Đánh giá hiệu quả của thử nghiệm blue carba so với thử nghiệm mcim trong việc phát hiện enterobacteriaceae tiết carbapenemase

ĐẶT VẤN ĐỀTỷ lệ Enterobacteriaceae đề kháng nhiều loại kháng sinh ngày cànggia tăng, các bác sĩ lâm sàng sử dụng kháng sinh carbapenem như là lựa chọncuối cùng để điều trị hiệu quả các b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

————

NGUYỄN THỊ HƯƠNG LAN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA THỬ NGHIỆM BLUE-CARBA SO VỚI THỬ NGHIỆM mCIM TRONG VIỆC PHÁT HIỆN Enterobacteriaceae

TIẾT CARBAPENEMASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN THỊ HƯƠNG LAN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA THỬ NGHIỆM BLUE-CARBA

SO VỚI THỬ NGHIỆM mCIM TRONG VIỆC PHÁT HIỆN

Enterobacteriaceae TIẾT CARBAPENEMASE

Ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y Học

Mã số: 872 06 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS.BS VÕ THỊ CHI MAI

2 TS.BS.TRƯƠNG THIÊN PHÚ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019

.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Tất cả cơ

sở dữ liệu, tài liệu tham khảo trong đề tài này là hoàn toàn trung thực và tuântheo đúng yêu cầu của một đề tài nghiên cứu Luận văn này là duy nhất vàchưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hương Lan

.

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Danh mục viết tắt vi

Danh mục bảng viii

Danh mục biểu đồ x

Danh mục hình xi

Tóm tắt luận văn xii

Abstract xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU 3

MỤC TIÊU 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT NGHIÊN CỨU 4

1.1.1 Đại cương 4

1.1.2 Tính chất nuôi cấy 4

1.1.3 Khả năng gây bệnh 5

1.1.4 Các loại vi khuẩn thường gặp 5

1.1.5 Mức độ đề kháng kháng sinh 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH 7

1.2.1 Đại cương về kháng sinh 7

1.2.2 Hiện tượng đề kháng kháng sinh 9

1.3 CƠ CHẾ ĐỀ KHÁNG CỦA VI KHUẨN VỚI KHÁNG SINH 12

1.3.1 Vi khuẩn tiết enzim để phá hủy hoạt tính của kháng sinh 12

1.3.2 Vi khuẩn thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với kháng sinh 15

1.3.3 Vi khuẩn làm thay đổi điểm tác động của kháng sinh 15

1.3.4 Vi khuẩn thay đổi con đường biến dưỡng tránh tác động của kháng sinh 17

.

i

1.4 CARBAPENEM VÀ CƠ CHẾ KHÁNG CARBAPENEM 18

1.4.1 Đại cương về carbapenem 18

1.4.2 Cơ chế hoạt động 21

1.4.3 Các cơ chế kháng carbapenem 23

1.5 CARBAPENEMASE 25

1.5.1 Carbapenemase lớp A 25

1.5.2 Carbapenemase lớp B 26

1.5.3 Carbapenemase lớp D 26

1.6 THỰC TRẠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CRE, CÁC THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN CARBAPENEMASE 27

1.6.1 Các phương pháp phát hiện CRE 27

1.6.2 Một số thử nghiệm phát hiện carbapenemase 28

1.6.3 Hướng điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn kháng carbapenem 32

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1.1 Thiết kế nghiên cứu 34

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 34

2.1.3 Dân số mục tiêu 34

2.1.4 Cỡ mẫu 34

2.1.5 Kỹ thuật chọn mẫu 34

2.1.6 Tiêu chí chọn mẫu 35

2.2 QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN 35

2.2.1 Quy trình thực hiện thử nghiệm Blue-Carba 35

2.2.2 Quy trình thực hiện thử nghiệm mCIM 38

2.2.3 Quy trình thực hiện thử nghiệm real-time PCR 42

2.3 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP SỐ LIỆU 49

2.4 PHẦN MỀM XỬ LÝ SỐ LIỆU 49

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50

.

3.1 TỶ LỆ CÁC VI KHUẨN MỤC TIÊU 50

3.1.1 Tỷ lệ vi khuẩn Enterobacteriaceae gây bệnh thường gặp 50

3.1.2 Tỷ lệ vi khuẩn Enterobacteriaceae gây bệnh thường gặp kháng carbapenem do tiết carbapenemase 51

3.2 SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN Enterobacteriaceae TIẾT CARBAPENEMASE CỦA THỬ NGHIỆM BLUE-CARBA SO VỚI THỬ NGHIỆM mCIM 52

3.2.1 Kết quả so sánh chung 52

3.2.2 Kết quả so sánh riêng đối với từng vi khuẩn mục tiêu 53

3.3 KẾT QUẢ PHÂN LỚP CARBAPENEMASE 55

3.3.1 Kết quả thử nghiệm real-time PCR chung 55

3.3.2 Kết quả thử nghiệm real-time PCR với từng vi khuẩn mục tiêu 57 3.3.3 Kết quả thử nghiệm real-time PCR với từng kiểu gen 59

3.3.4 Kết quả phân lớp carbapenemase của thử nghiệm Blue-Carba 64

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 72

4.1 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA THỬ NGHIỆN BLUE-CARBA SO VỚI THỬ NGHIỆM mCIM 78

4.1.1 Đối với vi khuẩn Enterobacter spp 79

4.1.2 Đối với vi khuẩn E.coli 79

4.1.3 Đối với vi khuẩn K.pneumoniae 79

4.2 SỰ BẤT TƯƠNG ĐỒNG GIỮA BCT VÀ THỬ NGHIỆM mCIM SO VỚI KẾT QUẢ CỦA THỬ NGHIỆM REAL-TIME PCR 79

4.2.1 Đối với 1 chủng vi khuẩn E coli 80

4.2.2 Đối với 2 chủng vi khuẩn K pneumoniae 80

4.3 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ CỦA BCT VÀ THỬ NGHIỆM mCIM SO VỚI KẾT QUẢ REAL-TIME PCR 81

4.3.1 Khẳng định kết quả dương tính với carbapenemase của BCT 81

4.3.2 Đánh giá khả năng phân lớp carbapenemase của BCT 84

4.3.3 Mục đích sử dụng thử nghiệm Blue-Carba 85

.

