Nghiên cứu phân lập, xây dựng quy trình định lượng flavonoid trong nguyên liệu, cao chiết an xoa (helicteres hirsuta lour )

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Toàn cây trên mặt đất của cây An xoa Helicteres hirsuta Lour , được thu hái tại Bình Phước vào tháng 03/2017.

Mẫu dược liệu đã được xác nhận đúng loài bởi Cô Ths Nguyễn Thị Thu Hằng, Bộ môn thực vật, Khoa Dược, ĐH Y Dược TPHCM.

Để xử lý an xoa, nguyên liệu cần được phơi khô và xay nhuyễn khoảng 2 mm, phục vụ cho nghiên cứu hóa học và chiết xuất Sau đó, nguyên liệu được đóng gói trong túi nilong 2 lớp chống ẩm, với các đơn vị đóng gói 1 kg và 2 kg Cuối cùng, một phần nguyên liệu sẽ được rây qua rây 0,3 mm để kiểm tra đặc điểm vi học.

2.1.2 Dung môi, hóa chất, tá dược

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong chiết xuất và kiểm nghiệm

Tên hóa chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc

Cloroform Tinh khiết phân tích (PA) J.T.Baker, Mỹ

Ethanol Tinh khiết phân tích (PA) J.T.Baker, Mỹ

Ethylacetat Tinh khiết phân tích (PA) J.T.Baker, Mỹ n- hexan Tinh khiết phân tích (PA) J.T.Baker, Mỹ

Methanol Tinh khiết phân tích (PA) J.T.Baker, Mỹ

Methanol Tinh khiết cho HPLC Merck, Đức

Acetonitril Tinh khiết cho HPLC Merck, Đức

Nước cất Tinh khiết cho HPLC Việt Nam

Ethanol 96% TCCS OPC, Việt Nam

Nước cất TCCS Việt Nam

Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong chiết xuất và kiểm nghiệm

Tên thiết bị Hiệu, mã số Xuất xứ

Bể siêu âm gia nhiệt ElmaS180H Đức

Bếp cách thủy điều nhiệt Memmert WB14 Đức

Cân kỹ thuật Satorius TE412 Đức

Cân phân tích 4 chữ số Precisa XB220A ThụySĩ

Cân phân tích 5 chữ số Sartorius CP - 2250 Đức

Cân xác định độ ẩm Sartorius MA - 45 Đức

Máy cô quay chân không 1 lít BuchiRotavapor R210S ThụySĩ Máy cô quay chân không 20 lít BuchiRotavapor R220S Thụy Sĩ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) Dionex Ultimate 3000 Mỹ

Tủ sấy Memmert ULM500 Đức

Lò nung Carbolite ELF 11/14B Anh

Thiết bị ngấm kiệt bằng inox loại nhỏ

(dung tích 500 ml) trong phòng thí nghiệm Việt Nam

Thiết bị ngấm kiệt loại lớn loại lớn 50 lít Việt Nam

Bộ môn Phân tích-Kiểm nghiệm, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Dược liệu; Khoa Dược-Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh.

Phòng nghiên cứu và phát triển, Công ty TNHH ADC pharma, KV Thới Hưng, Phường Long Hưng, Quận Ô Môn, Cần Thơ.

Nghiên cứu thăm dò điều kiện chiết xuất dịch chiết và điều chế cao đặc từ dịch chiết lá khô được thực hiện thông qua ba thí nghiệm, với kết quả trung bình được ghi nhận.

- Phần định lượng tiến hành 6 thí nghiệm lấy kết quả trung bình.

- Sử dụng mô hình thực nghiệm kết hợp phương pháp Box - Willson.

- Sử dụng phần mềm tính toán và xử lý số liệu Microsoft Excel 2010.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất phân lập chất đánh dấu trong dược liệu An xoa

2.2.1.1 Chiết xuất dược liệu An xoa

Tham khảo tài liệu [3] An xoa được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt. Nguyên liệu An xoa độ ẩm 6,3 % khoảng 2 kg làm ẩm bằng ethanol 50 % trong

Sau 2 giờ ngâm, bổ sung 50% ethanol vào bình và mở khóa để loại bỏ bọt khí Đóng khóa, đổ dịch chiết trở lại và thêm ethanol cho ngập mặt dược liệu khoảng 2 cm, ngâm lạnh trong 24 giờ Rút dịch chiết theo tỉ lệ 5/1 với tốc độ 2 ml/phút, sau đó cô quay dưới áp suất giảm ở 70°C đến khi đạt thể chất đặc Cao thu được được phân tán với ít nước và lắc qua các dung môi n-hexan, cloroform, ethyl acetat để thu dịch ethyl acetat Cuối cùng, cô quay dịch ethyl acetat dưới áp suất giảm để thu được cao ethyl acetat có tính chất dẻo sánh, sẵn sàng cho việc sắc ký cột cổ điển để phân lập chất đánh dấu.

