm sáng da phù hợp với thị trường trong nước Nhữngmục tiêu cụ thể là:

- Khảo sát điều kiện thích hợp cho phương pháp sàng lọc đã lựa chọn

- Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên một số dược liệu nhằm tìm

kiếm bộ phận dùng dược liệu và phân đoạn chiết cho tác dụng mạnh nhất

- Xác định IC50 cho cao chiết và các phân đoạn tiềm năng

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1.1 Khái niệm Tyrosinase và sinh tổng hợp melanin

Tyrosinase là một enzym chứa đồng có mặt trong các tế bào sinh sắc tố trên dangười và động vật Enzym này xúc tác phản ứng hydroxyl hóa L-tyrosin tạoL-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) và phản ứng oxy hóa L-DOPA chodopaquinon Dopaquinon sau đó bị chuyển vị và oxy hóa tự nhiên tạo dopachrom

có màu đỏ; qua một chuỗi phản ứng tự oxy hóa và trùng hợp, từ dopachrom sinh ramelanin (màu đen)

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp melanin [16]

Nguyên tắc thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase

Phản ứng oxy hóa chất nền (L-tyrosin hoặc L-DOPA) với xúc tác tyrosinase đượcthực hiện với sự có mặt của mẫu thử Mẫu thử có tác dụng ức chế tyrosinase là mẫuthử làm chậm (hoặc dừng) phản ứng, giảm lượng dopachrom sinh ra và ngăn cản sựtạo thành melanin

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo melanin

Tyrosinase

Tyrosinase từ nấm Agaricus bisporus là nguồn enzym chính dùng trong nghiên cứu

tác dụng ức chế tyrosinase, cả cho mục đích dược học hoặc thực phẩm, vì có các

đặc tính tương đồng với tyrosinase từ động vật; cụ thể, tyrosinase từ A.bisporus có

khả năng phản ứng đặc biệt cao đối với L-tyrosin và L-DOPA Vì các đặc tính của

tyrosinase thay đổi theo nhà sản xuất và lô sản xuất, nguồn tyrosinase từ A.bisporus

do Sigma-Aldrich cung cấp được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu thực hiệnthử nghiệm này

Chất nền

L-tyrosin (C9H11NO3; 118,2 g/mol, CAS 60-18-4) là chấtrắn màu trắng, góc quay cực riêng αD từ -9.8° đến -11.2° (50 mg/ml,1 M HCl, 25 °C) Độ tan của L-tyrosintrong nước là 0,45 mg/ml (tương đương 2,48 mM) ở pH3,2-7,5 và độ tan thay đổi theo pH

L-3,4-dihydroxy phenylalanin (L-DOPA) (C9H11NO4;197,2 g/mol, CAS 59-92-7) là sản phẩm oxy hóa củaL-tyrosin bởi tyrosin hydroxylase và là đồng phân củatiền chất dopamin, có độ tan trong nước là 3,30 mg/ml(tương đương 16,73 mM), kém bền trong kiềm, dễ bị oxy hóa

Trong các thí nghiệm khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase, một trong hai loại chấtnền L-tyrosin và L-DOPA đều có thể được lựa chọn Tuy nhiên, cơ chế phản ứng

có sự khác nhau giữa hai chất nền

Cơ chế phản ứng với chất nền L-DOPA

L-DOPA có thể trực tiếp phản ứng với tyrosinase theo chu trình sau [43]:

Hình 1.2 Cơ chế phản ứng oxy hóa L-DOPA với xúc tác tyrosinase[43]

Cơ chế phản ứng với chất nền L-tyrosin, ảnh hưởng của khoảng trễ

Dạng tồn tại chủ yếu của tyrosinase (85% là met-tyrosinase [16]) khi tương tác trực

Hình 1.3 Cơ chế phản ứng oxy hóa L-tyrosin với xúc tác tyrosinase[43]

Khoảng thời gian để tyrosinase chuyển sang dạng hoạt động với L-tyrosin được gọi

là khoảng trễ (lag period) [13] Các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến

khoảng trễ và thay đổi diễn biến của phản ứng Ngoài ra, lượng dư L-tyrosin có thể

tự ức chế phản ứng

Các yếu tố môi trường

pH: pH ≤ 5 giúp hoạt hóa enzym, làm mất khoảng trễ pH 7,0 giúp chuyển hóanhanh chóng dopaquinon thành dopachrom qua dopaquinon-H+ [48]

Oxy hòa tan: vì phản ứng chuyển dạng enzym tiêu thụ oxy, có khả năng hàm lượngoxy hòa tan có ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng

Chất cho proton, o-dihydro phenol: sự hiện diện của các chất này trong mẫu thử

có thể rút ngắn hoặc làm mất thời gian trễ [50]

Chất ức chế tyrosinase

Các chất ức chế tyrosinase có tác dụng ngăn cản hoạt động của tyrosinase, làmgiảm lượng dopaquinon và dopachrom sinh ra, từ đó kiềm hãm sự hình thànhmelanin

Về cơ chế tác dụng, các chất ức chế tyrosinase được phân thành các nhóm:

- Chất bất hoạt tyrosinase đặc hiệu: ức chế enzym không thuận nghịch

- Chất ức chế tyrosinase đặc hiệu: theo cơ chế cạnh tranh thuận nghịch [16]

+ Chất ức chế cạnh tranh (competitive)+ Chất ức chế không cạnh tranh (uncompetitive)+ Chất ức chế phi cạnh tranh (non-competitive)+ Chất ức chế dạng hỗn hợp (mixed) [16]

Về cấu trúc hóa học, chất ức chế tyrosinase tự nhiên được phân thành các nhóm:

- Dẫn chất phenol: phenol đơn giản, acid hữu cơ, flavonoid, stilben, coumarin

- Dẫn chất benzaldehyd và benzoat

- Các lipid mạch dài, steroid và triterpenTrong đóhầu hết hoạt chất từ tự nhiên thuộc nhóm các dẫn chất phenol [16]

1.1.2 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, mô hình DPPH trên SKLM

Mô hình DPPH là mô hình được sử dụng phổ biến nhất để khảo sát tác dụng chốngoxy hóa Mô hình này có thể thực hiện trên ống nghiệm, trên bản mỏng hay trên đĩa

96 giếng Mô hình DPPH thực hiện trên SKLM được giới thiệu bởi Hostettmann, K

- Chuẩn bị bản mỏng và khai triển với pha động thích hợp

- Phun hoặc nhúng dung dịch DPPH trong methanol lên bản mỏng

- Để yên trong tối Quan sát sau 5 phút hoặc đến 30 phútĐánh giá kết quả:

Vết có tác dụng có màu vàng trên nền tím (Hình 1.5) [14].

