Tiêu chuẩn hóa cao khô dành dành, cao khô đỗ trọng và viên nén 2 thành phần dành dành – đỗ trọng

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2016 - 2018TIÊU CHUẨN HÓA CAO KHÔ DÀNH DÀNH, CAO KHÔ ĐỖ TRỌNG VÀ VIÊN NÉN 2 THÀNH PHẦN DÀNH DÀNH – ĐỖ TRỌNG Tr n Thanh Tâm Th y hư ng d n: PGS TS Nguy n Đức Tuấn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Học viên

Tr n Thanh Tâm

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2016 - 2018

TIÊU CHUẨN HÓA CAO KHÔ DÀNH DÀNH, CAO KHÔ ĐỖ TRỌNG VÀ VIÊN

NÉN 2 THÀNH PHẦN DÀNH DÀNH – ĐỖ TRỌNG

Tr n Thanh Tâm

Th y hư ng d n: PGS TS Nguy n Đức Tuấn

Từ khóa: Eucommia ulmoides Oliv., Gardenia jasminoides Ellis , viên n n thành ph n

Dành dành – Đ trọng, geniposid, pinoresinol diglucosid

Mở đầu: Đ trọng Eucommia ulmoides Oliv , và Dành dành Gardenia jasminoides

Ellis , là dược liệu n i tiếng, được s dụng từ bao đ i nay v i tác dụng đi u tr tănghuyết áp Tuy nhiên, cho đến nay chưa c công trình nghiên cứu nào công bố v việc xâydựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Dành dành và cao khô Đ trọng, một yêu c u bắt buộctrong công tác kiểm tra chất lượng nguyên liệu đ u vào của quy trình sản xuất các chếphẩm từ Dành dành và Đ trọng Đ ng th i, chưa c công trình nghiên cứu quy trình đ nhlượng đ ng th i geniposid và pinoresinol diglucosid trong chế phẩm thành ph n Dành

dành – Đ trọng được công bố Xuất phát từ những lý do trên, đ tài “Tiêu chuẩn hóa cao khô Dành dành, cao khô Đỗ trọng và viên nén 2 thành phần Dành dành - Đỗ trọng”

được thực hiện

Đối tượng v phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: cao khô Dành dành, cao khô Đ trọng và viên n n thành ph n

Dành dành – Đ trọng

Phương pháp nghiên cứu: xây dựng quy trình đ nh lượng geniposid trong cao khô Dành

dành, xây dựng quy trình đ nh lượng pinoresinol trong cao khô Đ trọng và xây dựng quytrình đ nh lượng đ ng th i geniposid và pinoresinol diglucosid trong viên n n thành ph nDành dành – Đ trọng b ng phư ng pháp HPLC – D D Tiêu chuẩn h a cao khô Dànhdành, cao khô Đ trọng và viên n n thành ph n Dành dành – Đ trọng

Kết quả: đã xây dựng quy trình đ nh lượng geniposid trong cao Dành dành, quy trình đ nh

lượng pinoresinol trong cao Đ trọng và quy trình đ nh lượng đ ng th i geniposid vàpinoresinol diglucosid trong viên n n thành ph n Dành dành – Đ trọng b ng phư ngpháp HPLC – D D Cả quy trình trên đ u được thẩm đ nh và đạt yêu c u theo hư ng

d n của ICH Đ tài đã xây dựng dự thảo tiêu chuẩn c s cao khô Dành dành, cao khô Đtrọng và viên n n thành ph n Dành dành – Đ trọng

Kết luận: v i các kết quả thực hiện được, đ tài g p ph n vào công tác đảm bảo chất

lượng từ khâu nguyên liệu đến sản phẩm đưa ra th trư ng, đảm bảo an toàn và hiệu quả

đi u tr

Master’s thesis – Academic course: 2016 – 2018

STANDARDIZATION OF EUCOMMIA ULMOIDES DRY EXTRACT,

GARDENIA JASMINOIDES DRY EXTRACT AND TWO COMPONENT EUCOMMIA ULMOIDES-GARDENIA JASMINOIDES TABLET

Tran Thanh TamSupervisor: PhD ssoc Prof Nguyen Đuc Tuan

Keywords: Eucommia ulmoides Oliv., Gardenia jasminoides Ellis., two components

Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet, geniposid, pinoresinol diglucosid.

Introduction: Eucommia ulmoides Oliv., and Gardenia jasminoides Ellis., which are two

famous herbal medicine, have been used for treatment of hypertension for many years ago.Nervertheless, there has not been any researches about constructing quality standard for

dry extract of Eucommia ulmoides Oliv., and Gardenia jasminoides Ellis., a compulsory

requirement for assessment of materials, used to manufacture tablet Moreover, there hasbeen no published guidelines for the simultaneous determination of these two herbals’

markers in two components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet so far.

Therefore, the study “Standardization of Eucommia ulmoides dry extract, Gardenia jasminoides dry extract and two components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet” was done.

Materials and methods

Materials: Eucommia ulmoides dry extract, Gardenia jasminoides dry extract and two

components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet.

Methods: Develop method for determination geniposid in Gardenia jasminoides dry

extract, method for determination pinoresinol diglucosid in Eucommia ulmoides dry

extract, method for simultaneous determination geniposid and pinoresinol diglucosid in

two components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet by HPLC-DAD Standardization of Eucommia ulmoides dry extract, Gardenia jasminoides dry extract and two components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet.

Results: Qualification method of geniposid in Gardenia jasminoides dry extract,

qualification method of pinoresinol diglucosid in Eucommia ulmoides dry extract,

simultaneous qualification method of geniposid and pinoresinol diglucosid in two

components Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet by HPLC-DAD were

developed These methods were validated according to ICH guidelines Quality procedures

of Eucommia ulmoides dry extract, Gardenia jasminoides dry extract and two components

Eucommia ulmoides-Gardenia jasminoides tablet were also established.

Conclusion: These established standards will be applied for quality procedure of both raw

materials and product, ensuring safety and effective treatment

MỤC ỤC

Trang

ỜI CAM ĐOAN i

MỤC ỤC iv

DANH MỤC C C K HI U, C C CH VI T TẮT vii

DANH MỤC C C BẢNG ix

DANH MỤC C C HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1 1 D C LIỆU DÀNH DÀNH 3

