Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số dẫn chất 2,5 diaryl 1,3,4 oxadiazol

Nội dung chính: Đề tài được thực hiện gồm 4 nội dung chính sau: 1 Tổng hợp một số dẫn chất 2,5-diaryl-1,3,4-oxadiazol 2 Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các chất tổng hợp 3 Khảo sá

Trang 1

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

Trang 2

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

Trang 3

− Mã số: 195-17 (số đăng ký)

− Chủ nhiệm đề tài: TS.DS Trần Ngọc Châu

− Điện thoại: 09 38 77 66 35 Email: tranchau@ump.edu.vn

− Đơn vị quản lý về chuyên môn: Bộ môn Hóa Dược – Khoa Dược

− Thời gian thực hiện: từ 01/10/2017 đến 01/10/2018

− Thành viên tham gia:

 TS Vũ Thanh Thảo (giảng viên bộ môn Vi Ký sinh)

 Sinh viên Võ Hoàng Nam (nghiệm chế viên bộ môn Hóa Dược)

2 Mục tiêu:

Tổng hợp một số dẫn chất 2,5-diaryl-1,3,4-oxadiazol để sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn Đồngthời tìm hiểu mối liên quan cấu trúc và tác dụng để góp phần định hướng cho nghiên cứu tổnghợp các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn tốt

3 Nội dung chính:

Đề tài được thực hiện gồm 4 nội dung chính sau:

1) Tổng hợp một số dẫn chất 2,5-diaryl-1,3,4-oxadiazol

2) Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các chất tổng hợp

3) Khảo sát tác dụng kháng khuẩn của các chất

4) Tìm hiểu mối liên quan cấu trúc các dẫn chất và tác dụng kháng khuẩn

4 Kết quả chính đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):

Về đào tạo: hướng dẫn nghiên cứu khoa học cho 1 sinh viên Võ Hoàng Nam (sinh viên lớp

Dược liên thông DLT 2013) đã tốt nghiệp Dược sĩ đại học

Công bố khoa học: Kết quả của nghiên cứu được đăng trên tạp chí Y học TP.HCM

Võ Hoàng Nam, Vũ Thanh Thảo, Trần Ngọc Châu (2018) “Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của

một số dẫn chất 1,3,4-oxadiazol” Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, chuyên đề Dược, phụ bản tập 22, số

1, trang 486-493.

Trang 5

Danh mục chữ viết tắt IV Danh mục bảng V Danh mục hình VI

Chương 1 Đặt vấn đề 1

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Hoạt tính sinh học các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol 3

2.2 Cấu trúc và tính chất dị vòng 1,3,4-oxadiazol 7

2.3 Phương pháp tổng hợp dị vòng 1,3,4-oxadiazol 10

Chương 3 Đối tượng & phương pháp nghiên cứu 16

3.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.2 Nguyên liệu và trang thiết bị 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4 Xác định độ tinh khiết và xác định cấu trúc 20

3.5 Thử hoạt tính kháng khuẩn 21

Chương 4 Kết quả và bàn luận 26

4.1 Kết quả tổng hợp hóa học 26

4.2 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn 48

Chương 5 Kết luận và đề nghị 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 52

Tài liệu tham khảo VI Phụ lục PL-1

Trang 6

Chữ tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

MHA Mueller – Hinton

MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

TSA Tryptycase Soy Agar

TSB Tryptycase Soy Broth

Trang 7

Bảng 3.1 Danh sách nguyên liệu hóa chất dùng trong tổng hợp và tinh chế 16

Bảng 4.1 Bảng tổng hợp thông tin của các N-acyl hydrazon tổng hợp được 43

Bảng 4.2 Bảng tổng hợp thông tin của các 1,3,4-oxadiazol tổng hợp được 45

Bảng 4.3 Định tính khả năng kháng khuẩn (đường kính vòng kháng khuẩn, mm) 48

Bảng 4.4 MIC của các chất thử nghiệm 49

Trang 8

Hình 2.1 Cấu trúc dị vòng 1,3,4-oxadiazol 3

Hình 2.2 Các đồng phân của oxadiazol 8

Hình 2.3 Các hướng chính tổng hợp 1,3,4-oxadiazol 10

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp các N-acyl hyrazon 19

Hình 3.2 Công thức cấu tạo của Cloramin B 20

Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất 1,3,4-oxadiazol 20

Hình 3.4 Đĩa thạch định tính khả năng kháng khuẩn 22

Hình 3.5 Đĩa thạch xác định MIC 25

Trang 9

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Gần 100 năm từ khi kháng sinh penicillin được tìm ra đến nay, hàng trăm loạikháng sinh đã được phát minh và đưa vào sử dụng Sự ra đời của kháng sinh đãđánh dấu một kỷ nguyên mới của y học về điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, đã cứusống hàng triệu người khỏi các bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm Kháng sinh còn được

sử dụng rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản… Tuynhiên cũng do việc sử dụng rộng rãi, kéo dài và lạm dụng, chưa hợp lý, nên tìnhtrạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn ngày một gia tăng Mức độ kháng thuốcngày càng trầm trọng làm ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị, tiên lượng xấu, nguy cơ

tử vong cao, thời gian điều trị kéo dài, chi phí điều trị tăng cao, ảnh hưởng đến sứckhỏe người bệnh và cộng đồng [29]

