Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng vi nấm trichoderma đối với nấm fusarium gây bệnh héo vàng và collectotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt (capsicum frutescens l)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH ------ LÊ TỐ NGA Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng vi nấm Trichoderma đối với nấm Fusarium gây bệnh héo vàng và Collectot

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH

- -

LÊ TỐ NGA

Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng

vi nấm Trichoderma đối với nấm Fusarium gây bệnh héo vàng và Collectotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt (Capsicum frutescens L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN



Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn

TS Đỗ Thu Hà đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Sinh – Môi trường – ĐH Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong 4 năm học

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Lê Tố Nga

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

I ĐẶT VẤN ĐỀ 8

II MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 9

III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Sơ lược về thành phần bệnh nấm hại trên cây ớt 10

1.1.1 Nấm Fusarium gây bệnh héo vàng trên cây ớt 11

1.1.2 Nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt 12

1.2 Sơ lược về nấm Trichoderma 14

1.2.1 Đặc điểm của nấm Trichoderma 14

1.2.2 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma 15

1.2.3 Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh của Trichoderma 15

1.2.4 Hoạt động tiết enzim của nấm Trichoderma 17

1.2.4.1 Hệ enzim thủy phân chitin 17

1.2.4.2 Hệ enzim thủy phân cellulose 18

1.2.4.3 Các hợp chất kháng nấm từ Trichoderma 18

1.2.5 Vị trí phân loại 19

1.2.6 Tình hình nghiên cứu về nấm Trichoderma 19

1.2.6.1 Trên thế giới 19

1.2.6.2 Ở Việt Nam 20

1.3 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm và một số chế phẩm từ nấm Trichoderma đã được sản xuất, ứng dụng 21

1.3.1 Phương pháp lên men xố p tạo chế phẩm nấm Trichoderma 21

1.3.2 Một số chế phẩm từ Trichoderma đã được sản xuất và ứng dụng 22

CHƯƠNG 2 24

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG 24

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 24

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 24

2.2.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2011 đến tháng 03/2012 24

2.3 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 24

2.3.1 Nguyên liệu 24

2.3.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24

2.3.2.1 Hóa chất 24

2.3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 25

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất [3], [5] 25

2.4.2 Phương pháp phân lập các chủng vi nấm Trichoderma 26

2.4.3 Phương pháp giữ giống 27

2.4.4 Phương pháp thử tính đối kháng của Trichoderma đối với các chủng nấm gây bệnh trên cây ớt [9],[12] 27

2.4.5 Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của chế phẩm Trichoderma đối với nấm bệnh [4] 30

2.3.6 Phương pháp lên men trên môi trường xốp [9] 31

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33

3.1 Phân lập nấm Trichoderma 33

3.2 Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma cókhả năng đối kháng mạnh đối với các chủng nấm Fusarium và Colletotrichum gây bệnh trên cây ớt 37

3.2.1 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh Fusarium37 3.2.2 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh Colletotrichum 40

3.3 Kết quả quá trình lên men xốp của các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với các chủng nấm gây bệnh trên cây ớt 45

3.4 Kết quả thử khả năng đối kháng giữa chế phẩm nấm Trichoderma và nấm

gây bệnh cây trồng 46

3.4.1 Kết quả theo dõi khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma đối với nấm bệnh Fusarium 46

3.4.2 Kết quả theo dõi khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma đối với nấm bệnh Collectotrichum 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

1 KẾT LUẬN 52

2 KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 54

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 56

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Sự phát triển của các chủng nấm Trichoderma 34 sau 5 ngày nuôi cấy 34 Bảng 3.4:Mức độ đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với các chủng nấm gây bệnh 43 Bảng 3.5: So sánh số lượng bào tử thu được trong 3 công thức lên men tạo chế phẩm nấm Trichoderma 45 Bảng 3.6 : Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Fusarium sau khi rắc 47 chế phẩm nấm Trichoderma 47 Bảng 3.7: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Collectotrichum sau khi rắc chế phẩm nấm Trichoderma 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Phương pháp đánh giá tính kháng của nấm Trichoderma trên đĩa peptri với các chủng nấm gây bệnh,A: Trichoderma, B: các loại nấm gây bệnh 29 Hình 2.2:Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma

đối với nấm bệnh 30

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma 32

Hình 3.1: Hình ảnh cành bào tử nấm Trichoderma 33

Hình 3.2: Hình ảnh khuẩn lạc các chủng nấm Trichoderma 35

(T.01, T.03, T.14, T.15, T.18) 35

Hình 3.3: Hình ảnh khuẩn lạc các chủng nấm Trichoderma (T.02, T.04, T.05, T.06, T.07, T.08, T.09, T.10, T.11, T.12, T.13, T.16, T.17, T.19, T.20) 36

Hình 3.4: Mức độ đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm bệnh Fusarium 38

Hình 3.5: Khả năng đối kháng của một số chủng nấm Trichoderma 39

Hình 3.6: Mức độ đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm bệnh Colletotrichum 41

Hình 3.7: Khả năng đối kháng của một số chủng nấm Trichoderma đối với nấm bệnh Collectotrichum (NB2:Collectotrichum) 42

Hình 3.8: Hình ảnh cành bào tử và ống giống của nấm Trichoderma T.01 44

Hình 3.9: Hình ảnh cành bào tử và ống giống của nấm Trichoderma T.02 44

Hình 3.10: Hình ảnh cành bào tử và ống giống của nấm Trichoderma T.16 44

Hình 3.11: Chế phẩm nấm Trichoderma sản xuất bằng phương pháp lên men xốp sau 5 ngày nuôi cấy ở 3 công thức 45

Hình 3.12: Chế phẩm nấm Trichoderma dạng bột sản xuất bằng phương pháp lên men xốp theo công thức 2 46

Hình 3.14: Khả năng đối kháng của chế phẩm nấm Trichoderma đối với nấm bệnh Collectotrichum 50

MỞ ĐẦU

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, nền nông nghiệp Việt Nam đã có những bước tiến vượt bậc, ngoài việc đáp ứng được nhu cầu lương thực- thực phẩm trong nước, sản lượng nhiều loại nông sản xuất khẩu ở nước ta được xếp hàng đầu thế giới Tuy nhiên, chất lượng và hiệu quả của việc sản xuất nông sản ở nước ta còn nhiều hạn chế so với các nước trong khu vực Một trong những vấn đề phải đối mặt là các bệnh cây trồng do vi sinh vật đặc biệt vi nấm gây ra Để khắc phục tình hình dịch bệnh trên cây trồng các biện pháp phòng trừ bệnh bằng phương pháp hóa học đã được áp dụng, tuy hiệu quả nhanh chóng song đã làm ảnh hưởng tới chất lượng nông sản, gây ra hàng loạt vấn đề ảnh hưởng tới môi trường như ô nhiễm nguồn nước, đất và dư lượng thuốc bảo vệ thực vật vượt quá ngưỡng cho phép, mất cân bằng hệ sinh thái Vì vậy, phương pháp đấu tranh sinh học đang là hướng mở tích cực cho nông nghiệp để bảo vệ cây trồng, nâng cao năng suất và phòng chống ô nhiễm môi trường, tạo điều kiện phát triển một nền nông nghiệp sạch và bền vững Hiện nay, các chế phẩm sinh học ngày càng được lựa chọn trong công tác bảo

vệ thực vật Trong đó, nấm Trichoderma đã được nghiên cứu và sử dụng để phòng trừ bệnh hại trên nhiều loại cây trồng Trichoderma là vi nấm được phân lập từ

trong đất, thường hiện diện ở vùng xung quanh hệ thống của rễ cây Đây là loại nấm hoại sinh có khả năng ký sinh và đối kháng trên nhiều loại nấm bệnh hại cây trồng

Nhờ vậy, nhiều loài Trichoderma được nghiên cứu như là một tác nhân phòng trừ

sinh học và đã được thương mại hóa thành thuốc trừ bệnh có nguồn gốc sinh học (biofungicides), phân sinh học (biofertilizers) và chất cải tạo đất (soil amendments)

[31] Các kết quả nghiên cứu cho thấy, các chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma

không ảnh hưởng đến các loài thiên địch có lợi trên đồng ruộng, các sinh vật có ích trong đất, nước và môi trường

Để tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng nấm Trichoderma trong việc

phòng trừ các bệnh hại cây trồng do vi nấm gây ra, từ đó góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tăng sản lượng nông nghiệp, chúng tôi tiến hành chọn

đề tài: “Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng vi nấm Trichoderma đối

với nấm Fusarium gây bệnh héo vàng và Collectotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt (Capsicum frutescens L.)”

II MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

- Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm Fusarium gây bệnh héo vàng và Collectotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt

tại thôn Lộc Mỹ, xã Hòa Bắc, thành phố Đà Nẵng, là cơ sở khoa học để sản xuất

chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ các tác nhân vi nấm gây hại cây trồng

III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân lập các chủng nấm Trichoderma trong đất tại thôn Lộc Mỹ, xã Hòa

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về thành phần bệnh nấm hại trên cây ớt

Theo Thomas A Zitter (1989) [57] bệnh do nấm và lớp phụ nấm gây nên trên

cây ớt gồm: Bệnh thán thư, bệnh đốm lá, bệnh đen rễ, bệnh héo Fusarium, bệnh

đốm xám lá, bệnh mốc xám, bệnh mốc trắng, bệnh sương mai, bệnh phấn trắng Theo Ken Pernezny và Tim Momol (2006) [44] bệnh nấm gây hại trên cây ớt gồm có:

Bệnh chết rạp cây con (do nấm Pythium spp và Rhizoctonia solani): Cây con

trồng từ hạt khi bị nhiễm nấm sẽ xuất hiện vết chết hoại ở trụ lá mầm và cổ rễ, làm cho cây đổ gập xuống và chết

Bệnh đốm trắng lá (Cercospora capsici): Vết đốm trên lá có hình tròn thô

giáp, ở giữa vết bệnh có màu nâu, vàng nhạt tới trắng và có viền màu nâu đen Bệnh đốm trắng lá gây hại nặng là nguyên nhân gây rụng lá và làm giảm năng suất ruộng

ớt

Bệnh đốm xám lá (Stemphylium solani): Vết đốm trên lá có dạng gần giống

hình tròn, các vết đốm ban đầu có màu nâu sau chuyển sang màu nâu sáng tới sáng trắng với thương tổn bị lõm ở giữa vết bệnh và viền vết bệnh có màu nâu tới đo đỏ Các vết đốm có thể xuất hiện trên thân, cuống lá hoặc cuống quả nhưng không xuất hiện trên quả và cánh hoa

Bệnh sương mai do nấm Phytophthora capsici là một bệnh phổ biến và gây

hại nghiêm trọng ở Floria Bệnh có thể xâm nhiễm vào các bộ phận khác nhau trên cây ớt Bệnh làm chết cây con cũng như thối rễ, thối thân, héo lá và thối quả ớt Sự lây nhiễm của bệnh lên thân qua tiếp xúc với đất là phổ biến Cây trồng bị nhiễm bệnh héo và chết ngay sau đó Vết bệnh ban đầu trên lá, thân và quả, màu xanh tối

và sũng nước nhưng chuyển sang màu nâu khi cây chết Giai đoạn cây ớt ra hoa bị nhiễm nấm, toàn bộ các cành có thể bị nhiễm bệnh Các vết đốm nhỏ trên lá có dạng hình tròn tới hình không xác định có thể liên kết với nhau gây cháy lá

Bệnh héo rũ gốc mốc trắng (Sclerotium rolfsii): Bệnh gây hại trong điều kiện

Trong điều kiện thời tiết có ẩm độ cao, sợi nấm trắng xuất hiện trên thân ở vị trí tiếp giáp với mặt đất Nhiều hạch nấm nhỏ xuất hiện trên hệ sợi nấm, ban đầu hạch nấm

có màu trắng sau chuyển sang màu nâu [44]

Bệnh thối hạch do nấm Sclerotinia sclerotiorium gây hại nặng trên cây ớt

những năm có điều kiện thời tiết mát mẻ, mùa đông ẩm ướt và đặc biệt những cánh đồng ớt có trồng các cây trồng mẫn cảm với bệnh Nấm thường xâm nhiễm lên thân

từ phần thân, cuống lá và đôi khi cả trên quả khi các bộ phận này tiếp xúc với bề mặt đất Sự lây nhiễm nấm xung quanh thân thường là nguyên nhân làm cây héo và chết Khi điều kiện thời tiết có ẩm độ cao sợi nấm trắng thường xuất hiện nhiều trên

bề mặt thân thậm chí lên cả mặt đất xung quanh thân [57]