2.2.1.2 Phân lập và tinh chế chất đánh dấu

* Sắc ký cột cổ điển

- Khảo sát hệ dung môi

Nghiên cứu hệ dung môi cho sắc ký cột cổ điển được thực hiện thông qua việc triển khai sắc ký lớp mỏng cao ethyl acetat với nhiều hệ dung môi khác nhau Kết quả được đánh giá bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, đồng thời hiện vết bằng thuốc thử vanilin-sulfuric (VS) sau khi hơ nóng bản mỏng trên bếp điện Việc lựa chọn hệ dung môi cho sắc ký cột cổ điển dựa trên nguyên tắc rằng các vết trên sắc ký lớp mỏng phải tách biệt rõ ràng, không bị kéo vệt, với Rf của các vết cần tách nằm trong khoảng 0,25 – 0,35.

+ Hệ 1: Cloroform - methanol - acid acetic (9 : 1 : 0,1)

+ Hệ 2: Cloroform - ethyl acetat - acid acetic (8 : 2 : 0,1) + Hệ 3: Petroleum ether - ethyl acetat (6 : 4)

+ Hệ 4: Ethyl acetat - methanol - acid acetic (9 : 1 : 0,1)

Silica gel có kích thước hạt 40 - 63 được sử dụng để nhồi cột có kích thước 4,5 x 50 cm theo phương pháp hỗn dịch Dung môi được sử dụng để chạy cột với tỷ lệ gấp 40 lần so với lượng mẫu phân lập Quá trình ổn định cột được thực hiện bằng cách mở khóa để dung môi chảy liên tục qua cột.

Cao ethyl acetat được nạp vào cột bằng phương pháp nạp mẫu khô, kết hợp với một lượng silicagel tối thiểu Sau đó, bột thu được được sấy ở nhiệt độ 40 độ C cho đến khi đạt được độ mịn, tơi và xốp.

- Nạp mẫu và triển khai cột

Nạp mẫu khô và dung môi vào cột, sau đó triển khai cột với tốc độ ổn định Tăng dần độ phân cực của hệ dung môi bằng cách điều chỉnh tỉ lệ giữa các dung môi Tiến hành thu các phân đoạn và theo dõi quá trình bằng sắc ký lớp mỏng Đánh giá kết quả thu được thông qua việc soi UV ở bước sóng thích hợp.

Phương pháp xác định vết 254 nm và 365 nm sử dụng thuốc thử vanilin-sulfuric (VS) bằng cách hơ nóng bản mỏng trên bếp điện Các phân đoạn có thành phần tương tự được gộp lại, sau đó cô dưới áp suất giảm để thu được dịch đậm đặc Dịch này sẽ được kết tinh trong các dung môi thích hợp qua nhiều lần lặp lại, nhằm đạt được chất tinh khiết.

* Sắc ký lỏng (HPLC) điều chế

Sau khi triển khai sắc ký cột cổ điển, việc tách các phân đoạn vết trở nên khó khăn nếu tiếp tục sử dụng phương pháp này Do đó, để cải thiện hiệu quả, các phân đoạn sẽ được xử lý bằng sắc ký lỏng HPLC điều chế, mang lại ưu điểm về thời gian phân lập nhanh và hiệu năng tách cao Các hệ dung môi sẽ được thăm dò để tối ưu hóa quá trình chạy HPLC điều chế cho các phân đoạn cần phân lập.

2.2.1.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

* Kiểm tra độ tinh khiết

- Bằng sắc ký lớp mỏng

Các chất phân lập được thực hiện thông qua phương pháp sắc ký lớp mỏng với ba hệ dung môi khác nhau Việc quan sát sắc ký được thực hiện dưới ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, và các vết được hiện bằng thuốc thử vanilin-sulfuric (VS) sau khi hơ nóng bản mỏng trên bếp điện.

- Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Các chất phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên máy Dionex Ultimate 3000, sử dụng đầu dò PDA Dionex 3000 với các điều kiện sắc ký phù hợp.

+ Cột sắc ký: Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 àm, 250 mm x 4,6 mm) + Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl

Nhiệt độ cột được duy trì ở mức 30 oC và tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút Pha động được triển khai trên cùng một mẫu và trong cùng một điều kiện với các pha động khác nhau, nhằm lựa chọn pha động phù hợp nhất cho quá trình phân tích.

+ Bước sóng phát hiện: dựa vào phổ hấp thu UV-Vis của chất đánh dấu để chọn bước sóng phát hiện khi định lượng.

* Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Sau khi kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và HPLC, các chất phân lập được sẽ được đo phổ UV-Vis, IR, MS và NMR Dựa trên các dữ liệu phổ thu được, tiến hành biện giải và so sánh với dữ liệu phổ tham khảo để xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập.

Các chất phân lập được hòa tan trong methanol và sau đó được đo bằng máy quang phổ UV-Vis Kết quả cho thấy hình dạng phổ và đỉnh hấp thu cực đại (nm) của các chất này.

Các chất phân lập được phân tích bằng phổ IR trên máy FT-IR Bruker sử dụng kỹ thuật ép đĩa KBr với khoảng 1,5 mg mẫu thử cho mỗi đĩa Dải hấp thu được ghi nhận trong khoảng số sóng từ 4000 cm⁻¹ đến 400 cm⁻¹, nhằm xác định sơ bộ nhóm cấu trúc của chất.

