Nghiên cứu ứng dụng quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của mupirocin trong thuốc kem bằng phương pháp sắc ký lỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  HOÀNG KIM DUNG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN TRONG THUỐC KE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



HOÀNG KIM DUNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ

XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN TRONG THUỐC KEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



HOÀNG KIM DUNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ

XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN TRONG THUỐC KEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc & Độc chất

Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS HÀ MINH HIỂN

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 KHÁNG SINH 1

1.1.1 Khái niệm chất kháng sinh 1

1.1.2 Định nghĩa 2

1.1.3 Nguồn gốc 2

1.2 KHÁNG SINH MUPIROCIN 3

1.2.1 Dược lý và cơ chế tác dụng 3

1.2.2 Dược động học 4

1.2.3 Chỉ định 4

1.3 SINH TỔNG HỢP MUPIROCIN 5

1.3.1 Sinh tổng hợp hợp chất Polyketid 6

1.3.2 Quá trình sinh tổng hợp Polyketid 6

1.3.3 Quá trình sinh tổng hợp Mupirocin 7

1.4 CÁC TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN 10

1.4.1 Công thức cấu tạo và danh pháp 11

1.4.2 Con đường phát sinh tạp 12

1.5 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN THEO USP 40 14

1.5.1 Chuyên luận Mupirocin calcium 14

1.5.2 Chuyên luận kem Mupirocin calcium 16

1.6 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỊNH LƯỢNG MUPIROCIN VÀ TẠP CHẤT LIÊN QUAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC TRÊN THẾ GIỚI 20

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ 22

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Khảo sát các điều kiện khắc nghiệt để tạo ra tạp Mupirocin Impurity 1, Mupirocin Impurity 2, Mupirocin Impurity 3 và Mupirocin Impurity 4 23

2.2.2- Xây dựng quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của Mupirocin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA 26

2.2.3 Thẩm định quy trình xác định tạp chất liên quan của Mupirocin 30

2.2.4.Thẩm định quy trình định lượng Mupirocin 33

2.2.5 Ứng dụng quy trình đã thẩm định tiến hành định lượng và xác định tạp chất liên quan trên 3 mẫu thuốc trên thị trường 37

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 36

3.1 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN KHẮC NGHIỆT ĐỂ TẠO RA TẠP 36

3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN 44

3.2.1 Khảo sát từ điều kiện sắc ký ban đầu là chương trình sắc ký 2 44

3.2.2 Khảo sát từ điều kiện sắc ký ban đầu là chương trình sắc ký 1 46

3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN 56

3.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MUPIROCIN 62

3.5 ĐỊNH LƯƠNG MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG 68

3.6 DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN TRONG THUỐC KEM 70

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Đông Nam Á

Mu imp 1 Mupirocin impurity 1

Mu imp 2 Mupirocin impurity 2

Mu imp 3 Mupirocin impurity 3

Mu imp 4 Mupirocin impurity 4

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Các nhóm chức năng của một modul PKS đơn giản nhất 6

Hình 1.2 Quá trình sinh tổng hợp polyketid 7

Hình 1.3 Giai đoạn kéo dài trong quá trình tổng hợp polyketid 7

Hình 1.4 Công thức các pseudomonic acid 8

Hình 1.5 Gen sinh tổng hợp Mupirocin và con đường tổng hợp Mupirocin 9

Hình 1.6 Sơ đồ tạo vòng pyran của acid monic 10

Hình 1.7 Pseudomonic acid B … 11

Hình 1.8 Tap B Pseudomonic acid C 11

Hình 1.9 Pseudomonic acid D 12

Hình 1.10 Mupirocin impurity 1 12

Hình 1.11 Mupirocin impurity 2… 12

Hình 1.12 Pseudomonic acid E 12

Hình 1.13 Mupirocin impurity 3 13

Hình 1.14 Mupirocin impurity 4 13

Hình 1.15 Pseudomonic acid F 13

Hình 1.16 Sản phẩm phân hủy của Mupirocin 13

Hình 1.17 Công thức cấu tạo Mupirocin 14

Hình 3.1 Sắc ký đồ phân hủy mupirocin 20h trong môi trường acid pH2 36

Hình 3.2 Sắc ký đồ phân hủy mupirocin trong môi trường acid 37

Hình 3.3 Sắc ký đồ mupirocin khi phân hủy dưới ánh sáng mặt trời 4h 39

Hình 3.4 Sắc ký đồ mupirocin khi phân hủy trong môi trường H2O2 3% 41

Hình 3.5 Sắc ký đồ phân hủy trong môi trường kiềm , nhiệt độ 700C 42

Hình 3.6 Sắc ký đồ phân hủy ở nhiệt độ 700C trong bể cách thủy 42

Hình 3.7 Sắc ký đồ phân hủy trong môi trường acid pH 2, nhiệt độ 700C 42

Hình 3.8 Sắc ký đồ phân hủy trong môi trường pH2, nhiệt độ 500C 42

Hình 3.9 Sắc ký đồ phân hủy trong môi trường pH2, nhiệt độ 450C 42

Hình 3.10 Sắc ký đồ phân hủy mẫu nồng độ Mupirocin 5mg/ml, pH2,

nhiệt độ 450C 42

Hình 3.11 Sắc ký đồ phân hủy mẫu nồng độ Mupirocin 5mg/ml, pH 2 43

Hình 3.12 Sắc ký đồ phân hủy dung dịch Mupirocin nồng độ 5mg/ml 43

Hình 3.13 Sắc ký đồphân tích theo USP 40 43

Hình 3.14 Sắc ký đồ các chương trình gradient A 46

Hình 3.15 Sắc ký đồ các chương trình gradient B 47

Hình 3.16 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 49

Hình 3.17 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 0,7 ml/p 50

Hình 3.18 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 0,5 ml/p 51

Hình 3.19 SKĐ theo các điều kiện phù hợp 52

Hình 3.20 Sắc ký đồ các chương trình gradient dung môi 53

Hình 3.21 Sắc ký đồ các chương trình gradient dung môi và tốc độ dòng 55

Hình 3.22 SKĐ mẫu A theo chương trình sắc ký của USP 40 55

Hình 3.23 Tính đặc hiêu của phương pháp xác định giới hạn tạp 63

Hình 3.24 Tính đặc hiệu phương pháp định lượng mupirocin 64

Hình 3.25 Tuyến tính Mupirocin 66

DANH MỤC BẢNG BIỂU – SƠ ĐỒ

Trang

Bảng 1.1 Chương trình gradient định lương tạp theo USP 40 5

Bảng 1.2 Giới hạn cho phép của các tạp theo USP 40 13

Bảng 1.3 Các nghiên cứu liên quan đên định lượng Mupirocin và tạp liên quan 12

Bảng 2.1 Thành phần mẫu placebo 21

Bảng 2.2 Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.3 Các chương trình gradient A ( THF: đệm) 22