Đề kháng kháng sinh được báo cáo nhiều nơi trên thế giới, trong đó có châu Âu,phân tích từ Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh Châu Âu (ECDC) năm 2009ước tính rằng nhiễm trùng do các vi khuẩn kháng thuốc đã gây ra khoảng 25 000 ca

tử vong ở châu Âu hàng năm Ngoài những ca tử vong có thể tránh được, thì chiphí chăm sóc sức khoẻ thiệt hại ước tính ít nhất là 1,5 tỷ euro [21] Tại Việt Nam,kết quả của “Khảo sát đề kháng kháng sinh của một số vi khuẩn phân lập tại bệnh

viện Quận 2 TP HCM” năm 2016: tỷ lệ kháng kháng sinh của E Coli sinh ESBL:

cefuroxim 100%, ceftriazon 100%, ceftazidim 81,25% cho thấy trình trạng khángkháng sinh khá cao [3]

Việc tìm ra các kháng sinh mới là nhu cầu cấp thiết Trong các tác nhân khángkhuẩn đang được nghiên cứu, các dẫn chất dị vòng 1,3,4-oxadiazol được nghiên cứukhá nhiều trong hóa học hữu cơ Có nhiều yếu tố kích thích sự quan tâm đến cáchợp chất này Nhờ có hoạt tính sinh học rất đa dạng, các dẫn xuất dị vòng 1,3,4-oxadiazol có thể được dùng trong y học để kháng khuẩn, kháng nấm mốc, làmthuốc giảm đau, kháng viêm [7]

Vì những lý do trên, trong phạm vi đề tài khóa luận tốt nghiệp và điều kiện phòng thí

nghiệm nghiên cứu“ Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số

Trang 10

dẫn chất 1,3,4-oxadiazol” nhằm tạo ra các hợp chất mới có tiềm năng về mặt sinh

học, ứng dụng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi khuẩn trong cơ thể con người.Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là tổng hợp các dẫn chất dị vòng 1,3,4-oxadiazol vàkhảo sát hoạt tính kháng khuẩn với mục tiêu cụ thể là:

1 Tổng hợp dẫn chất thế chứa dị vòng 1,3,4-oxadiazol,

2 Xác định cấu trúc sản phẩm và độ tinh khiết bằng phương pháp đo điểm chảy, sắc

ký lớp mỏng, quang phổ hổng ngoại IR, khối phổ MS và phổ cộng hưởng từ hạtnhân 1H-NMR,

3 Thử hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol đã tổng hợp được

Trang 11

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC DẪN CHẤT 1,3,4-OXADIAZOL

Các hợp chất có chứa dị vòng oxadiazol nói chung, đặc biệt là dị vòng oxadiazol đã được nghiên cứu rất nhiều trong vài thập kỷ qua Kết quả từ nhiềunghiên cứu đã được công bố cho thấy các dẫn chất này có hoạt tính sinh học đa dạngkhác nhau [59]

1,3,4-Hình 2.1 Cấu trúc dị vòng 1,3,4-oxadiazol

Một số dẫn chất 1,3,4-oxadiazol thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật rất tốt như:kháng khuẩn [10], kháng lao [24] , kháng nấm [26] Ngoài ra, một số dẫn chất kháclại thể hiện khả năng gây độc tế bào [46], chống viêm và giảm đau [41], hạ lipid máu[32], chống ung thư [35], chống loét [11], chống co giật [33] và các hoạt tính khác…

2.1.1 Các thuốc có cấu trúc 1,3,4-oxadiazol

Các hợp chất dị vòng 1,3,4-oxadiazol được tổng hợp qua nhiều phản ứng hóa học,tạo được nhiều hợp chất quan trọng, có tiềm năng sinh học to lớn Hai ví dụ của cáchợp chất có chứa dị vòng 1,3,4-oxadiazol hiện đang được sử dụng trên lâm sàng là:Raltegravir thuốc kháng retrovirus [56] và Zibotentan tác nhân chống ung thư [31]

Trang 12

2.1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của dẫn chất 1,3,4-oxadiazol

Nghiên cứu được công bố năm 2014 của Ajmer Singh Grewal và cộng sự cho thấyhoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất 1,3,4-oxadiazol Các chất được tổng hợp

có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.coli với vùng ức chế (đường kính)

nằm trong khoảng 15-24 mm Trong số các hợp chất được tổng hợp, (1f) được tìmthấy là hợp chất hoạt động mạnh nhất vùng ức chế 24 mm khi so sánh với kháng sinhđối chiếu là carbenicillin (vùng ức chế 25 mm) Hợp chất (1b) với vùng ức chế 23

mm so với kháng sinh đối chiếu Các hợp chất tổng hợp khác cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn vừa phải với E.coli [26].

Năm 2010, Patel và cộng sự đã xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số dẫn chất

có chứa khung cấu trúc 1,3,4-oxadiazol trên một số loài vi khuẩn gây bệnh thường

gặp (2 chủng vi khuẩn gram dương là S aureus MTCC 96, S pyogenes MTCC 442

và 2 chủng vi khuẩn gram âm là E coli MTCC 443 và P aeruginosa MTCC 1688).