Phân tích phổ khối (MS) của các chất phân lập được thực hiện bằng máy LC-MS tại Viện Công Nghệ Hóa Học Tín hiệu thu được được ghi nhận dựa trên phân mảnh chính [M-H] với số khối (m/z) và cường độ tương đối, từ đó xác định khối lượng phân tử của các chất.

Các chất phân lập đã được phân tích bằng phổ NMR trên máy Avance 500MHz của Bruker tại Viện Hóa học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Mẫu được hòa tan trong DMSO với chất chuẩn nội TMS Kỹ thuật phổ NMR một chiều (1-D) và hai chiều (2-D) được sử dụng để so sánh và xác định cấu trúc cụ thể của các hợp chất phân lập.

2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng chất đánh dấu trong dược liệu, cao chiết An xoa

2.2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng chất đánh dấu trong dược liệu An xoa

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chiết xuất phân lập chất đánh dấu trong dược liệu An xoa

3.1.1 Chiết xuất dược liệu An xoa

Quy trình chiết xuất 2,1 kg bột An xoa được thực hiện bằng cách thu hái toàn cây trên mặt đất, sau đó phơi khô và xay mịn Kết quả thu được từ quá trình này là 10,3 g cao ethyl acetat, theo sơ đồ chiết xuất 3.1.

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cao ethyl acetat từ cây An xoa

3.1.2 Phân lập và tinh chế chất đánh dấu

3.1.2.1 Phân lập cao ethyl acetat bằng sắc ký cột cổ điển

* Khảo sát pha động triển khai sắc ký cột cổ điển

Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với cao ethyl acetat lần lượt với các hệ dung môi sau:

- Hệ 1: Cloroform - methanol - acid acetic (9 : 1 : 0,1)

- Hệ 2: Cloroform - ethyl acetat - acid acetic (8 : 2 : 0,1)

- Hệ 3: Petroleum ether - ethyl acetat (6 : 4)

Ngấm kiệt với ethanol 50 % Rút dịch chiết với tỉ lệ 1:5

Dịch chiết an xoa (10,5 lít)

Cô quay dưới áp suất giảm ở 70 o C Cao đặc (220 g)

Lắc phân bố lần lượt với n-hexan, cloroform, ethyl acetat

Cô thu hồi dung môi

- Hệ 4: Ethyl acetat - methanol - acid acetic (9 : 1 : 0,1)

Kết quả sắc ký đồ với hệ dung môi cloroform - methanol - acid acetic (9:1:0,1) cho thấy khả năng tách tốt nhất với nhiều vết tách rõ ràng và không bị kéo vệt Vì vậy, cloroform và methanol được chọn làm dung môi cho phương pháp sắc ký cột cổ điển.

UV 254 nm UV 365nm Thuốc thử VS

Hình 3.1 Kết quả sắc ký đồ với hệ cloroform - methanol - acid acetic (9 : 1 : 0,1)

* Triển khai sắc ký cột cổ điển

Cao ethyl acetat (10,3 g) được hòa tan trong methanol tối thiểu, sau đó trộn đều với 10,3 g silica gel kích thước hạt 40-63 Hỗn hợp này được sấy ở nhiệt độ 40 °C cho đến khi đạt được bột mịn, tơi và xốp, sau đó được nạp vào cột sắc ký.

- Cột sắc ký có kích thước 4,5 x 50 cm, nhồi cột ướt bằng 410 g silica gel kớch thước hạt 40-63 àm phõn tỏn trong cloroform.

- Hệ dung môi chạy cột là cloroform - methanol với tỷ lệ thay đổi từ 100 : 0 đến 96 : 4.

- Thể tích hứng các phân đoạn: 10 ml.

Các phân đoạn được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi cloroform - methanol - acid acetic theo tỷ lệ 9:1:0,1 Những phân đoạn có vết tương tự được gom chung lại để phân tích.

Bảng 3.1 Kết quả thu các phân đoạn từ cao ethyl acetat qua sắc ký cột

Tỷ lệ pha động Phân đoạn Thể tích hứng (lít)

Cloroform - methanol từ (98 : 2) III 4 lít Cloroform - methanol từ (97 : 3) IV 9 lít Cloroform - methanol từ (96 : 4) V 8,5 lít

UV 254 nm Thuốc thử VS

Hình 3.2 Sắc ký đồ SKLM các phân đoạn từ cao ethyl acetat qua sắc ký cột

Kết quả tách các phân đoạn từ cao ethyl acetat qua sắc ký cột cho thấy có 5 phân đoạn Trong đó, phân đoạn I và IV nổi bật với các vết tách rõ rệt và cách xa nhau, đồng thời chúng cũng cho màu vàng nhạt khi quan sát bằng mắt thường và bắt màu vàng với thuốc.

Luận văn thạc sỹ dược học của Trần Ngọc Đan Thanh đã tiến hành thử nghiệm và sơ bộ đánh giá các chất flavonoid, thuộc nhóm chất đánh dấu của An xoa.

