Đánh giá sự biến đổi hình thái apoptosis của tế bào ung thư dạ dày gây bởi dịch chiết cây lược vàng

HỒ CHÍ MINHBÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI APOPTOSIS CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY GÂY BỞI DỊCH CHIẾT CÂY LƯỢC VÀNG Mã số: Chủ nhiệm đ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI APOPTOSIS CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY GÂY BỞI DỊCH

CHIẾT CÂY LƯỢC VÀNG

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: TS LÊ NGUYỄN UYÊN CHI

Tp Hồ Chí Minh, 12/2018

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI APOPTOSIS CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY GÂY BỞI DỊCH

CHIẾT CÂY LƯỢC VÀNG

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài

TS LÊ NGUYỄN UYÊN CHI

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA

TS LÊ NGUYỄN UYÊN CHI

Bộ môn Sinh học

Khoa Khoa học cơ bản

Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh

2.1.4 Công dụng làm thuốc của cây Lược vàng 132.2 Tình hình nghiên cứu tính kháng ung thư của cây Lược vàng 142.3 Ứng dụng của GFP trong nghiên cứu quan sát tế bào 15

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – HÓA CHẤT - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU19

4.2 Độc tính của dịch chiết Lược vàng trên tế bào AGS 24

4.3 Biến đổi hình thái apoptosis trên tế bào AGS-gfp gây bởi dịch chiết Lược

4.4 Phân tích sự phân đoạn nhiễm sắc thể do apoptosis 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTATCC American Type Culture Collection

DNA Deoxyribonucleic acid

DAPI 4′,6-diamidino-2-phenylindole

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

FBS Fetal Bovine Serum

ms milisecond (mili giây)

PBS Phosphate Buffer Sodium

RNA Ribonucleic acid

Rpm round per minute (vòng/phút)

siRNA small interfeing RNA

TAE Tris Acetate EDTA

UV Ultraviolet

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Hình thái cây Lược vàng Callisia fragrans 9

Hình 4 Quan sát tế bào nuôi cấy sau 24 và 48 giờ ở các giếng nuôi cấy 26

Hình 6 Biến đổi hình thái tế bào AGS kiểu apoptosis do tác động của các nồng

Hình 7 Các dạng hình thái tế bào AGS kiểu apoptosis 29Hình 8 Sự hình thành các phân mảnh DNA trong tế bào AGS 30

DANH MỤC BẢNG BIỂUBảng 1 Hiệu suất thu cắn khô từ lá C fragrans 23

Bảng 2 Hiệu suất thu cắn khô từ thân C fragrans 23Bảng 3 Tỷ lệ tế bào sống khi ủ 48 giờ với các nồng độ CL 24Bảng 4 Tỷ lệ tế bào sống khi ủ 48 giờ với các nồng độ CT 24

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1 Thông tin chung:

－ Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI APOPTOSIS CỦA TẾBÀO UNG THƯ DẠ DÀY GÂY BỞI DỊCH CHIẾT CÂY LƯỢC VÀNG

－ Mã số:

－ Chủ nhiệm đề tài: TS LÊ NGUYỄN UYÊN CHI

－ Điện thoại: 01216395936 Email: chile@ump.edu.vn

－ Đơn vị quản lý: khoa Khoa học cơ bản, bộ môn Sinh học

－ Thời gian thực hiện: 9/2016 - 9/2018

2 Mục tiêu:

Đánh giá khả năng gây apoptosis trên dòng tế bào ung thư dạ dày người của dịch

chiết từ cây Lược vàng (Callisia fragrans).

3 Nội dung chính:

－ Tạo dòng tế bào AGS-gfp phát huỳnh quang ổn định.

－ Thu nhận dịch chiết lá và thân C fragrans.

－ Đánh giá độc tính của dịch chiết C fragrans trên dòng tế bào ung thư dạ dày.