Ampicillin được sử dụng như kháng sinh đối chiếu Kết quả cho thấy các hợp chất(2), (3) có tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn 2 và 5 lần với ampicillin [48]

Năm 2011, Desai và cộng sự đã thiết kế và sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của một

số hợp chất 1,3,4-oxadiazol có cấu trúc như hình vẽ (4) Mười hai chất tổng hợp đã

Trang 13

được sàng lọc khả năng kháng khuẩn trên các loại vi khuẩn gram dương S aureus (MTCC 96), Staphylococcus pyogenes (MTCC 442) và vi khuẩn gram âm E coli (MTCC 443), P aeruginosa (MTCC 1688) bằng phương pháp pha loãng Hoạt tính

kháng khuẩn của các hợp chất đã tổng hợp từ trung bình đến tốt Các hợp chất vớicác nhóm thế 2,4-dimethyl, 3-OCH3 ,và 3,4-dichlorocho hoạt tính kháng khuẩn tốt[18]

Kumar và công sự (2010) đã tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất

(5) được nghiên cứu chống lại sự phát triển của Klebsiella pneumoniae, Escherichia

coli (gram âm) và Bacillus subtilis, Streptococus aureus (gram dương), những hợp

chất này được sử dụng hai nồng độ (25 và 50 ppm) Phần lớn các hợp chất này có

tính kháng khuẩn đáng lưu ý Hoạt tính ức chế E coli, Klebsiella pneumonia, B.

subtilis và S aureus được so sánh với kháng sinh streptomycin Trong những hợp

chất được tổng hợp thì các hợp chất (5c) và (5h) thể hiện hoạt tính gần bằng vớichuẩn streptomycin [36]

Maldali và cộng sự (2013) đã tổng hợp và đánh giá khả năng kháng khuẩn của dẫnchất chứa dị vòng 1,3,4-oxadiazol với cấu trúc (6) Kết quả cho thấy hầu hết các hợpchất được kiểm tra ức chế vi khuẩn từ vừa đến tốt [40]

Trang 14

Ngoài các nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất oxadiazol thì ở Việt Nam năm 2012 Nguyễn Thị Sơn tổng hợp và thử hoạt tínhkháng khuẩn của một số hợp chất 1,3,4-oxadiazol có khung cấu trúc như hình vẽ (7)

1,3,4-có khả năng kháng vi khuẩn E coli với nồng độ thấp 15 μg/ml [1].

Năm 2015, Lê Hoàng Trung Hiếu đã tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩncủa những hợp chất được nghiên cứu, trong số những hợp chất đã tổng hợp thì hợp

chất số (8) có hoạt tính mạnh trên cả S aureus và MRSA (MIC = 8 μg/ml) [4].

Gần đây nhất năm 2016 Vũ Phạm Mỹ Trinh đã tổng hợp và đánh giá hoạt tính khángkhuẩn của dị vòng 1,3,4-oxadiazol (9) Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất đãtổng hợp từ trung bình đến tốt đối với vi khuẩn gram dương Các hợp chất mangnhóm thế: 4-fluoro, 3,4-dicloro, 3-nitro; có MIC = 4 µg/ml với chủng MRSA; vớichủng MSSA có MIC = 4 µg/ml với nhóm thế 3,4-dicloro, 8 µg/ml với nhóm thế 3-

nitro, 16 µg/ml với nhóm thế 4-fluoro; với chủng Streptococcus faecalis các kết quả

đáng chú ý là 4 µg/ml với nhóm thế 3,4-dicloro, 16 µg/ml với nhóm thế 3-nitro [2]

Ngoài ra một số dẫn chất có cấu trúc rất gần với 1,3,4-oxadiazol là 1,3,4-oxadiazolincũng được quan tâm nghiên cứu Theo Olivera C.S và cộng sự (2012), đã tổng hợp

Trang 15

và khảo sát hoạt tính của dẫn chất 1,3,4-oxadiazolin (10) trên các chủng S aureus,

kháng methicillin và amino glycosid (MARSA), và kháng đa thuốc – MDR Các hợpchất cho thấy hiệu quả trong việc ức chế hoạt động của những vi khuẩn này ở nồng

độ từ 4-32 μg/mL Các hợp chất này mạnh hơn chloramphenicol chuẩn từ 2-8 lần[17]

Ở trong nước cũng có nhiều nghiên cứu tập trung vào hoạt tính sinh học của cấu trúcnày Năm 2016, Nguyễn Thị Mai Hiên đã tổng hợp và đánh giá hoạt tính khángkhuẩn của một số dẫn chất 1,3,4-oxadiazolin có khung cấu trúc như hình vẽ (11).Nhìn chung, các chất tổng hợp có tác dụng kháng khuẩn từ yếu đến trung bình [5]

2.1.3 Nhận xét và kết luận

Như vậy sau khi liệt kê tác dụng sinh học, đặc biệt là tác dụng kháng khuẩn, chúngtôi có thể thấy dị vòng 1,3,4-oxadiazol có thể có vai trò kháng khuẩn, có thể khithay đổi ở vị trí cacbon số 2 và số 5 của khung cấu trúc 1,3,4-oxadiazol thườngdẫn đến hoạt tính sinh học của chúng, có thể tác động này phụ thuộc vào nhóm thếhoặc vòng khác trong cấu trúc, có rất nhiều cấu trúc khác nhau có thay đổi hoạt tính,

có thể gắn vào mất hoạt tính Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính khángkhuẩn của dẫn chất có dị vòng 1,3,4-oxadiazol