3.1.2.2 Xử lý phân đoạn IV

* Phân lập bằng HPLC điều chế

Trong phân đoạn IV, quá trình cô thu hồi dung môi đã thu được 235 mg bột màu vàng Hệ thống sắc ký HPLC được sử dụng là Waters 2767, với đầu dò PDA 2996 để tiến hành phân tích.

- Cột sắc ký: cột bỏn điều chế Sunfire C18 (5 àm, 10 mm x 150 mm) với tiền cột C18 (5 àm, 10 mm x 10 mm)

- Thể tớch tiờm mẫu: 100 àL

- Tốc độ dòng: 2 ml/phút

- Pha động: MeOH - nước (40 : 60), rửa giải đẳng dòng

- Bước sóng phát hiện: 314 nm

Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC điều chế phân đoạn IV

Kết quả từ quá trình chạy HPLC điều chế với phân đoạn IV cho thấy có hai phân đoạn mới là IV.1 và IV.2 Sau khi cô bốc hơi dung môi, phân đoạn IV.1 thu được 43 mg bột kết tinh màu vàng, trong khi phân đoạn IV.2 thu được 26 mg bột kết tinh màu vàng Tiếp theo, độ tinh khiết của các phân đoạn này đã được kiểm tra bằng phương pháp HPLC.

* Kiểm tra độ tinh khiết các phân đoạn đã phân lập bằng HPLC

Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh Điều kiện chạy HPLC như sau:

- Cột sắc ký: Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 àm, 250 mm x 4,6 mm)

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl

Kết quả từ hình 3.4, 3.5, 3.6 và bảng 3.2 cho thấy phân đoạn IV.1 chứa hoạt chất LD1 với thời gian lưu là 18,873 phút và độ tinh khiết sắc ký đạt 99,82% dựa trên % diện tích pic sắc ký Do đó, phân đoạn IV.1 sẽ được tiếp tục phân tích bằng các phương pháp phổ UV, IR, MS và NMR để xác định cấu trúc của LD1.

Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC phân đoạn IV.1 (hoạt chất LD1)

Hình 3.5 Phổ 3D của hoạt chất LD1

Hình 3.6 Phổ UV của hoạt chất LD1 Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết LD1 bằng HPLC

Diện tích pic (mAU*min) % Diện tích pic

Kết quả phân tích phổ UV của LD1 trong methanol tại hình 3.5 cho thấy LD1 có 2 đỉnh hấp thu cực đại tại 268 nm và 313 nm.

* Phân lập bằng sắc ký cột cổ điển

Trong quá trình cô thu hồi dung môi, chúng tôi thu được 210 mg bột màu vàng Tiếp theo, chúng tôi tiến hành sắc ký cột cổ điển lần 2 bằng cách hòa tan bột màu vàng này với một lượng tối thiểu methanol và trộn đều với 210 mg silica gel có kích thước hạt 40.

63 àm tiến hành sấy ở 40 o C đến khi thu được bột cú thể chất mịn, tơi, xốp và được nạp vào cột sắc ký

- Cột sắc ký có kích thước 2 x 40 cm, nhồi cột ướt bằng 8 g silicagel kích thước hạt 40 - 63 àm phõn tỏn trong cloroform.

- Hệ dung môi chạy cột là cloroform - methanol với tỷ lệ thay đổi từ 100 : 0 đến 97 : 3.

- Thể tích hứng các phân đoạn: 5 ml.

Các phân đoạn được phân tích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi gồm cloroform, methanol và acid acetic với tỷ lệ 9:1:0,1 Những phân đoạn có dấu hiệu tương đồng được kết hợp lại với nhau.

UV 254 nm UV 365nm Thuốc thử VS

Hình 3.7 Sắc ký đồ SKLM hoạt chất LD2

Kết quả phân lập từ phân đoạn I cho thấy thu được 39 mg bột tinh thể màu vàng LD2 Sắc ký đồ SKLM chỉ xuất hiện một vết, tắt quang ở UV 254 nm và có màu vàng nhạt khi quan sát bằng mắt thường, đồng thời hiện màu vàng với thuốc thử VS, cho thấy LD2 có khả năng là một flavonoid Độ tinh khiết của LD2 được kiểm tra bằng phương pháp HPLC.

* Kiểm tra độ tinh khiết LD2 bằng HPLC Điều kiện chạy HPLC như sau:

Kết quả từ hình 3.8, 3.9 và bảng 3.3 cho thấy sau khi thực hiện sắc ký cột cổ điển lần 2 với phân đoạn I, hợp chất LD2 đạt thời gian lưu 8,017 phút và độ tinh khiết sắc ký 98,66% dựa trên % diện tích pic sắc ký Hợp chất LD2 tiếp tục được phân tích bằng phổ UV.

IR, MS và NMR nhằm biện giải tìm ra cấu trúc phân tử LD2.

Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất LD2

Hình 3.9 Phổ 3D của hoạt chất LD2

Hình 3.10 Phổ UV-Vis của hoạt chất LD2 Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết LD2 bằng HPLC

Diện tích pic (mAU*min) % Diện tích pic

Kết quả phân tích phổ UV của LD2 trong methanol tại hình 3.10 cho thấy LD2 có 3 đỉnh hấp thu cực đại tại 224 nm, 281 nm và 305 nm Trong đó đỉnh

Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh hấp thu cực đại tại 281 nm và 305 nm trong methanol thường đặc trưng cho cấu trúc chất nhóm flavon.