－ Đánh giá khả năng gây chết apoptosis của dịch chiết trên tế bào AGS-gfp

qua hai chỉ tiêu biến đổi hình thái tế bào và sự phân đoạn DNA

4 Kết quả chính đạt được (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):

－ Về đào tạo (số lượng, chuyên ngành, trình độ…):

－ Công bố trên tạp chí trong nước và quốc tế (tên bài báo, tên tạp chí, năm xuấtbản):

－ Sách/chương sách (Tên sách/chương sách, năm xuất bản):

－ Patent, Giải pháp hữu ích (tên; trình trạng nộp đơn đối với giải pháp chưađăng ký sở hữu trí tuệ; mã số, ngày cấp, thời gian bảo hộ đối với patent vàgiải pháp đã đăng ký sở hữu trí tuệ):

5 Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài mang lại:

－ Kết quả nghiên cứu được chuyển giao:

 Báo cáo tổng kết về nghiên cứu khả năng ứng dụng dược chất trong cây C.

fragrans để ức chế tế bào ung thư dạ dày.

 Đơn vị nhận chuyển giao: Đại học Y dược Tp.HCM

 Giá trị chuyển giao: kết quả nghiên cứu làm cơ sở cho thử nghiệm in vivotiếp theo; làm tài liệu tham khảo cho sinh viên, nghiên cứu viên ngànhdược liệu

－ Phạm vi và địa chỉ ứng dụng kết quả nghiên cứu:

 Đơn vị ứng dụng kết quả nghiên cứu: bộ môn Sinh học, Đại học Y dượcTp.HCM

 Bài giảng được trích dẫn kết quả nghiên cứu trong giảng dạy: Cái chết của

tế bào

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT

Ung thư dạ dày là một trong những loại ung thư gây chết người nguy hiểmnhất ở châu Á, mỗi năm có khoảng 800.000 ca tử vong, trở thành loại hiểm họa tửvong do ung thư đứng hàng thứ hai trên thế giới Ở Việt Nam, tỷ lệ ung thư dạ dàyđang gia tăng nhanh chóng, là bệnh ung thư đường tiêu hóa phổ biến nhất ở namgiới và xếp thứ hai ở nữ giới, sau ung thư vú và ung thư cổ tử cung Thống kê vàonăm 2000, bệnh ung thư dạ dày ở nam giới với tỷ lệ mắc thô là 14,5 và tỷ lệ mắcchuẩn theo tuổi là 23,7 trên 100.000 dân; ở phụ nữ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là10,8 trên 100.000 dân Ước tính đến năm 2020, cả nước sẽ có khoảng gần 27.000nam giới mắc bệnh ung thư dạ dày và gần 13.000 nữ giới mắc căn bệnh ác tínhnày [2]

Việc sử dụng thảo dược và dược chất từ thực vật là hướng bào chế thuốcphòng chống bệnh an toàn hiện nay Đối với bệnh nan y như ung thư, việc tìm ramột nguồn dược chất điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh là cấp thiết Có rất nhiềubài thuốc dân gian, truyền miệng hiện đang lưu hành trong công đồng, đưa đếnnhững mặt lợi lẫn mặt hại Vì vậy các nghiên cứu để làm sáng tỏ công dụng củachúng là cần thiết Cây lược vàng là loại cây cảnh du nhập vào Việt Nam Từ năm

2006, một số dân cư ở Thanh Hóa xem cây lược vàng nguồn thuốc dân gian cóhiệu quả trong chữa bệnh viêm hô hấp, viêm răng lợi, viêm đường tiết niệu, viêm

dạ dày, đau xương khớp, bệnh tim mạch, huyết áp và cả ung thư Trên thế giới,chỉ có một số ít nghiên cứu tại Nga công bố thành phần hóa học và tác dụng sinhhọc của cây Lược vàng Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinhhọc hay ứng dụng điều trị lâm sàng chính thức của loại cây này, đặc biệt là khảosát tính gây chết tế bào ung thư kiểu apoptosis

Dựa trên những tài liệu tham khảo về thành phần hóa học của cây Lược

vàng đã công bố trên thế giới, chúng tôi thực hiện nghiên cứu in vitro về khả năng gây chết apoptosis của dịch chiết từ cây Lược vàng (Callisia fragrans) trên dòng

tế bào ung thư dạ dày người với sự đánh giá những biến đổi hình thái apoptosis của

tế bào ung thư

1.2 MỤC TIÊU

Đánh giá khả năng gây apoptosis trên dòng tế bào ung thư dạ dày người

của dịch chiết từ cây Lược vàng (Callisia fragrans).