KẾT LUẬN 90KIẾN NGHỊ 91TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

.

i

DANH MỤC VIẾT TẮTTiếng anh

AMR: Antimicrobial resistance

BA: Blood Agar

CDC: Centers for Disease Control and

DAEC (Diffusely adherent E coli)

DNA: Deoxyribonucleic acid

EAEC (Enteroaggregative E coli)

EDTA: Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EHEC: Enterohemorrhagic E coli

EIEC: Enteroinvasive E coli

EPEC: Enteropathogenic E coli

ESBL: Extended-Spectrum β-lactamases

ETEC: Enterotoxigenic E coli

EUCAST: The European Committee on

Antimicrobial Succeptibility Testing

FDA: Food and Drug Administration

Tiếng việt

Kháng kháng sinhThạch máu

Trung tâm Kiểm soát và Phòngngừa dịch bệnh

Viện tiêu chuẩn lâm sàng vàphòng thí nghiệm, Hoa Kỳ

Vi khuẩn đường ruột sinh enzimcarbapenemase

Vi khuẩn đường ruột khángcarbapenem

E coli gây kết dính lan tỏa

E coli gây kết dính đường ruột

E coli gây xuất huyết đường

ruột

E coli xâm lấn đường ruột

E coli gây bệnh đường ruột

β-lactamase phổ rộng

E coli sinh độc tố ruột

Ủy ban châu Âu về thử nghiệmtính nhạy cảm kháng sinh

Cục Quản lý Thực phẩm và

.

i

GARP-VN: Global Antibiotic Resistance

Partnership Viet Nam

mCIM: Modified Carbapenem Inactivation

Method

MDR: Multi Drug Resistance

MHA: Mueller Hinton Agar

MHT: Modified Hodge Test

MIC: Minimum Inhibitory Concentration

PABA: Para-Amino-Benzoic Acid

PBP: Penicillin-Binding Protein

PCR: Polymerase Chain Reaction

PDR: Pan Drug Resistance

VITEK MS (MALDI-TOF technology):

VITEK Mass spectrometry (Matrix

Assisted Laser Desorption Ionization

Time-of-Flight technology)

VRE: Vancomycin-Resistant Enterococcus

WHO: World Health Organization

XDR: Extended Drug Resistance

Dược (Hoa Kỳ)

Dự án Hợp tác toàn cầu vềkháng kháng sinh GARP ViệtNam và Đơn vị Nghiên cứu Lâmsàng ĐH Oxford

Phương pháp bất hoạtcarbapenem cải tiến

Đa kháng thuốcThạch MHThử nghiệm Hodge cải tiếnNồng độ ức chế tối thiểu

Protein gắn PenicillinPhản ứng chuỗi polymeraseKháng thuốc toàn bộ

VITEK khối phổ (kỹ thuậtMALDI-TOF)

Vancomycin

Tổ chức y tế thế giớiKháng diện rộng

.

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Kháng sinh nhóm β-lactam 20

Bảng 1.2: Cách đọc kết quả thử nghiệm đĩa kết hợp MASTDISCS® ID (D70C+D71C + temocillin) 30

Bảng 2.1: Kết quả thử nghiệm Blue – Carba 38

Bảng 2.2: Chương trình khuếch đại 45

Bảng 2.3: Điều kiện đọc kết quả MBL (VIM,IMP,NDM) Real-TM 46

Bảng 2.4: Điều kiện đọc kết quả KPC/OXA Real-TM 46

Bảng 2.5: Phân tích kết quả real-time PCR MDR MBL (VIM,IMP,NDM) 47

Bảng 2.6: Phân tích kết quả real-time PCR MDR KPC/OXA 48

Bảng 3.1: Tỷ lệ các vi khuẩn họ Enterobacteriaceae gây bệnh thường gặp 50

Bảng 3.2: Phát hiện vi khuẩn họ Enterobacteriaceae tiết carbapenemase 51

Bảng 3.3: Kết quả của thử nghiệm Blue-Carba và thử nghiệm mCIM 53

Bảng 3.4: Kết quả phát hiện vi khuẩn Enterobacter spp tiết carbapenemase 53 Bảng 3.5: Kết quả phát hiện vi khuẩn E coli tiết carbapenemase 54

Bảng 3.6: Kết quả phát hiện vi khuẩn K pneumoniae tiết carbapenemase 55

Bảng 3.7: Sự phân bố các kiểu gen carbapenemase 56

Bảng 3.8: Số kiểu gen carbapenemase trong vi khuẩn Enterobacter spp 57

Bảng 3.9: Số kiểu gen carbapenemase trong vi khuẩn E coli 58

Bảng 3.10: Số kiểu gen carbapenemase trong vi khuẩn K pneumoniae 58

Bảng 3.11: Tỷ lệ vi khuẩn tiết KPC 59

Bảng 3.12: Tỷ lệ vi khuẩn tiết NDM 60

Bảng 3.13: Tỷ lệ vi khuẩn tiết OXA-48 60

Bảng 3.14: Tỷ lệ vi khuẩn tiết đồng thời 2 kiểu gen VIM+NDM 61

Bảng 3.15: Tỷ lệ vi khuẩn tiết đồng thời 2 kiểu gen IMP+NDM 62

Bảng 3.16: Tỷ lệ vi khuẩn tiết đồng thời 2 kiểu gen IMP+OXA-48 62

Bảng 3.17: Tỷ lệ vi khuẩn tiết đồng thời 2 kiểu gen NDM+OXA-48 63

Bảng 3.18: Tỷ lệ vi khuẩn chưa xác định kiểu gen 64

Bảng 3.19: Thời gian xác định kết quả của thử nghiệm Blue-Carba 64

Bảng 3.20: Xác định kết quả của BCT với kiểu gen KPC 65

Bảng 3.21: Xác định kết quả của BCT với kiểu gen NDM 66

Bảng 3.22: Xác định kết quả của BCT với kiểu gen OXA-48 66

Bảng 3.23: Xác định kết quả của BCT với kiểu gen VIM+NDM 67

Bảng 3.24: Xác định kết quả của BCT với kiểu gen IMP+NDM 68

.

Bảng 3.25: Xác định kết quả của BCT với kiểu gen IMP+OXA-48 68

Bảng 3.26: Xác định kết quả của BCT với kiểu gen NDM+OXA-48 69

Bảng 3.27: Kết quả của BCT với 2 chủng chưa xác định kiểu gen 70

Bảng 4.1: Tỷ lệ vi khuẩn họ Enterobacteriaceae tiết carbapenemase 78

Bảng 4.2: Khác biệt giữa thử nghiệm: Blue-Carba, mCIM và real-time PCR 80 Bảng 4.3: Tần suất và tỷ lệ các kiểu gen carbapenemase 82

Bảng 4.4: Bảng so sánh một số thử nghiệm phát hiện carbapenemase 88

.

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 2.1: Các kênh kết quả MDR MBL (VIM, IMP, IC, NDM) 47

Biểu đồ 2.2: Các kênh kết quả MDR MBL (KPC, OXA, IC) 48

Biểu đồ 3.1: Kết quả thử nghiệm Blue-Carba và thử nghiệm mCIM 51

Biểu đồ 3.2: Sự phân bố các kiểu gen carbapenemase 56

Biểu đồ 3.3: Xác định thời gian dương tính của BCT với các kiểu gen 71

.

i

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Các cơ chế tác động của kháng sinh 8

Hình 1.2: Nguồn gốc kháng thuốc 11

Hình 1.3: Phương thức lây truyền vi khuẩn kháng thuốc 12

Hình 1.4: Phân biệt vách tế bào vi khuẩn gram âm và gram dương 15

Hình 1.5: Cơ chế đề kháng kháng sinh 18

Hình 1.6: Peptidoglycan đơn phân của E.coli (trái) và S aureus (phải) 21

Hình 1.7: Cầu nối pentaglycine (trái) hay cầu nối giữa 2 tetrapeptide (phải) 22 Hình 1.8: Hình ảnh thử nghiệm Hodge cải tiến (MHT) 28