3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của LD1

Hình 3.11 Phổ MS của LD1

Kết quả phổ MS của LD1 được trình bày tại hình 3.11 cho thấy có mảnh m/z 593,04 [M-H] – , tương ứng với khối lượng phân tử của LD1 là 594 đvC.

Hình 3.12 Phổ IR của LD1

Kết quả phổ IR của LD1 cho thấy các dao động hóa trị đặc trưng như sau: nhóm O-H tại 3460 cm -1, nhóm C-H tại 3242 cm -1, nhóm C=O tại 1682 cm -1 và 1607 cm -1, cùng với nhóm C-H nhân thơm thế para tại 822 cm -1.

Dữ liệu phổ NMR của LD1 bao gồm phổ 1 H, 13 C, COSY, DEPT, HMBC, HSQC được trình bày tại phụ lục 1.

Phổ 1 H (500 MHz, DMSO) tại hình 3.13 cho tín hiệu của proton tại δH 12,567 ppm ở vùng từ trường thấp có khả năng là proton của OH tại vị trí C-

Tín hiệu δH tại 10,82 ppm có thể là proton của OH tại vị trí C-7, trong khi tín hiệu δH tại 9,98 ppm có khả năng là proton của OH tại vị trí C-4’ Phổ 1 H cho thấy các tín hiệu proton methine (CH) với hai đỉnh đôi ở δH 7,9 ppm (d, 9 Hz) và δH 6,85 ppm (d, 9 Hz), cho thấy 4 proton này thuộc vòng thơm B, đặc trưng cho flavonoid với tính đối xứng cao Ngoài ra, hai tín hiệu mũi đôi tại δH 6,15 ppm (d, 2 Hz) và δH 6,38 ppm (d, 2,5 Hz) xác nhận các proton ở vị trí meta của vòng A Các tín hiệu δH từ 3-4 ppm cho thấy sự hiện diện của các proton vòng đường, với tín hiệu đặc trưng của proton anomer tại δH 5,44 ppm (d, 7,5 Hz) cùng với hai proton khác tại δH 4,27 ppm (d, 11 Hz) và δH 4,03 ppm (dd, 12 Hz), cho thấy LD1 chứa 1 đường glucose cấu trúc β Hai tín hiệu đỉnh đôi δH 7,34 ppm (d) và δH 6,1 ppm (d) có giá trị hằng số tương tác lớn với J = 15,5 Hz, cùng với hai tín hiệu mũi đôi tại δH 6,79 ppm (d, 8,5 Hz) và δH 7,36 ppm (d, 8,5 Hz), gợi ý sự có mặt của coumaryl.

Hình 3.13 Phổ 1 H (500 MHz, DMSO) của LD1

Xây dựng quy trình định lượng tilirosid trong dược liệu, cao chiết An xoa

3.2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tilirosid trong dược liệu

3.2.1.1 Thăm dò phương pháp định lượng chất đánh dấu trong dược liệu An xoa

* Khảo sát bước sóng phát hiện

Hình 3.21 Phổ UV-Vis của tilirosid

Kết quả phổ UV-Vis của tilirosid cho thấy có hai đỉnh hấp thu cực đại tại 268 nm và 313 nm, với đỉnh hấp thu mạnh nhất nằm ở 313 nm Vì vậy, bước sóng 314 nm được lựa chọn làm bước sóng để phát hiện và định lượng tilirosid.

* Khảo sát hệ dung môi pha động tiến hành HPLC

Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu thử với hệ pha động ACN - acid acetic 0,2 % (25 : 75)

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu thử với hệ pha động ACN - nước (27 : 73)

Mẫu thử được phân tích dưới các điều kiện sắc ký giống nhau với hai hệ pha động: ACN - acid acetic 0,2 % (25:75) và ACN - nước (27:73) Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 3.22 và 3.23, cho thấy sự khác biệt giữa hai hệ dung môi ACN - acid acetic 0,2 %.

75) pic tilirosid tách chưa tốt và chưa hoàn toàn so với các pic khác, còn với hệ ACN - nước (27 : 73) các pic tách tốt và pic tilirosid tốt, cân đối, ít kéo đuôi. Kết luận chọn hệ dung môi ACN - nước (27 : 73) làm pha động để định lượng tilirosid trong mẫu dược liệu.

* Thăm dò phương pháp chiết xuất để định lượng tilirosid trong dược liệu An xoa

Tiến hành như mục 2.2.2.1 Kết quả được trình bày tại bảng 3.6

Bảng 3.6 Diện tích pic tilirosid trong dược liệu An xoa được chiết bằng methanol 45 %, 70 %, 100 %

STT Nồng độ methanol Diện tích pic tilirosid

Kết quả thu được dung môi methanol nồng độ 70 % cho hàm lượng tilirosid cao nhất Do đó chọn methanol 70 % làm dung môi chiết xuất.