Mô tả và phân loại 3

1.1.1 Phân bố, sinh thái 4

1.1.2 Bộ phận dùng 4

1.1.3 Thành ph n hóa học 4

1.1.4 Tác dụng dược lý 4

1.1.5 Công dụng 6

1.1.6 1.2 GENIPOSID 6

Tính chất lý hóa 6

1.2.1 Tác dụng dược lý 7

1.2.2 Một số phư ng pháp đ nh lượng geniposid (GP) trong quả Dành dành 7

1.2.3 1.3 D C LIỆU ĐỖ TR NG 11

Mô tả và phân loại 11

1.3.1 Phân bố, sinh thái 11

1.3.2 Bộ phận dùng 12

1.3.3 Thành ph n hóa học 12

1.3.4 Tác dụng dược lý 13

1.3.5 Công dụng 13

1.3.6 1.4 PINORESINOL DIGLUCOSID 14

Tính chất lý hóa 14 1.4.1

Tác dụng dược lý 14

1.4.2 Một số phư ng pháp đ nh lượng pinoresinol diglucosid (PDG) trong vỏ 1.4.3 thân Đ trọng 15

Một số phư ng pháp đ nh lượng đ ng th i GP và PDG trong vỏ thân Đ 1.4.4 trọng 19

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU 22

2.1 ĐỐI T NG NGHIÊN C U 22

2.2 NGUYÊN V T LIỆU 23

2.2.1 Chất đối chiếu 23

2.2.2 Dung môi, hóa chất 23

2.2.3 Dụng cụ và trang thiết b 23

2.3 NƠI NGHIÊN C U 24

2.4 PH ƠNG PHÁP NGHIÊN C U 24

2.4.1 Xây dựng quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành 24

2.4.2 Xây dựng quy trình đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng 28

2.4.3 Xây dựng quy trình đ nh lượng GP và PDG trong viên nén 2 thành ph n Dành dành – Đ trọng 30

2.4.4 Tiêu chuẩn hóa cao khô Dành dành 34

2.4.5 Tiêu chuẩn h a cao khô Đ trọng 36

2.4.6 Tiêu chuẩn hóa viên nén 2 thành ph n cao khô Dành dành và cao khô Đ trọng 38

CHƯƠNG 3 - K T QUẢ NGHIÊN CỨU 41

1 Xây dựng quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành 41

Khảo sát đi u kiện sắc ký 41

3.1.1 Khảo sát đi u kiện x lý m u cao khô Dành dành để đ nh lượng GP 42

3.1.2 Thẩm đ nh quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành (Phụ lục 1) 3.1.3 45

3.2 Xây dựng quy trình đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng 49

Khảo sát đi u kiện sắc ký 49 3.2.1

Khảo sát đi u kiện x lý m u cao khô Đ trọng để đ nh lượng PDG 523.2.2.

Thẩm đ nh quy trình đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng Phụ lục 553.2.3

3.3 Xây dựng quy trình đ nh lượng GP và PDG trong viên n n thành ph n Dànhdành – Đ trọng 61

Khảo sát đi u kiện sắc ký 613.3.1

Khảo sát đi u kiện x lý m u đ nh lượng đ ng th i GP và PDG 623.3.2

Thẩm đ nh quy trình đ nh lượng đ ng th i GP và PDG trong viên n n3.3.3

thành ph n Dành dành - Đ trọng Phụ lục 65 Tiêu chuẩn hóa cao khô Dành dành (Phụ lục 7) 723.3.4

Tiêu chuẩn h a cao khô Đ trọng Phụ lục 8 763.3.5

Tiêu chuẩn hóa viên nén 2 thành ph n Dành dành – Đ trọng Phụ lục 9 803.3.6

CHƯƠNG 4 - BÀN UẬN 86

4 1 Xây dựng quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành 86

Khảo sát đi u kiện sắc ký 864.1.1

Khảo sát đi u kiện x lý m u cao khô Dành dành để đ nh lượng GP 864.1.2

4.2 Xây dựng quy trình đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng 87

Khảo sát đi u kiện sắc ký 874.2.1

Khảo sát đi u kiện x lý m u cao khô Đ trọng để đ nh lượng PDG 884.2.2

4.3 Xây dựng quy trình đ nh lượng GP và PDG trong viên n n thành ph n Dànhdành – Đ trọng 89

Khảo sát đi u kiện sắc ký 894.3.1

Khảo sát đi u kiện x lý m u đ nh lượng đ ng th i GP và PDG 894.3.2

4.4 Tiêu chuẩn hóa cao khô Dành dành, cao khô Đ trọng và viên n n thành

ph n Dành dành – Đ trọng 90

K T UẬN 92

KI N NGHỊ 92 TÀI I U THAM KHẢO

PHỤ ỤC

CP Chinese pharmacopoeia Dược điển Trung QuốcDAD Diode array detector Đ u d dãy diod quangDĐVN Dược điển Việt Nam

ICH International conference on

harmonisation

Hội ngh quốc tế v sự đ ngthuận

HPLC High performmance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Limit of detection Gi i hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification Gi i hạn đ nh lượng

PDG Pinoresinol diglucosid

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tư ng đối

Ký hiệu, ch

viết tắt

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

UV – Vis Ultra Violet – Visible T ngoại – Khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 1 Chư ng trình r a giải geniposid theo Bergonzi M C và cộng sự 10

Bảng 1 2 Chư ng trình r a giải PDG theo DĐVN V 16

Bảng 1 3 Chư ng trình r a giải PDG theo BP 17 17

Bảng 1 4 Th i gian lưu các pic theo Hilderbert Wagner 18

Bảng 1.5 Chư ng trình r a giải đ ng th i GP và PDG theo Bing Tian Zhao và cộng sự 19

Bảng 1 6 Chư ng trình r a giải đ ng th i GP và PDG theo Xin Chai và cộng sự 20 Bảng 2 1 Chất đối chiếu s dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2 2 Danh mục dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu 23

Bảng 2 3 Dụng cụ, trang thiết b s dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 3 1 Thông số sắc ký của GP tư ng ứng v i cột sắc ký khảo sát (n=3) 42

Bảng 3 2 Thông số sắc ký của GP tư ng ứng v i dung môi chiết khảo sát (n=3) 43

Bảng 3 3 Thông số sắc ký của GP tư ng ứng v i tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau (n=3) 43

Bảng 3 4 Thông số sắc ký của GP tư ng ứng v i th i gian chiết khác nhau (n=3) 44 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát t nh ph hợp hệ thống trên m u đối chiếu GP và m u th (n=6) 45

Bảng 3 6 Kết quả khảo sát t nh tuyến t nh GP 46

Bảng 3 7 Kết quả thẩm đ nh độ l p lại và độ ch nh xác trung gian của quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành n=9 47

Bảng 3 8 Kết quả thẩm đ nh độ đ ng của quy trình đ nh lượng GP trong cao khô Dành dành (n=9) 48

Bảng 3 9 Thông số sắc ký của GP trong thẩm đ nh độ b n n= 49

Bảng 3 1 Các thông số sắc ký tư ng ứng v i các chư ng trình pha động đ nh lượng PDG được khảo sát 50

Bảng 3 11 Thông số sắc ký của PDG tư ng ứng v i dung môi chiết khảo sát (n=3) 52

Bảng 3 12 Thông số sắc ký của PDG tư ng ứng v i tỷ lệ cao và dung môi chiết

khác nhau (n=3) 54

Bảng 3 13 Thông số sắc ký của PDG tư ng ứng v i th i gian chiết khác nhau (n=3) 55

Bảng 3 14 Kết quả khảo sát t nh ph hợp hệ thống trên m u đối chiếu PDG và m u th (n=6) 55

Bảng 3 15 Kết quả khảo sát t nh tuyến t nh PDG 57

Bảng 3 16 Kết quả thẩm đ nh độ l p lại và độ ch nh xác trung gian của quy trình đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng n=9 58

Bảng 3 17 Kết quả thẩm đ nh độ đ ng của quy trình đ nh lượng PDG trong cao khô Đ trọng n=9 59

Bảng 3 18 Chư ng trình pha động khảo sát độ b n quy trình đ nh lượng PDG 60

Bảng 3 19 Thông số sắc ký của PDG trong thẩm đ nh độ b n n=3) 60

Bảng 3 2 Các chư ng trình pha động đ nh lượng đ ng th i GP và PDG 61

Bảng 3 21 Thông số sắc ký của GP và PDG tư ng ứng v i tỷ lệ bột thuốc và dung môi chiết khác nhau (n=3) 63