Hình 1.9: Hình ảnh 2 thử nghiệm Carba-NP và Blue-Carba 29

Hình 1.10: Thử nghiệm đĩa kết hợp MASTDISCS® ID (D70C+D71C + temocillin) 30

Hình 2.1: Thử nghiệm Blue-Carba 38

Hình 2.2: Quy trình thực hiện mCIM 40

Hình 2.3: Kết quả thử nghiệm mCIM 41

Hình 3.1: Khuẩn lạc họ Enterobacteriaceae trên môi trường MC 50

Hình 3.2: Hình ảnh thử nghiệm Blue-Carba và thử nghiệm mCIM 52

Hình 4.1: Tỷ lệ tử vong do kháng kháng sinh vào năm 2050 trên thế giới 73

Hình 4.2: Phân bố các gen carbapenemase trên toàn thế giới 76

Hình 4.3: Quá trình phát triển kháng sinh 77

.

i

TÓM TẮT LUẬN VĂNĐặt vấn đề: Các thử nghiệm nhanh, đơn giản và đáng tin cậy để sàng

lọc các loài vi khuẩn gram âm tiết carbapenemase là cần thiết để hỗ trợ tíchcực cho việc chọn kháng sinh điều trị phù hợp, góp phần quan trọng vàonhiệm vụ quản lý kháng sinh và giám sát dịch tễ học chương trình kiểm soátnhiễm khuẩn Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm đánh giá hiệu quảcủa thử nghiệm Blue-Carba (BCT) so với mCIM (modified carbapeneminactivation method) trong việc phát hiện vi khuẩn đường ruột tiếtcarbapenemase

Đối tượng và phương pháp: Đây là một nghiên cứu cắt ngang Tiến

hành thử nghiệm Blue-Carba song song với mCIM trên 189 chủng

Enterobacteriaceae kháng carbapenem (bao gồm các chủng Escherichia coli,

Klebsiella spp và Enterobacter spp phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng, được

định danh và thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh bằng máy Vitek MS và Vitek

2 compact theo tiêu chuẩn CLSI 2018) tại Bệnh viện Chợ Rẫy Sau đó, thựchiện real-time PCR tìm 5 kiểu gen carbapenemase (KPC, NDM, VIM, IMP vàOXA) trên 94 chủng dương tính hoàn toàn với BCT mà chỉ 91 dương tính vớimCIM

Kết quả: Trong số 189 chủng trên, có 178 chủng dương tính (94,2%)

và 11 chủng âm tính (5,8%) với BCT; 175 chủng dương tính (92,6%) và 14chủng âm tính (7,4%) với mCIM Với hệ số Kappa là 0,87, tỷ lệ tương đồngquan sát của 2 thử nghiệm là 0,98 (KTC: 0,95 – 1,00) Trên 94 chủng dươngtính với BCT, real-time PCR phát hiện 92 chủng dương tính với ít nhất mộttrong 5 kiểu gen carbapenemase kể trên

Kết luận: BCT tương đồng gần như hoàn hảo với thử nghiệm mCIM.

Hơn nữa, BCT còn có thể định hướng phân lớp A, B và D carbapenemase Do

.

v

ABSTRACTBackground: Fast, simple and reliable tests for screening

carbapenemase-producing gram-negative bacilli are necessary to activelysupport the appropriate antimicrobial therapy, to contribute to the antibioticstewardship, and to survey epidemiological data for infection controlprograms Therefore, we conducted this study evaluating the actualavailability of Blue-Carba test compared to mCIM for detection ofcarbapenemase-producing enterobacteria

Materials and method: This is a cross-sectional study Blue-Carba test

(BCT) was conducted in parallel with modified carbapenem-inactivatedmethod (mCIM) on 189 carbapenem-resistant isolates of enterobacteria,

including Escherichia coli, Klebsiella spp., and Enterobacter spp., which

were isolated from clinical specimens at Cho Ray hospital, identified by Vitek

MS and tested for antimicrobial susceptibility by Vitek 2 Compact according

to CLSI 2018 Then real-time PCR was performed to determine five types ofcarbapenemase genes, including KPC, NDM, VIM, IMP and OXA, on 94 ofthose isolates positive with BCT and 91 of them positive with mCIM

Results: Among these 189 isolates, BCT showed 178 positive strains

(94.2%) and 11 negative strains (5.8%); while 175 (92.6%) of these werepositive and 14 (7.4%) negative with mCIM Calculated Kappa coefficientwas 0.87 and proportions of agreement of two tests was 0.98 (CI: 0.95 –1.00) Of those 94 isolates positive with BCT, real-time PCR determined 92strains producing at least one of the 5 carbapenemase genes mentioned above

Conclusion: The similarity of BCT to mCIM is almost perfect.

Moreover, BCT can preliminarily orientate carbapenemase subgroups A, Band D Therefore, the test is actually effective for screening carbapenemase-producing enterobacteria in most of clinical microbiological laboratories

.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tỷ lệ Enterobacteriaceae đề kháng nhiều loại kháng sinh ngày cànggia tăng, các bác sĩ lâm sàng sử dụng kháng sinh carbapenem như là lựa chọncuối cùng để điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm khuẩn nghiêm trọng do các vikhuẩn đa kháng này Sự xuất hiện và lan truyền của Enterobacteriaceae khángcarbapenem (CRE) là một vấn đề rất đáng quan tâm về lâm sàng và sức khỏecộng đồng [14] Các cơ chế kháng carbapenem trong Enterobacteriaceae rấtphức tạp, bao gồm các cơ chế: (i) tiết carbapenemase, enzim có khả năng thủyphân carbapenem; (ii) không phải do tiết carbapenemase như vi khuẩn tiết quánhiều AmpC β-lactamase hoặc ESBL phổ rộng (ESBLs) hay (iii) thay đổi tínhthấm của màng tế bào [39], [70] Mặc dù hiện nay, việc xác định cơ chế khángcarbapenem chưa được khuyến nghị cho việc hướng dẫn các quyết định điềutrị và cũng chưa được thực hiện thường xuyên trong hầu hết các phòng xétnghiệm (PXN) vi sinh lâm sàng [19], [67], sự khác biệt giữa CPE(Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae) và không CPE là rất quantrọng đối với mục đích kiểm soát nhiễm khuẩn và giám sát dịch tễ học vikhuẩn gram âm kháng carbapenem Việc phát hiện ra chúng một cách nhanhchóng và chính xác sẽ hỗ trợ tích cực cho công tác kiểm soát sự lây lan cáctính kháng này [16] Ngoài ra, khi các kháng sinh mới có thể điều trị hiệu quảđối với CPE được đưa vào sử dụng, việc phân biệt CPE với không phải CPE

sẽ rất quan trọng cho sự quản lý và sử dụng hợp lý các loại kháng sinh mớinày [12] Mặt khác, một báo cáo gần đây cũng cho thấy vi khuẩn CPE có thể cóđộc lực cao hơn so với vi khuẩn không phải là CPE [64] Nếu phát hiện nàyđược xác nhận thì việc xác định các cơ chế kháng thuốc trong CRE sẽ trở nênquan trọng đối với chăm sóc lâm sàng, nhưng các thử nghiệm nhạy cảmkháng sinh (AST: Antimicrobial Susceptibility Testing) không thể xác định

.