Các yếu tố ảnh hưởng đến thí nghiệm

Có thể dùng dung dịch DPPH với nhiều nồng độ khác nhau 0,2% [14], 0,1% [45],0,05% [21] hoặc 0,04% [57] (w/v) trong methanol Phản ứng có thể được quan sáttại 30 phút sau khi tẩm thuốc thử hoặc mỗi 5 phút trong vòng 30 phút [14]

Ánh sáng, oxy không khí là các yếu tố chính khiến nền DPPH kém ổn định, gâygiới hạn về thời gian quan sát do đó việc ủ bản mỏng trong bóng tối là cần thiết[14] Nhiệt độ ủ thấp là thiết yếu khi sàng lọc trên các mẫu bay hơi [14]

Hoạt tính của các hợp chất được so sánh dựa trên cường độ màu và diện tích vết

1.1.3 Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM

Wangthong, S và cộng sự (2007) [55] đã giới thiệu quy trình thử nghiệm tác dụng

ức chế tyrosinase trên SKLM bằng cách phun lần lượt dung dịch enzym và chất

nền; sau đó, García, P và cộng sự (2015) [24] đã áp dụng thành công việc cố định

enzym trong gel SKLM

Cách thực hiện:

- Chuẩn bị bản mỏng và triển khai với pha động thích hợp

- Tẩm hỗn hợp phản ứngvào bản mỏng đã khai triển:

+ Phun lần lượt dung dịch tyrosinase và L-tyrosin lên bản mỏng [55]

+ Pha gel chứa dung dịch L-tyrosin và tyrosinase; rót gel lên bản mỏng [24]

- Để yên phản ứng trong một thời gian nhất định

Đánh giá kết quả:

- Quy trình phun các dung dịch thử: vết có tác dụng sáng màu trên nền xám [55]

- Quy trình cố định enzym: vết có tác dụng sáng màu trên nền nâu đỏ [24]

Phun hỗn hợp phản ứng [55] Cố định tyrosinase trong gel

100 nmol/cm 2 L-tyrosin Thạch đa dụng (Britania)

20 phút

Silicagel 60 RP-18 F254 (Merck)

8,0 U/cm 2 tyrosinase

100 nmol/cm 2 L-tyrosin Poloxamer 407 (Pluronic)

20 phút

Hình 1.6 Một số kết quả định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM

Ảnh hưởng của các điều kiện thí nghiệm đến đánh giá kết quả

Với quy trình phun hoặc nhúng hỗn hợp phản ứng:

- Mật độ enzym và L-tyrosin cần để phát hiện các hoạt chất cơ bản là 2 – 4 U/cm2

và 20 – 60 nmol/cm2; để phát hiện hoạt chất ở lượng nhỏ (5-20 ng) cần

4 – 8 U/cm2 tyrosinase và 10 – 100 nmol/cm2 L-tyrosin [55]

- Các vết không thấm nước sẽ tạo thành vết dương giả, phải dùng Triton-X đểtăng tính thấm [53]

- Kết quả kém ổn định [24]

Với quy trình cố định enzym trong gel:

- Mật độ 4 – 8 U/cm2 tyrosinase và 40 – 100 nmol/cm2 L-tyrosin giúp phát hiện3,89 – 14,76 ng acid kojic trên lý thuyết [24] Kết quả này thống nhất vớikhảo sát của Wangthong, S và cộng sự [55]

- Hai yếu tố chính ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm là mật độ phủ tyrosinase vàL-tyrosin; nhiệt độ và thời gian ủ ít ảnh hưởng, có thể ủ tại 20 oC trong 20 phút

- García, P và cộng sự (2015) đã triển khai SKLM với 100 µg cao chiết và 100

ng acid kojic Mật độ phủ enzym và chất nền là 8 U/cm2 và 100 nmol/cm2 [24]

- Chưa có báo cáo về vết dương tính giả

1.1.4 Khảo sát in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase bằng mô hình đo quang

Nguyên tắc: Các chất ức chế tyrosinase ngăn cản sự chuyển hóa L-tyrosin thànhL-DOPA và dopaquinon, từ đó giảm lượng dopachrom sinh ra Tác dụng ức chếtyrosinase được xác định bằng cách so sánh lượng dopachrom sinh ra ở mẫu thửvới mẫu chứng qua độ hấp thu tại 450 nm [51], 470 nm [15], 475 nm [36], hoặc

490 nm [26] (hình 1.7.)

Hình 1.7 Phản ứng ức chế tyrosinase Bảng 1.1 tóm tắt các quy trình thử nghiệm từ tài liệu tham khảo

Màu đỏ

Màu xám

Bảng 1.1 Các quy trình khảo sát in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase Nguồn

pH 6.8

300 μg/ml Cao MeOH-H 2 O 50%

(5g/100ml) dm: đệm

(1995) [34]

cuvet

3 ml

1 ml 2,5 mM L-DOPA

0,1 ml

138 U/ml dm: nước

1,8 ml PBS 100 mM

pH 6,8

0,1 ml Cao MeOH tách phân đoạn H 2 O, EA và nHx dm: DMSO

0,1 ml *

480 U/ml

1,0 ml đệm McIlvaine

pH 6.8

0,9 ml

100 μg/ml Cao MeOH

PĐ MeOH-H 2 O 50%

PĐ aceton-H 2 O 60%

PĐ H 2 O Dm: DMSO 10%

50μl *

1600 U/ml

875μl PBS50 mM

pH 6,5

- 25 μl ~ 10μl cao chiết PG-nước khử ion 50%

(100g/1000ml) dm: đệm

- Trộn chất nền, đệm và mẫu thử Thêm tyrosinase Theo dõi

độ hấp thu tại 475nm theo thời gian.

Morus alba (lá)

Brazil

0,15 mg L-tyrosin

(2005) [9]

cuvet

1 ml

333 μl 2,5 mM L-tyrosin L-DOPA

33 μl

1380 U/ml

600μl PBS0,1M pH 6,5

- Thêm mẫu thử và tyrosinase.

- Theo dõi sự tăng hấp thu tại 470nm

Acid kojic Indonesia

Masuda et al.

(2005) [40]

đĩa 96 giếng

40μl 2,5mM L-DOPA

40 μl

46 U/ml

80 μl PBS pH 6.8

Heo et al,

(2007) [26]

đĩa 96 giếng

40μl * 2.5mM

- L-DOPA

40 μl * 125 U/ml

80 μl PBS 0,1M

Kanwong, Hàn Quốc

Hwang & Lee,

(2007) [27]

đĩa 96 giếng

40μl * 1.5mM L-tyrosin

đệm phosphat pH 6.5

40μl 2,5mM L-DOPA

40 μl

31 U/ml

80 μl PBS 0,1M

pH 6,8

40μl 500μg/ml Cao methanol dm: DMSO 10%

- Pha hỗn hợp phản ứng Mẫu trắng: không thêm chất nền.