Bảng 3 22 Thông số sắc ký của GP và PDG tư ng ứng v i th i gian chiết khác nhau (n=3) 64

Bảng 3 23 Kết quả khảo sát t nh ph hợp hệ thống trên m u đối chiếu và m u th (n=6) 65

Bảng 3 24 Kết quả khảo sát t nh tuyến t nh GP và PDG 67

Bảng 3 25 Kết quả độ l p lại và độ ch nh xác trung gian quy trình đ nh lượng 68

Bảng 3 26 Kết quả thẩm đ nh độ đ ng của quy trình đ nh lượng GP và PDG 69

Bảng 3 27 Kết quả khảo sát LOD và LOQ của GP và PDG n=6 70

Bảng 3 28 Chư ng trình pha động khảo sát độ b n quy trình đ nh lượng đ ng th i GP và PDG trong chế phẩm 70

Bảng 3 29 Thông số sắc ký của GP và GDP trong thẩm đ nh độ b n n=3) 71

Bảng 3 3 Kết quả mất khối lượng do làm khô cao Dành dành n=6 72

Bảng 3 31 Kết quả tro không tan trong acid hydrocloric cao Dành dành n=6 72

Bảng 3 32 Kết quả tro toàn ph n cao Dành dành n=6 72

Bảng 3 33 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn cao Dành dành n=6 73

Bảng 3 34 Kết quả th gi i hạn kim loại n ng cao Dành dành n=6 74

Bảng 3 35 Kết quả đ nh t nh GP trong cao Dành dành b ng HPLC n=6 75

Bảng 3 36 Kết quả đ nh lượng GP trong cao Dành dành n=6 75

Bảng 3 37 T m tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Dành dành 75

Bảng 3 38 Kết quả xác đ nh mất khối lượng do làm khô cao Đ trọng n=6 76

Bảng 3 39 Kết quả tro không tan trong acid hydrocloric cao Đ trọng n=6 76

Bảng 3 4 Kết quả tro toàn ph n cao Đ trọng n=6 77

Bảng 3 41 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn của lô cao Đ trọng n=6 77

Bảng 3 42 Kết quả th gi i hạn kim loại n ng cao Đ trọng n=6 78

Bảng 3 43 Kết quả đ nh t nh PDG trong cao Đ trọng b ng HPLC n=6 79

Bảng 3 44 Kết quả đ nh lượng PDG trong cao Đ trọng n=6 80

Bảng 3 45 T m tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Đ trọng 80

Bảng 3.46 Kết quả th độ rã viên thành phẩm 81

Bảng 3 47 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn viên thành phẩm n=6 82

Bảng 3 48 Kết quả đ nh t nh GP và PDG trong viên thành phẩm b ng HPLC n=6 83

Bảng 3 49 Kết quả th độ đ ng đ u hàm lượng GP và PDG trong viên thành phẩm 83

Bảng 3 5 T m tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên n n thành ph n Dành dành – Đ trọng 84

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Trang

H nh 1 1 Dành dành Gardenia jasminoides Ellis) 3

H nh 1 2 Công thức cấu tạo geniposid 6

H nh 1.3 Sắc ký đ dung d ch chuẩn GP và dung d ch th bột quả Dành dành 8

H nh 1 4 Sắc ký đ dung d ch chuẩn GP và dung d ch th bột quả Dành dành 9

H nh 1 5 Sắc ký đ dung d ch th bột quả Dành dành theo Bergonzi M.C 10

H nh 1 6 Đ trọng (Eucommia ulmoides Oliv) 11

H nh 1 7 Công thức cấu tạo pinoresinol diglucosid 14

H nh 1 8 Sắc ký đ dung d ch th bột vỏ thân Đ trọng theo Hilderbert Wagner 18

H nh 1 9 Sắc ký đ dung d ch chuẩn và dung d ch th bột vỏ thân Đ trọng theo Tian Zhao 19

H nh 1 1 Sắc ký đ UPLC dung d ch chuẩn và dung d ch th bột vỏ thân Đ trọng theo Xin Chai 21

H nh 3 1 Sắc ký đ m u đối chiếu, m u th và ph UV tại th i gian lưu của GP 41 H nh 3 2 Sắc ký đ m u th khảo sát cột sắc ký 42

H nh 3 3 Hàm lượng GP chiết được v i các dung môi chiết khác nhau 42

H nh 3 4 Hàm lượng GP chiết được v i tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau 43

H nh 3 5 Hàm lượng GP chiết được v i th i gian chiết khác nhau 44

H nh 3 6 Kết quả khảo sát t nh chọn lọc của phư ng pháp đ nh lượng GP 46

H nh 3 7 Sắc ký đ m u th cao Dành dành trong thẩm đ nh độ b n 49

H nh 3 8 Ph UV tại th i gian lưu PDG của m u đối chiếu 49

H nh 3 9 Sắc ký đ m u th v i các pha động đ nh lượng PDG được khảo sát 52

H nh 3 1 Hàm lượng PDG chiết được v i các dung môi khác nhau 52

H nh 3 11 Hàm lượng PDG chiết được v i các tỷ lệ cao và dung môi khác nhau 53 H nh 3 12 Sắc ký đ d ch chiết cao Đ trọng 53

H nh 3 13 Hàm lượng PDG chiết được v i th i gian siêu âm khác nhau 54

H nh 3 14 Sắc ký đ khảo sát t nh chọn lọc phư ng pháp đ nh lượng PDG 56

H nh 3 15 Sắc ký đ m u th cao Đ trọng trong khảo sát độ b n 60

H nh 3 16 Sắc ký đ m u th v i các pha động đ nh lượng đ ng th i GP và PDG

được khảo sát 62

H nh 3 17 Hàm lượng GP và PDG chiết được v i tỷ lệ bột thuốc và dung môi chiết khác nhau 63

H nh 3 18 Hàm lượng GP và PDG chiết được v i th i gian chiết khác nhau 64

H nh 3 19 Sắc ký đ khảo sát t nh chọn lọc phư ng pháp đ nh lượng đ ng th i GP và PDG trong chế phẩm 66

H nh 3 2 Sắc ký đ khảo sát LOD và LOQ của GP và PDG 69

H nh 3 21 Sắc ký đ m u th chế phẩm trong khảo sát độ b n 71

H nh 3 22 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn cao Dành dành 73

H nh 3 23 Kết quả th gi i hạn kim loại n ng cao Dành dành 74

H nh 3 24 Sắc ký đ SKLM đ nh t nh GP trong cao Dành dành 74

H nh 3 25 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn cao Đ trọng 78

H nh 3 26 Gi i hạn kim loại n ng cao Đ trọng 78

H nh 3 27 Sắc ký đ đ nh t nh PDG trong cao Đ trọng b ng SKLM 79

H nh 3 28 Kết quả th gi i hạn nhi m khuẩn viên thành phẩm 81

H nh 3 29 Sắc ký đ SKLM đ nh t nh GP và PDG trong viên thành phẩm 82

MỞ ĐẦU

Từ bao đ i nay, dược liệu rất g n gũi và gắn b v i đ i sống con ngư i: từ nguyênliệu, gia v của những m n ăn h ng ngày, cho đến thành ph n không thể thiếu củacác loại nư c hoa, m phẩm làm đ p và đ c biệt dược liệu như một ngư i bạn đ nghành, trợ thủ đắc lực cho các th y thuốc trong việc đi u tr bệnh và chăm s c sứckhỏe Ngày nay, trư c những tác dụng phụ cũng như hậu quả c khi rất nghiêmtrọng của thuốc h a dược, vai tr của các loại thuốc c ngu n gốc tự nhiên rất đượcquan tâm và ch ý b i vì t nh hiệu quả cũng như độ an toàn từ kinh nghiệm s dụngqua hàng trăm năm H n thế nữa, dư i sự phát triển của khoa học k thuật và y họchiện đại, các tác dụng và c chế đi u tr của dược liệu đang ngày càng sáng tỏ h nnữa, và xu hư ng – “quay tr v v i thiên nhiên” ngày càng mạnh mẽ h n

Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis., Rubiaceae), một loài cây được tr ng và

phát triển rất tốt các tỉnh mi n Bắc nư c ta, n i bật b i màu lá xanh b ng và hoa

th m trắng ng n Đ c biệt, quả Dành dành v i thành ph n h a học đ c trưng là cáciridoid glycosid (trong đ hoạt chất c hàm lượng cao là geniposid và gardenosid

đã được s dụng từ lâu đ i như một phư ng thuốc quý trong việc đi u tr các bệnhnhư viêm gan, hạ huyết áp, đái tháo đư ng, lợi tiểu…

Đ trọng (Eucommia ulmoides Oliv., Eucommiaceae) là một v thuốc c truy n

được biết đến v i tác dụng đi u tr tăng huyết áp và là thành ph n của nhi u bàithuốc dân gian chữa đau nhức lưng, đau nhức kh p gối, động thai,… Các nghiêncứu v h a học, dược lý cho thấy lignan chủ yếu là pinoresinol diglucosid vàiridoid là hai nh m hoạt chất chính cho các tác dụng của dược liệu Đ trọng

Ở ngư i bệnh tăng huyết áp, lượng muối và nư c dư thừa trong c thể khiến thànhđộng mạch ch u thêm nhi u áp lực Dành dành v i tác dụng lợi tiểu sẽ tác động đếnthận nh m tăng lượng muối và nư c thải ra khỏi c thể qua đư ng tiểu g p ph nvào hiệu quả đi u tr tăng huyết áp của dược liệu Đ trọng Vì vậy, việc nghiên cứucông thức bào chế và tiêu chuẩn h a viên n n phối hợp hai thành ph n cao khô Đtrọng và cao khô Dành dành là c n thiết

Hiện nay, DĐVN V đã quy đ nh chỉ tiêu đ nh lượng hoạt chất geniposid trong dượcliệu Dành dành và pinoresinol diglucosid trong dược liệu Đ trọng Tuy nhiên, chođến nay chưa c công trình nghiên cứu nào công bố v việc xây dựng tiêu chuẩnchất lượng cho cao khô Dành dành và cao khô Đ trọng, một yêu c u bắt buộc chocông tác kiểm tra chất lượng nguyên liệu đ u vào của quy trình sản xuất các chếphẩm từ Dành dành và Đ trọng Đ ng th i, chưa c công trình nghiên cứu quytrình đ nh lượng đ ng th i geniposid và pinoresinol diglucosid trong chế phẩmthành ph n Dành dành – Đ trọng được công bố Xuất phát từ những lý do trên, đ

tài “Tiêu chuẩn hóa cao khô Dành dành, cao khô Đỗ trọng và viên nén 2 thành

phần Dành dành - Đỗ trọng” được thực hiện v i những mục tiêu cụ thể sau:

- Tiêu chuẩn h a cao khô Dành dành

- Tiêu chuẩn h a cao khô Đ trọng

- Tiêu chuẩn h a viên n n thành ph n Dành dành – Đ trọng

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN1.1 DƯỢC LI U DÀNH DÀNH

H nh 1.1 Dành dành Gardenia jasminoides Ellis)

(A) Hoa và lá Dành dành; (B) Quả Dành dành khô

Tên khoa học: Gardenia jasminoides Ellis

Tên đ ng nghĩa: Gardenia florida L.

Tên khác: Chi t , mác làng cư ng Tày

Tên nư c ngoài: Cape jasmine (Anh)

Mô tả và phân loại

1.1.1.

Cây cỏ, cao 1 - m, xanh tốt quanh năm, phân nhánh nhi u Cành màu nâu nhẵn, c

kh a rãnh dọc Lá mọc đối hay mọc v ng , dày, hình thuôn, trái xoan Hoa to, màutrắng ho c trắng ngà, rất th m Quả hình trứng, c đài t n tại đỉnh, khi chín cmàu vàng, th t quả màu vàng cam, hạt d t, quả nhi u hạt [3]

Phân bố, sinh thái

1.1.2.

Chi Gardenia c khoảng 7 loài trên thế gi i, phân bố rộng rãi v ng nhiệt đ i và

cận nhiệt đ i châu Á và châu Phi Ở Việt Nam c 1 loài, phân bố khắp các tỉnh

đ ng b ng và trung du nhưng tập trung chủ yếu các tỉnh Hải Dư ng, Hưng Yên,Thái Bình, Hà Nam, Nam Đ nh, Ninh Bình, Thanh H a, Nghệ n và Hà Tĩnh Dànhdành ưa ẩm, ưa sáng và c thể ch u b ng, thư ng mọc đất ẩm, g n ngu n nư cnhư b ao, b kênh rạch hay b suối thành bụi l n, đôi khi gốc ngập chìm trong

Lá: thu hái quanh năm, d ng lá tư i [3]

là chất đánh dấu của dược liệu Dành dành [17]

- Các acid hữu c : cid picrocrocinic, acid dicafeoyl - 5 - (3 - hydroxy - 3 - methylglutaroyl quinic, acid 3 - cafeoyl - 4 - sinapoyl quinic [3]

- Các sắc tố : α - Crocin, α – crocetin [3]

Lá chứa một iridoid duy nhất là cerbinal [3]

Hoa chứa một steroid là acid gardenolic B, chất cycloartan triterpenoid là acidgardenic và acid gardenolic B và tinh d u trong đ c benzyl acetat,hydroxycitronelal và eugenol [3]

Tác dụng dƣợc lý

1.1.5.

Tác dụng lợi mật: D ch chiết c n từ quả chứa các chất crocin, crocetin và genipin

đ u làm tăng sự tiết mật Thí nghiệm trên thỏ đã thắt ống d n mật chủ cho thấy cao

c n, cao nư c của quả Dành dành đ u c tác dụng ức chế sự gia tăng bilirubin trongmáu [3].