được CPE và không CPE [17], [63] Do vậy, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừadịch bệnh (CDC) hiện khuyến nghị các PXN vi sinh lâm sàng tích cực sànglọc các chủng vi khuẩn tiết carbapenemase trong CRE [16] Các thử nghiệmkiểu hình để phát hiện vi khuẩn tiết carbapenemase hiện có như: Hodge testcải tiến, Carba NP, mCIM đều có những hạn chế nhất định như: thời gianthực hiện kéo dài, độ nhạy và / hoặc độ đặc hiệu không cao Thử nghiệm kiểugen như: PCR, real-time PCR, giải trình tự gen phát hiện được kiểu gencarbapenemase cụ thể của các lớp Ambler A (KPC, SME, GES, IMI, NMC),Ambler B (VIM, IMP, NDM, GIM, SPM), Ambler D (OXA), tuy nhiên cácphương pháp này đắt tiền lại đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao Vì vậy việc tìm ramột thử nghiệm có khả năng phát hiện CPE nhanh chóng, chính xác, dễ thựchiện và phù hợp với điều kiện kinh tế xã hội hiện tại của Việt Nam là yêu cầucấp thiết.

.

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

Thử nghiệm Blue-Carba có thể sử dụng thường quy tại các PXN Visinh lâm sàng tại Việt Nam trong việc phát hiện vi khuẩn gram âm tiếtcarbapememase không?

MỤC TIÊU

Mục tiêu tổng quát

Đánh giá hiệu quả của thử nghiệm Blue-Carba so với thử nghiệm

mCIM trong việc phát hiện vi khuẩn đường ruột gây bệnh thường gặp như: E.

coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp tiết carbapenemase.

Mục tiêu cụ thể

1 Xác định tỷ lệ các vi khuẩn E coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp kháng carbapenem do tiết carbapenemase bởi thử nghiệm

Blue-Carba và thử nghiệm mCIM

2 Đánh giá hiệu quả của thử nghiệm Blue-Carba so với thử nghiệmmCIM

3 Xác định khả năng phân lớp carbapenemase của thử nghiệmBlue-Carba

.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT NGHIÊN CỨU 1.1.1 Đại cương

Họ vi khuẩn đường ruột là một họ lớn gồm nhiều loại trực khuẩn gram âm,

và hơn 110 loài

1.1.2 Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn đường ruột thường dễ nuôi cấy trên các loại môi trường như: môitrường không ngăn chặn (BA: Blood Agar, NA: Nutrient Agar), môi trườngphân biệt (lên men hay không lên men lactose), môi trường chọn lọc (ức chế

vi khuẩn không mong muốn, đồng thời giúp cho vi khuẩn muốn tìm kiếmphát triển dễ dàng) hay môi trường tăng sinh

.

1.1.3 Khả năng gây bệnh

Bình thường phần lớn các vi khuẩn đường ruột không gây bệnh ở ruột

mà còn góp phần vào chức năng bình thường và dinh dưỡng của ruột Vikhuẩn đường ruột sẽ trở thành tác nhân gây bệnh khi chúng đến các mô ởngoài ruột Các vị trí thường gặp nhất trong các nhiễm khuẩn quan trọng làđường tiết niệu, đường mật hay bất kỳ vị trí nào trong cơ thể như nhiễmkhuẩn vết thương, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi, đặc biệt

là gây nhiễm khuẩn cơ hội trên các ký chủ giảm sức đề kháng hay suy giảmmiễn dịch như người già, trẻ em, phụ nữ mang thai, những người sử dụngthuốc ức chế miễn dịch

Bốn loại vi khuẩn được ghi nhận là tác nhân gây nhiễm khuẩn đường

tiêu hóa là E coli, Shigella spp., Salmonella spp và Yersinia spp Một số loài

khác có trong thực phẩm hoặc đồ uống bị ô nhiễm hoặc do vi khuẩn lâytruyền qua đường phân kết hợp với điều kiện vệ sinh kém Các quốc gia có

khả năng khử nhiễm coliforms (E coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp.)

nguồn nước kém sẽ gây ra nhiều bệnh tật hơn và tỉ lệ tử vong do nhiễm vikhuẩn đường ruột cao hơn Ngoài ra, một số vi khuẩn đường ruột có thể gâytiêu chảy cho khách du lịch do khác biệt về mặt địa lý Viêm dạ dày ruột do vikhuẩn đường ruột có thể gây nôn mửa và tiêu chảy, dẫn đến mất nước

Vi sinh lâm sàng: Phân lập và định danh các loại vi khuẩn này từ các loạibệnh phẩm như: phân, nước tiểu, máu, dịch não tủy, đàm, dịch vết thương

1.1.4 Các loại vi khuẩn thường gặp

Trong số các vi khuẩn đường ruột gây bệnh ở người thì phổ biến nhất là

các loài Escherichia coli, Klebsiella spp và Enterobacter spp.

.

1.1.4.1 Escherichia coli

Vi khuẩn kỵ khí tùy nghi này sống nhiều nhất trong ruột già (vùng hồi

manh tràng) chiếm khoảng 80%, E coli đứng hàng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy thuộc các nhóm sau: EPEC (Enteropathogenic E coli), ETEC (Enterotoxigenic E coli), EIEC (Enteroinvasive E coli), EHEC (Enterohemorrhagic E coli), EAEC (Enteroaggregative E coli) và DAEC (Diffusely adherent E coli), viêm đường tiết niệu (90% trường hợp), viêm

đường mật, nhiễm khuẩn huyết khi sức đề kháng của cơ thể giảm, thường gặp

ở trẻ sơ sinh và sau nhiễm khuẩn đường tiểu E coli còn có thể gây nhiều

bệnh khác như viêm màng não (40% trường hợp ở trẻ sơ sinh và 75% trong sốnày là vi khuẩn có kháng nguyên K1), viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương

1.1.4.2 Klebsiella spp.

Klebsiella spp có trong hệ vi khuẩn bình thường ở ruột người trưởng

thành, ngoài ra cũng tìm thấy trong hệ hô hấp Vi khuẩn này chủ yếu gây bệnh

cơ hội ở cộng đồng hoặc trong bệnh viện, là một trong những nguyên nhângây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp Hai loài thường gặp nhất trong các

tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện là: K pneumoniae và K oxytoca Hầu hết các cơ quan đều có thể bị nhiễm khuẩn do Klebsiella Trong đó, K.

pneumoniae là một căn nguyên gây viêm phổi đã được biết đến từ lâu, bệnh

thường gặp ở trẻ sơ sinh, tỷ lệ tử vong rất cao nếu không được chẩn đoán vàđiều trị kịp thời Ngoài ra, nó còn có khả năng gây nhiễm khuẩn huyết, viêmmàng não, viêm tai giữa, viêm xoang, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, áp xegan Đối với các bệnh nhân: có thời gian nằm viện kéo dài, sử dụng khángsinh phổ rộng và điều trị tại các khoa săn sóc đặc biệt là các yếu tố nguy cơ

gây nhiễm Klebsiella spp [2], [13]

.