Bệnh phấn trắng hại ớt (do nấm Leveillula taurica): Bệnh gây hại trên cả ớt

cay, ớt ngọt và ớt chuông ở tất cả các tỉnh ở California từ những năm 1990 [47]

1.1.1 Nấm Fusarium gây bệnh héo vàng trên cây ớt

Nấm Fusarium thuộc lớp Hyphomycetes, nhóm nấm bất toàn Fungi imperfecti,

đây là loại nấm có thành phần phong phú, đa dạng, sự biến động số lượng loài phụ thuộc cơ bản vào điều kiện khí hậu các vùng khác nhau trên thế giới Loài nấm này gây hại trên nhiều cây trồng, ở tất cả các bộ phận của cây, đặc biệt là các bộ phận

gốc, rễ Nấm bệnh (Fusarium oxysporum) xâm nhiễm qua rễ vào cây và phát triển

trong cây cản trở sự vận chuyển nước trong cây làm lá bị héo vàng Triệu chứng của bệnh thường xuất hiện muộn thông qua hiện tượng các lá già bị rụng Tiếp theo là

sự lây nhiễm nấm sang các lá non và cuối cùng là cây bị chết Trong nhiều trường hợp, chỉ có một cành hoặc một phần của cây có triệu chứng héo [23]

Theo nhiều nghiên cứu thì nấm Fusarium gây bệnh trên cây ớt thì chúng gây

thối trên gốc và quả[40]nhưng theo nghiên cứu năm 1999 thì bệnh héo vàng gây hại trên toàn cây mà không gây hại trên quả Khi cây bị bệnh thì năng suất thu hoạch giảm sút trong điều kiện nhà kính, khoảng 25% các cây cho năng suất thu hoạch thấp Bệnh héo vàng này gây ảnh hưởng nhiều mức độ khác nhau trên các loại cây

hưởng lớn đến năng suất trong đó một số các loài nấm thuộc chi Fusarium như F

moniliforme, F oxysporum, F pallidoresium và F solani phân lập từ cây ớt Capsicum annuum L Hashira, MH và U thrane (1990) [48]

Theo nghiên cứu của Phạm Đình Quân thì thành phần bệnh nấm hại ớt tại Hải Dương vụ hè thu và vụ đông xuân gồm có 5 loại bệnh, vụ xuân hè gồm 4 bệnh,

trong đó Fusarium sp gây bệnh héo ớt trên cả 3 vụ và gây hại trên toàn cây ớt

Bệnh nấm đã gây ảnh hưởng khá nghiêm trọng tại vùng sản xuất [11]

Ở nước ta kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái, khả năng xâm

nhiễm các loài nấm gây bệnh cây còn hạn chế, đặc biệt là nấm Fusariumgây bệnh

héo vàng trên cây ớt

1.1.2 Nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt

Bệnh thán thư trên cây ớt đã được nghiên cứu là do các loài nấm

Colletotrichum gây ra bao gồm nấm C acutatum (Simmonds), Colletotrichum capsici (Syd.) Butler và Bisby, Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz và

Sacc., và C coccodes [38]

Bệnh thán thư do các loài Colletotrichum gây nên thuộc Giới Nấm; Ngành

Ascomycota; Lớp Deuteromycetes; bộ Melanconiales, họ Melanconiaceae Giai

đoạn hữu tính là Glomerella Bệnh thán thư ớt được Halsted (1890)[58] báo cáo đầu

tiên tại New Jersey, USA vào năm 1980, Halsted đã mô tả các tác nhân gây ra là

Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum Bệnh thán thư gây hại chủ yếu

trên quả ớt chín, gây thiệt hại nghiêm trọng cho quả ớt cả trước và sau khi thu hoạch

Năm 1989 tại Đài Loan, Suryaningsih xác định các loài nấm Colletotrichum

capsici, Colletotrichum gloeosporioides, Glomerellacingulata gây hại trên quả ớt

chín, trong đó 2 loài Colletotrichum capsici và Colletotrichum gloeosporioides là

quan trọng hơn cả [56]

Theo Park và Kim [40], [41] xác định các loài gây bệnh thán thư trên ớt ở Hàn

Quốc là Colletotrichum gloeosporioides ; C acutatum ; C coccodes ; C

dematium ; Glomerellacingulata Trong đó loài Colletotrichum gloeosporioides là

phổ biến hơn

Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Kasetsart Kamphaeng Saen Campus,