2.2 CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT DỊ VÒNG 1,3,4-OXADIAZOL

2.2.1 Cấu trúc của dị vòng 1,3,4-oxadiazol

Dị vòng oxadiazol là dị vòng 5 cạnh chứa một nguyên tố oxy và hai nguyên tố

Trang 16

nitơ với công thức phân tử C2H2N2O Dị vòng oxadiazol có 4 đồng phân: oxadiazol, 1,2,4-oxadiazol, 1,2,5-oxadiazol, 1,3,4-oxadiazol.

1,2,3-Hình 2.2 Các đồng phân của oxadiazol

Trong các dị vòng oxadiazol với cấu trúc như hình vẽ trên, chúng tôi quan tâmđến dị vòng 1,3,4-oxadiazol vì có nhiều nghiên cứu được thực hiện trên các dẫnchất này và một số phương pháp tổng hợp có thể thực hiện được trong điều kiệnphòng thí nghiệm của chúng tôi

2.2.2 Tính chất của dị vòng 1,3,4-oxadiazol

CTPT: C2H2N2O, khối lượng phân tử 70,05 g/mol 1,3,4-oxadiazol là chất lỏng,khối lượng riêng 1,193 g/cm3 Các hợp chất thế ở vị trí 2 và 5 của dị vòng 1,3,4-oxadiazol là những hợp chất không màu Tính tan trong nước của 1,3,4-oxadiazol phụ thuộc vào nhiều nhóm thế, ví dụ như: 2,5-dimethyl-1,3,4-oxadiazol tan trong nước ở mọi tỉ lệ, trong khi đó 2,5-diphenyl-1,3,4-oxadiazolthì kém tan trong nước Nhiệt độ sôi 150 oC Hợp chất thế 1,3,4-oxadizaol đốixứng có nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi cao hơn 1,3,4-oxadiazol bất đốixứng, khi thay gốc alkyl bằng aryl thì nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi cũngtăng lên

Phổ IR hấp thu đặc trưng của 1,3,4-oxadiazol: đỉnh hấp thu tại 1640-1650 cm-1(C=N), 1020 cm-1 (C−O) [53]

1,3,4-oxadiazol có tính base yếu

Sự rút điện tử của hai N làm cho mật độ electron tại C của vòng thấp, dẫn đếnphản ứng thế với tác nhân ái điện tử khó xảy ra Các hợp chất vòng 1,3,4-oxadiazol luôn có hệ số phân bố dầu nước (log P) thấp hơn so với các hợp chất

Trang 17

đồng phân của nó.

Phản ứng với tác nhân ái nhân [45]

Phản ứng này không phổ biến Nhiều tác nhân mở vòng được hay không tùythuộc vào mật độ electron tại C-2 và C-5 của vòng 1,3,4-oxadiazol Nói chungaryl được thế ở vòng 1,3,4-oxadiazol ít nhạy cảm với acid hơn alkyl

Phản ứng với tác nhân ái điện tử [6]

Do mật độ electron trên nguyên tử C thấp cũng như khả năng proton hóa củanguyên tử N mà các phản ứng thế với tác nhân ái điện tử rất khó xảy ra Vòngoxadiazol được gắn nhóm cho điện tử tại C số 2 và 5 có thể tham gia phản ứngthế ái điện tử tại nguyên tử N

Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ [6]

Vòng 1,3,4-oxadiazol rất bền với nhiệt Khi gắn thêm các nhóm aryl hoặc perfoalkyl,

độ bền nhiệt của vòng sẽ tăng lên Tại nhiệt độ (210-230 oC), oxadiazolinon bịdecarboxy hóa tạo thành nitrilimin

Trang 18

Phản ứng tạo các hợp chất vòng khác [45]

Vòng 1,3,4-Oxadiazol có thể chuyển thành các dị vòng khác Ví dụ sự hiện diệnhydrazin hydrat nó có thể được chuyển thành triazol amin hoặc với sự có mặt củathioure nó có thể chuyển đổi thành thiadiazol

2.3 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DỊ VÒNG 1,3,4-OXADIAZOL

Có nhiều phương pháp tổng hợp dị vòng 1,3,4-oxadizol, nhưng có 4 hướng chínhđược tóm tắt theo theo hình vẽ sau:

Hình 2.3 Các hướng chính tổng hợp 1,3,4-oxadiazol

Trang 19

2.3.1 Tổng hợp từ dẫn chất N-acyl hyrazon

Dẫn chất thế ở vị trí 2 và 5 của vòng 1,3,4-oxadiazol đã được điều chế bằng cách oxi

hóa đóng vòng N-acyl hydrazon Phản ứng này được thực hiện bởi các phương pháp

khác nhau với các chất oxy hóa khác nhau như :

Phương pháp 1: dùng Dess-Martin periodinan (DMP) trong các dung môi khác

nhau như dichloromethan, dimethylformamid (DMF) và acetonitril [19]