- Ủ 10 phút Đo độ hấp thu tại

110μl L-tyrosin 2mM L-DOPA 12mM

30 μl

333 U/ml

PBS pH 6,8 70 μl

500μg/ml dm: DMSO 3%

Arung et al.,

(2009) [8]

đĩa 96 giếng

330μl L-DOPA 2,5mM L-tyrosin 330μM

33μl

1380 U/ml

600μl PBS 0,1M,

pH 6,5

33μl

100 μg/ml, 500μg/ml Cao methanol Dm: DMSO 16,5%

- Hòa chất nền và đệm Để yên ở

25 o C Thêm mẫu & tyrosinase

- Nếu dùng L-DOPA, đo quang ngay ở 475 nm

- Nếu dùng L-tyrosin, ủ 20 phút

ở 25 o C & đo quang

Acid kojic Kalimantan

Indonesia

Chen et

al.,(2009) [17]

đĩa 96 giếng

80μl 0,1mg/ml L-tyrosin

40μl

50 U/ml

120μl PBS pH 6,8

40μl 500μg/ml Cao aceton DMSO ≤ 0,25%

- Hòa hỗn hợp mẫu thử tyrosinase và đệm.

- Ủ tại 37 o C trong 5 phút

- Thêm chất nền và ủ tại 37 o C trong 30 phút

- Đo hấp thu tại 475nm

Acid kojic 0,1mg/ml

Đài Loan

tài liệu

Dụng

cụ đo

Lai, Lim &

Tan, (2009)

[36]

đĩa 96 giếng

40μl 2,5mM L-DOPA

40μl 0,02mg/ml

80 μl PBS 0,1M

pH 6,8

40 μl

500 μg/ml DMSO 10%

Kuala Lampur, Malaysia

T.Y.Lim, et al,

(2009) [39]

đĩa 96 giếng

40μl 2,5mM L-DOPA

40μl 0,02mg/ml

80 μl PBS 0,1M

pH 6,8

40 μl * 500 μg/ml DMSO 10%

Malaysia

Senol et al.,

(2009) [66]

đĩa 96 giếng

40μl 2,5mM L-DOPA

40 μl

46 U/ml

80 μl PBS 1/15M

pH 6.8

40 μl DMSO 5%

110μl L-tyrosin

2 mM L-DOPA 12mM

30μl

333 U/ml

- 70μl

- 7,81-2000 μg/ml Cao methanol hoặc ethanol 50%

20mg/ml trong DMSO, hòa loãng trong đệm

- Hòa dung dịch mẫu thử và tyrosinase Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Thêm chất nền Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

1,5mM L-tyrosin

100mMpH

500 μg/ml Cao ethanol 80%

- Hòa mẫu, tyrosinase vào dung dịch đệm.Ủ 15 phút ở 37 o C

Arbutin:

IC 50 :

Jeju, Hàn Quốc

5 mM L-DOPA

PBS pH 6,8

2mg/ml cao ethanol 30%

- Pha 250μl hỗn hợp thử

- Ủ tại 37 o C trong 10 phút

- Đo hấp thu tại 475nm

Vitamin C Arbutin

Thượng Hải

Abdillhari et

al (2010) [6]

đĩa 96 giếng

40µl 2,5mM L-DOPA

40 µl

31 U/ml

80 µl PBS 0,1 M

- Đo hấp thu tại 470nm

Souza et al.

(2012) [51]

đĩa 96 giếng

100 µl L-tyrosin

2 mM

30 µl

250 U/ml

60 µl PBS 50 mM,

pH 6,5

10 µl * 1 mg/ml Cao n-hexan, ethanol trong DMSO

Cao nước trong DW

- Pha dung dịch đệm, mẫu thử và L-tyrosin Để yên 5 phút.

- Thêm tyrosinase và ủ tại 25 o C trong 20 phút

110 μl L-tyrosin 2mM L-DOPA 12mM

- Hòa mẫu + tyrosinase Để yên

ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Thêm chất nền.Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

40μl 2.5mM L-DOPA

40 μl

46 U/ml

Đệm phosphat pH 6.8

80μl

250 μg/ml dm: đệm Cao EtOAc, MeOH và

H 2 O trong DMSO

- Pha mẫu Ủ 10 phút tại 23 o C.

- Thêm chất nền và ủ 23 o C trong

10 phút.

- Đo độ hấp thu tại 475nm

Acid kojic

Izmir-Odemis, Thổ Nhĩ Kỳ

20 μl 0,85mM L-DOPA

20 μl 203,3 U/ml

140μl đệm phosphat pH 6,8

20μl 20μg/ml Cao ethanol

- Hòa đệm, mẫu và tyrosinase.Ủ 10 phút tại 25 o C

- Thêm chất nền Ủ tại 25 o C trong

trong nước

Songkhla, Thái Lan

Fatiha et al.,

(2015) [22]

đĩa 96 giếng

80μl L-DOPA 4mM L-tyrosin 7mM

90μl

50 U/ml

50-500μg/ml Cao ethanol trong EtOH:DMSO 50:50, pha loãng trong nước.

- Pha hỗn hợp thử.

- Để yên trong tối ở 37 o C

- Đọc độ hấp thu tại 450nm mỗi 20 phút trong 180 phút

Acid kojic Bejaia,

Algeria

de Freitas et

al (2016) [19]

đĩa 96 giếng

100 µl L-tyrosin

2 mM

30 µl

250 U/ml

60 µl PBS 50 mM,

pH 6,5

10 µl 0,49-1000 µg/ml Cao ethanol 95%

40μl 2,5mM L-DOPA

40μl

46 U/ml

80 µl PBS pH 6,8

Cao methanol Dm: DMSO

- Pha mẫu, tyrosinase Ủ 10 phút.

Tamil Nadu,

Ấn Độ

Về cơ bản, các quy trình tương tự nhau về cách thực hiện Những khác biệt chủ yếugiữa các quy trình gồm:

- Cả L-tyrosin và L-DOPA đều được các tác giả sử dụng

- Nồng độ cuối cùng của tyrosinase và chất nền thay đổi Trên lý thuyết, khi tăngnồng độ chất nền và enzym, thời điểm kết thúc phản ứng sẽ kết thúc sớm hơn.Tuy nhiên, sự thay đổi trên thời gian ủ phản ứng là không theo quy luật này

Nông độ cuối của enzym (U/ml)

Thời gian ủ trước phản ứng (phút)

Thời gian phản ứng (phút)

- Cần khảo sát lại điều kiện thí nghiệm, đặc biệt là nồng độ cuối cùng của enzym

và chất nền trong tương quan với thời gian phản ứng

- Quy trình de Freitas, M M và cộng sự (2016) [19] được chọn tham khảo vì

thể tích dung dịch đệm có thể hiệu chỉnh tương đối rộng (60 µl), thuận tiện choviệc thiết kế các khảo sát điều kiện thí nghiệm

1.1.5 Những dược liệu được sàng lọc có tác dụng ức chế tyrosinase

Nhiều nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế tyrosinase đã được thực hiện trênthế giới, chủ yếu trên các dược liệu từ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, một số

được thực hiện tại Bangladesh, Thái Lan, Brazil, và Argentina Một cách sơ bộ, họDâu tằm (Moraceae) và họ Đậu (Fabaceae) có nhiều loài cho tác dụng ức chếtyrosinase hiệu quả.