Bảng 3.7 Diện tích pic tilirosid trong dược liệu An xoa được chiết ở các nhiệt độ 30 o C, 45 o C, 60 o C

STT Nhiệt độ chiết xuất Diện tích pic tilirosid

Kết quả thu được ở nhiệt độ chiết xuất 60 o C cho hàm lượng tilirosid cao nhất.

Do đó chọn mức nhiệt độ 60 o C là nhiệt độ chiết xuất.

Bảng 3.8 Diện tích pic tilirosid trong dược liệu An xoa được chiết ở các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút và 40 phút

STT Thời gian chiết xuất Diện tích pic tilirosid

Kết quả thu được ở thời gian chiết xuất 30 phút cho hàm lượng tilirosid cao nhất Do đó chọn mức thời gian 30 phút là thời gian chiết xuất.

Bảng 3.9 Diện tích pic tilirosid trong các dịch chiết

STT Số lần chiết Diện tích pic tilirosid

Kết quả từ lần chiết bằng methanol 70% cho thấy gần như toàn bộ tilirosid trong dược liệu đã được chiết xuất, do đó chỉ cần thực hiện quy trình chiết một lần để định lượng Quy trình chiết mẫu dược liệu để xác định tilirosid bắt đầu bằng cách cân chính xác 1 g bột An xoa và cho vào bình nón nút mài 50 ml, sau đó thêm một lượng methanol thích hợp.

Để chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC, hãy sử dụng 20 ml methanol 70%, đậy nắp chặt và siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 60°C Sau đó, chuyển dung dịch vào bình định mức 20 ml, bổ sung dung môi đến vạch và lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiến hành khai triển HPLC.

3.2.1.2 Thẩm định quy trình định lượng tilirosid trong dược liệu An xoa

Cách tiến hành như mục 2.2.2.1 Triển khai HPLC với điều kiện sắc ký như sau:

* Tính tương thích hệ thống

Hỡnh 3.24 Sắc ký đồ đại diện của dung dịch chuẩn 20 àg/ml Bảng 3.10 Kết quả sắc ký của dung dịch chuẩn với 6 lần tiêm mẫu

Diện tích pic (mAU*min)

Hệ số bất đối (As)

Hình 3.25 Sắc ký đồ đại diện của dung dịch thử Bảng 3.11 Kết quả sắc ký của dung dịch thử với 6 lần tiêm mẫu

STT Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic (mAU*min) Độ phân giải (Rs)

Kết quả khảo sát cho thấy tính tương thích của hệ thống với 6 lần tiêm liên tiếp được lặp lại trên cả mẫu thử và mẫu chuẩn, với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông số sắc ký không vượt quá 2% Hệ số bất đối nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5, trong khi số đĩa lý thuyết lớn hơn 2000.

Kết luận quy trình định lượng có tính tương thích hệ thống

Hình 3.26 Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu trẻn mẫu thử dược liệu

Hình 3.27 Phổ UV của tilirosid trong dung dịch chuẩn

Hình 3.28 Phổ UV của tilirosid trong dung dịch thử

Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng được trình bày tại hình 3.26, 3.27, 3.28 cho thấy:

- Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của tilirosid

- Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chỉ xuất hiện pic của tilirosid

- Sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu tương tự như thời gian lưu của tilirosid trong mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ của dung dịch thử thêm chuẩn cho diện tíc pic của tilirosid tăng lên rõ rệt

- Các pic của tilirosid trong mẫu chuẩn và thử đều đạt độ tinh khiết

Kết luận quy trình định lượng có tính đặc hiệu

Hình 3.29 Đường tuyến tính của chất đánh dấu tilirosid Bảng 3.12 Kết quả tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất đánh dấu tilirosid

STT Nồng độ tilirosid trong mẫu

Diện tích pic (mAU*min) - Y

Dùng công cụ Regression (MS-Excel) kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy và kiểm tra ý nghĩa của các hệ số hồi quy

Phương trình hồi quy của tilirosid: y = 292,99x - 56,02 với:

- Hệ số b có t = 1,51 < t0,05 = 2,45 nên hệ số b không có ý nghĩa

- Hệ số a có t = 239,93 > t0,05 = 2,45 nên hệ số a có ý nghĩa

Tính thích hợp của phương trình hồi quy: Có F = 57567,92 > F0,05 = 6,61 nên phương trình hồi quy thích hợp

Do đó phương trình hồi quy của tilirosid là y = 292,99x

Kết luận cho thấy hệ số tương quan R² = 0,9999, vượt qua ngưỡng 0,998, chứng minh rằng phương pháp định lượng tilirosid trong dược liệu An xoa đạt tính tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 5 - 50 àg/ml Phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ tilirosid và diện tích pic được xác định là y = 292,99x với R² = 0,9999.

Để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của quy trình phân tích, cần thực hiện ít nhất 9 lần mẫu thử trong miền giá trị đã định, bao gồm 3 lần phân tích cho mỗi nồng độ ở 3 mức khác nhau.