Tác dụng ức chế sự tiết dịch vị và hoạt động dạ dày - ruột: Trên chuột cống thắt

môn v , genipin được cho thẳng vào hoành tá tràng v i li u 5 mg/kg làm giảm sựtiết d ch v Tác dụng này b ng khoảng 1/5 – 1/1 tác dụng của atropin sulfat B ng

đư ng tiêm tĩnh mạch, genipin (li u 5 mg/kg), gardenosid (li u 1 mg/kg) đ u ctác dụng ức chế co b p do pilocarpin gây nên [3]

Đối với hệ thần kinh trung ương: Th nghiệm trên chuột nhắt trắng tiêm xoang bụng

cao c n quả Dành dành v i li u 5,69 g/kg c tác dụng gây trấn tĩnh, làm giảm hoạtđộng tự nhiên của chuột, c tác dụng hợp đ ng v i phenobarbital kéo dài th i gianngủ Khi tiêm xoang bụng chuột nhắt trắng d ch chiết c n quả Dành dành sau một

gi xuất hiện tác dụng hạ thân nhiệt Tác dụng này k o dài trong nhi u gi [3]

Tác dụng giảm đau: Th nghiệm trên chuột nhắt trắng v i phư ng pháp gây qu n

đau b ng cách tiêm acid acetic, các hoạt chất genipin, gardenosid và dạng chiết

nư c quả Dành dành đ u c tác dụng giảm đau một cách rõ rệt, giảm số l n qu nđau của chuột [3]

Tác dụng hạ huyết áp: Nư c sắc và d ch chiết c n quả Dành dành th nghiệm trên

mèo, thỏ, chuột cống, dùng b ng đư ng uống, tiêm xoang bụng hay tĩnh mạch đ u

c tác dụng làm hạ huyết áp Tác dụng này xuất hiện trong th i gian ngắn [3]

Tác dụng đối với tim: Trên tim ếch cô lập, d ch chiết quả Dành dành làm giảm sức

co b p c tim D ch chiết methanol quả Dành dành tiêm tĩnh mạch cho chuột cốngtrắng v i li u 1 g/kg theo dõi trên điện tâm đ cho thấy c dấu hiệu của t n thư ng

c tim và d n truy n nhĩ thất b phong bế [3]

Ảnh hưởng đối với cholesterol máu: Trên mô hình thỏ được nuôi b ng thức ăn c

1% cholesterol còn crocetin cứ ngày 1 l n tiêm bắp v i li u 5 µg/kg, kết quả chothấy hàm lượng cholesterol trong huyết thanh lô d ng thuốc giảm 5 % so v i lôkhông d ng thuốc, c n lượng triglycerid lô d ng thuốc v n duy trì được mứcbình thư ng trong khi đ lô không dùng Dành dành tăng % [3]

Tác dụng kháng khu n chống viêm: B ng phư ng pháp đục l khuyếch tán thuốc

trong môi trư ng nuôi cấy, quả Dành dành c tác dụng ức chế sự phát triển của tụ

c u khuẩn vàng và não mô c u Th nghiệm trên ống k nh, nư c ngâm quả Dànhdành c tác dụng ức chế một số nấm gây bệnh ngoài da D ch chiết b ng ethanol vàmethanol từ quả Dành dành c tác dụng chống viêm [3]

Tác dụng gây tiêu chảy: Các chất gardenosid, geniposid đ u c tác dụng gây tiêu

chảy, trên chuột nhắt trắng li u c hiệu lực 5 % - ED50 của gardenosid là 0mg/kg và ED50 của geniposid > 800 mg/kg [3]

C ng dụng

1.1.6.

Dành dành là một v thuốc được d ng từ lâu trong y học c truy n để hạ sốt, b n

ch n kh ngủ, vàng da, huyết nhiệt, tiểu tiện kh khăn, mắt đỏ đau, miệng khátQuả Dành dành sao đen c tác dụng chỉ huyết, lư ng huyết d ng chữa chảy máucam, nôn ra máu, đái ra máu, băng lậu Li u d ng: Ngày d ng 6 - 1 g dư i dạng

nư c sắc ho c hoàn tán D ng ngoài, Dành dành giã nát đắp lên ch sưng đau, chữabong gân, vết thư ng [3]

- Ph UV: λmax = 236,5 nm (ethanol) [18], λmax = 239 nm [16]

H nh 1.2 Công thức cấu tạo geniposid

Tác dụng dược lý

1.2.2.

Nhi u nghiên cứu đã chứng minh r ng geniposid có ti m năng trong tr liệu bệnhhen suyển vì c khả ức chế cả 5-lipoxygenase và cảm ứng ovalbumin Bên cạnh đ ,geniposid cũng c tác dụng chống lại tác nhân gây ung thư là 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate sẽ k ch hoạt protein kinase C cũng như tác dụngkháng angiogenic [10]

Theo Hou Y.C và cộng sự, quả Dành dành v i thành ph n ch nh geniposid - mộtiridoid glucosid, là một thuốc c truy n n i tiếng của Trung Quốc d ng đi u tr cácbệnh v da, các bệnh v gan, viêm màng kết cấp t nh, huyết niệu [9]

Một số phương pháp định lượng geniposid (GP) trong quả Dành dành 1.2.3.

1.2.3.1 Theo CP 2015 [17]

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch thử: Cân chính xác 0,1 g bột quả Dành dành vào bình nón n t mài, thêm

5 ml methanol, cân, siêu âm ph t, cân lại, b sung lượng methanol, bay h i, lắc,lọc H t ch nh xác 1 ml d ch lọc vào bình đ nh mức 5 ml, b sung methanol đếnvạch

Dung dịch chu n: Hòa tan lượng ch nh xác chuẩn GP v i methanol để thu được

Dung dịch thử: Cân chính xác 0,2 g bột dược liệu qua rây số 5 vào bình n n n t

mài, thêm ch nh xác 5 ml methanol, đậy n t bình và cân xác đ nh khối lượng Lắcsiêu âm trong 1 gi , để nguội và cân lại, b sung methanol để được khối lượng ban

đ u, lắc đ u và ly tâm D ch ly tâm được lọc qua màng lọc ,45 μm

Dung dịch chu n: Hòa tan geniposid chuẩn trong methanol để được dung d ch c

n ng độ ch nh xác khoảng ,1 mg/ml

Điều kiện sắc ký: Cột C18 5 x 4,6 mm; 5 μm ; Bư c s ng phát hiện: 4 nm;

Phương pháp chiết siêu âm: Cân khoảng 1, g bột quả, thêm một lượng dung môi

chiết xuất th ch hợp, ngâm 30 phút, sau đ siêu âm t n số 4 KHz, d ch chiếtđược lọc qua màng lọc ,45 μm

Phương pháp chiết hồi lưu: Cân 5, g bột quả, thêm 5 ml nư c, đun h i lưu 9

oC trong gi , lọc, chiết lại bã dược liệu 1 l n nữa v i c ng đi u kiện D ch chiếtđược lọc qua màng lọc ,45 μm

Phương pháp chiết với sự hỗ trợ của vi sóng: Cân 5, g bột quả, thêm 5 ml nư c,

chiết 1 ph t, d ch chiết được lọc qua màng lọc ,45 μm

Điều kiện sắc ký: Hệ thống sắc ký Waters alliance 695 – đ u d PD 996; Cột

sắc ký: SunFire 15 x 4,6 mm; 5 μm ; Pha động: CN – H2O 15:85, tt/tt ; Tốc độ

d ng: 1, ml/ph t; Thể t ch tiêm: 5 μl; Nhiệt độ cột: oC; Bư c s ng phát hiện:

238 nm

H nh 1.3 Sắc ký đ dung d ch chuẩn GP và dung d ch th bột quả Dành dành

theo Xin-Sheng Wang

1.2.3.4 Theo Toshiyuki Oshima và cộng sự [21]

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch thử: Cân khoảng ,5 g bột quả Dành dành, thêm 15 ml h n hợp methanol

– nư c (1:1, tt/tt , đun h i lưu 85 oC, làm nguội, ly tâm tốc độ 1600 vòng/phút,gạn lấy d ch chiết, chiết bã dược liệu thêm l n nữa v i c ng đi u kiện Gom d ch

chiết lại cho vào bình đ nh mức 5 ml, b sung đến vạch b ng h n hợp methanol –

nư c (1:1, tt/tt)