Phương pháp 2: dùng hỗn hợp N-chlorosuccinimid (NCS) và 1,8-diazabicyclo

[5.4.0] undec-7-ene (DBU) trong dichlormethan [47]

Phương pháp 3: dùng tert-butyl hypoiodit (t-BuOI) mới sinh được tạo ra từ t-BuOCl

và NaI trong các dung môi khác nhau như nước, ethanol [23]

Phương pháp 4: dùng iodobenzen diacetat trong dichloromethan (DCM) [50]

Phương pháp 5: dùng cloramin T trong ethanol [43]

Phương pháp 6: dùng diacetoxyiodo benzen (DIB) trong DCM [52]

Trang 20

Phương pháp 7: dùng xúc tác Cu(OTf)2, Cs2CO3, và oxy không khí [27]

Trong một nghiên cứu liên quan tổng hợp dẫn chất 1,3,4-oxadiazolin: các dẫn chất

N-acyl hydrazon được đóng vòng với xúc tác là anhydrid acetic (phương pháp 8)

[22]

Ngoài ra, các dẫn chất N-acyl hydrazon có thể được đóng vòng bởi các tác nhân:

HgO, MgO và Iod Hoặc được đóng vòng trong pyridin và benzoyl clorid [57]

2.3.2 Tổng hợp từ dẫn chất hydrazid

Tổng hợp dẫn chất 1,3,4-oxadiazol bằng cách ngưng tụ acyl hydrazid với cácbenzaldehyd bởi các tác nhân oxi hóa đóng vòng khác nhau như: ceric ammoni nitrat(CAN) trong dichloromethan (DCM) [15] hoặc trichloroisocyanuric acid (TCCA)trong ethanol [49]

Trang 21

Các acyl hydrazid được đóng vóng trực tiếp bằng alpha-bromo nitroalkan:[61]

Cacbohydrazid cho phản ứng vớicarbon disulphid và kali hydroxid trong môi trườngethanol, được đun hồi lưu cho ra dẫn chất 1,3,4-oxadiazol:[12]

Dẫn chất 1,3,4-oxadiazol được tổng hợp từ acyl hydrazid và cyanogen bromid:[16]

Dẫn chất 1,3,4-oxadiazol được tổng hợp từ acyl hydrazid và yl)methanimin:[16]

di(benzotriazol-1-Nghiền aryl hydrazid với aldehyd thơm với xúc tác là iod ở nhiệt độ phòng cũng thuđược dẫn chất 1,3,4-oxadiazol Phương pháp này đơn giản, hiệu quả cao và thânthiện với môi trường, và tránh sử dụng các dung môi hữu cơ trong phản ứng [34]

Trang 22

2.3.3 Tổng hợp từ dẫn chất diacyl hydrazin

Đóng vòng diacyl hydrazin với thionyl chlorid cho ra dẫn chất 1,3,4-oxadiazol:[42]

Dẫn chất 1,3,4-oxadiazol được tổng hợp từ dẫn chất diacyl hydazin với xúc táctriphenylphosphin oxid và triflic anhydrid:[13]

Tổng hợp các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol đi từ 1,2-diacyl hydrazin và zirconium (IV)chlorid:[58]

2.3.4 Tổng hợp từ dẫn chất N-acyl thiosemicarbazid

Dẫn chất N-acyl thiosemicarbazid được tách lưu huỳnh và đóng vòng bằng các tác

nhân khác nhau: chẳng hạn như iod và kali cacbonat trong ethanol vàdichloromethan.[28]

Trang 23

Phản ứng cũng có thể được thực hiện với xúc tác iodoxybenzoic acid (IBX) trongtriethylamin,[14]

Ngoài ra, dùng chất xúc tác là tosyl clorid và pyridin trong tetrahydrofuran(THF)cũng đóng vòng tạo 1,3,4-oxadiazol [20]

Dẫn chất 1,3,4-oxadiazol được tổng hợp từ acyl thiosemicarbazid và 5,5-dimethylhydantoin:[55]

1,3-dibromo-2.3.5 Tổng hợp từ một số dẫn chất khác

Tổng hợp dẫn chất 1,3,4-oxadiazol từ dị vòng tetrazol trong pyridin ở 50o

C:[59]

Tổng hợp dẫn chất 1,3,4-oxadiazol từ semicarbazon:[51]

Trang 24

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các N-acyl hydrazon tổng hợp từ INH và các dẫn chất benzaldehyd

Dẫn chất 1,3,4-oxadiazol đi từ N-acyl hydrazon đã tổng hợp

3.2 NGUYÊN LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ

3.2.1 Nguyên liệu

Bảng 3.1 Danh sách nguyên liệu hóa chất dùng trong tổng hợp và tinh chế

1 Isoniazid Số lô: 14806, công ty:

Amsal chem privatelimited, Ấn Độ

Trang 25

10 4-methoxybenzaldehyd Acros >98%

11 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd Acros >99%

12 4-hydroxybenzaldehyd Acros >98%

guanghua, Trung Quốc

>99,5%

15 Acid acetic băng Côngty: Guangdong

guanghua, Trung Quốc

Bản mỏng silicagel GF254 tráng sẵn của Merck

Các dung môi chạy sắc ký: aceton, toluen, cloroform, methanol

Môi trường

Môi trường tăng sinh: NB, TSB, TSA

Môi trường thử nghiệm kháng sinh: (MHA)