Bảng 3.13 Kết quả sắc ký thẩm định độ lặp lại của phương pháp

STT Lượng cân mẫu thử (g)

Thời gian lưu mẫu thử (phút)

Diện tích pic mẫu thử (mAU*min)

Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình được trình bày tại bảng 3.13 cho độ lệch chuẩn tương đối RSD của các kết quả định lượng < 2 %

Kết luận quy trình định lượng đạt độ lặp lại

- Độ chính xác trung gian

Bảng 3.14 Kết quả sắc ký thẩm định độ chính xác trung gian của phương pháp

STT Lượng cân mẫu thử (g)

Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của quy trình cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các kết quả định lượng nhỏ hơn 2%, như được trình bày trong bảng 3.14.

Kết luận quy trình định lượng đạt độ chính xác trung gian

Bảng 3.15 Kết quả sắc ký thẩm định độ đúng của phương pháp

Lượng chất chuẩn thêm vào (mg)

Lượng tilirosid tìm lại (mg)

Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình cho thấy tỷ lệ thu hồi đạt từ 90% đến 107% và RSD ≤ 2%, chứng tỏ quy trình định lượng có độ đúng cao.

Quy trình định lượng tilirosid trong mẫu thử dược liệu An xoa đã chứng minh đạt yêu cầu về thẩm định tính tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 5 - 50 àg/ml, đồng thời thể hiện tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian.

3.2.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tilirosid trong cao chiết

3.2.2.2 Thẩm định quy trình định lượng tilirosid trong cao An xoa

Cách tiến hành như mục 2.2.2.2 Triển khai HPLC với điều kiện sắc ký như sau:

* Tính tương thích hệ thống

Hỡnh 3.30 Sắc ký đồ đại diện của dung dịch chuẩn 34 àg/ml Bảng 3.16 Kết quả sắc ký của dung dịch chuẩn với 6 lần tiêm mẫu

Diện tích pic (mAU*min)

Hình 3.31 Sắc ký đồ đại diện của dung dịch thử Bảng 3.17 Kết quả sắc ký của dung dịch thử với 6 lần tiêm mẫu

STT Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic (mAU*min) Độ phân giải (Rs)

Kết quả khảo sát cho thấy tính tương thích của hệ thống sau 6 lần tiêm liên tiếp với mẫu thử và mẫu chuẩn, đạt độ lệch chuẩn tương đối (RSD) các thông số sắc ký không vượt quá 2% Hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 đến 1,5, trong khi số đĩa lý thuyết lớn hơn 2000.

Kết luận quy trình định lượng có tính tương thích hệ thống

Hình 3.32 Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu trẻn mẫu thử cao

Hình 3.33 Phổ UV của tilirosid trong dung dịch chuẩn

Hình 3.34 Phổ UV của tilirosid trong dung dịch thử

Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng được trình bày tại hình 3.32, 3.33, 3.34 cho thấy:

- Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của tilirosid

- Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chỉ xuất hiện pic của tilirosid với độ tinh khiết sắc ký đạt 97,99 %

- Sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu tương tự như thời gian lưu của tilirosid trong mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ của dung dịch thử thêm chuẩn cho diện tíc pic của tilirosid tăng lên rõ rệt

- Các pic của tilirosid trong mẫu chuẩn và thử đều đạt độ tinh khiết

Kết luận quy trình định lượng có tính đặc hiệu

Hình 3.35 Đường tuyến tính của chất đánh dấu tilirosid Bảng 3.18 Kết quả tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất đánh dấu tilirosid

STT Nồng độ tilirosid trong mẫu

Diện tích pic (mAU*min) - Y

Dùng công cụ Regression (MS-Excel) kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy và kiểm tra ý nghĩa của các hệ số hồi quy

Phương trình hồi quy của tilirosid: y = 380,61x - 279,94 với:

- Hệ số b có t = 1,06 < t0,05 = 2,45 nên hệ số b không có ý nghĩa

- Hệ số a có t = 67,96 > t0,05 = 2,45 nên hệ số a có ý nghĩa

Tính thích hợp của phương trình hồi quy: Có F = 4618,46 > F0,05 = 6,61 nên phương trình hồi quy thích hợp

Do đó phương trình hồi quy của tilirosid là y = 380,61x

Kết luận, hệ số tương quan R² = 0,9991 cho thấy phương pháp định lượng tilirosid trong cao An xoa đạt tính tuyến tính trong khoảng 7,5 - 80 µg/ml Phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ tilirosid và diện tích pic được xác định là y = 380,61x với R² = 0,9991.

Để đảm bảo tính chính xác trong quy trình phân tích, cần thực hiện tối thiểu 9 lần mẫu thử với các nồng độ khác nhau, cụ thể là 3 lần phân tích cho mỗi nồng độ ở 3 mức khác nhau.

Bảng 3.19 Kết quả sắc ký thẩm định độ lặp lại của phương pháp

Lượng cân mẫu thử (mg)

Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình được trình bày tại bảng 3.19 cho độ lệch chuẩn tương đối RSD của các kết quả định lượng < 2 %

Kết luận quy trình định lượng đạt độ lặp lại

- Độ chính xác trung gian

Bảng 3.20 Kết quả sắc ký thẩm định độ chính xác trung gian của phương pháp

Lượng cân mẫu thử (mg)

Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của quy trình cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các kết quả định lượng là dưới 2%.