1.3 CÁCH TIẾP CẬN

－ Tham khảo các tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước

－ Thực nghiệm

1.4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

－ Dòng tế bào biểu mô u dạ dày người AGS (ATCC, USA)

1.5 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

－ Dịch chiết nước từ lá và thân cây Lược vàng

－ Tế bào ung thư dạ dày người AGS-gfp.

－ Chỉ thị apoptosis là sự biến đổi hình thái tế bào và sự phân đoạn DNA

－ Nghiên cứu in vitro.

1.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

－ Tạo dòng tế bào AGS-gfp phát huỳnh quang ổn định.

－ Thu nhận dịch chiết lá và thân Lược vàng

－ Thử nghiệm độc tính tế bào của dịch chiết trên tế bào AGS-gfp.

－ Đánh giá khả năng gây apoptosis của dịch chiết trên tế bào AGS-gfp qua

hai chỉ tiêu biến đổi hình thái tế bào và sự phân đoạn DNA

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1 GIỚI THIỆU CÂY LƯỢC VÀNG

2.1.1 ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI

Ở Việt Nam, loài Lược vàng du nhập vào có tên khoa học là Callisia

fragrans (Lindl.) Woodson Tên thường gọi: Lược vàng, Lan vòi, Bạch tuột, Giả

khóm, v.v…

- Giới: Plantae

- Ngành: Maggnoliophyta (Ngọc lan)

- Lớp: Liliopsida (Hành)

- Bộ: Commelinales (Rau trai)

- Họ: Commelinaceae (Thài lài)

Hoa mọc thành cụm từ 2-3 hoa dạng xim trên phát hoa hình chùy dàikhoảng 60 cm Mỗi căp xim được ôm bởi các lá bắc dạng răng cưa dài 10-15 mm

Lá đài trong suốt, màu trắng, khô, dài 5-6 mm Cánh hoa bóng, trong suốt, màutrắng và mỏng [33]

Hình 1 Hình thái cây Lược vàng Callisia fragrans [49].

2.1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ DƯỢC CHẤT

Trong chi Callisia có một số loài như C elegans, C fragrans, C insignis,

C macdougallii, C repens, C soconusensis đã được Maria A và cộng sự khảo

sát sơ bộ bằng sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng cho thấy đều có chứa flavon

C-glycosid phổ biến Lá của C elegans, C insignis, C macdougallii có cyanidin

3,7,3’-triglucosid acyl hóa Một số nghiên cứu từ Nga cũng cho thấy trong thân

cây C fragrans có các hợp chất phenol là anthraquinon (aloe-emodin) 0,008%,

coumarin (umbelliferon, scopoletin) 0,14%, acid phenolic (acid gallic, caffeic

và chicoric) 0,37%, flavonoid (kaempferol, quercetin) 0,05%, v.v [4, 36,37-39]

Ở Việt Nam, nhóm tác giả Nguyễn Văn Hùng (2013) đã phân lập được 31hợp chất, trong đó có 15 chất từ lá cây, 16 chất từ thân cây và 9 chất từ chồi nhánhcây (một số chất tách từ 3 bộ phận trùng nhau), trong đó có 4 chất có cấu trúc mới(1 chất từ lá cây và 3 chất từ thân cây) và một muối vô cơ Nhóm nghiên cứu đã

phát hiện ra sự có mặt của lớp chất ecdysteroit trong cây Lược vàng và đã phân

lập được 19 hợp chất ecdysteroit từ các bộ phận lá, thân và chồi nhánh cây, trong