1.1.4.3 Enterobacter spp.

Enterobacter spp thường có mặt trong: đất, nước và bên ngoài môi

trường E cloacae và nhóm E aerogenes có thể là thành viên trong hệ vi khuẩn bình thường ở ruột người và động vật Enterobacter spp gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp là: E cloacae và E aerogenes, E sakazakii

thường gây nhiễm khuẩn ở trẻ sơ sinh

1.1.5 Mức độ đề kháng kháng sinh

Tại Mỹ, mỗi năm có 9300 người nhiễm khuẩn Enterobacteriaceae kháng

carbapenem, trong đó có 7900 người nhiễm Klebsiella spp kháng carbapenem và 1400 nhiễm E coli kháng carbapenem, gây tử vong 610

người Đặc biệt CPE gây tử vong 50% lượng bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết

b) Ức chế tổng hợp màng tế bào: Nhóm kháng sinh polypeptide gồmcolistin (polymyxin E) và polymyxin B

.

c) Ức chế tổng hợp protein: Ức chế 2 tiểu đơn vị của Ribosome.

 Tác động trên tiểu đơn vị 30S gồm các nhóm kháng sinh như sau:aminoglycosides (amikacin, gentamicin, kanamycin, netilmicin,tobramycin, và arbekacin), tetracyclin, glycylcyclin, và oxazolidinone

 Tác động trên tiểu đơn vị 50S gồm các nhóm kháng sinh như:macrolides (erythromycin, azithromycin), lincosamides (lincomycin,clindamycin), chloramphenicol, streptogramin

d) Ức chế tổng hợp acid nucleic gồm các thế hệ kháng sinh nhómquinolone hiện nay đang sử dụng như: nalidixic acid, ciprofloxacin,levofloxacin, fluoroquinolone

Hình 1.1: Các cơ chế tác động của kháng sinh

(Nguồn: Phân loại và cơ chế tác dụng của kháng sinh - PGS.TS Hà Hoàng

Kiệm, Bệnh Viện 103)

.

1.2.2 Hiện tượng đề kháng kháng sinh

1.2.2.1 Định nghĩa đề kháng kháng sinh

AMR xảy ra khi các vi sinh vật như (vi khuẩn, nấm, vi rút và ký sinhtrùng) thay đổi sau khi tiếp xúc với thuốc chống vi trùng như (kháng sinh,thuốc chống nấm, thuốc chống vi rút, thuốc chống sốt rét và thuốc chốnggiun) Do đó, các loại thuốc này trở nên không hiệu quả và nhiễm khuẩn tồntại trong cơ thể, làm tăng nguy cơ lây lan sang người khác Các vi sinh vậtphát triển tính kháng thuốc chống vi trùng đôi khi được gọi là siêu vi khuẩn(WHO) Sự đề kháng của vi khuẩn đối với loại kháng sinh này thì có thể gây

ra đề kháng với những kháng sinh khác có cùng cơ chế tác động, gọi là đềkháng chéo

Hiện nay tại Việt Nam, các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm khuẩnbệnh viện hay cộng đồng đều có khuynh hướng đa kháng (MDR: Multi DrugResistance) MDR được định nghĩa là không nhạy cảm với ít nhất một loạitrong ba hoặc nhiều nhóm kháng sinh, XDR (Extended Drug Resistance)được định nghĩa là không nhạy cảm với một số kháng sinh nhưng không phải

là tất cả (tức là các chủng vi khuẩn chỉ nhạy cảm với một hoặc hai nhómkháng sinh) và PDR (Pan Drug Resistance) được xác định là không nhạy cảmcho tất cả các các nhóm kháng sinh Ví dụ như: vi khuẩn đường ruột K.

pneumoniae, E coli, Enterobacter spp (tiết ESBL / AmpC / Carbapenemase),

1.2.2.2 Nguồn gốc của sự đề kháng kháng sinh

Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có nguồn gốc từ vật liệu di truyềncủa chúng Các gen kháng thuốc hiện diện trên: nhiễm sắc thể (đề khángnhiễm sắc thể), hoặc qua trung gian plasmid, hay các yếu tố có thể chuyển vịtrí hoặc trên nhiễm sắc thể nhưng lại là các gen nhảy (transposon) (đề khángngoài nhiễm sắc thể) Vi khuẩn có thể đề kháng tự nhiên hoặc mắc phải[1]

.

0

 Đề kháng kháng sinh tự nhiên

Là vi khuẩn đã có tính kháng thuốc từ trước khi tiếp xúc với kháng sinh

Các gen đề kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn Ví dụ: Proteus spp.

kháng tự nhiên với colistin [1]

 Đề kháng kháng sinh mắc phải

 Nguồn gốc không di truyền

Sự nhân lên của vi khuẩn là yếu tố cần thiết cho tác động của thuốc khángsinh Nếu vì lý do nào đó mà vi khuẩn không nhân lên được, ví dụ như sức đềkháng của cơ thể ký chủ Vi khuẩn sẽ tồn tại nhiều năm trong mô ký chủ,nhưng không đáp ứng điều trị Ví dụ: vi khuẩn nhạy cảm với penicillin có thểbiến đổi thành dạng L trong quá trình sử dụng thuốc, chúng sẽ trở nên khángthuốc ức chế tổng hợp vách tế bào như: penicillin, cephalosporin, nhưng cácthế hệ sau khi chúng tổng hợp được vách tế bào thì sẽ nhạy cảm trở lại [1]

Đề kháng ngoài nhiễm sắc thể do plasmid

Do yếu tố R là một lớp của plasmid mang những gen kháng một đếnnhiều loại kháng sinh Các gen này kiểm soát việc tiết enzim phá hủy thuốckháng sinh như: β-lactamase, Chloramphenicol-Acetyltransferase[1]

.

1

1.2.2.3 Nguyên nhân gây ra kháng thuốc

Kháng thuốc kháng sinh xảy ra do nhiều nguyên nhân Trong cơ thể người

và động vật có rất nhiều loại vi khuẩn nhưng chỉ một số ít kháng thuốc Khi

sử dụng kháng sinh thì các loại vi khuẩn nhạy cảm và lợi khuẩn sẽ bị tiêu diệt,

vô tình tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc phát triển và nhân lên Hơnnữa các vi khuẩn này còn có khả năng truyền gen kháng thuốc cho các vikhuẩn khác gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng hơn (Hình 1.2) [14]

Hình 1.2: Nguồn gốc kháng thuốc

Tính kháng thuốc có thể lây truyền khi: Sử dụng kháng sinh trong chănnuôi sẽ phát triển vi khuẩn kháng thuốc trong ruột các động vật này Khingười sử dụng thịt động vật bị nhiễm khuẩn, cây lương thực có sử dụng phânbón từ động vật, các vi khuẩn này sẽ lây sang người hay người sử dụng khángsinh thì vi khuẩn kháng thuốc sẽ tồn tại, tăng sinh trong ruột người Sau đócác vi khuẩn này có thể lây truyền trong cộng đồng chung qua các con đườngsau: trực tiếp từ bệnh nhân này sang bệnh nhân khác tại các cơ sở y tế, giántiếp từ môi trường hay trên bàn tay không sạch của các nhân viên y tế, dụng

cụ y tế hay lây cho người thân trong gia đình (Hình 1.3 [14])

.