Bảng 1.3 Một số dược liệu tại Việt Nam đã được kết luận cho tác dụng ức chế

tyrosinase trong các công bố quốc tế

Acorus gramineus Soland

Phần trên mặt đất

MeOH : 314,43 μg/ml [27] Brassicaceae Cỏ tam giác (tam giác mạch)

Capsella bursa-pastoris Medik.

Toàn cây MeOH: 446,24 μg/ml [27]

Sophora flavescens Aiton

Rễ Toàn cây

MeOH : 41,6 μg/ml MeOH : 64,66 μg/ml

[42] [27] Lamiaceae Bạc hà lá tròn

Mentha rotundifolia Hud.

Tía tô (Pe rilla frutescens Kudo) Phần trên

mặt đất

Lauraceae Ô đước lá mã tiền

Lindera aggregata Kosterm.

EtOH 80% : 22,0 µg/ml

[27] [42] Dâu gai

Cudrania tricuspidata Bur ex Laval.

Vỏ cành Lá

MeOH : 210,97 μg/ml MeOH : 295,44 μg/ml

[27]

Myrica rubra Siebold & Zucc.

Simaroubaceae Sầu đâu cứt chuột

Brucea javanica Merr.

Quả Lá

MeOH: 45.37 µg/ml

DW : 14.44 µg/ml EtOH 80% : 337.6 µg/ml

[27] [42]

Ampelopsis japonica Makino

MeOH: 80,02%

MeOH: 88,77%

Họ Dược liệu BPD %I 100 µg/ml TLTK

và 47% (gỗ vỏ)

Mít (Ar tocarpus heterophyllus L.) Gỗ MeOH: 96%

Agrimonia pilosa Ledeb.

Toàn cây MeOH 50% : 56,1%

Agastache rugosa Kuntze

Myristicaceae Nhục đậu khấu

Myristica fragrans Houtt

Tại Việt Nam, Nguyễn Thị Dung và cộng sự (2011) và nhóm tác giả Nguyễn ThịThanh Mai và cộng sự (2012-2016) đã thực hiện khảo sát tác dụng ức chế

tyrosinase của các hoạt chất từ cây Kim ngân (Lonicera japonica Thund.) [2], gỗ Mít (Lignum Artocarpi heterophylli) [5], và lá Sa-kê (Folium Artocarpi altilis) [3]:

- Cao chiết ethanol từ hoa, lá và cành Kim ngân cho IC50 đối với tác dụng ức chếtyrosinase lần lượt là 11,6 ± 2,61 μg/ml, 15,81 ± 3,89 μg/ml, 17,18 ± 1,76 μg/ml– gấp khoảng 3, 4,5 và 5 lần IC50 của acid kojic (3,5 ± 0,94 μg/ml) [2]

- Từ phân đoạn ethyl acetat của gỗ Mít, 15 hoạt chất đã được phân lập và khảo sátcho giá trị IC50 từ 0,013 ± 0,002 μM đến 82,2 ± 0,8 μM [5]

- Từ lá Sa-kê, 5 hoạt chất được phân lập và khảo sát cho giá trị IC50< 100 μM [3]

1.1.6 Vấn đề mẫu thử cho tỉ lệ ức chế tyrosinase <0%

Những mẫu thử cho tỉ lệ ức chế tyrosinase < 0% được Hwang J.H và cộng sự(2007) báo cáo như “những cao chiết không có tác dụng ức chế tyrosinase” với tỉ lệ

ức chế tyrosinase là 0% [27] với các đặc điểm:

- Đa số gặp ở những mẫu thử ở nồng độ thấp

- Tỉ lệ ức chế tyrosinase của mẫu thử tăng lên theo nồng độ

Hiện tượng tỉ lệ ức chế tyrosinase < 0% chưa được quan tâm giải thích đầy đủ, tạonghi vấn trong việc phân tích kết quả thí nghiệm

Đặt giả thiết: Các mẫu thử có thành phần hấp thu tại bước sóng quan sát và kém biểu hiện tác dụng ức chế tyrosinase sẽ cho giá trị ức chế tyrosinase < 0%.

Điều này xảy ra khi trong mẫu thử có thành phần bị chuyển hóa bởi tyrosinase chosản phẩm có hấp thu ở bước sóng quan sát.Từ giả thiết trên có những hệ quả:

- Hệ quả 1: Nếu các mẫu thử có tỉ lệ ức chế tyrosinase < 0% chỉ biểu hiện

tác dụng ở nồng độ cao thì tỉ lệ ức chế tyrosinase giảm theo nồng độ mẫu thử và

ổn định khoảng 0% ở nồng độ thấp

- Hệ quả 2: Nếu các mẫu thử cho tỉ lệ ức chế tyrosinase < 0% kém tác dụng ức

chế tyrosinase, tỉ lệ ức chế tyrosinase tăng khi giảm nồng độ mẫu thử và ổn địnhkhoảng 0% ở nồng độ thấp

Như vậy, khi kết quả sàng lọc tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng đáp ứnghai hệ quả trên có thể kết luận nguyên nhân của các mẫu ức chế tyrosinase < 0%

1.1.7 Tương quan giữa tác dụng ức chế tyrosinase và tác dụng chống oxy hóa

Hiện tượng dược liệu có tác dụng ức chế tyrosinase cũng cho tác dụng chống oxyhóa đã được báo cáo ở một số tài liệu tham khảo:

- Kim, S.J và cộng sự (2005), trước khi sàng lọc tác dụng ức chế tyrosinase, đãtiền sàng lọc qua tác dụng chống oxy hóa mô hình DPPH [30]

- Kim, S.S và cộng sự (2007) đã khảo sát song song hai tác dụng này trong 254mẫu dược liệu Tất cả 11 dược liệu được Kim, S.S và cộng sự (2007) báo cáo

ức chế hiệu quả tyrosinase đều có tác dụng chống oxy hóa mạnh [33]

- 4 dược liệu có tác dụng ức chế tyrosinase được Wang, K.S và cộng sự (2006)

báo cáo là Pharbitis nil, Sophora japonica, Spatholobus suberectus, và Morus

alba đều có tác dụng chống oxy hóa mạnh với giá trị IC50< 100 µg/ml [54].Tuy nhiên, ở chiều ngược lại, không phải dược liệu có tác dụng chống oxy hóa