Bảng 2.4 Các chương trình gradient dung môi THF: đêm: nước 26

Bảng 2.5 Các chương trình gradient dung môi 31

Bảng 2.6 Các chương trình gradient dung môi và tốc độ dòng 32

Bảng 2.7 Cách pha chuẩn khảo sát tính tuyến tính định lượng Mupirocin 33

Bảng 2.8 Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng Mupirocin 34

Bảng 3.1 So sánh thời gian lưu tương đối của tạp với tiêu chuẩn USP 40 44

Bảng 3.2 Chương trình sắc ký ban đầu 44

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát các chương trình sắc ký A 51

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát các chương trình sắc ký B 51

Bảng 3.5 Tổng kết Rs theo tốc độ dòng và nhiệt độ 53

Bảng 3.6 Hệ số phân giải của Mu imp 1 và 2 tại các tỷ lệ % THF 53

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát các chương trình sắc ký gradient dung môi 53

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát các chương trình gradient dung môi và tốc độ dòng 54

Bảng 3.9 Bảng thời gian lưu tương đối điều chỉnh lại 55

Bảng 3.10 Bảng kết quả tính phù hợp hệ thống 56

Bảng 3.11 Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Mu imp 1 57

Bảng 3.12 Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Mu imp 2 57

Bảng 3.13 Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Pseu D 58

Bảng 3.14 Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Pseu B 59

Bảng 3.15 Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Mu imp 3 59

Bảng 3.16 Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Mu imp 4 60

Bảng 3.17 Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Pseu C 60

Bảng 3.18 Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Pseu E 61

Bảng 3.33 Kết quả tính phù hợp hệ thống Mupirocin 62

Bảng 3.34 Kết quả khảo sát tính tuyến tính Mupirocin 65

Bảng 3.35 Kết quả thẩm định độ lặp lại Mupirocin 66

Bảng 3.36 Kết quả độ chính xác trung gian Mupirocin 66

Bảng 3.37 Kết quả thẩm định độ đúng Mupirocin 67

Bảng 3.38 Kết quả định lượng các mẫu thị trường 67

Bảng 3.39 Kết quả định lượng tạp trong các mẫu thị trường 68

Bảng 3.40 Kết quả định lượng tạp trong các mẫu thị trường (tiếp theo) 69

Bảng 3.41 Phần trăm hàm lượng các tạp trong mẫu thị trường 69

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.Kết quả, số liệu nghiên cứu trong luận văn là trung thực và

không trùng với bất kì công trình khác

Tác giả

Hoàng Kim Dung

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy TS Hà Minh Hiển đã nhiệt tình hướng dẫn, góp

ý, hỗ trợ tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn thầy PGS TS Trần Việt Hùng và thầy PGS TS NguyễnĐức Tuấn đã dành thời gian nhận xét, phản biện và góp ý kiến để giúp luận văn của emđược hoàn chỉnh hơn

Em xin gửi lời cảm ơn cô PGS TS Võ Thị Bạch Huệ đã dành thời gian nhận xét

và đóng góp ý kiến để giúp luận văn của em được hoàn chỉnh hơn

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Y Dược TP Hồ ChíMinh, Phòng đào tạo Sau Đại học trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Khoa Dượctrường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh, và đặcbiệt là các anh chị em trong phòng Kiểm nghiệm Đông dược đã hỗ trợ tôi rất nhiều trongquá trình nghiên cứu thực nghiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý đồng nghiệp Trung Tâm Kiểm Nghiệmtỉnh Khánh Hòa

Và cuối cùng tôi cũng xin cảm ơn đến gia đình đã luôn động viên và ủng hộ tôitrong suốt quá trình học tập và làm luận văn

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN TRONG THUỐC KEM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Hoàng Kim DungHướng dẫn khoa học: TS Hà Minh Hiển

Từ khóa: Mupirocin, mupirocin impurity, HPLC

Mở đầu: Mupirocin là một kháng sinh mới, có phổ kháng khuẩn rộng kể cả những chủng

đề kháng methicillin, được bào chế dưới dạng thuốc kem bôi da Dược điển USP 40 đã cóchuyên luận về định lượng và xác định tạp chất của mupirocin trong thuốc kem Tuynhiên khi áp dụng vào thực tế còn gặp một số khó khăn do những trang thiết bị và môitrường của mỗi phòng thí nghiệm là khác nhau Do đó đề tài này được thực hiện với mục

mupirocin trong thuốc kem bằng phương pháp sắc ký lỏng

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Mẫu thành phẩm thuốc kem mupirocin 2% của công ty dược Phương pháp nghiên cứu: Mupirocin được để trong những điều kiện môi trường khắc

nghiệt để tạo ra 4 tạp phân hủy là mupirocin impurity 1,2,3 và 4 Khảo sát các điều kiệnsắc ký để tách mupirocin và 8 tạp chất liên quan Xây dựng quy trình định lượng và xácđịnh tạp chất liên quan của mupirocin Quy trình sau đó được thẩm định theo hướng dẫncủa ICH

Kết quả:Đã xây dựng được quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của

mupirocin trong thuốc kem bằng phương pháp sắc ký lỏng Điều kiện sắc ký bao gồm cộtAgilent C8 (250x× 4,6 mm, 5 µm), pha động: đệm amoni acetat pH5,7 và tetrahydrofurantheo chương trình gradient Quy trình đã được thẩm định đạt yêu cầu chung của một quytrình phân tích