2

Hình 1.3: Phương thức lây truyền vi khuẩn kháng thuốc

1.3 CƠ CHẾ ĐỀ KHÁNG CỦA VI KHUẨN VỚI KHÁNG SINH

Để đối phó với tác động của kháng sinh, vi khuẩn đã tiến hóa và đề khángkháng sinh theo các cơ chế như sau (Hình 1.5)

1.3.1 Vi khuẩn tiết enzim để phá hủy hoạt tính của kháng sinh

Do có ngoài cấu trúc màng ngoài vách tế bào nên β-lactamase được tiết

ra bởi các vi khuẩn gram âm sẽ tập trung tại khoảng gian màng ngoài và vách

tế bào vi khuẩn Vì vậy kháng sinh β-lactam sẽ khó vượt qua hàng rào bảo vệnày Bên cạnh việc phát triển các thế hệ kháng sinh β-lactam thì vi khuẩngram âm cũng đã tiến hóa và phát triển nhiều loại β-lactamase ngày càngmạnh hơn Sự tiến hóa của các nhóm β-lactamase có thể tóm tắt như sau:

1.3.1.1 Nhóm β-lactamase cổ điển

Các gen mã hóa TEM1 và SHV1 nằm trên plasmid nên có khả năng lâytruyền trong cùng loài thậm chí khác loài vi khuẩn Enzim này có khả năng

Sử dụng KS trong chăn nuôi

Người sử dụng kháng sinh

Cơ sở y tế Nông trại

Sử dụng phân bón cho cây lương thực

Cung cấp thịt cho người

Người sử dụng rau,

củ, quả

Lây lan qua chăm sóc y tế

Lây cho cộng đồng và người thân

Lây qua bàn tay không sạch của nhân viên y tế

Lây lan từ bề mặt môi trường hay qua chăm sóc y tế.

BN mang

về nhà

VÍ DỤ VỀ CÁCH LÂY TRUYỀN VI KHUẨN KHÁNG THUỐC

.

3

phá hủy các kháng sinh như: ampicillin, amoxicillin hay penicillin dẫn đến sự

đề kháng các kháng sinh này chỉ sau một thời gian ngắn khi được đưa vào sửdụng Tuy nhiên enzim này không có khả năng phá hủy cephalosporin từ thế

hệ 2 trở lên và bị ức chế bởi các chất ức chế β-lactamase (clavulanic acid,sulbactam, tazobactam) Nhờ vậy chúng không gây khó khăn cho các bác sĩlâm sàng trong việc lựa chọn kháng sinh để điều trị [6]

β-khuẩn sẽ kháng cephalosporin thế hệ 3 ngay trong quá trình điều trị (ví dụ

trong trường hợp: nhóm E aerogenes và E cloacae khi điều trị bằng các

cephalosporin phổ rộng như: ceftriaxone, cefotaxim và ceftazidim)

β-lactamase AmpC không chỉ đề kháng với cephalosporin thế hệ 3, cephamycin

mà còn kháng được với các chất ức chế β-lactamase Hiện tại, cephalosporinthế hệ 4 và carbapenem chưa phá hủy bởi enzim này Cần lưu ý rằng gen nàymặc dù thường nằm trên nhiễm sắc thể và mức độ lây lan chưa đáng báo độngnhư β-lactamase phổ rộng (ESBL: Extended Spectrum Beta-Lactamase),

nhưng ở một số vi khuẩn như: E coli, K pneumonia và P mirabilis có thể

thu nhận gen này qua plasmid [6]

1.3.1.3 Nhóm β-lactamase phổ rộng (ESBL)

Các trực khuẩn gram âm đặc biệt là Enterobacteriaceae đã tiếp tục tiếnhóa và tiết ra một loại enzim β-lactamase Enzim này có khả năng phá hủy

.

4

được hầu hết các thế hệ cephalosporin, đó là β-lactamase phổ rộng (ESBL)

Vì vậy, để điều trị vi khuẩn tiết ESBL chỉ còn cephamycin và carbapenem.Tuy nhiên, cần khuyến cáo rằng khi sử dụng cephamycin, có thể gây cảm ứng

vi khuẩn tiết AmpC Sự nguy hiểm của enzim này là do khả năng kháng đượctất cả các thế hệ cephalosporin và sự lây lan cao của chúng, vì chúng cónguồn gốc đột biến từ gen TEM và SHV trên plasmid hoặc trên nhiễm sắc thểnhưng lại là các gen nhảy Tuy nhiên, vì có nguồn gốc này nên chúng cũng bị

ức chế bởi các chất ức chế β-lactamase Mặc dù vậy, nhưng trên thực tế cácchất ức chế β-lactamase không ức chế được ESBL nồng độ cao tại khoảnggian màng ngoài và vách tế bào vi khuẩn, đặc biệt trong trường hợp nhiễmkhuẩn nặng với số lượng vi khuẩn tập trung cao tại ổ nhiễm, nên chỉ sử dụngchất ức chế β-lactamase để phát hiện vi khuẩn tiết ESBL [6]

1.3.1.5 Các enzim khác

Ngoài β-lactamase, vi khuẩn còn có khả năng đề kháng chloramphenicol

do tiết enzim chloramphenicol acetyltransferase hay kháng aminoglycoside dotiết acetylase, adenylase, phosphorylase Tuy nhiên cơ chế này không nghiêmtrọng bằng các cơ chế khác nên ít được chú ý [1], [6], [42]

.

sự xâm nhập của nhiều hợp chất độc hại, bao gồm một số kháng sinh như: lactam, tetracycline và fluoroquinolone bằng cách giảm sự hấp thu đối với cácphân tử kháng sinh này Nếu kháng sinh không thể khuếch tán thụ động quacác kênh porin này, sẽ không tác động được đối với vi khuẩn gram âm (ví dụ:kháng sinh vancomycine) [42] (Hình 1.4 [60]).

β-Hình 1.4: Phân biệt vách tế bào vi khuẩn gram âm và gram dương 1.3.3 Vi khuẩn làm thay đổi điểm tác động của kháng sinh

Các tế bào vi khuẩn đề kháng có thể làm thay đổi thụ thể đối với thuốckháng sinh Do vậy, thuốc không thể gắn vào hoặc liên kết một cách hiệu quảtới đích tác động của chúng

.

6

1.3.3.1 Vi khuẩn thay đổi cấu trúc PBP đề kháng β-lactam

Hoạt tính kháng khuẩn của β-lactam phụ thuộc vào khả năng phá vỡvách tế bào thông qua sự ức chế PBP (là các enzim quan trọng chịu tráchnhiệm cho quá trình tổng hợp chuỗi peptidoglycan của vách tế bào) Kháng

methicillin ở S aureus là kết quả của việc thu nhận một gen ngoại lai (có thể

là từ Staphylococcus sciuri) mecA Gen mecA mã hóa PBP2a thay thế PBP.