Kết luận quy trình định lượng đạt độ chính xác trung gian

Bảng 3.21 Kết quả sắc ký thẩm định độ đúng của phương pháp

Lượng chất chuẩn thêm vào (mg)

Lượng tilirosid tìm lại (mg)

Điều chế cao An xoa

3.3.1 Xây dựng một số tiêu chuẩn dược liệu An xoa

3.3.1.1 Kiểm tra dược liệu An xoa

- Cảm quan: bột nhẹ, khô tơi, màu vàng, vị đắng

- Độ ẩm - tạp chất - tro toàn phần: tiến hành theo tiêu chuẩn DĐVN V Kết quả trình bày trong bảng 3.22

Bảng 3.22 Kết quả kiểm tra độ ẩm, tạp chất và tro toàn phần dược liệu Độ ẩm (%) Tạp chất (%) Tro toàn phần (%)

Phương pháp DĐVN V, phụ lục

Yêu cầu ≤ 10,0 ≤ 1 ≤ 5 Đánh giá Đạt Đạt Đạt

Kết luận: Nguyên liệu An xoa đạt theo tiêu chuẩn DĐVN V về chỉ tiêu độ ẩm, tạp chất và tro toàn phần

Thời gian lưu của tilirosid trong nguyên liệu An xoa phải trùng với thời gian lưu tilirosid phân lập được

Hình 3.36 Sắc ký đồ của chất đánh dấu tilirosid phân lập được

Hình 3.37 Sắc ký đồ của tilirosid trong nguyên liệu An xoa

Bảng 3.23 Kết quả định lượng tilirosid trong dược liệu An xoa Mẫu Hàm lượng tilirosid (%) Trung bình (%) RSD (%)

3.3.1.2 Xây dựng một số tiêu chuẩn cho dược liệu An xoa

Từ các kết quả kiểm nghiệm, nguyên liệu được đề xuất một số tiêu chuẩn chất lượng và được trình bày trong bảng 3.24

Bảng 3.24 Một số chỉ tiêu của dược liệu An xoa

3.3.2 Các thí nghiệm thăm dò

* Thăm dò phương pháp chiết

Bảng 3.25 Kết quả thăm dò phương pháp chiết Phương pháp Đun hồi lưu Ngấm kiệt

Tỷ lệ dịch chiết : dược liệu 4,5/1, thời gian đun

Tỷ lệ dịch chiết : dược liệu 4,5/1, thời gian ngâm lạnh

24 giờ, tốc độ rút dịch chiết

Hàm lượng tilirosid trung bình (%) 0,16 % 0,19 %

Kết quả thăm dò cho thấy, phương pháp ngấm kiệt chiết cây An xoa bằng dung môi ethanol 50% cho hàm lượng hoạt chất cao hơn so với phương pháp đun hồi lưu Vì vậy, phương pháp ngấm kiệt được chọn để nghiên cứu chiết xuất Đây là một đề tài mới trong lĩnh vực nghiên cứu.

STT Chỉ tiêu Yêu cầu Thực hiện

1 Độ ẩm Không quá 10% (DĐVN V) Theo PL 12.13,

2 Tạp chất Không quá 1% (DĐVN V) Theo PL 12.11,

3 Tro toàn phần Không quá 5% (DĐVN V) Theo PL 9.8,

Các đỉnh trong mẫu thử có thời gian lưu và phổ UV tương ứng với mẫu chuẩn

5 Định lượng Hàm lượng tilirosid không ít hơn 0,03 % HPLC, theo

Luận văn thạc sỹ dược học của Trần Ngọc Đan Thanh đã nghiên cứu nồng độ ethanol 50% và sẽ tiếp tục khám phá phương pháp đun hồi lưu với dung môi nước để nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

* Thăm dò nồng độ dung môi chiết

Bảng 3.26 Kết quả thăm dò nồng độ dung môi chiết Ngấm kiệt Ethanol 50 %

Hàm lượng tilirosid trung bình (%)

Hàm lượng hoạt chất chiết xuất bằng dung môi nước qua phương pháp đun hồi lưu thấp hơn so với các dung môi khác Sử dụng phương pháp ngấm kiệt, hàm lượng dịch chiết ethanol 50% có sự khác biệt thống kê so với dịch chiết ethanol 96%, cho thấy nồng độ ethanol ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất.

* Thăm dò tỉ lệ dịch chiết : dược liệu

Bảng 3.27 Kết quả thăm dò tỉ lệ dịch chiết : dược liệu

Hàm lượng tilirosid trung bình khi ngấm kiệt với ethanol 50 % (%)

Hàm lượng hoạt chất trong dịch chiết từ tỷ lệ 4:1 của dược liệu có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p

Tiêu đề	Study on isolation, quantitative determination of flavonoid in plant and extract from helicteres hirsuta lour.
Tác giả	Trần Ngọc Đan Thanh
Người hướng dẫn	PGS. TS Ngụ Thị Thanh Diệp, PGS. TS Trần Anh Vũ
Trường học	Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Thể loại	Luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	146
Dung lượng	7,06 MB