Kết luận: Đã xây dựng được quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của

mupirocin trong thuốc kem bằng phương pháp sắc ký lỏng.Quy trình có thể được ứngdụng để kiểm tra chất lượng các mẫu thuốc kem mupirocin lưu hành trên thị trường

STUDY ON APPLICATION OF HPLC METHODS FOR THE DETERMINATION OF MUPIROCIN AND ITS RELATED SUBSTANCES IN

MUPIROCIN CREAM

Hoang Kim DungSupervisor: Dr Ha Minh Hien

Keyword: Mupirocin, mupirocin impurity, HPLC

Introduction : Mupirocin is a topical antibiotic useful against superficial skin infections

with broad spectrum even against superficial methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) It is used as a cream or ointment applied to the skin The monograph ofmupirocin cream has been existed in United States Pharmacopeia including the methods

of analysis for related substances and assay However, they need to be verified ormodified depending on the availability of the quality control laboratories Therefore, thissudy on application of HPLC methods for the determination of mupirocin and its relatedsubstances in mupirocin cream has been conducted

Materials and Methods:

Material: Mupirocin cream, 2 % manufactured by a pharmaceutical company

Method: Mupirocin was stored in a stressed conditions to obtain the related substances of

mupirocin impurity 1, 2, 3 and 4 Study on difference mobile phase and gradient elution

to obtain a satisfactory separation of the impurities Establish and validate the methodsfollowing the ICH guidelines

Results: A reverse-phase HPLC methods for assay and determination of related

compounds in mupirocin cream were developed: Column – Agilent C8 (25 cm × 4.6 mm,

C; mobile phase:tetrahydrofuran and pH 5.7 ammonium acetate buffer, elute in gradient; flow rate – 1.0ml/min The method was validated following the ICH guidelines

Conclusion: Suitable methods for assay and determination of related substances in

mupirocin cream were established for routine testing which can be used to control thequality of mupirocin cream circulated in the market

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nghiên cứu, sản xuất thuốc, ngoài việc nghiên cứu tác dụng dược lý của các hoạtchất chính, các nhà nghiên cứu còn phải khảo sát tác dụng dược lý của các tạp chất có thểphát sinh trong nguyên liệu hoặc thành phẩm do nguyên liệu đầu vào còn lẫn tạp hoặc tạpchất phân hủy trong quá trình sản xuất và lưu hành Những tạp chất phát sinh có thể làmthay đổi hoặc làm giảm hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc hoặc gây các tácdụng khác nhau với hậu quả không lường trước được Việc kiểm soát các tạp chất liênquan trong nguyên liệu và đặc biệt là trong chế phẩm tương ứng đã được quy định chặtchẽ đối với phần lớn chuyên luận trong Dược điển các nước (EP, USP, BP)

Mupirocin là một kháng sinh mới, phổ diệt khuẩn rộng có hoạt tính chống lại hầu hết các

vi khuẩn gây nhiễm trùng da Thuốc này dễ sử dụng, có hiệu quả tốt và ít tác dụng phụ, ítthấy có sự đề kháng của vi khuẩn Vì thế, một số nhà sản xuất trong nước đã nghiên cứuphát triển sản phẩm kem thuốc chứa mupirocin Tuy nhiên, để thiết lập hồ sơ đăng kýthuốc theo sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc thì cần phải có quy trình phân tích Dược điểnUSP 40 đã có quy trình phân tích định lượng và xác định giới hạn tạp chất liên quan chochế phẩm thuốc kem Mupirocin, tuy nhiên 1 quy trình phân tích trong dược điển nóichung muốn đưa vào áp dụng thì phải khảo sát lại theo điều kiện trang thiết bị của từng

cơ sở kiểm nghiệm Hơn nữa nền mẫu dạng kem là rất phức tạp và rất khác nhau đối vớitừng hãng bào chế, phương pháp phân tích đòi hỏi phải đảm bảo các thành phần đệm,chất làm phân tán và các chất bảo quản trong công thức bào chế phải tách khỏi các tạpchất liên quan cần xác định Vì thế, đề tài ―

nh giới hạn tạp chấ kem bằ ơ pháp sắc ký lỏ ” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1) Khảo sát các tạp chất liên quan của mupirocin

2) Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng mupirocin trong thuốc kem

3) Xây dựng và thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan của mupirocintrong thuốc kem

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 KHÁNG SINH

1.1.1 Khái niệm chất kháng sinh

Thuật ngữ ―chất kháng sinh‖ lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng

để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis

trên động vật nhiễm bệnh

Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặctính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đốikháng

Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus

subtilis có liên quan đến quá trình hình thành loài bào tử.

Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụngđiều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn và ông là người đầutiên xây dựng hoàn thiện phương pháp tìm kiếm và phát hiện vi sinh vật sinh tổnghợp chất kháng sinh trong tự nhiên

Năm 1929 thuật ngữ ―chất kháng sinh‖ mới được Alexander Fleming mô tả mộtcách đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về penicillin

Năm 1931, các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theophương pháp lên men bề mặt Năm 1938 ở Oxford, Ernst Boris Chain và HowaraWalter Florey đã tiếp tục triển khai nghiên cứu này, các ông đã tinh chế được mộtlượng lớn penicillin (1939) đủ để thử nghiệm trên các loạt động vật thí nghiệm.Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột và chínhthức được dùng điều trị thành công trên người (1941) trong nỗ lực cuối cùng nhằmcứu sống các thương binh bị nhiễm khuẩn nặng trong chiến tranh thế giới thứ hai.Trong thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc củangành công nghệ sản xuất chất kháng sinh non trẻ như:

* Khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh như: griseofulvin (1939), gramicidin S(1942), streptomycin (1943), bacitracin (1945), chloramphenicol và polymycin

(1947), clotetracyclin và cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin

và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), vancomycin (1956),kanamycin và rifamycin (1957),

* Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến đã tạo ra nhữngbiến chủng công nghiệp có năng lực ―siêu tổng hợp‖ các chất kháng sinh cao gấphàng vạn lần các chủng ban đầu

* Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công nghiệp đểsản xuất penicillin G (1942) và hoàn thiện công nghệ lên men này trên những sảnphẩm khác trong những năm tiếp theo

* Năm 1959, phát hiện và tinh chế sử dụng thành công 6-aminopenicillinic acid(6APA) làm nguyên liệu để sản xuất các chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp

1.1.2 Định nghĩa

Ngày nay chất kháng sinh hiểu theo nghĩa đầy đủ là các chất hoá học xác định,không có bản chất enzyme, có nguồn gốc từ vi sinh vật, bán tổng hợp hoặc tổnghợp hóa học với đặc tính ngay ở nồng độ thấp có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặctiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo được an toàn cho ngườihay động vật được điều trị

lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sựphát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó

* Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khảnăng sống sót cao cho chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là đốivới các loài có bào tử

1.1.3 Nguồn gốc

Kháng sinh có thể có 3 nguồn gốc:

+ Kháng sinh tự nhiên: ví dụ nhóm Lipopeptid (daptomycin) chiết xuất từ môi

trường nuôi cấy Streptomyces reseosporus, hoặc Fusidic acid: chiết xuất từ nấm

Fusidium coccineum, penicilin G là kháng sinh tự nhiên, được chiết xuất từ môitrường nuôi cấy Penicilium …

+ Kháng sinh bán tổng hợp:

Các cephalosporin khác nhau được hình thành bằng phương pháp bán tổng hợp

Sự thay đổi các nhóm thế sẽ dẫn đến thay đổi đặc tính và tác dụng sinh học củathuốc, clindamycin là kháng sinh bán tổng hợp từ lincomycin…

+ Kháng sinh tổng hợp hóa hoc:

Các kháng sinh nhóm quinolon toàn bộ được sản xuất bằng tổng hợp hóa học

tổng hợp hóa học, thiamphenicol cũng là kháng sinh tổng hợp…

1.2 KHÁNG SINH MUPIROCIN

Mupirocin là một kháng sinh có cấu trúc Polyketid, có nguồn gốc từ Pseudomonas

fluorescens.Cơ chế tác dụng của mupirocin chưa rõ hoàn toàn, nhưng khác với cơchế của các thuốc kháng sinh hiện có Vì thế mupirocin ít bị kháng chéo với các

nhóm kháng sinh khác in vitro Thuốc ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn do

gắn thuận nghịch vào isolecyl ARNt synthetase là enzym xúc tác sự tạo thành

isoleucyl-ARNt từ isoleucin và ARNt [16].

Mupirocin ảnh hưởng không đáng kể đến sự tổng hợp ADN của vi khuẩn và tổnghợp peptidoglycan ở thành tế bào vi khuẩn, không tác động đến quá trìnhphosphoryl oxy hóa của vi khuẩn

1.2.1 Dược lý và cơ chế tác dụng:

Mupirocin là sản phẩm lên men của Pseudomonas fluorescens Thuốc có tác dụng

kìm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao Sau khi bôi kemmupirocin calci hoặc mỡ mupirocin 2 %, thuốc đạt nồng độ diệt khuẩn tại da Các

nghiên cứu in vitro cho thấy mupirocin tác dụng tốt nhất ở môi trường acid yếu, vì

vậy pH thông thường của da khoảng 5,5 được coi là yếu tố thuận lợi cho tác dụngcủa thuốc khi bôi Mặt khác, mupirocin có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu trên vi

khuẩn Gram dương Hầu hết các chủng Staphylococci như Staphylococcus aureus

(kể cả các chủng kháng methicillin và đa kháng), Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus saprophyticus đều nhạy cảm với thuốc [23] Nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) của mupirocin đối với các chủng Staphylococcus aureus nhạy cảm dao động từ 0,04 – 0,32 µg/ml, với các chủng Staphylococcus aureus kháng

methicilin là 0,03 – 2 µg/ml Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của mupirocin

đối với Staphylococcus aureus thường cao gấp 3 – 32 lần nồng độ ức chế tối thiểu Thuốc có tác dụng trên phần lớn các chủng Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, Streptococcus adalactiae, Streptococcus viridans với

nồng độ ức chế tối thiểu khoảng 0,12 – 2 µg/ml Các chủng Enterococci kể cả

Enterococcus faecalis đã kháng với mupirocin Mupirocin cũng có tác dụng trên Listeria monocytigenes (nồng độ ức chế tối thiểu khoảng 8 µg/ml), Erysipelothrix rhusiopathiae (nồng độ ức chế tối thiểu 2 – 8 µg/ml).

Nói chung các vi khuẩn Gram âm ưa khí ít nhạy cảm với thuốc Tuy nhiên,

mupirocin tác dụng tốt trên Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae,

Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Bordetella pertussis, Pasteurella multocida.

Thuốc không có tác dụng đối với các vi khuẩn kị khí kể cả Gram dương và Gram

âm, Chlamydia và nấm.

Kháng thuốc: có một số rất ít chủng S aureus đã kháng thuốc tự nhiên, nhưng đã

có một số sau khi điều trị kháng thuốc, nhất là sau khi điều trị lâu dài Sự khángthuốc này có thể xảy ra do isoleucyl transfer-RNA synthetase bị biến đổi[3].Kháng thuốc mạnh qua trung gian plasmid (nồng độ ức chế tối thiểu > 1024

microgam/ml) của một số chủng Staphylococcus aureus và Staphylococcus

coagulase âm tính (kể cả Staphylococcus epidermidis) đã được thông báo.