Đối với S pneumoniae kháng penicillin do các đột biến điểm biến đổi

PBP thành PBP1a/1b, PBP2a/2b và PBP2x Các PBP này trở nên kém ái lựcvới penicillin ít hay nhiều là tùy thuộc vào số đột biến điểm trên mỗi gen chịutrách nhiệm hay số lượng gen bị đột biến điểm [6], [42]

1.3.3.2 Vi khuẩn biến đổi cấu trúc ribosome để đề kháng kháng sinh

Một trong những ví dụ đặc trưng nhất về đề kháng kháng sinh thông qua

cơ chế biến đổi cấu trúc ribosome tại vị trí đích là sự methyl hóa ribosome

được xúc tác bởi một enzim mã hóa bởi gen erm (trong trường hợp này làmethylase), methyl hóa ribosome erythromycin Trong trường hợp không cócảm ứng bởi kháng sinh erythromycin, vi khuẩn phát triển tạo ra bản phiên

mã mRNA với cấu trúc thứ cấp che giấu vị trí liên kết ribosome ở peptide mở

đầu của gen erm Quá trình phiên mã thông qua peptide mở đầu sau đó chấm

dứt, không thể tổng hợp protein như mong muốn, ngăn chặn việc tổng hợp

gen ermC Ngược lại, với sự hiện diện của erythromycin, tính kháng nàyđược tạo ra sau khi bị cảm ứng (khả năng cảm ứng giữa các macrolide là khácnhau) các ribosome bị ức chế bởi kháng sinh trong quá trình dịch mã peptide

mở đầu cho phép thay đổi cấu trúc của mRNA ermC làm lộ ra vị trí gắn kết ribosome của nó, dẫn đến dịch mã hiệu quả để tổng hợp gen ermC Mặt khác,

tính kháng này không gây ra bởi lincosamides hoặc streptogramin Tuy nhiên,

việc sử dụng các tác nhân này để chống lại các chủng phân lập mang gen erm

.

7

cảm ứng có thể dẫn đến việc lựa chọn các đột biến cấu thành in vivo (đặc biệt

là trong nhiễm khuẩn nặng) dẫn đến thất bại trong điều trị [42]

1.3.3.3 Vi khuẩn biến đổi enzim để tránh sự bất hoạt của kháng sinh

Cơ chế đề kháng TMP-SMX (Trimethoprim - Sulfomethoxazol), khángsinh này làm giảm sự tổng hợp purin và một số axit amin quan trọng của vikhuẩn bằng cách thay đổi con đường tổng hợp folate Con đường này baogồm hai loại enzim chính là dihydropteroic acid synthase (DHPS), xúc tácphản ứng tạo thành dihydrofolate từ axit para-aminobenzoic (bị ức chế bởisulfomethoxazol (SMX)) và dihydrofolate reductase (DHFR), xúc tác phảnứng tạo thành tetrahydrofolate từ dihydrofolate (bị ức chế bởi trimethoprim(TMP)) Những đột biến dẫn đến kháng TMP-SMX như: i) việc tiết quá mứccác enzim DHFR hoặc DHPS vượt quá khả năng ức chế của kháng sinh TMP-SMX, ii) thay đổi các acid amin trong enzim làm giảm ái lực với kháng sinhhay iii) thu nhận các gen mã hóa DHPS hoặc DHFR từ bên ngoài dẫn đếngiảm nhạy cảm với kháng sinh TMP-SMX [42]

1.3.4 Vi khuẩn thay đổi con đường biến dưỡng tránh tác động của

kháng sinh

Vi khuẩn có thể thay đổi con đường biến dưỡng để tránh tác động củakháng sinh Đây là kiểu hình đề kháng với trimethoprim và sulphonamide

(TMP-SMX) điển hình của enterococci (Streptococcus faecalis group D), một

tác nhân gây nhiễm khuẩn tiết niệu Kháng sinh TMP-SMX (bactrim) thườngđược xem là kháng sinh đầu tay của các bác sĩ điều trị nhiễm khuẩn tiết niệu,

do nồng độ hữu dụng của kháng sinh này trong đường tiểu khá cao, vượt quaMIC của kháng sinh đối với vi khuẩn này Tuy nhiên nhờ có khả năng sửdụng trực tiếp tetrafolate, thậm chí là pyrimidine có sẵn trong nước tiểu đểtổng hợp acid folic mà không sử dụng con đường biến dưỡng từ PABA, điều

.

8

này có tương quan với sự gia tăng MIC của (TMP-SMX) đến 25 lần Đây là

lý do dẫn đến sự thất bại điều trị dù kết quả thử nghiệm nhạy cảm kháng sinhvẫn cho thấy vi khuẩn nhạy cảm cao với bactrim [6], [42]

Hình 1.5: Cơ chế đề kháng kháng sinh

(Nguồn:

https://bacsitrongnha.com/cap-nhat-tinh-hinh-khang-sinh-o-viet-nam-update-2017/)

1.4 CARBAPENEM VÀ CƠ CHẾ KHÁNG CARBAPENEM

1.4.1 Đại cương về carbapenem

Kháng sinh họ β-lactam gồm các phân nhóm chính như sau: penicillin,các thế hệ cephalosporin, carbapenem và monobactam có cấu trúc giống nhau

ở phần cốt lõi là vòng β-lactam Kháng sinh nhóm β-lactam chỉ cócarbapenem là kháng sinh duy nhất có thể chống lại sự thủy phân của hầu hếtcác loại β-lactamase (β-lactamase cổ điển, AmpC β-lactamase, ESBL) Đây làmột trong những lý do quan trọng để phát triển nhóm kháng sinh carbapenem.Hầu hết các kháng sinh này đều có hoạt phổ rộng, tác động bằng cách ức chếsinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn gram âm và gram dương Chúng đượcxem như vũ khí cuối cùng cho các bệnh nhiễm khuẩn nặng hay nghi ngờ

Cơ chế khép kênh porin

Cơ chế bơm đẩy kháng sinh

Enzim bất hoạt kháng sinh

Thay đổi điểm gắn của kháng sinh

9

kháng thuốc Không may thay, sự xuất hiện gần đây của các tác nhân gâybệnh đa kháng thuốc (MDR) đe dọa nghiêm trọng nhóm kháng sinhcarbapenem [47]

Kháng sinh nhóm carbapenem ban đầu được phát triển tại Merck & Co từcarbapenem thienamycin, một sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên của

Streptomyces cattleya được xác định là có khả năng ức chế các loại

β-lactamase thông thường (sau acid clavulanic) Carbapenem tổng hợp gồm cácloại: ertapenem, imipenem, meropenem và doripenem Trong đó: ertapenem,imipenem, meropenem là các loại thông dụng, doripenem cũng đã được FDAchấp nhận sử dụng để chữa trị các trường hợp nhiễm khuẩn ổ bụng và nhiễmkhuẩn tiểu nặng [30] Kháng sinh carbapenem phổ hoạt động rộng hơn so vớihầu hết các cephalosporin và penicillin, carbapenem là một loại thuốc khángsinh có hiệu quả cao thường được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩnnặng hay nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn gram âm tiết ESBLnhư: viêmphổi do nhiễm khuẩn bệnh viện, viêm màng não mủ, nhiễm khuẩn không rõnguồn gốc [47] Tuy nhiên tỷ lệ vi khuẩn kháng carbapenem hiện nay là vấn đềtoàn thế giới đang rất quan tâm vì sẽ có rất ít lựa chọn để điều trị, đặc biệt đối

với các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn tiết carbapenemase như K.

pneumoniae hay các vi khuẩn khác thuộc họ vi khuẩn đường ruột

(Enterobacteriaceae) kháng carbapenem

.