1.1.8 Các dược liệu được quan tâm nghiên cứu

Nhằm chọn được các dược liệu tiềm năng cho tác dụng ức chế tyrosinase, việcchọn dược liệu cho nghiên cứu dựa trên các tiêu chí: đã được công bố cho tác dụng

ức chế tyrosinase, được tin dùng làm sáng da, có tác dụng chống oxy hóa mạnhhoặc có hàm lượng cao polyphenol Cụ thể :

Bảng 1.4 Các dược liệu được quan tâm nghiên cứu

Benincasa hispida (Thunb.) Cogn., Cucurbitaceae

Flavonoid

3 Rau má, họ Rau răm

Centella asiatica (L.) Urban, Polygonaceae

Toàn cây Nước ép

Kinh nghiệm Saponin, flavonoid

Citrus maxima (Burm.) Merr., Rutaceae

Flavonoid

Curcuma longa L., Zingiberaceae

Morinda citrifolia L., Rubiaceae

Rễ, thân, lá, quả Anthranoid, flavonoid

TD chống oxy hóa

8 Cải xoong, họ Cải

Nasturtium officinale R.Br., Brassicaceae

Toàn cây Nước ép

Kinh nghiệm

9 Chanh dây, họ Lạc tiên

Passiflora edulis Sims., Passifloraceae

Quả, hạt, nước quả

Kinh nghiệm

TD chống oxy hóa

10 Tía tô, họ Hoa môi

Perilla frutescens (L.) Britton, Lamiaceae

TD chống oxy hóa

11 Đào, họ Hoa hồng

Prunus persica (L.) Batsch., Rosaceae

Thân, lá, hoa Nam Dược thần hiệu

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI ARTOCARPUS

1.2.1 Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae)

Ngành: Thực vật có hoa (Angiospermae) Lớp: Cây hai lá mầm (Eudicots) Nhánh: Hoa hồng (Rosids)

Bộ: Hoa hồng (Rosales) Họ: Dâu rằm (Moraceae) Chi: Artocarpus

Chi này có nguồn gốc ở Nam và Đông Nam Á, New Guinea và khu vực Nam Thái

Bình Dương với khoảng 50 loài Trong đó, cây mít (Artocarpus heterophyllus Lam.) và cây Sa-kê (Artocarpus altilis (Parkison) Forberg) là các loài phổ biến.

1.2.2 Mô tả thực vật

Cây thường xanh hay cây nhỏ rụng lá vào thu đến cây gỗ lớn; tất cả mọi bộ phậnđều có có mủ trắng Lá mọc xoắn, cách hoặc đối; phiến lá nguyên, xẻ thùy, képhoặc xẻ lông chim, nhẵn hoặc phủ lông ngắn Hoa tự dạng đầu đơn tính, mọc ở đầucành hoặc từ cành cây Quả phức được tạo thành bởi toàn bộ đầu hoa cái phình to.Hạt lớn không có ngoại nhũ, nảy mầm dưới mặt đất [29]

1.2.3 Thành phần hóa học

Quả và hạt Mít giàu dinh dưỡng Phần ăn được của quả Mít chứa carbohydrate,protein, chất béo, chất xơ, vitamin A, và các khoáng chất Hạt Mít chứa nhiềucarotenoid, carbohydrate, protein, dầu béo và các nguyên tố khoáng Ngoài ra, các

loài Artocarpus giàu cáchợp chất phenol bao gồm flavonoid, stilbenoid và

arylbenzofuron ở mọi bộ phận của cây Đặc biệt các hợp chất flavonoid prenyl hóa

là đặc trưng cho chi này Jacalin từ hạt mít và artocarpin từ Artocarpus lakoocha là

các lectin tiềm năng trong nghiên cứu miễn dịch học [29]

1.2.4 Tác dụng dược lý

Cao chiết và các hợp chất phân lập được từ các loài Artocarpus đã được đánh giá

về nhiều tác dụng sinh học Các tác dụng dược lý nổi bật là kháng lao, kháng virus,kháng sốt rét, kháng giun, kháng viêm và tác dụng độc tế bào [29] Tổng quan các

hợp chất đã phân lập được và tác dụng dược lý được trình bày trong Bảng 1.4.[29]:

Bảng 1.5 Tổng quan tác dụng dược lý của các loài Artocarpus [29]

Artocarpus heterophyllus

Kháng khuẩn

Vỏ rễ A altilis

Chữa tiểu đường

Gỗ tâmA altilis

Ức chế tyrosinase Cao chiết ethyl acetat

Artonkin-4 O-glucoside,

Lá Artocarpus nobilis Kháng giun

5,7,40-trihydroxy-6,8-diprenylisoflavone Artocarpus heterophyllus Ức chế peroxy hóa lipid

Ức chế tyrosinase

Rễ, cành Artocarpus altilis

Kháng tụ cầu sinh mảng bám Kháng sốt rét, Kháng lao

Ức chế 5-alpha reductase

Kháng viêm Artocapones A và B, artoindonesianin E,

artoindonesianin R, heteroflavanone C,

Vỏ cành A.champeden Kháng sốt rét Artocommunol CC, artochamin B Vỏ rễ Artocarpus altilis Chống kết tập tiểu cầu

Bắt gốc tự do DPPH

Artoflavone A, artomunoisoxanthone,

artochamin D, dihydroartomunoxanthone

Rễ Artocarpus altilis Bắt gốc tự do DPPH

Artoindonesianin A-2, heterophyllin Vỏ cành A.champeden Kháng sốt rét, Độc tế bào

Độc tế bào

Artoindonesianin L, artonin M, artonin E,

artonin O

Vỏ rễ Artocarpus rotunda Độc tế bào

hóa

Đối tượng Nguồn gốc Tác dụng dược lý

Ức chế xanthine oxidase

Độc tế bào Chaplashin; morusin, cudraflavone

B,artobiloxanthone

Rễ,cành Artocarpus altilis Kháng sốt rét

Kháng lao Cudraflavone C, 6-prenylapigenin,

Gỗ tâm A gomazianus

Kháng sốt rét, Kháng lao, Kháng virus

Ức chế xanthine oxidase

A heterophyllus, A altilis

Kháng sốt rét, Kháng viêm Chống oxy hóa

Dihydroisocycloartomunin, cyclomorusin,

cudraflavone A, cyclocommunin

Dihydroartomunoxanthone Vỏ rễ Artocarpus altilis Chống kết tập tiểu cầu Isocyclomorusin, norartocarpetin Gỗ tâm A gomazianus Kháng virus

Gỗ tâm A gomazianus

Kháng HSV, HIV, Kháng viêm

1.2.5 Công dụng

Múi quả và hạt của câyArtocarpus heterophyllus được dùng như thuốc bổ mát, rễ

được dùng chữa tiêu chảy và sốt, lá để tăng tiết sữa ở phụ nữ và động vật, nhưthuốc chữa giang mai và thuốc chữa giun Nhựa trộn với dấm kích thích chữa lànhabscess, rắn cắn và phù sinh dục Lá và vỏ cành được dùng chữa thiếu máu, hen,viêm da, tiêu chảy, ho và như thuốc long đờm Rễ được dùng như bài thuốc chữabệnh da và hen, chiết xuất của nó được dùng để giảm sốt và tiêu chảy [29]

Lá Artocarpus altilis được sử dụng để chữa xơ gan, cao huyết áp và tiểu đường Múi quả Artocarpus lakoocha được dùng làm thuốc bổ gan.