Dung dịch chu n geniposid: Xây dựng đư ng chuẩn GP (1,0 – 5 μg/ml ,

gardenosid (0,25 – 1 μg/ml , acid geniposid (0,2 – 1 μg/ml , genipin–1–β–gentiobiosid (1,0 – 500) trong h n hợp methanol – nư c 1:1, tt/tt)

Điều kiện sắc ký: Hệ thống HPLC Shimadzu Model LC6A; Cột sắc ký: ODS

-TSK gel LS-410 (150 x 4,6 mm; 5 μm); Pha động: nư c – methanol – acidphosphoric (870:130:1, tt/tt/tt); Tốc độ d ng: 1,0 ml/phút; Nhiệt độ cột: 5 oC;

Bư c s ng phát hiện: 238 nm; Thể t ch tiêm: 1 μl

H nh 1.4 Sắc ký đ dung d ch chuẩn GP và dung d ch th bột quả Dành dành

theo Toshiyuki Oshima(1) Geniposid , (2) gardenosid, (3) acid geniposid, (4) genipin–1–β–gentiobiosid

1.2.3.5 Theo Bergonzi M.C và cộng sự [4]

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch thử: Cân khoảng 1, g bột quả Dành dành, thêm 1 ml methanol 5 %,

siêu âm 4 ph t, lọc, gạn lấy d ch chiết, chiết bã dược liệu thêm l n nữa v i c ng

đi u kiện Gộp d ch chiết lại, bay h i dung môi đến khô, cân cắn thu được, h a tancắn trong methanol

Điều kiện sắc ký: Hệ thống HPLC: HP 1100L; Cột sắc ký: Luna C18 (250 x 4,6

mm; 5 μm ; Tốc độ d ng: 1,0 ml/phút; Nhiệt độ cột: 27 oC; Bư c sóng phát hiện:

240 nm; Thể tích tiêm: 2 μl; Pha động: MeOH ) – H2O (pH 3,2, HCOOH) (B),chư ng trình r a giải trong Bảng 1 1

Bảng 1.1 Chư ng trình r a giải geniposid theo Bergonzi M C và cộng sự

H nh 1.5 Sắc ký đ dung d ch th bột quả Dành dành theo Bergonzi M.C.

(1) Scandosid methylester, (2) gardenosid, (3) genipin gentobiosid,

 Cột sắc ký được s dụng là cột pha đảo C18

 Pha động bao g m dung môi hữu c CN/MeOH và dung d ch nư c(nư c/nư c acid

 Chế độ r a giải đẳng d ng chỉ đ nh lượng geniposid ho c r a giảigradient đ nh lượng nhi u hợp chất trong đ c geniposid

 Th i gian phân tích tư ng đối ngắn tối đa ph t

 Bư c s ng phát hiện dao động trong khoảng 8 – 240 nm

1.3 DƢỢC LI U ĐỖ TRỌNG

H nh 1.6 Đ trọng Eucommia ulmoides Oliv)

(A Cây Đ trọng; (B) Lá Đ trọng; C Vỏ thân Đ trọng ph i khô

Tên khoa học: Eucommia ulmoides Oliv.

Tên khác: Dang ping (Tày)

Tên nư c ngoài: Guttapercha (Anh)

Mô tả và phân loại

1.3.1.

Cây nhỡ hay cây to, cao 1 – 15 m hay h n, thư ng xanh Vỏ cây màu xám, khi bẻđôi sẽ thấy sợi nhựa trắng mảnh như t giữa các mảnh vỏ đ Vỏ cây phẳng ho ccong hai m p, to nhỏ không đ u, dày 0,2 – 0,5 cm, màu xám tro Lá mọc so le, hìnhtrứng rộng, gốc tr n, đ u nhọn; hoa đ n t nh, hoa đực mọc thành ch m, hoa cái tụtập kẽ lá; quả hình thoi, d t, đ u quả xẻ đôi, chứa một hạt, màu nâu b ng [3].Phân loại thực vật Đ trọng [19]

1962 – 196 Cây Đ trọng ưa kh hậu ẩm mát của v ng nhiệt đ i n i cao trên

1300 m); nhiệt độ trung bình năm là 15 – 20 oC; lượng mưa – 2800 mm [3]

1.3.4.1 Lignan glycosid

Lignan và những d n xuất của n là thành ph n ch nh của vỏ thân Đ trọng Nhữnghợp chất lignan bao g m phân t phenylpropanoid nối v i nhau v tr carbon số8-8’[23] Các lignan glycosid trong vỏ thân g m medioresinol di–O–β–D–glucopyranosid, olivil di–O–β–D–glucopyranosid, medioresinol 4’–O–β–D–glucopyranosid eucomin , hydroxypinoresinol 4”–O–β–D–glucopyranosid vànhi u hợp chất lignan đã biết như pinoresinol di–O–β–D–glucopyranosid(pinoresinol diglucosid), olivil, liriodendrin, pinoresinol–O–β–D glucopyranosid,syrigaresinol–O–β–D–glucopyranosid và hydroxypinoresinol 4’–O–β–D–glucopyranosid [3] Pinoresinol diglucosid c chủ yếu libe của vỏ, khoảng 0,55%các ph n khác của vỏ không có diglucosid) và pinorescinol diglucosid được xem làchất đánh dấu của dược liệu Đ trọng trong Dược điển Trung Quốc [17]

1.3.4.2 Iridoid glycosid

Iridoid glycosid là nh m thành ph n ch nh khác của cây Đ trọng, là mộtmonoterpenoid điển hình v i 1 n a phân t glucose gắn vào v tr C1 của v ngpyran [23] Các iridoid glycosid ch nh bao g m aucubin, harpagid acetat, ajugosid,reptosid và eucomiol ucubin là thành ph n ch nh c hàm lượng ,1 – 4 % vỏthân và 1,6 – 1,7 % lá Ngoài ra, còn có ulmosid (aucubigenin–1–β–isomaltosid),

eucomiosid, acid geniposid, geniposid, 4–deoxyeucomiol chất này c cả cả thân

hạ huyết áp c n do tác dụng làm giãn mạch ngoại vi và tác dụng trực tiếp trên c

tr n thành mạch D ch chiết từ quả cũng c tác dụng gây hạ huyết áp [3]

Nư c sắc vỏ thân làm tăng tiết niệu chuột nhắt, tăng trư ng lực c tr n t cung vàruột động vật th nghiệm Cho chuột nhắt cái uống d ch chiết của một bài thuốc bthận đông y g m vỏ Đ trọng và một số v thuốc khác, thấy c tác dụng gây độngdục kiểu estrogen [3]

Nhi u công trình nghiên cứu v sinh học trên các d n chất lignoid chiết từ vỏ thân

Đ trọng đã chứng minh một số chất c tác dụng kháng khuẩn, chống phân bào,chống ung thư và tác dụng ức chế đ c hiệu một số enzym [3]

Các d n chất iridoid chiết từ vỏ thân Đ trọng được nghiên cứu cho thấy c một sốtác dụng dược lý như tác dụng kháng khuẩn, hạ huyết áp, giảm đau, chống viêm, an

th n, nhuận tràng và chống ung thư [3]

Các hợp chất phân lập từ vỏ thân Đ trọng đã được nghiên cứu v hoạt t nh chốngkết hợp b thể Cao 5 % methanol và nư c của vỏ thân c tác dụng chống kết hợp

Trong y học c truy n Trung Quốc, vỏ thân Đ trọng được d ng chữa các chứngbệnh đau mỏi lưng và kh p gối, di tinh phối hợp v i ngưu tất, tang ký sinh , c thai

đau tức v ng hông, động thai phối hợp v i tục đoạn, táo nhục , tăng huyết áp d ngchung v i hạ khô thảo, hoàng c m [3].