Các môi trường này được cung cấp dưới dạng bột khô, khi sử dụng hòa tan vàonước theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các môi trường thạch phải đun nóng chothạch tan Tiệt trùng ở 121oC, 1 atm Môi trường đã hấp tiệt trùng nhưng chưa sửdụng được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-8 o

Trang 26

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Streptococcus faecalis ATCC 29212

Staphylococcus aureus ATCC 29213

Staphylococcus aureus đề kháng methycilin (MRSA) ATCC 43300

3.2.2 Trang thiết bị

Cân phân tích Kern ABS 220-4

Máy khuấy từ gia nhiệt Stuart SB 162

Máy đo điểm chảy Stuart SMP10

Buồng soi UV Vilber Lourmat

Máy đo IR NICOLET iS5

Máy đo phổ MS MSQ Plus của hãng Thermo và máy LC-MS Shimadzu

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance-500

Bình triển khai sắc ký

Ống nghiệm, pipet, micropipet, eppendoff, microwave, que cấy, que bông, đèn cồn,bông gòn, đĩa petri

Bếp cách thủy, tủ sấy, tủ ấm

Máy đo quang Gene Quant 1300

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Từ các phương pháp tổng hợp đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành tổng hợp dẫn chấtchứa dị vòng 1,3,4-oxadiazol từ INH và các benzaldehyd:

Trang 27

Phương pháp đầu tiên là phương pháp nghiền INH với benzaldehyd, xúc tác là Iod.Đây là phương pháp tổng hợp trực tiếp, không qua giai đoạn trung gian, không phải

sử dụng bất kì dung môi hữu cơ nào, thân thiện với môi trường [34] Nhưng chúngtôi thực nghiệm thì thấy: ngoài 1 vết mới thì vẫn còn vết nguyên liệu INH vàbenzaldehyd Do đó chúng tôi tiến hành tổng hợp dẫn chất 1,3,4-oxadiazol qua 2

giai đoạn: tạo acylhydrazon từ INH và các benzaldehyd Sau đó đóng vòng

N-acyl hydrazon được các 1,3,4-oxadiazol tương ứng

3.3.1 Tổng hợp các N-acyl hyrazon từ INH và các benzaldehyd

Hòa tan INH và benzaldehyd (tỉ lệ 1,1 : 1) riêng biệt trong methanol trước khi phốihợp Phối hợp hai nguyên liệu vào bình cầu 100 ml Sau đó thêm vào dung dịch trênvài giọt acid acetic băng, khuấy đều và đun hồi lưu hỗn hợp trên bếp từ gia nhiệt ở60-65 oC [5] Kiểm tra phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp,khi lượng benzaldehyd không còn thì kết thúc phản ứng Thời gian phản ứng từ 1-3giờ Tinh chế sản phẩm: nếu có kết tủa thì để nguội sẽ tủa thêm, lọc lấy tủa, rửa tủavới nước, đem tủa sấy khô; nếu không có tủa thì đem cô quay loại dung môi đượcsản phẩm rắn, rửa sản phẩm rắn nhiều lần với nước để loại INH còn dư, sấy khô,

thu được các N-acyl hyrazon.

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp các N-acyl hyrazon

3.3.2 Tổng hợp dẫn chất 1,3,4-oxadiazol từ N-acyl hydrazon

Chúng tôi đã sử dụng những tác nhân oxi hóa khác nhau để đóng vòng oxadiazol: acid sulfuric đậm đặc, nước javel, iod nhưng không ra được sản phẩmmong muốn, những phương pháp trên ra nhiều tạp rất khó tinh chế Nhưng đến khi

1,3,4-sử dụng Cloramin B để đóng vòng thì xuất hiện một vết mới và 1 vết nghi ngờ là

Trang 28

aldehyd Do đó tôi chọn Cloramin B làm xúc tác đóng vòng N-acyl hydrazon, tiến

hành tổng hợp các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol như sau:

Hòa tan N-acyl hydrazon trong một lượng tối thiểu ethanol hoặc methanol có thể gia

nhiệt nhẹ cho tan hết, sao cho khi để nguội thì không được kết tinh lại Sau đó cho

từ từ Cloramin B đã hòa trong dung môi vào, khuấy từ không cần gia nhiệt Theo

dõi phản ứng bằng SKLM đến khi hết vết N-acyl hydrazon thì kết thúc phản ứng.