Nakhom Pathom, Thái Lan (2007) đã xác định 5 loài trong chi Colletotrichum gây bệnh loét trên ớt là: C acutatum, C coccodes, Colletotrichum gloeosporioides,

Colletotrichum capsici, C graminicola [54]

Kim et al (2004) [41] cho rằng, các loài khác nhau gây bệnh ở những bộ phận

khác nhau của cây ớt: Ví dụ, nấm C acutatum và Colletotrichum gloeosporioides

xâm nhiễm vào quả ở tất cả các giai đoạn phát triển, nhưng thường không gây hại

trên lá và thân, trong khi lá và thân bị nấm C coccodes và C dentium gây hại mạnh Nấm C coccodes gây bệnh thán thư trên lá cây ớt con được trồng trên đồng ruộng

lần đầu tiên được Hong và Hwang báo cáo ở tỉnh Chungnam Hàn Quốc vào năm

1988 Cũng theo Hong và Hwang năm 1998 và Kim et al vào năm 1999 các loài

Colletotrichum khác nhau cũng có thể hiện vai trò quan trong khác nhau trong các

giai đoạn quả chín khác nhau Ví dụ, nấm Colletotrichum capsici phổ biến trên quả

ớt đỏ, nhưng ngược lại nấm C acutatum và Colletotrichum gloeosporioides được xem là phổ biến trên cả quả xanh non và chín Nấm C coccodes gây bệnh thán thư

không được xem là bệnh nguy hiểm trên quả ớt [37]

Tác giả Pring et al (1995) [52] nhận định nấm Colletotrichum có thể qua đông

trên các cây ký chủ khác như các cây họ cà hoặc các cây họ đậu, tàn dư thực vật và

các quả bị bỏ lại trên đồng ruộng Các loài Colletotrichum sản sinh ra các hạch nấm

nhỏ để tồn tại ở trạng thái ngủ nghỉ trong đất giữa mùa đông hoặc khi gặp điều kiện bất lợi và những hạch nhỏ này có thể sống sót nhiều năm Trong điều kiện nóng ẩm thông qua mưa và tưới tiêu bào tử đính từ trong các đĩa cành và các hạch nhỏ bị bắn tung tóe từ các quả bệnh tới quả khoẻ và lá cây Quả bệnh như là một nguồn lây nhiễm cho phép bệnh phát tán từ cây này sang cây khác trên đồng ruộng Sự xâm

nhiễm ban đầu bởi các loài nấm Colletotrichum có liên quan đến một loạt các quy

trình bao gồm sự tiếp xúc bào tử lên bề mặt cây trồng, sự nảy mầm của bào tử, sự hình thành giác bám, sự xâm nhập vào biểu bì của cây, sự phát triển và định vị vào

mô cây, sự sản sinh ra đĩa cành và bào tử phân sinh

Đối với bệnh thán thư những nghiên cứu ở nước ta còn chưa nhiều Theo Ngô Bích Hảo (1991)[19] nguyên nhân gây bệnh thối quả ớt là do 2 loài nấm

Colletotrichum nigrum và Colletotrichum capsici Bệnh thường xuất hiện và gây hại

nặng vào giai đoạn đang thu hoạch quả Theo Trần Thị Miên (2008) [18] cho rằng

trong vụ xuân hè năm 2008, tại vùng Hà Nội và phụ cận đã xác định có hai loài gây

bệnh thán thư trên ớt đó là loài Colletotrichum capsici và Colletotrichum

gloeosporioides Theo Ngô Bích Hảo bệnh thán thư hại ớt là một loại bệnh nguy

hiểm và khó phòng trừ, do đó hướng chọn tạo giống ớt chống chịu bệnh là một yêu cầu cấp bách hiện nay

Theo Vũ Triệu Mân và CTV bệnh do hai loại nấm Colletotrichum nigrum Ell

et Hals và Colletotrichum capsici (Syd.) Butler và Bisby gây ra Hai loài nấm trên

thường song song phá hại làm quả ớt bị thối nhanh chóng [20]