Hạt Artocarpus chempeden được dùng chữa tiêu chảy và rễ dùng chữa sốt rét.

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÂY SA-KÊ

Tên khác: Xa-kê, cây bánh mì

Tên khoa học: Artocarpus communis J R Forst et G Forst

= Artocarpus altilis (Parkison) Forsberg – họ Dâu tằm (Moraceae)

Tên nước ngoài:sakéé (Thái, Khmer), khanun-sampalor (Thái Lan), Khanaôrsâmloo (Khmer), kulur, sukun (Indonesia), rimas (Philippin)…

l’arbre à pan (Pháp), fruta pāo (Bồ Đào Nha), árbol a pan (Tây Ban Nha)…

Bộ phận dùng: rễ, vỏ cành, lá – Radix, Cortex et Folium Artocarpi alitilis.

1.3.1 Mô tả thực vật

Cây gỗ lớn, cao 15 m, có mủ trắng Lá dài đến 1 m, có khía sâu thành 3-9 thùy, rấtnhám ở mặt dưới; lá kèm vàng mau rụng, dài 12-13 cm Bông đực dài 20 cm, hoađực có 1 nhị Quả phức hình cầu vàng xanh rồi vàng vàng, to bằng đầu người, cónạc trắng, không ngọt nhưng nhiều bột Hạt to 1 cm [1] Cây có nguồn gốc từIndonesia và New Ghinea, được trồng phổ biến ở các tỉnh Nam Trung bộ vàNam bộ Việt Nam

Nguồn: Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam (bộ mới) tập 2 [1]

1.3.2 Thành phần hóa học

Quả Sa-kê chứa nhiều carbohydrat, chất xơ, vitamin và chất khoáng [47] Phần múi

ăn được của Sa-kê chứa 25% tinh bột, 3% protein và 0,5% lipid [1] Hạt Sa-kê giàuprotein, ít béo, giàu vitamin và khoáng chất [47]

Ngoài ra, nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập, chủ yếu có cấu trúcprenyl flavonoid hoặc benzoxanthon:

- Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2012) [3] đã phân lập được từ lá cây Sa-kê

3 auron: altilisin H, altilisin I, altilisin J, và 2 geranyl flavonoid: 40,5,7-trihydroxy-flavon và cycloaltilisin 7

8-geranyl Sau đó, Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2014) [4], bằng phân tích sắc kí cột

và sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC), tiếp tục phân lập được 8 hợp chấtgeranyl dihydrochalcon là sakenin A, B, C, D, E, F, G, H và 4 hợp chất đã biết:+ 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[3,4-dihydro-3,8-dihydroxy-2-methyl-2-(4-methylpent-3-enyl)-2H-1-benzopyran-5-yl]propan-1-one;

+ 2H-1-benzopyran-5-yl]propan-1-one;

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methylpent-3-enyl)-+ 2-geranyl-2’,3,4,4’-tetrahydroxydihydrochalcon+ Và cycloaltilisin

- Từ gỗ tủy và vỏ cành cây Sa-kê, Lan Wen-Chun và cộng sự (2012) [37] đã phânlập được 17 hợp chất từ phân đoạn các LLE dichloromethan, ethyl acetat bằng

sắc kí cột silica gel, rửa giải với n-hexan - ethyl acetat hoặc n-hexan - aceton, và

sắc kí cột pha đảo RP-18, rửa giải với aceton – nước; là 10-oxoartogomezianon,8-geranyl-3-(hydroxyprenyl) isoetin, hydroxyartoflavon A, iso-cycloartobilo-xanthon, furanocyclocommunin, artocarpin, norartocarpetin, artogomezianon,cyclocommunol, cycloartocarpin, 8-geranylapigenin, cyclomorusin, artonol B,cudraflavon A, artoflavon A, cyclogeracommunin, và artonin M

- Từ rễ Sa-kê, Boonphong và cộng sự (2007) [12] đã phân lập được 9 hợp chất từcác cao chiết dichloromethan bằng sắc kí lọc gel Sephadex LH-20 và sắc kí cộtsilica gel, rửa giải với dichloromethan – ethyl acetat; là artocarpin, cyclo-artocarpin, chaplashin, morusin, cudraflavon B, cycloartobiloxanthon, artonin E,cudraflavon C, artobiloxanthon

1.3.3 Tác dụng dược lý

Theo y học dân gian, rễ Sa-kêcó tính làm dịu, có tác dụng trừ ho; vỏ có tác dụng sáttrùng; lá có tác dụng kháng sinh, tiêu viêm, lợi tiểu [1] Mặt khác, các dịch chiếtcủa Sa-kê đã được quan tâm nghiên cứu và thể hiện các tác dụng sinh học hữu íchnhư: cao chiết gỗ tủy cho tác dụng ức chế 5-α-reductase, cao chiết methanol từ vỏcành cho tác dụng ngừa tăng lipid máu, cao chiết ethyl acetat từ lá cho tác dụng bảo

vệ tế bào dưới ảnh hưởng của LDL oxy hóa, cao chiết methanol từ quả cho tácdụng ức chế α-glucosidase, các cao chiết từ lá thể hiện tác dụng kháng sinh

Bên cạnh đó, các hợp chất đã phân lập được từ các bộ phận dùng của Sa-kê cũngcho nhiều tác dụng sinh học có giá trị Đại diện một số hoạt chất đã được phân lập

và tác dụng của chúng được trình bày trong Bảng 1.5.