Thời gian phản ứng từ 2-4 giờ, cô quay loại dung môi Tinh chế sản phẩm bằng hỗnhợp cổn - nước để loại benzaldehyd sinh ra sau phản ứng

Hình 3.2 Công thức cấu tạo của Cloramin B

Trang 29

Chất thử được xem là tinh khiết khi Rf sản phẩm khác Rf nguyên liệu và trên sắc ký

Các đỉnh phân nhánh được ký hiệu:

s: đỉnh đơn d: đỉnh đôi t: đỉnh ba m: đa đỉnh

3.5 THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

3.5.1 Định tính khả năng kháng khuẩn của các chất thử nghiệm

Sử dụng phương pháp khuếch tán trong thạch [8]

Chuẩn bị

Môi trường

Môi trường hoạt hóa vi khuẩn thử nghiệm: (NB) hay (TSB)

Môi trường thử nghiệm: (MHA) Môi trường MHA được nấu chảy và đổ hộp saocho có được lớp thạch dày khoảng 3-4 mm Nếu bề mặt thạch bị đọng nước cần ủkhô mặt thạch bằng cách mở nắp hộp và để trong tủ ấm 35-37 oC trong 15-30 phút

Vi khuẩn thử nghiệm

Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ.Lấy 3-5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB

Ủ từ 2-6 giờ ở 37 oC để hoạt hóa vi khuẩn

Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu đượctương đương với McFarland 0,5 là khoảng 1,5 x 108 CFU/ml

Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

Trang 30

Để hộp mở nắp trong tủ ấm 3-5 phút cho ráo mặt.

Đặt đĩa giấy lên bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng

Chất thử được nhỏ vào đĩa giấy, đường kính 6 mm khoảng 30 μl

Tiến hành song song với chứng chỉ nhỏ DMSO, không có chất thử

Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch

Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35-37 oC trong 16-18 giờ Nếu vi khuẩn là MRSA thì ủtrong 24 giờ

Đọc kết quả

Khoanh giấy chứng chứa DMSO không ức chế sự phát triển vi khuẩn: ɸ = 6 mmChất thử thể hiện khả năng kháng khuẩn khi xung quanh khoanh giấy có vòngkháng khuẩn

Trang 31

(Semi-Những thử nghiệm này nói chung được gọi là thử nghiệm MIC Kết quả được thểhiện bằng nồng độ chất thử tối thiểu (µg/ml) có khả năng ức chế sự mọc của vikhuẩn.

Nguyên tắc: chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ từ thấp tới cao theo cấp

số nhân trong môi trường nuôi cấy Mỗi nồng độ chất thử được cấy một lượng vikhuẩn nhất định và được nuôi cấy trong vòng 18-24 giờ Nồng độ chất thử thấp nhất

mà ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (môi trường không đục hoặc vi khuẩnkhông mọc trên mặt thạch) được gọi là giá trị MIC

Một số phương pháp thực hiện thử nghiệm MIC:[37]

Phương pháp pha loãng trong thạch: chất thử được pha loãng trong thạch Phươngpháp này có ưu điểm là có thể tiến hành thử nghiệm đồng thời trên cùng một dãynồng độ chất thử với nhiều chủng vi sinh vật Tuy nhiên, nhược điểm của phươngpháp này là không có giá trị kinh tế cao khi thực hiện thử nghiệm nhiều vi sinh vậttrên nhiều loại chất thử

Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng: chất thử được pha loãng trong cácống nghiệm chứa môi trường lỏng Đây là phương pháp tốt nhất cho một loại vi sinhvật khi dùng chất thử phối hợp Tuy nhiên, không cho giá trị kinh tế cao khi thựchiện thử nghiệm nhiều loại vi sinh vật trên cùng một hoặc nhiều chất thử

Phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng: kháng sinh được pha loãng trongcác giếng vi lượng Phương pháp này tốt nhất cho thử nghiệm nhiều chất thử trênnhiều loại vi khuẩn Tuy nhiên phương pháp này rất khó đọc kết quả khi các chất thử

có màu

Phương pháp [62]

Chuẩn bị

Môi trường

Môi trường MHA được phân chia vào các ống nghiệm với một thể tích chính xác,

để đảm bảo các đĩa thạch có độ dày đồng đều; hấp tiệt trùng ở 121oC, 15 phút

Trang 32

Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO Khi

sử dụng pha loãng bằng môi trường thử nghiệm hoặc pha trực tiếp với môi trườngthử nghiệm sao cho tạo thành giai nồng độ trong môi trường thử nghiệm (có nồng

độ sau bằng ½ nồng độ trước) như sau: 1024 µg/ml, 512 µg/ml, 256 µg/ml, 128µg/ml, 64 µg/ml, 32 µg/ml, 16 µg/ml, 8 µg/ml, 4 µg/ml Khi pha chất thử vào môitrường phải đảm bảo nồng độ DMSO nằm trong khoảng từ 2-5% nhằm tránh việcnồng độ DMSO cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm

Cho chất thử vào môi trường đã để nguội về 45-50 oC, lắc đều để đạt được nồng độcuối cần thử nghiệm

Đổ vào đĩa petri, độ dày thạch khoảng 3-4 mm

Vi khuẩn

Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ.Lấy 3-5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB

Ủ từ 2-6 giờ ở 37 o

C để hoạt hóa vi khuẩn

Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu đượctương đương với McFarland 0,5 là khoảng 1,5 x 108