Đ trọng c n được d ng đi u tr ph và những bệnh v thận, gan và bệnh thốngphong Dùng ngoài c tác dụng chữa bệnh ngoài da [3]

Ở Nhật Bản, Đ trọng được d ng v i công dụng b gan thận, cư ng gân, xư ng, anthai [3]

vành [23] Bên cạnh đ , Sih và Deyama cũng chứng minh PDG mg/kg) và acidgeniposid (30 mg/kg c tác dụng hạ huyết áp tốt [14].

Dung dịch thử: Cân chính xác 2,0 g bột vỏ thân Đ trọng, tiến hành chiết Soxhlet

v i cloroform trong 6 gi Loại bỏ d ch cloroform và bay h i lượng cloroform c nlại trong d ch chiết, sau đ chuyển d ch chiết vào lại hệ thống Soxhlet Thêmmethanol và tiếp tục đun n ng h i lưu trong v ng 6 gi Cô d ch chiết methanol đếnthể t ch th ch hợp và chuyển vào bình đ nh mức 1 ml, thêm methanol đến vạch

Dung dịch chu n: Hòa tan lượng ch nh xác chuẩn PDG v i methanol để thu được

Dung dịch thử: Lấy ch nh xác khoảng ,4 g dược liệu qua rây c cỡ mắc rây ,85

mm), thêm 10 ml ethanol 50 %, siêu âm trong ph t r i ly tâm trong 5 ph t Lọc

d ch ly tâm qua màng lọc ,45 μm và chuyển d ch lọc vào bình đ nh mức 5 ml

L p lại cách chiết như trên 1 l n nữa Gộp d ch lọc vào bình đ nh mức và thêmethanol 50 % đến vạch, lắc đ u, lọc qua màng lọc ,45 μm

Dung dịch chu n: Hòa tan pinoresinol diglucosid chuẩn trong methanol để được

dung d ch c n ng độ ch nh xác khoảng 1,0 mg/ml Từ dung d ch này, pha dãy dung

d ch chuẩn c n ng độ 1, 1 , 5 , 1 , μg/ml

Điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm ; Bư c sóng phát hiện: 228 nm;

Thể tích tiêm: 5 μl; Tốc độ d ng: 1, ml/ph t; Pha động: ACN – H2O, chư ng trình

r a giải trong Bảng 1

Bảng 1.2 Chư ng trình r a giải PDG theo DĐVN V

Yêu cầu: RSD % diện t ch pic PDG của 5 l n tiêm 5 μg/ml 5, %; RSD %

th i gian lưu PDG của 5 l n tiêm 5 μg/ml , %; Số đĩa lý thuyết không được

≥ 5 000; Độ lệch th i gian lưu PDG giữa dung d ch chuẩn và dung d ch th5,0%; Độ phân giải của pic PDG v i các pic khác ≥ 1,5; Hàm lượng PDG ≥ 0,10 %

1.4.3.3 Theo BP 2017 [6]

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch thử: Cân chính xác 2,0 g bột vỏ thân Đ trọng, tiến hành chiết Soxhlet

v i 75 ml methylen clorid trong 1 gi Làm nguội, loại bỏ d ch methylen clorid vàthêm 75 ml methanol, chiết Soxhlet trong 6 gi Lọc và bay h i d ch chiết đến khô,

h a tan cắn trong 1 ml h n hợp methanol – nư c :7 , tt/tt), lọc qua màng lọc0,45 μm

Dung dịch chu n (a): Cân chính xác 2,0 g dược liệu đối chiếu vỏ thân Đ trọng,

tiến hành chiết Soxhlet v i 75 ml methylen clorid trong 1 gi Làm nguội, loại bỏ

d ch methylen clorid và thêm 75 ml methanol, chiết Soxhlet trong 6 gi Lọc và bay

h i d ch chiết đến khô, h a tan cắn trong 1 ml h n hợp methanol – nư c :7 ,tt/tt , lọc qua màng lọc ,45 μm

Dung dịch chu n (b): Hòa tan 20, mg cafein trong pha động và pha loãng đến

20 ml v i pha động Pha loãng 1, ml thành 5 ml b ng pha động

Điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 mm x 4,0 mm); Bư c sóng phát hiện: 278 nm; Tốc

độ dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: μl; Pha động: Pha động A (dung d ch

H3PO4 1,0 g/L) – Pha động B (ACN), chư ng trình r a giải trong Bảng 1

Bảng 1.3 Chư ng trình r a giải PDG theo BP 2017

Yêu cầu: Hàm lượng PDG ≥ 0,1%.

1.4.3.4 Theo Hilderbert Wagner và cộng sự [8]

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch thử: Cân chính xác 2,0 g bột vỏ thân Đ trọng, tiến hành đun h i lưu v i

75 ml dicloromethan trong 1 gi Làm nguội, loại bỏ d ch dicloromethan và bay h ilượng dicloromethan c n lại trong d ch chiết Thêm 75 ml methanol, đun h i lưutrong 6 gi Lọc và bay h i d ch chiết đến khô, h a tan cắn trong 4 ml methanol, lọcqua màng lọc 0,45 μm

Điều kiện sắc ký: Cột: LiChroCART® 250-4, LiChrospher® 100 RP-18 (5 μm);

Ti n cột: LiChroCART®

4-4, LiChrospher® 100 RP-18 5 μm); Tốc độ d ng: ,6ml/phút; Bư c s ng phát hiện: 1 nm; Th i gian sắc ký: 70 phút; Pha động: phađộng dung d ch H3PO4 0,001%) – pha động B CN , chư ng trình r a giảigradient: 0–30% B trong 45 phút, 30–95% B trong 20 phút, 95% B trong 5 phút

Nhận diện pic:

Bảng 1.4 Th i gian lưu các pic theo Hilderbert Wagner

H nh 1.8 Sắc ký đ dung d ch th bột vỏ thân Đ trọng theo Hilderbert Wagner.

(1) Pinoresinol-di-O-glucosid, chưa đ nh danh, chưa đ nh danh, 4

- Đi u kiện sắc ký:

 Đ u s dụng cột pha đảo C18

 Pha động s dụng bao g m dung môi hữu c CN/MeOH và dung

d ch nư c nư c/nư c acid

 Chế độ r a giải h u hết là r a giải gradient

 Th i gian phân t ch k o dài từ 4 đến 7 ph t

 Bư c s ng phát hiện 77 nm ho c 78 nm

 Pic PDG chưa tách hoàn toàn

Một số phương pháp định lượng đồng thời GP và PDG trong vỏ thân Đỗ 1.4.4.

trọng

1.4.4.1 Theo Bing Tian Zhao và cộng sự [5]

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch thử: Cân ch nh xác khoảng 1, g bột vỏ thân Đ trọng, thêm ml dung

d ch ethanol 7 % chứa chuẩn nội (IS) catechol n ng độ µg/ml , lắc siêu âm v i

t n số 5 Hz trong ph t, lọc dung d ch qua màng lọc ,45 µm

Dung dịch chu n: Cân ch nh xác 5, mg chuẩn PDG, acid geniposidic, geniposid và

liriodendrin, h a tan v i 1 ml dung môi ethanol 7 % có chứa chuẩn nội catechol

để được dung d ch chuẩn v i n ng độ m i chất là 5 ppm

Điều kiện sắc ký: Cột Gemini C18 - 110A (250 mm x 4,6 mm; 5 µm); Bư c sóng

phát hiện: 230 nnm; Tốc độ dòng: 2,0 ml/phút; Pha động: H3PO4 0,01%/H2O (A)