đó có 4 chất ecdysteroit mới là turkesterone2-O-β-D-glucopyranoside(CFLW19.4) từ lá cây và callecdysterol A (CFT3), callecdysterol B (CFT5) vàcallecdysterol C (CFT8) từ thân cây [15, 50]

2.1.3.1 Quercetin:

Quercetin là một flavonoid phổ biến ở thực vật, có công thức là

C15H10O7, khối lượng phân tử 302,236 g/mol, điểm nóng chảy 316 oC

Tác dụng sinh học đáng chú ý của quercetin như chống viêm bằng cách ứcchế biểu hiện của các gen iNOS, COX-2 và CRP, khóa các NF-kappaB hoạt động

và điều hòa tăng của các gen tiền viêm; chống oxy hóa mạnh và chống lão hóa[7]; bảo vệ gan theo cách tăng cường hệ thống phòng vệ chống oxy hóa và ức chế

sự peroxy hóa lipid, điều biến miễn dịch [6]

Quercetin có thể phòng chống ung thư thông qua cơ chế thúc đẩy hệ thốngphòng thủ chống oxy hóa enzyme và không enzyme trong giai đoạn khởi đầu củaung thư gan [46] Ở mức độ phân tử, quercetin tương tác với một số thụ thể, cụthể là thụ thể aryl hydrocarbon có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư docác chất hóa học nhất định gây ra Quercetin điều chỉnh một vài tín hiệu của sựtruyền tính trạng trong chuỗi các phản ứng hóa sinh liên quan đến MER/ERK vàNRF2/KEAP1 của quá trình gây viêm và ung thư [29]

2.1.3.2 Kaempferol (3,4’,5,7-tertrahydroxyflavone)

Công thức phân tử C15H10O6, khối lượng phân tử 286,23 g/mol, điểmnóng chảy 276-278 oC

Đặc tính: kỵ sáng, tan trong DMSO hoặc ethanol

Cấu trúc kaempferol tương tự quercetin và cũng có tác dụng chống oxyhóa và chống viêm [12], được dùng chữa viêm nhiễm, dị ứng và bệnh đường tiếtniệu Kaempferol cũng ngăn cản một cách hiệu quả sự phát triển của chứng viêm

dị ứng qua trung gian IgE của các mô hình tế bào đường ruột [21]

Kaempferol còn có tác dụng gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis)trên nhiều dòng tế bào ung thư Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tác dụng chốngoxy hóa của kaempferol có thể liên quan đến việc cảm ứng apoptosis ở tế bàoH460, liên quan đến sự thay đổi mức độ biểu hiện của caspase-3 và AIF Sự biểuhiện quá mức enzyme chống oxy hóa Mn-SOD được đẩy mạnh để tạo một loạigen mới ức chế khối u trong một vài tế bào ung thư người, và có thể nó đóng vaitrò quan trọng vào tác dụng apoptosis trên tế bào H460 của kaempferol [22].Kaempferol ức chế sự phát triển của tế bào bằng cách phá vỡ chu trình tế bào, kết

hợp mạnh với việc ngăn cản sự phân chia tế bào ở pha G2/M và có thể gâyapoptosis thông qua sự phosphoryl hóa p53 ở các tế bào MDA-MB-453 trongung thư vú ở người [5].

Kaempferol còn có thể giúp phòng ngừa hay chữa trị ung thư biểu mô tếbào gan do ức chế hiệu quả hoạt động của HIF-1 và ngăn chặn sự sống sót của các

tế bào ung thư gan hiệu quả trong điều kiện oxy giảm [30]

2.1.3.3 Scopoletin

Công thức hóa học C10H8O4 Scopoletin là một coumarin có nhiều tácdụng sinh học như chống oxy hóa, chống viêm khớp, chống ung thư, làm hạhuyết áp và chống trầm cảm Trong nghiên cứu của Manuele (2006), scopoletin

phân lập từ T cordata Mill và thử tác dụng kháng phân bào và gây độc tế bào

trên các u lympho bào [26] Scopoletin gây ức chế sự tăng sinh của tế bào PC3bằng cách cảm ứng quá trình apoptosis Các tế bào xử lý với scopoletin cho thấynhững sự thay đổi về hình thái điển hình của apoptosis Tỷ lệ chết apoptosis là0,3%, 2,1%, 9,3%, và 35% tương ứng với liều scopoletin là 0, 100, 200, 400 mg/l[24]