1.2.3 Chỉ định:

Nhiễm khuẩn ngoài da do vi khuẩn có nhiều khả năng nhạy cảm

Chốc lở, viêm da: chỉ điều trị tại chỗ khi có ít tổn thương Nếu tổn thương rộng,cần điều trị tại chỗ phối hợp với kháng sinh thích hợp toàn thân

Viêm nang lông, lở loét

Tổn thương da nhiễm khuẩn sau chấn thương (tổn thương da dài tối đa 10 cm hoặc

1.3 SINH TỔNG HỢP MUPIROCIN

1.3.1 Sinh tổng hợp hợp chất Polyketid

Mupirocin là một hợp chất Polyketid [17]

Hợp chất Polyketid (PK) là một tập hợp các đơn vị có cấu trúc carboxylic [22] PK

là sản phẩm của chuỗi phản ứng tổng hợp do một hay nhiều enzyme đặc hiệu chịutrách nhiệm, đó là enzyme polyketid synthase (PKS) PKS là những enzyme phân

tử lớn được cấu tạo bởi nhiều modul, mỗi modul lại gồm nhiều nhóm có chứcnăng khác nhau[19] Cấu trúc của PKS tùy thuộc vào số lượng và trình tự cácmodul cũng như loại nhóm chức hiện diện trong từng modul

Đối với một PKS điển hình, trình tự đơn giản nhất của các nhóm chức thuộcmodul chịu trách nhiệm kéo dài cấu trúc bao gồm: một nhóm ketoacyl synthasehay ketosynthase (KS), một nhóm acyltransferase (AT) và một nhóm acyl carrierprotein (ACP) AT xúc tác quá trình vận chuyển nhóm acyl RCO- từ đơn vị cấutrúc đến ACP trên cùng một modul ACP sau khi liên kết với nhóm acyl tiếp tục

polyketid có thể được thay đổi do các nhóm như keto-reductase (KR)- chuyển ketothành hydroxyl, nhóm dehydratase (DH)- có nhiệm vụ loại phân tử nước và nhómenoyl redutase (ER)- chuyển liên kết đôi thành liên kết đơn Mỗi modul chịu tráchnhiệm gắn kết một đơn vị cấu trúc vào chuỗi polyketid do gắn malonyl-CoA haydẫn chất tương tự

Hình1.1 Các nhóm chức năng của một modul PKS đơn giản nhất

Các modul và nhóm chức năng của một PKS hoàn chỉnh thường có trình tự nhưsau: modul khởi đầu AT-ACP- hay KS-AT- ACP-, modul kéo dài- KS-AT-(KR-DH-ER)-ACP- và modul kết thúc- TE

1.3.2 Quá trình sinh tổng hợp polyketid

Quá trình sinh tổng hợp polyketid gồm 3 giai đoạn-Giai đoạn đầu, nhóm carboxy của đơn vị khởi đầu- thường là acetyl-CoA haypropyonyl-CoA- lien kết với nhóm 5’ phosphopantetheinyl SH của ACP (Hình 2)

Hình 1.2:(a)Đơn vị khởi đầu (b)đơn vị kéo dài (c)giai đoạn khởi đầu trong quá trình tổng hợp polyketid

-Giai đoạn kéo dài, chuỗi polyketid di chuyển từ nhóm ACP sang nhóm KS củamodul kế tiếp và được gắn thêm một đơn vị cấu trúc – thường là malonyl-CoA haydẫn chất Trong quá trình này, công thức của polyketid có thể được bổ sung cácnhóm chức hóa học tùy thuộc vào sự hiện diện của các nhóm chức năng Như vậyphân tử polyketid trung gian trong quá trình tổng hợp sẽ dịch chuyển từ modul nàysang modul kế tiếp cho đến khi công thức hoàn chỉnh (Hình 3)

-Giai đoạn kết thúc, thioesterase (TE) giải phóng polyketid hoàn chỉnh khỏi nhómACP của modul cuối cùng [4]

Hình 1.3: Giai đoạn kéo dài trong quá trình tổng hợp polyketid Các nhóm chức năng được đánh dấu là

các nhóm tùy chọn thêm

1.3.3 Quá trình sinh tổng hợp Mupirocin

Mupirocin là este của acid monic và acid 9-hydroxynonanoic [26] Mupirocin làhỗn hợp của 4 acid pseudomonic : Pseudomonic acid A ( mupirocin) (PA-A)khoảng 90%, pseudomonic acid B (PA-B) chiếm khoảng 8%, pseudomonic acid C(PA-C) chiếm ít hơn 2%, pseudomonic acid D (PA-D) chiếm ít hơn 2% [9]

Hình 1.1 thể hiện công thức các pseudomonic acid

Hình 1.4 Công thức các pseudomonic acid.

Pseudomonic acid B có nhóm hydroxyl ở C8, mà nó có thể là sản phẩm oxy- hóatiếp theo của pseudomonic acid A ( mupirocin) Pseudomonic acid C có một nốiđôi tại C10-C11, thay vì là một vòng epoxide nhƣ Pseudomonic acid A, mà nó cóthể là do thiếu đi tiến trình hoạt đông của MupO ( đƣợc cho là một P450oxygenase) Pseudomonic acid D có một nối đôi C4′-C5′ ở chuỗi acid 9 cacbon,

mà có thể đƣợc sinh ra do sự ngƣng tụ của phân tử malonate thứ 2 với

3-hydroxy-propionate không đƣợc khử hoàn toàn bởi ER (enoyl reductase) [32]

Gene sinh tổng hợp Mupirocin là một đoạn AND dài 74kb đƣợc sắp xếp theo trình

tự Nó gồm 35 khung đọc mở tltk Sơ đồ tổng hop Mu) trong đó có 6 khung đọc

mở lớn (ORF: open reading frames) : mmpA-F, những gen riêng biệt mupA- X và

macp A-E [37] MmpD đƣợc cho là chứa 4 modul, mmpA chứa 3 modul [17]

Hình1.6 Sơ đồ tạo vòng pyran của acid monic [17]

1.4 CÁC TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN

1.4.1 Công thức các tạp- danh pháp [28]

Theo USP 40 có 9 tạp liên quan của Mupirocin:

Hình 1.7 Công thức cấu tạo Pseudomonic acid B

Danh pháp:9-{(EMethyl-4-[(2S ,3R ,4S ,5R )-3,4,5-trihydroxy-5-({(2S ,3S [(2S ,3S )-3-hydroxybutan-2-yl]oxiran-2-yl}methyl)tetrahydro-2H -pyran-2-yl]but-2-enoyloxy}nonanoic acid.