Đĩa thạch được đánh số cho vị trí các chủng vi khuẩn

Làm khô mặt đĩa thạch có chất thử và đĩa chứng không có chất thử

Cho 1-2 μl huyền phù dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn trên thạch

là 104 CFU/ml

Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khô

Lật ngược đĩa thạch đã cấy và ủ trong tủ ấm ở 37 o

C trong 16-18 giờ Đối vớiMRSA phải ủ trong 24 giờ

Trang 33

Hình 3.5 Đĩa thạch xác định MIC

Đọc kết quả

Kết quả chỉ có giá trị khi vi khuẩn trong mẫu chứng mọc bình thường

Đặt đĩa thạch trên một bề mặt sẫm màu, không phản xạ ánh sáng, quan sát sự tạothành khóm của vi khuẩn thử nghiệm Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàntoàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này làm MIC của chất thử đối với vi khuẩnthử nghiệm

Các khóm đơn lẻ hoặc vết mờ do đầu cấy để lại không được tính

Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy cóthể đã bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại

Trang 34

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Hiệu suất phản ứng: 88,8%

Tính chất: bột màu trắng, tan trong ethanol, methanol, không tan trong nước.

Điểm chảy: 199-201 oC (có điểm chảy phù hợp với tài liệu đã công bố) [60]

SKLM: dung môi khai triển

Aceton - toluen (1:1) Rf = 0,5

Cloroform - methanol (9,5:0,5) Rf = 0,4

IR (ν cm-1): 3193,71, 3023,9 (NH); 1682,41 (C=O); 1598,17 (C=N) (Phụ lục 1) (kếtquả phổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [60]

Trang 35

4.1.1.2 Tổng hợp N’-(3’-nitrobenzyliden)isonicotinohydrazid (1b)

Tiến hành: tương tự như cách tổng hợp sản phẩm (1a) chỉ khác với sản phẩm (1a)

là sản phẩm (1b) có tủa, để nguội tủa thêm, lọc lấy tủa, rửa tủa với nước, đem tủasấy khô được sản phẩm, thời gian phản ứng 1 giờ

Hiệu suất phản ứng: 90,2 %

Tính chất: bột màu vàng nhạt, tan trong methanol, không tan trong ethanol, nước

Điểm chảy: 230-232 oC (có điểm chảy phù hợp với tài liệu đã công bố ) [63]

IR (ν cm-1): 3232,33, 3081,0 (NH); 1687,33 (C=O); 1546,97 (C=N); 1351,22 (NO2)(Phụ lục 2) (kết quả phổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [63]

là sản phẩm (1c) có tủa, để nguội tủa thêm, lọc lấy tủa, rửa tủa với nước, đem tủasấy khô thu được sản phẩm, thời gian phản ứng 1 giờ

Trang 36

IR (ν cm-1): 2985,98, 2828,02 (NH); 1680,47 (C=O); 1553,10 (C=N); 1333,82(NO2) (Phụ lục 3) (dữ liệu phổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [60]

Tiến hành: tương tự như cách tổng hợp sản phẩm (1a), thời gian phản ứng 2 giờ.

Tinh chế sản phẩm: đem cô quay loại dung môi được sản phẩm rắn, rửa sản phẩmrắn nhiều lần với nước để loại INH còn dư, sấy khô thu được sản phẩm

Tính chất: bột màu trắng, tan trong ethanol, methanol, không tan trong nước

IR (ν cm-1): 3191,65, 3024,92 (NH); 1681,86 (C=O); 1593,56 (C=N); 758,53 Cl)(Phụ lục 4) (có dữ liệu phổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [30]

Trang 37

Điểm chảy: 222-224 oC (có điểm chảy gần bằng với tài liệu đã công bố là 230 oC)[63]

IR (ν cm-1): 3088,18 (NH); 1675,05 (C=O); 1589,49 (C=N); 798,42 (C-Cl) (Phụ lục5)

Điểm chảy: 246-248 o

C (có điểm chảy phù hợp với tài liệu đã công bố) [30]

IR (ν cm-1): 3178,17 (NH); 1680,07 (C=O); 1589,65 (C=N); 813,12 (C-Cl)(Phụ lục6) (kết quả phổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [30]

Trang 38

4.1.1.7 Tổng hợp N’-(2’-chloro-6’-fluorobenzyliden)isonicotinohydrazid (1g)

IR (ν cm-1): 3098,95, 2760,48 (NH); 1676,13 (C=O); 1590,56 (C=N); 1389,95 F); 781,38 (C-Cl)(Phụ lục 7) (kết quả phổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [5]

Trang 39

IR (ν cm-1): 3469,25, 3182,35 (NH); 1656,03 (C=O); 1598,44 (C=N); 1299,97 F) (Phụ lục 8) (có dữ liệu phổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [9]

IR (ν cm-1): 3439,38 (NH); 1652,26 (C=O); 1595,91 (C=N) (Phụ lục 9) (kết quảphổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [9]

Trang 40

Điểm chảy: 220-222 oC (có điểm chảy phù hợp với tài liệu đã công bố) [63]

IR (ν cm-1): 3494,46 (NH); 2942,77 (OMe); 1675,70 (C=O); 1575,73 (C=N) (Phụlục 10) (có dữ liệu phổ phù hợp với tài liệu đã công bố) [30]

là sản phẩm (1k) có tủa, để nguội tủa thêm, lọc lấy tủa, rửa tủa với nước, đem tủa

sấy khô được sản phẩm Thời gian phản ứng 2 giờ.

Định dạng
Số trang	111
Dung lượng	6,95 MB