2.1.3.4 Aloe emodin

Công thức hóa học C15H10O5 Đây là một hydroxyanthraquinon, có khảnăng chống viêm vì nó ức chế sản xuất oxid nitric, TNF-alpha, và IL-12 [28].Aloe emidin còn là một tác nhân kháng virus Japanese encephalitis do việc kíchthích sản xuất interferon [23]

Aloe emodin cũng là một loại tác nhân chống ung thư mới với hoạt tính

chọn lọc chống lại khối u thần kinh ngoại bì in vitro và in vivo [40] Nghiên cứu

tác dụng chống ung thư của aloe emodin trên hai dòng tế bào ung thư gan ở người

là Hep G2 và Hep G3 cho thấy chất này ức chế sự phát triển tế bào và gâyapoptosis cho tế bào theo các cơ chế khác nhau Ở tế bào Hep G2, aloe emodincảm ứng sự biểu hiện p53 và kèm theo biểu hiện của p21 kết hợp với việc ngăncản chu trình tế bào trong pha G1 Với những tế bào Hep G3 thiếu p53, tác dụng

ức chế tăng sinh tế bào của aloe emodin qua trung gian phụ thuộc p21 mà khôngngăn cản chu trình tế bào hoặc làm tăng lượng thụ thể Fas/APO1 Cơ chế chính làaloe emodin gây cảm ứng apoptosis bằng cách tăng cường sự biểu hiện của Bax[20] Aloe emodin làm chết tế bào u dạ dày AGS và NCl-N87 theo cách phụthuộc thời gian và liều lượng Nó giải phóng các yếu tố cảm ứng apoptosis vàcytochrome c từ ty thể, hoạt hóa caspase-3, dẫn đến co rút nhân và gây apoptosis.[3, 13].

2.1.3.5 Gallic acid

Công thức hóa học C7H6O5 Đây là một polyphenol thực vật, có đặc tínhchống oxy hóa, bảo vệ gan [42], ức chế tyrosinase mạnh, ức chế đáng kể sự tăng

sinh tế bào và gây apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư Nghiên cứu in vitro

cho thấy acid gallic gây ra những biến đổi hình thái, giảm tỷ lệ tế bào sống sót vàgây apoptosis trên tế bào hắc sắc tố A375-S2 theo cơ chế điều hòa tăng cácprotein pro-apoptotic như Bax và gây cảm ứng dòng caspase, nhưng lại điều hòa

ức chế các protein anti-apoptotic như Bcl-2 Gallic acid kích thích giải phóngnguyên sinh chất của các phân tử apoptosis, cytochrome c, thúc đẩy hoạt hóacaspase 9 và caspase 3, dẫn đến chết tế bào [25] Gallic acid ức chế sự phát triểncủa tế bào ung thư cổ tử cung người bằng cách gây ra apoptosis [47] Các thửnghiệm khác cũng cho thấy tác dụng gây chết tế bào của acid gallic qua trunggian của hydrogen peroxid, anion superoxid, các enzyme phụ thuộc calmodulin[18]

phẩm giàu ecdysteroid được điều chế từ cây lược vàng C fragrans gây ức chế

khoảng 27,02 % thể tích của khối u từ tế bào ung thư phổi chuột so với lô đối

chứng ở mức liều 1000 mg/kg/ngày và không ảnh hưởng đến enzyme chức nănggan và thận của chuột gây u [35].