)-3-Hình 1.8 Công thức cấu tạo Pseudomonic acid C

Danh pháp: 9-((E)-4-{(2S ,3R ,4R ,5S )-3,4-Dihydroxy-5-[(4R ,5S methylhex-2-enyl]tetrahydro-2H -pyran-2-yl}-3-methylbut-2-enoyloxy)nonanoicacid

,E)-5-hydroxy-4-Hình 1.9 Công thức cấu tạo Pseudomonic acid D

Danh pháp: (E)-9-{(E)-4-[(2S ,3R ,4R ,5S )-3,4-Dihydroxy-5-({(2S ,3S )-3-[(2S ,3S)-3-hydroxybutan-2-yl]oxiran-2-yl}methyl)tetrahydro-2H -pyran-2-yl]-3-methylbut-2-enoyloxy}non-4-enoic acid

Hình 1.10 Công thức cấu tạo Mupirocin impurity 1

Danh pháp: 9-{(E)-4-[(2R ,3a S,6S ,7S ,8aRS )-2-{(1RS ,2S ,3S methylbutyl}-7-hydroxyhexahydro-2H -furo[3,2-c]pyran-6-yl]-3-methylbut-2-

)-1,3-Dihydroxy-2-enoyloxy}nonanoic acid

Hình 1.11 Công thức cấu tạo Mupirocin impurity 2

Danh pháp: 9-{(E)-4-[(2R ,3RS ,4a S,7S ,8S ,8aR )-3,8-Dihydroxy-2-{(2S ,3S hydroxybutan-2-yl}octahydropyrano[3,2-c]pyran-7-yl]-3-methylbut-2-

)-3-enoyloxy}nonanoic acid

Hình 1.12 Công thức cấu tạo Pseudomonic acid E

Danh pháp: 11-{(E)-4-[(2S ,3R ,4R ,5S )-3,4-Dihydroxy-5-({(2S ,3S [(2S ,3S hydroxybutan-2-yl]oxiran-2-yl}methyl)tetrahydro-2H -pyran-2-yl]-3-methylbut-2-enoyloxy}undecanoic acid

)-3-Hình 1.13 Công thức cấu tạo Mupirocin impurity 3

Danh pháp: 9-((E)-4-{(2S ,3R ,4R ,5S

)-3,4-Dihydroxy-5-[(3-hydroxy-4,5-dimethyltetrahydrofuran-2-yl)methyl]tetrahydro-2H enoyloxy)nonanoic acid

-pyran-2-yl}-3-methylbut-2-Hình 1.14 Công thức cấu tạo Mupirocin impurity 4

Danh pháp: 9-((E)-4-{(2S ,3R ,4R ,5S

)-3,4-Dihydroxy-5-[(3-hydroxy-4,5-dimethyltetrahydrofuran-2-yl)methyl]tetrahydro-2H enoyloxy)nonanoic acid

-pyran-2-yl}-3-methylbut-2-Hình 1.15 Công thức cấu tạo Pseudomonic acid F

Danh pháp: 7-{(E)-4-[(2S ,3R ,4R ,5S )-3,4-Dihydroxy-5-({(2S ,3S [(2S ,3S hydroxybutan-2-yl]oxiran-2-yl}methyl)tetrahydro-2H -pyran-2-yl]-3-methylbut-2-enoyloxy}heptanoic acid

)-3 Trong đó tạp quá trình (hay tạp xuất hiện trong quá trình sản xuất dƣợc chất) là:

+ Pseudomonic acid B (có nhóm hydroxyl ở C8)+ Pseudomonic acid C (có một nối đôi tại C10-C11)+ Pseudomonic acid D (có một nối đôi C4′-C5′ ở chuỗi acid 9 cacbon)+ Pseudomonic acid E ( có chuỗi acid 11 cacbon)

+ Pseudomonic acid F (có chuỗi acid 7 cacbon)-Tạp phân hủy ( xuất hiện trong quá trình bảo quản dƣợc chất):

+ Mupirocin impurity 1

+ Mupirocin impurity 2+ Mupirocin impurity 3+ Mupirocin impurity 4

1.4.2 Con đường phát sinh tạp

+ Đối với tạp quá trình con đường sinh ra tạp đã được nói ở trên

+ Đối với tạp phân hủy

Trong môi trường acid hoặc kiềm thì Mupirocin ( Pseudomonic acid A) bị phân hủythành 2 sản phẩm Mupirocin impurity 1 và 2 như sau [17]:

Hình 1.16 Sản phẩm phân hủy của mupirocin

- Pseudomonic acid D: Có thể gây nguy hiểm khi hít phải Có thể gây kích ứng đường hô

hấp Có thể nguy hiểm khi nuốt phải Có thể nguy hiểm nếu hấp thu qua da vì có thể gâykích ứng Có thể gây kích ứng mắt

1.5 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN THEO USP 40

1.5.1 Mupirocin calcium [28]

1.5.1.1 Công th c cấu tạo

Hình 1.17 Công thức cấu tạo Mupirocin

Bằng phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò UV-Vis ở bước sóng 240 nm

- Dung dịch 0,1 M amoni acetat: cân 7,7 g amoni acetat pha trong bình định mức 1000

ml, thêm 900 ml nước, chỉnh pH 5,7 bằng acic acetic, thêm nước vừa đủ

- Pha động: 0,1 M amonium acetat- dung dịch THF (68 : 32)

- Dung dịch chuẩn : Cân chính xác 25 mg chuẩn Mupirocin lithium, thêm 5 ml methanol

và pha loãng đến 200 ml với 0,1 M amonium acetat

- Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng mẫu thử tương ứng khoảng 25 mg Mupirocin,

thêm 5 ml methanol, pha loãng đến 200 ml với 0,1 M amonium acetat

- Dung dịch phân giải: Điều chỉnh 10 ml dung dịch thử đến pH 2 bằng dung dịch acid

hydrocloric 6 N và để yên 20 giờ

- Pha động: dung dịch 0,1M amonium acetat - THF (70: 30)

- Dung dịch đệm acetat pH 4: Natri acetat 13,6 g/L (đã được điều chỉnh đến pH 4 bằngacid acetic)

Dung môi pha loãng: Dung dịch đệm acetat pH 4 - MeOH (1: 1)