0

Bảng 1.1: Kháng sinh nhóm β-lactam Đặc tính của carbapenem Công thức hóa học

(A) 1-β-methyl (màu đỏ) làm tăng sức đề

kháng với DHP-I (dehydropeptidase I)

(B) Vòng pyrrolidine (màu đỏ) làm tăng

(E) Cấu hình R của hydroxyethyl làm

tăng hiệu lực của β-lactam.

(F) Cấu hình trans của carbapenem tại

liên kết C5 - C6 làm tăng hiệu lực của

chúng so với penicillin và cephalosporin.

Monobactam

1

Carbapenem với cấu trúc khá giống penicillin, gồm 1 vòng β-lactam,nhưng khác với penicillin ở chỗ là có sự thay thế carbon cho lưu huỳnh tại vịtrí C1 và liên kết đôi giữa C2 và C3 Do các cấu trúc đặc biệt sau đây đã tạo racác đặc tính của carbapenem như (Bảng 1.1)[47]:

Quá trình ức chế sự hình thành chuỗi peptidoglycan của vách tế bào vikhuẩn diễn ra như sau:

Hình 1.6: Peptidoglycan đơn phân của E.coli (trái) và S aureus (phải)

Peptidoglycan đơn phân Peptidoglycan đơn phân

.

Peptidoglycan là một chuỗi (polymer) bao gồm các peptidoglycan đơnphân (monomer) giống nhau liên kết tạo thành Một peptidoglycan đơn phânbao gồm: đường amin N-acetylglucosamine (NAG) và N-acetylmuramic acid

(NAM), với một nhánh pentapeptide từ NAM Trong E.coli, pentapeptide bao

gồm các acid amin: L-alanine, glutamic, meso diaminopimelic và 2 alanine (Hình 1.6 trái [35]) Trong S aureus, pentapeptide bao gồm các acid

D-amin: L-alanine, D-glutamine, L-lysine và 2 D-alanine (Hình 1.6 phải [35])

Trong trường hợp bình thường, ở E coli, D-alanine cuối cùng được tách

ra từ các pentapeptide để tạo thành một tetrapeptide bởi sự xúc tác của enzimtranspeptidases Điều này cung cấp năng lượng liên kết cho cầu nốipentaglycine từ D-alanine của tetrapeptide này với acid meso diaminopimelic

của một tetrapeptide khác Tương tự đối với S aureus, D-alanine cuối cùng

được tách ra từ pentapeptide để tạo thành tetrapeptide Điều này cung cấpnăng lượng liên kết cho cầu nối pentaglycine từ D-alanine của tetrapeptidenày với L-lysine của một tetrapeptide khác (Hình 1.7 [35])

Hình 1.7: Cầu nối pentaglycine (trái) hay cầu nối giữa 2 tetrapeptide (phải)

Khi carbapenem (hoặc các β-lactam khác) gắn vào vị trí hoạt động củaPBP, vòng β-lactam sẽ cạnh tranh cầu nối D alanine – D alanine với enzim

Cầu nối giữa 2 chuỗi tetrapeptide Cầu nối pentaglycine

Peptidoglycan

đơn phân

Peptidoglycan đơn phân

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

transpeptidases, làm cho enzim này không cắt đứt cầu nối D alanine – Dalanine Cầu nối pentaglycine không được tạo thành, chuỗi peptidoglycan mớicũng không hình thành được, trong khi enzim tự động ly giải chuỗipeptidoglycan của vách tế bào vẫn xảy ra liên tục Vì vậy vách tế bào vikhuẩn sẽ ngày càng yếu đi và vỡ ra do áp suất thẩm thấu bên trong tế bào quálớn so với môi trường bên ngoài [47]

1.4.3 Các cơ chế kháng carbapenem

Cơ chế kháng carbapenem bao gồm: tiết carbapenemase thủy phâncarbapenem, bơm đẩy, đột biến làm thay đổi biểu hiện hoặc mất chức năngcủa các kênh porin và các PBP hay kết hợp cả hai Sự kết hợp của các cơ chếnày có thể gây ra mức độ đề kháng carbapenem cao ở một số loài vi khuẩn

như Klebsiella pneumoniae, P aeruginosa và A baumannii [57]

Ví dụ: Ở K pneumoniae, kênh porin màng OmpK35 và OmpK36 giữ vai

trò quan trọng, sự thiếu hay thay thế một trong hai protein này đều đóng gópvào tính kháng carbapenem của vi khuẩn này [66]

1.4.3.1 Tiết các loại β-lactamase không phải carbapenemase

Tiết vượt mức một loại β-lactamase không phải carbapenemase nhưAmpC, Cephalosporinase hay ESBL kết hợp với giảm tính thấm màng ngoài

do mất hoặc thay thế kênh porin làm chặn cổng vào của kháng sinh Cơ chế

này được tìm thấy ở Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes,

1.4.3.2 Sự thay đổi điểm gắn kháng sinh

Sự thay đổi ái lực của các protein gắn penicillin (PBP) đối vớicarbapenem làm cho kháng sinh này không tiếp cận được với các enzim củaPBP nên không ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chuỗi peptidoglycan mớicho việc duy trì tính bền vững của vách tế bào vi khuẩn

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

1.4.3.3 Tiết enzim carbapenemase

Tiết carbapenemase có khả năng thủy phân carbapenem nhờ khả năngcắt đứt liên kết amide của vòng β-lactam Đây là cơ chế kháng phổ biến nhấthiện nay và sự phân bố của chúng ở các loài vi khuẩn khác nhau rất lớn [21], [69] Với đặc tính này của carbapenemase do K pneumoniae tiết (KPC), đã gây

ra nhiều đợt dịch trên thế giới với những hậu quả nghiêm trọng Cơ chế khángcarbapenem của carbapenemase theo sơ đồ phản ứng ức chế và thủy phâncarbapenem bởi các lớp A, B và D của carbapenemase, trong đó: E2:carbapenemase, S: carbapenem, k1, k-1, k2, k3 là các hằng số tốc độ tươngứng Khi carbapenemase tiếp xúc với carbapenem (E2:S) tạo thành phức hợpMichaelis (E2-S) ký hiệu là (Δ2) Khi tốc độ phản ứng nhanh, phức hợp (E2-S) sẽ bị thủy phân trực tiếp cho ra E2 và sản phẩm β-lactam bị bất hoạt Phứchợp (E2-S) có thể hoán chuyển lẫn nhau (tautomer: đồng phân hỗ biến ) vớixúc tác là enzim acyl, sẽ cắt liên kết peptide tạo thành (E2-T) ký hiệu là (Δ1).Việc chuyển đổi E2-S thành E2-T thể hiện tính chất lưỡng tính của quá trìnhthủy phân carbapenem, do sự di chuyển nguyên tử hydro (proton) dẫn đến sựthay đổi liên kết đôi pyrroline, có thể hoặc không đóng vai trò trong hoạt tínhcủa carbapenemase Khi tốc độ phản ứng chậm (E2-T) tiếp tục bị thủy phâncho ra E2 và sản phẩm β-lactam bị bất hoạt Theo sơ đồ 1.1 [47].

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ cơ chế đề kháng kháng sinh carbapenem 1.1

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.