2.1.4 CÔNG DỤNG LÀM THUỐC CỦA CÂY LƯỢC VÀNG

Loài C fragrans được dùng như một cây thuốc dân gian ở Nga để chữa

các bệnh dạ dày – ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường hô hấp như ho, viêmhọng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài danhư viêm da, zona, chàm, bỏng, dị ứng, hắc lào, vết thương ngoài da và cả ung

thư… Trong nghiên cứu khoa học, người ta tìm thấy một số hoạt tính của C.

fragrans như sau:

- Chống oxy hóa: Dịch chiết từ thân C fragrans có tác dụng chống oxy hóa in vitro, cụ thể là phân đoạn chiết ethyl acetate, nước, butanol, chloroform

biểu hiện giá trị IC50 lần lượt là 0,024, 0,032, 0,087, 0,21 mg/ml Dich chiết cóthể gây bất hoạt H2O2 (IC50 0,57mg/ml)

- Tăng cường miễn dịch: Khi cho chuột bị ức chế miễn dịch uống dịch

chiết thân C fragrans (5 ml/kg/ngày) mỗi ngày, trọng lượng tuyến ức và lách

được phục hồi và gia tăng số lượng tế bào có nhân

- Chống stress: Quan sát trên chuột được cho uống dịch chiết thân C.

fragrans (5 ml/kg/ngày) trước khi bị stress thì tỷ lệ bị loét dạ dày giảm còn 25%

so với 100% ở nhóm chứng, không thấy có chuột nào có u dạng vân ở nhóm uốnglược vàng trong khi nhóm đối chứng bị u 100% Tác dụng chống stress này cũngđược cho là do tác dụng chống oxy hóa của dịch ép này, biểu hiện ở việc làmgiảm 40% nồng độ MDA trong huyết thanh và làm tăng nồng độ glutation 3 lần,tăng hoạt độ các enzym catalase (54%) và superoxid dismutase (20%)

- Tăng cường hoạt động: Thử nghiệm dịch chiết thân C fragrans trên

chuột cống trắng với liều uống hằng ngày là 5- 10 ml/kg, quan sát thấy thời gianbơi của chuột tăng gấp đôi so với nhóm đối chứng Sự tăng cường khả năng hoạtđộng là do hoạt chất trong dịch chiết đã hoạt hóa quá trình tổng hợp ATP trong cơxương và cơ tim, làm tăng hàm lượng glycogen trong gan và giảm nồng độ acid

pyruvic và acid lactic trong máu Ngoài ra, dịch ép này đã giúp làm giảm stressoxy hóa của chuột bị cưỡng bức chạy, thể hiện ở việc làm giảm nồng độ MDAtrong huyết thanh, trong cơ xương và cơ tim chuột thí nghiệm cũng như làm tănghoạt độ enzyme catalase.

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA CÂY LƯỢC VÀNG

Tuy có các công bố về thành phần dược chất từ loài Callisia, nhưng những

thử nghiệm về khả năng thúc đẩy cái chết tế bào ung thư kiểu apoptosis vẫn chưađược thực hiện

Apoptosis là sự chết sinh lý của tế bào theo chương trình, được khởi phátbởi những kích thích từ bên trong hoặc bên ngoài tế bào, gây kích hoạt những tínhiệu caspase để thực hiện việc phân giải protein và tạo ra các biến đổi kiểu hình tếbào như cô đặc chất nhiễm sắc, phân mảnh DNA, cuối cùng là tạo các thểapoptosome bị đại thực bào phân hủy nhanh chóng và không gây phản ứng viêm.[1]

Hình 2 Ba bước của sự apoptosis [43]

Mục tiêu của liệu pháp điều trị ung thư hiện nay là làm cho tế bào ung thưchết đi mà không gây hại nhiều đến tế bào bình thường trong cơ thể, và liệu phápgây apoptosis cho tế bào tế bào ung thư được nghiên cứu rất nhiều Có nhiều loạithảo dược từ các cây thuốc cho thấy khả năng kháng u qua cơ chế apoptosis như

Caesalpinia sappan [44].