-H3PO4 0,01%/ACN (B), chư ng trình r a giải trong Bảng 1 5

Bảng 1.5 Chư ng trình r a giải đ ng th i GP và PDG theo Bing Tian Zhao và

(nội chuẩn, IS)

1.4.4.2 Theo Xin Chai và cộng sự [22]

Chuẩn bị mẫu

Dung dịch thử: Cân chính xác 0,5 g bột vỏ thân Đ trọng, chiết siêu âm nhiệt độ

thư ng trong th i gian ph t v i 5 ml dung môi methanol – nư c 5 : 5 , tt/tt)

D ch chiết được ly tâm trong 1 ph t v i tốc độ 14 v ng/ph t Một ph n d chµl) được b m vào hệ thống UPLC để phân t ch

Dung dịch chu n: Cân ch nh xác lượng PDG, acid geniposidic, acid clorogenic,

geniposid, genipin, licoagrosid, syringaresinol di–O–β–D–glucopyranosid,baicalein, wogonin, oroxylin A, hòa tan trong dung môi DMSO làm m u gốc Từcác m u gốc này lấy một lượng cho vào bình đ nh mức 5 ml và thêm dung môimethanol 50% đến vạch sao cho đạt n ng độ PDG 256,4 µg/ml, acid geniposidic391,2 µg/ml, acid clorogenic 87,22 µg/ml, geniposid 85,52 µg/ml, genipin 128,7µg/ml, licoagrosid 8,425 µg/ml, syringaresinol di–O–β–D–glucopyranosid 84,18µg/ml, baicalein 0,126 µg/ml, wogonin 0,0159 µg/ml, oroxylin A 0,0319 µg/ml

Điều kiện sắc ký: Hệ thống UPLC Waters Acquity UPLC – TUV detector; Cột:

Acquity UPLC BEH C18 (100 × 3,0 mm; 1,7 µm); Tốc độ d ng: ,5 ml/phút; Nhiệt

H nh 1.10 Sắc ký đ UPLC dung d ch chuẩn và dung d ch th bột vỏ thân Đ

trọng theo Xin Chai(1) acid geniposidic, (2) acid clorogenic, (3) geniposid, (4) genipin, (5) pinoresinoldiglucosid, (6) licoagrosid, (7) syringaresinol di–O–β–D–glucopyranosid, (8) baicalein, (9)

 Pha động bao g m dung môi hữu c CN và dung d ch nư c acid

 Th i gian phân t ch trên HPLC dài

 Các pic trên sắc ký đ v n chưa tách tốt khi tiến hành trên hệ thốngHPLC, pic PDG tách tốt khi tiến hành trên hệ thống UPLC

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Cao khô Dành dành số lô: DD1, DD , DD , cao khô Đ trọng số lô: DT1, DT ,DT3) và viên nén chứa hai thành ph n cao khô Dành dành và cao khô Đ trọng (sốlô: VN1, VN2, VN3) do Công ty CP BV Pharma cung cấp

Dược liệu vỏ thân Đ trọng

Cao nư c Đ trọng

+ Nư c 7 o

C)Lọc

Sấy phunCao khô Đ trọng

+ Nư c 7 oC)Lọc

2.2 NGUYÊN VẬT LI U

2.2.1 Chất đối chiếu

Chất đối chiếu s dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Chất đối chiếu s dụng trong nghiên cứu

Chất đối chiếu geniposid

(GP)

99,26% Ban Nghiên cứu khoa

học – Thư viện, KhoaDược, Đại học YDược TP HCM

Chất đối chiếu pinoresinol

diglucosid (PDG)

97,65%

2.2.2 Dung môi, hóa chất

Các dung môi, h a chất s dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Danh mục dung môi, h a chất d ng trong nghiên cứu

2.2.3 Dụng cụ và trang thiết bị

Các dụng cụ, trang thiết b s dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.3

Bảng 2.3 Dụng cụ, trang thiết b s dụng trong nghiên cứu

1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao Ultimate 3000 Thermo M

2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao alliance e2695 Waters M

3 Cân phân tích 5 số GH–202 Sartorius Đức)

4 Cân phân tích 4 số Denver AA–200 Sartorius Đức

8 Cân h ng ngoại A&D MS–70 Sartorius Đức

9 Cột pha đảo C18 Zorbax Eclipse

XDB C18

Agilent M

10 Cột pha đảo C18 Gemini–NX 110A Phenomenex M

Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM và Trungtâm Kiểm nghiệm tỉnh Đ ng Tháp

2.4.1 Xây dựng quy trình định lƣợng GP trong cao khô Dành dành

2.4.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Dựa vào cấu tr c h a học của GP và tham khảo một số tài liệu [17], [24], k thuậtsắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo v i đ u d D D đã được lựa chọn v i đi u kiệnsắc ký ban đ u như sau:

- Cột pha đảo C18 5 x 4,6 mm; 5 μm và ti n cột tư ng ứng

Tiến hành khảo sát pha động và cột sắc ký Qua các khảo sát thực nghiệm, chọnđược đi u kiện sắc ký th ch hợp sao cho pic GP đạt độ tinh khiết theo ph UV-Vis , tách hoàn toàn khỏi các pic tạp nếu c và c hệ số bất đối n m trong khoảng0,8 – 1,5.

2.4.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu cao khô Dành dành

Khảo sát dung môi chiết GP

Chiết c ng một lượng cao v i các dung môi khác nhau như methanol, methanol

7 %, 5 %, % tỷ lệ cao và dung môi chiết cố đ nh b ng siêu âm trong 1 ph t,chuẩn b m u th riêng biệt cho từng dung môi Tiến hành sắc ký các d ch chiếtChọn dung môi chiết GP theo các tiêu ch sau: diện t ch pic và chi u cao pic l nnhất, hệ số bất đối n m trong khoảng ,8 – 1,5; độ phân giải l n h n 1,5; pic GPtinh khiết theo ph UV-Vis) và n ng độ methanol cao

Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP

Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết đã được lựa chọn v i tỷ lệ khác nhau nhưsau:

 Tỷ lệ 1:1: Cân chính xác 25 mg cao và chiết v i 5 ml dung môi

 Tỷ lệ 1:2: Cân chính xác 25 mg cao và chiết v i 50 ml dung môi

 Tỷ lệ 1:4: Cân chính xác 25 mg cao và chiết v i 100 ml dung môi

Chuẩn b m u th riêng biệt cho từng tỷ lệ và chiết b ng phư ng pháp siêu âmtrong 10 phút Tiến hành sắc ký d ch chiết Chọn tỷ lệ cao và dung môi chiết theotiêu ch sau:

 Hàm lượng GP chiết được cao nhất

 Chi u cao pic GP trong khoảng , – 0,8 AU

Khảo sát th i gian chiết

Từ tỷ lệ cao và dung môi chiết đã được lựa chọn, tiến hành chiết siêu âm các th iđiểm , 5, và 1 ph t Chuẩn b m u th riêng biệt cho từng th i điểm Tiến hànhsắc ký các d ch chiết Chọn th i gian chiết cho hàm lượng GP chiết được cao nhất