Bảng 1.6 Một số hoạt chất đã được phân lập từ Sa-kê (Artocarpus altilis)

Hoạt chất Công thức cấu tạo Tác dụng dược lý TLTK

[37] [12]

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng sàng lọc tác dụng ức chế tyrosinase

20 mẫu dược liệu được thu hái vào tháng 7, tháng 8/2016 tại thành phố LongXuyên, tỉnh An Giang; riêng các mẫu Đào được thu hái tại Lâm Đồng Cải xoong

và Rau má được mua tại thành phố Hồ Chí Minh

Bảng 2.1 Các mẫu dược liệu được dùng trong bài

Nguyên liệu được định danh dựa vào hình ảnh, tài liệu tham khảo.Dược liệu đượcrửa sạch, phơi trong râm, sấy khô ở 50 oC, rồi xay đến dạng bột thôvà lưu mẫu tại

bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Trong quá trình chuẩn bị mẫu cần lưu ý mẫu vỏ quả và quả Bí đao, quả và hạtKhổ qua phơi khó khô và dễ bị ẩm mốc; vỏ quả Chanh dây dễ bị sâu mọt

2.2 DUNG MÔI, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1 Dung môi, hóa chất

Dung môi dùng cho chiết xuất, phân lập:

- Cồn 96%, nước cất

- Chloroform, ethyl acetat, n-hexan, methanol PA(Chemsol, Việt Nam).

Dung môi, hóa chất dùng cho thử nghiệm hoạt tínhsinh học

- DPPH, tyrosinase; L-tyrosin; acid kojic (Sigma-Aldrich, Singapore)

Bản mỏng sắc kí silicagel F254 (Merck, Đức)Các hóa chất, thuốc thử khác dùng trong phòng thí nghiệm Dược liệu học

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

- Tủ sấy UML-500 (Memmert)

- Tủ sấy chân không JeioTech Seri M099134

- Cân xác định độ ẩm MA - 45 (Satorius)

- Cân kỹ thuật EW-600-2M (Kern) sai số 0,01 g ;

- Cân phân tích Sartorius sai số 0,01 mg

- Máy đo UV-Vis Metertech SP-8001

- Micropipet loại 2-20 µl, 10-100 μl, 100-1000 μlMột số dụng cụ khác được dùng trong phòng thí nghiệm

2.2.3 Nơi thực hiện đề tài

Nghiên cứu được thực hiện tại bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, trường Đại học

20 g mẫu nguyên liệu được chiết lần lượt thành ba phân đoạn có độ phân cựctăng dần là chloroform, ethanol 96% và nước cất bằng phương pháp chiết nóng.Các dịch chiết được loại dung môi dưới áp suất giảm cho đến cắn thu được các caochiết tương ứng Sau đó được làm khô trong tủ sấy chân không đến khô kiệt, đựngtrong chai thủy tinh màu, rộng miệng, đã dán nhãn và cân bì, bảo quản trong tủ lạnh

Quy trình chiết chuẩn bị mẫu thử được mô tả theo hình 2.1.

Riêng các mẫu nước ép Rau má và Cải xoong (CaS và NoS) được chuẩn bị bằngcách vắt kiệt trong túi vải cotton sạch; dịch vắt được lọc lấy dịch trong suốt; dịchlọc sau đó được đông khô tạo thành bột mịn Bã còn lại được chiết với ethanol 96%(v/v) rồi cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các mẫu: cao chiết bãRau má (CaT) và cao chiết bã Cải xoong (NoT)

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thử cho sàng lọc sinh học

2.3.2 Chuẩn bị các dung dịch mẹ Dung dịch đệm phosphat (PBS) 50 mM: cân chính xác lượng muối phosphat cần

sử dụng, hòa tan vào nước cất hai lần đã lọc trong bình định mức có thể tíchphù hợp, kiểm tra và điều chỉnh về pH mong muốn, lọc bỏ cặn bẩn nếu có.Dung dịch được bảo quản trong phòng lạnh và nên được sử dụng trong ngày

Dung dịch đệm 50 mM, pH 6,5: chứa 42 mM KH2PO4 và 8 mM K2HPO4, đượcdùng cho khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase trên vi đĩa 96 giếng

Dung dịch đệm 50 mM, pH 6,8: chứa 36 mM KH2PO4 và 14 mM K2HPO4, đượcdùng cho khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM

Bột dược liệu (20 g)

1 Thêm CHCl 3

2 Đun cách thủy hồi lưu trong 1 giờ

3 Lọc Lặp lại nhiều lần đến khi chiết kiệt

1 Thêm EtOH 96%

2 Đun cách thủy hồi lưu trong 1 giờ

3 Lọc Lặp lại nhiều lần đến khi chiết kiệt

Cô thu hồi dung môi

Cô thu hồi dung môi

Cao EtOH 96%

Bã dược liệu

Cô trên bếp cách thủy

Cao nước Dịch chiết nước

Dung dịch tyrosinase 250 U/ml: Hòa tan lọ tyrosinase (25000 U /9 mg) trong

10 ml PBS 50 mM, pH 6,5 Bảo quản trong tủ lạnh -20 oC

2.3.3 Thiết kế thí nghiệm 2.3.3.1 Định tính tác dụng chống oxy hóa, mô hình DPPH trên SKLM

Thí nghiệm 1: Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, mô hình DPPH trên SKLM Mục đích: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, mô hình DPPH trên SKLM cung cấp

thêm hình ảnh về tác dụng chống oxy hóa của mẫu thử

Quy trình thực hiện:

- Chuẩn bị bản mỏng và triển khai trong pha động thích hợp

- Sau khi để khô dung môi, bản mỏng được nhúng dung dịch DPPH 0,1% trongmethanol và để yên trong hộp kín, tối Quan sát bản mỏng sau 5 phút

Triển khai sắc ký:

Các bản mỏng đã chấm dịch chiết được triển khai trong các dung môi thích hợp:

- Cao chloroform: chloroform – ethanol 9:1

- Cao ethanol 96%: ethyl acetat – methanol – nước 100:17:13

- Cao nước: ethyl acetat – methanol – nước 100:17:13

Tổng quát, bản mỏng được thiết kế theo Hình 2.3.

Mẫu được sắp xếp thành nhóm bộ phận dùng, theo thứ tự: (-1-) rễ, (-2-) thân, (-3-)

lá, (-4-) hoa, (-5-) quả, dịch quả, (-6-) hạt, (-7-) vỏ quả, (-8-) thân rễ, (-9-) toàn cây

Hình 2.2 Thiết kế bản mỏng cho thí nghiệm khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase

2.3.3.2 Khảo sát điều kiện định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM

Vì García, P và cộng sự (2015) gợi ý rằng quy trình phun thuốc thử cho kết quảkém ổn định [24], nghiên cứu tham khảo quy trình cố định enzym trong thạch

Thí nghiệm 2: Khảo sát điều kiện thí nghiệm

Thử nghiệm tính khả dụng của thạch Himedia RM-201:

Mục đích: Khảo sát nhiệt độ đông đặc của thạch Himedia RM-201 ở nồng độ 1,2%

(12 mg/ml) nhằm kết luận khả năng áp dụng loại thạch này cho thí nghiệm khảo sáttác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM

Nguyên tắc: Pha gel trắng với 15 mg/ml và 12 mg/ml thạch RM-201 theo quy trình

García, P và cộng sự (2015) [24] Quan sát những thay đổi nhiệt độ khi thêm cácphần PBS thay thế cho dung dịch L-tyrosin và tyrosinase Ghi nhận điểm đông đặccủa thạch

Bố trí thí nghiệm:

Cho 10 ml gel trắng 1,5% và 1,2% cần 150 mg và 120 mg thạch Himedia RM-201.Thể tích tương đương với dung dịch L-tyrosin là 3,125 ml; thể tích tương đươngvới dung dịch tyrosinase là 2 ml

Quy trình thực hiện:

- Cân chính xác 150 mg và 120 mg thạch RM-201 vào hai ống nghiệm có nắpvặn 16 mm x 160 mm.Thêm 4,875 ml PBS 0,5 mM, pH 6,8 Khuấy đều rồingâm trong 30 phút Đun ống nghiệm trong bếp cách thủy 95 oC đến khi thạchtrương nở hoàn toàn thành dung dịch trong suốt và không còn bọt khí Chuyểngel vào cốc 50 ml, theo dõi nhiệt độ bằng nhiệt kế thủy ngân 25 – 100 oC

- Trong lúc pha gel, đồng thời ủ 3,125 ml PBS 0,5 mM, pH 6,8 trong bể 55 oC,

0,5cm 0,5cm

1,0 cm

0,5 0,5 0,7

- Để nguội gel đến khi đông đặc (thử bằng cách kéo nhẹ nhiệt kế hoặc nghiêngống nghiệm) Đọc nhiệt độ tại thời điểm thạch đông đặc hoàn toàn.

Nguyên tắc: Gel thử chứa tyrosinase và L-tyrosin được rót lên bản mỏng đã được

khai triển và với phản ứng oxy hóa L-tyrosin với xúc tác tyrosinase diễn ra chậm.Sau một thời gian nhất định, gel thử chuyển từ không màu sang màu nâu đỏ Nhữnghoạt chất ức chế tyrosinase cho vết có hoạt tính sáng màu

Quy trình thử nghiệm:quy trình García, P và cộng sự (2015) hiệu chỉnh

Bố trí thí nghiệm:

Chuẩn bị bản mỏng và triển khai sắc ký: theo mô tả ở mục 2.3.3.1

Chuẩn bị gel mang hỗn hợp thử (gel thử):

Cho mỗi cm2 bản mỏng cần 0,16 ml gel: gồm 1,92mg thạch, 32 µl dung dịchtyrosinase 250 U/ml (~8 U/cm2), 50 µl dung dịch L-tyrosin 2 mM (~100 nmol/cm2),

88 µl PBS 0,2 mM, pH 6,8

Cân thạch và hòa tan vào PBS trong một ống nghiệm có nắp trên bếp cách thủy ởnhiệt độ > 85 oC (nhiệt độ cài đặt của bếp là 95,5 oC)

Để nguội gel đến 55 oC, thêm dung dịch L-tyrosin (ủ tại 55 oC trong bể siêu âm)

Để nguội đến 45 oC, thêm dung dịch tyrosinase ở nhiệt độ thường, nhiệt độ gelgiảm còn 39-37 oC Gel sau khi pha xong rót ngay vào bản mỏng

Phát hiện vết: Bản mỏng sau khi khai triển được rót gel đã hòa tan tyrosinase và

L-tyrosin, để yên trong 20 phút Các hoạt chất cho vết sáng màu trên nền gel màunâu đỏ

2.3.3.4 Khảo sát điều kiện thử nghiệm sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế

tyrosinase trên đĩa 96 giếng:

Thí nghiệm 4: Khảo sát bước sóng quan sát và ảnh hưởng của DMSO 5% đến kết quả đo quang:

Mục đích: Các quy trình thử nghiệm từ tài liệu tham khảo đo độ hấp thu tại 450 nm,

475 nm hoặc 490 nm Thí nghiệm nhằm:

- Chọn ra bước sóng quan sát phù hợp với điều kiện thực nghiệm

- Phân tích ảnh hưởng của DMSO 5% đến dạng phổ và kết quả đo quang.

Quy trình thực hiện: quy trình Nguyễn Hải Xuân và cộng sự (2016) hiệu chỉnh:

- Quét phổ trong cuvet thạch anh 3 ml

- Thử nghiệm trong PBS 50 mM pH 6,5 và PBS với 5% DMSO

- Lập đường nền với mẫu chứng là dung dịch L-tyrosin 0,5 mM

- Mẫu thử chứa 15 U/ml tyrosinase và 0,5 mM L-tyrosin

- Quét phổ UV trong khoảng 400-600 nm ở thời điểm bắt đầu phản ứng và mỗi

2 phút cho đến 30 phút sau khi thêm chất nền

Đánh giá kết quả:

Bước 1: Mô tả phổ Vis 400-600 nm của hỗn hợp phản ứng, xác định đỉnh hấp thu

trong môi trường PBS và PBS với 5% DMSO

Bước 2: Chọn bước sóng đặc hiệu và phù hợp với điều kiện thực nghiệm.

Bước 3: Mô tả ảnh hưởng của DMSO 5% đến kết quả đo quang.

Bố trí thí nghiệm

Chuẩn bị các mẫu thử:

- PBS: 1,905 ml PBS 50 mM, pH 6,5 + 0,825 ml dung dịch L-tyrosin 2 mM

trong PBS + 0,27 ml dung dịch tyrosinase 250 U/ml trong PBS

- DMSO:1,755 ml PBS 50 mM, pH 6,5 + 0,15 ml DMSO + 0,825 ml dung dịch

L-tyrosin 2 mM trong PBS + 0,27 ml dung dịch tyrosinase 250 U/ml trong PBS

Chuẩn bị mẫu chứng: PBS-C, DMSO-C: thay dung dịch tyrosinase bằng PBS.

Tiến hành:

- Nạp mẫu PBS-C vào cuvet 3 ml, lập đường nền

- Hoàn thành mẫu PBS trong cuvet 3 ml Quét phổ lần đầu

- Quét phổ của phản ứng sau mỗi 2 phút cho đến 30 phút từ 400 nm đến 600 nm.Thực hiện tương tự với mẫu DMSO, khi đó mẫu chứng là DMSO-C

Đánh giá kết quả:

Bước 1:

- Mô tả dạng phổ Vis đặc trưng của dopachrom và của hỗn hợp phản ứng

- Xác định đỉnh hấp thu và thời điểm mà tại đó độ hấp thu ở đỉnh là cao nhất

Bước 2: So sánh tính đặc hiệu giữa các bước sóng 450 nm, 475 nm và 490 nm:

- Cho mỗi thời điểm quét phổ, tính tỉ lệ độ hấp thu gia tăng tại các bước sóng

450 nm, 475 nm và 490 nm so với độ hấp thu gia tăng tại đỉnh hấp thu được