Trong các hợp chất có ở C fragrans, người ta thấy thành phần

Kaempferol có thể gây cảm ứng apoptosis ở tế bào u phổi H460 [22] và tế bào u

vú MDA-MB-453 [5]; Scopoletin cảm ứng quá trình apoptosis [24]; Aloeemodin giải phóng các yếu tố cảm ứng apoptosis và cytochrome c từ ty thể, hoạthóa caspase-3, dẫn đến co rút nhân và gây apoptosis ở tế bào u dạ dày AGS vàNCl-N87 [3]; Acid gallic gây ra những biến đổi hình thái apoptosis trên tế bàohắc sắc tố A375-S2 [25] và tế bào ung thư cổ tử cung Hela [47]

2.3 ỨNG DỤNG CỦA GFP TRONG NGHIÊN CỨU QUAN SÁT TẾ BÀO

Huỳnh quang là sự phát xạ ánh sáng diễn ra khi đang hấp thụ ánh sángkích thích Khi đó, một photon bức xạ tử ngoại va chạm với một electron trongnguyên tử và đưa electron lên mức năng lượng cao hơn Sau đó, electron kíchthích rơi xuống mức thấp hơn và phát ra ánh sáng dưới dạng một photon nănglượng thấp hơn trong vùng ánh sáng thấy được có bước sóng 400 - 700 nm.2.3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA GFP

Trong tự nhiên, một loài sinh vật có khả năng phát ra ánh sáng huỳnhquang tự nhiên, chẳng hạn ở Sứa Aequorea victoria biểu hiện một protein huỳnhquang màu xanh là GFP, viết tắt từ Green Fluorescent Protein, kích thước khoảng

27 kDa, gồm 238 amino acid GFP có chứa một trình tự serine, tyrosine vàglycine có các chuỗi bên quay vòng một cách ngẫu nhiên để tạo nên một tâmhuỳnh quang chromophore màu xanh khi được chiếu bằng ánh sáng xanh lam

Cấu trúc bậc ba của GFP bao gồm 11 phiến β xếp thành hình khối trụ, mộtxoắn ɑ chạy dọc trong lòng và che phủ hai đầu khối trụ GFP của Sứa A.victoria có bước sóng kích thích trong ngưỡng 395 - 475 nm và bước sóng bức xạ

ở 509 - 540 nm [48]

Khác với protein phát huỳnh quang sinh học, GFP hoàn toàn có khả năngphát huỳnh quang tự thân mà không cần đến sự trợ giúp của bất kì enzyme hoặcchất hỗ trợ nào khác ngoài oxi Chính điều này giúp cho các nhà nghiên cứu cóthể quan sát những hoạt động, phản ứng đang diễn ra trong tế bào và cơ thể sống.2.3.2 GEN GFP

Năm 1992, Douglas Prasher thành công trong việc thu nhận, giải trình tự

gen GFP hoang dại và tạo dòng cDNA [2] Đến nay, gen gfp đã được ứng dụng để

phát huỳnh quang ở các loài sinh vật chẳng hạn như loài giun

tròn Caenorhabditis elegans và vi khuẩn Escherichia coli, nấm

men Saccharomyces cerevisiae, ruồi giấm Drosophilia melanogaster cũng như

các loài động vật bậc cao hơn như cá ngựa, chuột, thỏ [11], v.v…

Tại Việt Nam, từ năm 1998 các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu lĩnh vựcchuyển gen vào tế bào gốc và đã đạt được một số thành tựu nhất định Năm 2009,một nhóm nghiên cứu tại đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh do

ThS Phan Kim Ngọc chủ trì đã chuyển thành công gen gfp của sứa biển bằng

phương pháp bắn gen vào trứng cá Ngựa Vằn và đã tạo ra được hơn 120 con cáphát quang [51]

Cùng với hướng nghiên cứu trên, người ta còn biến tính hoặc gây đột biếngen gfp để thu được những GFP có màu khác nữa Năm 1995, Roger Y Tsien tạiđại học California đã thực hiện thành công một phương pháp biến tính quantrọng, nâng cao được đặc trưng quang phổ của GFP, có cường độ phát quang caohơn, và bền hơn hàng chục lần [14] Người ta đã lợi dụng tính phát quang củaGFP - dùng như một chất đánh dấu rất đặc trưng - để nghiên cứu những quá trình