Dung dịch chuẩn: hòa tan 25mg chuẩn mupirocin lithium trong dung môi pha mẫu đến

200 ml

-Dung dịch thử: Hòa tan một lượng mẫu thử tương ứng với 50mg Mupirocin calcium

bằng dung môi pha mẫu trong bình định mức 10ml

-Dung dịch phân giải : điều chỉnh 10ml dung dịch chuẩn tới pH 2 bằng HCl 6N, để yên

20 giờ rồi chỉnh với NaOH 5 N đến pH 4

Điều kiện sắc ký:

Tốc độ dòng 1ml/phút, bước sóng 240 nm

Thể tích tiêm 20ul

Sắc ký dung dịch phân giải : 2 pic quan sát được với thời gian lưu tương đối 0,63 và 0,67

so với Mupirocin, hệ số phân giải giữa pic thứ 2 của 2 pic thủy giải và pic tương ứngMupirocin phải ≥ 7

Sắc ký dung dịch chuẩn : Số đĩa lý thuyết tương ứng Mupirocin ≥ 3000

Hệ số kéo đuôi của Mupirocin ≤ 2RSD của thời gian lưu và diện tích Mupirocin (độ lặp lại ) ≤ 5%-Giới hạn :

+ Pseudomonic acid D≤ 2,5 %

+ Các tạp khác : mỗi tạp ≤ 1%

+ Tổng các tạp ≤ 4,5%

+ Bỏ qua các pic có diện tích ≤ 0,05% so với diện tích pic mupirocin

1.5.2 Định tính , định lượng kem Mupirocin theo USP 40 [28]

1.5.2.1 Đ nh tính

-Dựa vào thời gian lưu của pic chinh trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu so với dungdich thử

1.5.2.2 Đ ng

- Dung dịch 0,1 M amoni acetat : cân 7,7 g amonium acetat pha trong BĐM 1000 ml,

thêm 900 ml nước, chỉnh pH 5,7 bằng acic acetic , thêm nước vừa đủ

-Dung dịch A : 0,1 M amonium acetat - THF (75:25)

-Dung dịch B: 0,1 M amonium acetat - THF (70:30)

Pha động theo chương trình gradient:

Bảng 1.1 Chương trình gradient định lương tạp theo USP 40 Thời gian

(phút)

Dung dich A (% v/v)

Dung dịch B (% v/v)

Dung dich đêm pH 6,3 :69 g NaH2PO4 thêm 800 ml nước , chỉnh với NaOH đến pH 6,3,thêm nước vừa đủ 1000ml

Dung dịch chuẩn : Hòa tan chuẩn Mupirocin Lithium trong dung dịch pH 6,3 để thu

được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/mL

Dung dich thử : phân tán một lượng kem tương ứng với 10mg Mupirocin vào bình định

mức 100ml, thêm 50 ml dung dịch đệm pH 6,3 rồi thêm 25 ml dung dịch tetrehydrofuran.Đậy nắp, lắc 1 đến 3 phút, thêm dung dịch pH 6,3 vừa đủ Để yên cho lớp mỡ tách ra sau

đó pha loãng đến vừa đủ bằng dung dịch pH 6,3 Lặp lại 2 đến 3 lần cho đến khi lớp mỡtách ra hết cuối cùng lấy lớp dung dịch ở dưới lọc qua màng lọc 0,5 µm Dung dịch này

có nồng độ khoảng 0,1mg/ml mupirocin

-Điều kiện sắc ký:

Sắc ký dung dich mẫu chuẩn (Pseudomonic acid D là thành phần phụ luôn hiện diệntrong Mupirocin calcium

Thời gian lưu tương đối của Pseudomonic acid D khoảng 0,75 so với Mupirocin

Hệ số phân giải của Pseudomonic acid D và Mupirocin ≥ 3

Số đĩa lý thuyết đối với Mupirocin ≥ 7000

Hệ số kéo đuôi mupirocin ≤ 1,75

RSD của thời gian lưu và diện tích pic mupirocin của độ lặp lại ≤ 2%

-Hỗn hợp dung dịch natri acetat và dung dịchTHF : trộn theo tỷ lệ 50: 50

Dung dịch thử tính phù hợp hệ thống : dung dịch chuẩn, chuẩn bị như phần định lượng

- Dung dịch thử gốc: Cân một lượng kem tương ứng với 50mg Mupirocin vào ống ly tâm

có nắp đậy, thêm 5ml THF, lắc vortex, thêm 5ml dung dịch natri acetat, lắc, ly tâm 15phút Hút lớp dưới lọc qua màng lọc 0,5 µm

- Dung dịch mẫu thử: Hút 1ml dung dịch thử gốc cho vào bình định mức 50 ml, thêm hỗnhợp dung dịch natri acetat và dung dịch THF, lọc qua màng lọc 0,5 µm

Tiến hành sắc ký như phần định lượng

-Tiêm sắc ký dung dịch thử gốc Xác định pic dựa vào thời gian lưu tương đối so vớiMupirocin của tạp theo bảng ở dưới

Hệ số phân giải giữa pic Mupirocin và pic Pseudomonic acid D ≥ 3

Số đĩa lý thuyết ứng với pic Mupirocin ≥ 7000

Hệ số bất đối xứng của pic mupirocin ≤ 1,75

RSD của thời gian lưu và diện tích pic mupirocin của độ lặp lại ≤ 2%

Bảng 1.3 Các nghiên cứu liên quan đến định lƣợng Mupirocin và tạp liên quan

(nm)

TLT K

Mupirocin và

Mometasone furoate

Cột C 18 250x4.6mm 5µm

-Acetonitril – NaH 2 PO 4 pH 6.8 (70:30 v/v))

Mupirocin và

Metronidazol

Cột C 18 Phenomenex (4.6mm x 240mm x5µm)

0.1% H 3 PO 4 đệm– methanol (50:50 v/v)

λ 220 [30]

Mupirocin và

Metronidazol

Cột C 18 Water’s X-bridge (4.6mm x 150mm x 5µm)

A: NaH 2 PO 4 +0.4% TEA pH 2.5

A : 0.025M Na 2 HPO 4 pH 3

B : acetonitril Gradient pha động

Nhận xét:

-Đa số các nghiên cứu trên đều tập trung vào việc định lượng Mupirocin hoặc Mupirocinphối với hoạt chất khác trong các chế phẩm, ít có nghiên cứu hay tài liệu về phân tích cáctạp chất liên quan của Mupirocin, hoặc nếu có thì cũng chỉ tập trung vào việc phân tíchđược Mupirocin tách ra khỏi các tạp, hoặc định lượng hoạt chất Mupirocin còn lại sau khi

để chế phẩm trong những điều kiện khắc nghiệt, còn việc phân tách từng tạp chất ra khỏinhau thì ít tài liệu đề cập đến

Do đó một quy trình đặc hiệu để phân tích các tạp chất liên quan là rất cần thiết để kiểmsoát chất lượng thành phẩm kem Mupirocin lưu hành trên thị trường cũng như có mộtquy trình để các nhà sản xuất áp dụng

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU- HÓA CHẤT- TRANG THIẾT BỊ

2.1.1.Chất đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu

Nguyên liệu đối chiếu Mupirocin calcium USP

Số lot : 34117021Hàm lượng: 90,1%

Nguồn gốc : Ấn Độ

2.1.2 Mẫu thành phẩm kem mupirocin calcium 2% của công ty dược

Thành phần của nền mẫu kem ( mẫu placebo) được trình bày ở Bảng 2.1

2.1.3 Dung môi , hóa chất

- Dung môi dùng cho sắc ký lỏng: Acetonitril, Methanol, Tetrahydrofuran ( J.T Baker)nước cất

- Hóa chất- dung môi dùng cho phân tích: Amoni acetat, Kali dihidrophosphat,, acidacetic , acid formic, natrihydroxyd, acid clohydric

2.1.4 Trang thiết bị

Bảng 2.2 Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

2 Cân phân tích Mettler Toledo

- Các thiết bị phân tích đã được hiệu chuẩn đạt quy định theo ISO 17025: 2005

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Khảo sát các điều kiện khắc nghiệt để tạo ra tạp Mupirocin Impurity 1, Mupirocin Impurity 2, Mupirocin Impurity 3 và Mupirocin Impurity 4

Khảo sát trên mẫu nguyên liệu

-Mẫu Mupirocin nồng độ 0,1mg/ml: Cân chính xác một lượng mẫu nguyên liệu tươngứng khoảng 20 mg Mupirocin calci, thêm 5 ml methanol, pha loãng đến 200 ml với 0,1

M amoni acetat (mẫu N)

- Mẫu Mupirocin nồng độ 5mg/ml: Hòa tan một lượng mẫu nguyên liệu tương ứng với50mg Mupirocin calci bằng dung môi pha mẫu trong bình định mức 10ml

Dung môi pha mẫu: Dung dịch đệm acetat pH 4 - methanol theo tỷ lệ 1: 1

- Dung dịch 0,1 M amonium acetat: cân 7,7 g amonium acetat pha trong bình định mức

1000 ml, thêm 900 ml nước, chỉnh pH 5,7 bằng acic acetic, thêm nước vừa đủ

-Dung dịch đệm acetat pH 4: Natri acetat 13,6 g/L (đã được điều chỉnh đến pH 4 bằng

acid acetic)

2.2.1.3 Khả s ều kiện khắc nghiệt

a/ Phân hủy trong môi trường HCl 6N pH 2 trong 20h [28]

Lấy mẫu N, hút 10 ml dung dịch này điều chỉnh đến pH 2 bằng dung dịch acidhydrocloric 6 N và để yên 20h

b/ Phân hủy trong môi trường HCl 6N pH 2 1h, 2h, 4h, 6h

Lấy mẫu N, hút 10 ml dung dịch này điều chỉnh đến pH 2 bằng dung dịch acidhydrocloric 6 N và để yên 1h, 2h, 4h , 6h

c/ Phân hủy mẫu trong điều kiện ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp

Mẫu N để trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời khoảng 4 giờ Sau đó phân tích bằng HPLC.[11]

d/ Phân hủy trong môi trường H 2 O 2 3% [25]

Cân khoảng 10mg Mupirocin vào BĐM 10ml, thêm vài giọt MeOH để hòa tan, thêm vừa

hỗn hợp dung môi đệm acetat pH 4 và methanol tỷ lệ 1:1 vừa đủ, lọc rồi phân tích bằngHPLC

e/ Phân hủy trong môi trường pH 2, nhiệt độ 70 0 C

Mẫu N, hút 10 ml dung dịch này điều chỉnh đến pH 2 bằng dung dịch acid hydrocloric 6

C trong 30 phút, 1h

f/ Phân hủy trong môi trường pH2, nhiệt độ 50 0 C

Mẫu N, hút 10 ml dung dịch này điều chỉnh đến pH 2 bằng dung dịch acid hydrocloric 6

g/ Phân hủy trong môi trường pH2, nhiệt độ 45 0 C

Mẫu N, hút 10 ml dung dịch này điều chỉnh đến pH 2 bằng dung dịch acid hydrocloric 6

h/ Phân hủy mẫu nồng độ Mupirocin 5mg/ml, pH 2

Mẫu nguyên liệu Mupirocin nồng độ 5mg/ml Chỉnh về pH 2 bằng HCl 6N, sau đó để

i/ Phân hủy mẫu nồng độ Mupirocin 5mg/ml

2.2.2- Xây dựng quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của Mupirocin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA.

2.2.2.1 Khả s ộ THF: ệm amoniacetat pH 5,7.

a/ Khảo sát từ điều kiện sắc ký ban đầu là chương trình sắc ký 2

Bảng 2.2 Chương trình sắc ký 2 Thời gian

(phút)

Tetrahydrofuran

(%)

Đêm pH 5,7 (%)

 Khảo sát chương trình gradient A

Bảng 2.3 Các chương trình gradient A ( THF: đệm) Chương trình

gradient

Thời gian

Đệm pH 5,7 (%)

Tốc độ dòng (ml/phút)

THF :H 2 O(75 :25)

(%)

Đệm pH 5,7 (%)

Tốc độ dòng (ml/phút)