1.2 Sơ lược về nấm Trichoderma

1.2.1 Đặc điểm của nấm Trichoderma

* Đặc điểm hình thái: Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính

bằng đính bào tử từ khuẩn ty Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất

nhầy Bào tử của hầu hết nấm Trichoderma có hình bầu dục với kích thước khoảng

(3 – 5μm) x (2 – 4μm), rất hiếm khi bào tử của nấm này có hình cầu Vách bào tử

trơn láng, tuy nhiên ở một vài loài Trichoderma (như T viride) bào tử có vách xù xì

như có nhiều mụn cơm Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục,

vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát triển

nhanh, chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở

200C [53]

*Sự hình thành bào tử trên môi trường: Phần lớn các loài Trichoderma có

cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện sáng tối lẫn lộn, hay bào tử có thể xuất hiện trong điều kiện sáng

Các hỗn hợp như azaguanine, 5- fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidium bromide ngăn cản sự hình các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc đặc biệt của cơ thể rất quan trọng trong hình thái học, làm tăng tiềm

năng trong phòng trừ sinh học T hamatum, T hazianum, T viride và T viirens ở

cả trong môi trường lỏng và rắn có acid thích hợp cho bào tử nảy mầm hơn là môi trường trung tính [55]

* Sự phân bố của Trichoderma

Nấm Trichoderma spp có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi

trong đất, trên bề mặt rễ, trên vỏ cây mục nát Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm

của nhiều loài nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma [44] Sự phân

bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất acid nhiều hơn ở vùng

đất trung tính hoặc kiềm [53]

1.2.2 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma

Nấm đối kháng là một trong những thành viên phổ biến của hệ vi sinh vật

đất Chúng thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc nấm kháng cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh Sự phân biệt của chúng phụ thuộc vào vùng địa lý, loại đất, điều kiện khí hậu và thảm thực vật ở từng khu vực Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh, giúp cây hồi phục, sinh trưởng và phát triển Một số loài nấm đối kháng đã được tìm

thấy: Penicillium axalicum, P frequetans, P vermiculata, P nigricans, P

chregsogetum là đối kháng của nấm Pythium spp.,Rhizoctonia solani, Sclerotium cepivorum, Verticillium alboatrum [40] Nấm Aspergillus niger đối kháng với nấm Fusariumsokeni, Rhizoctonia solani, Aeteriana alternata Nấm Aur eobasidium pollulans và Kikuchii là đối kháng của nấm Diaporthe phaseolorum var Sojage

[22]

Đối với nấm Trichoderma, cũng là một trong những loại nấm có khả năng ức chế một số nấm gây bệnh khác như: Sclerotium rolfsii, Phytopthora, Fusarium,

Pythium, Rhizoctonia gây bệnh trên nhiều loại cây trồng: Cây họ đậu, cây ăn trái,

hòa thảo, cây công nghiệp và cây hoa kiểng

1.2.3 Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh của Trichoderma

- Theo Harman (1996) [33] nấm Trichoderma spp có nhiều cơ chế đối kháng,

cơ chế ký sinh lên nấm bệnh, cơ chế tiết kháng sinh (antibiosis), cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống

- Theo Kredics (2003) [43] quá trình đối kháng của nấm Trichoderma spp với

nấm bệnh chủ yếu bằng 2 cơ chế:

* Thứ nhất: Nấm Trichoderma spp bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh

* Thứ hai: Nấm Trichoderma spp tiết ra các loại enzyme thủy phân

- Theo Elad (2000)[28], có nhiều cơ chế được ứng dụng trong phòng trừ sinh

học của Trichoderma spp đối với nấm gây bệnh, nhưng chỉ có 3 cơ chế quan trọng

là ký sinh, cạnh tranh và tiết ra kháng sinh Okigbo và Ikediugw (2000)[46], cho

biết những loài Trichoderma spp có hệ sợi nấm nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển

vọng trong phòng trừ sinh học chống bệnh thối hạt, thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch

Nấm Trichoderma spp được sử dụng rộng rãi trong phòng trừ sinh học để quản lý bệnh hại do R solani gây ra [34] Nấm Trichoderma spp tấn công trực tiếp

bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh[42] Nấm

Trichoderma spp sống ở rễ cây giúp biến đổi vật chất vô cơ, giúp tăng cường khả

năng sản xuất hormone ở cây trồng, làm tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng Bailey và Lumsden (1998) [25] cho rằng khi dùng dịch huyền phù nấm

Trichoderma hazianum vào trong đất làm tăng sự nảy mầm, tăng khả năng ra hoa,

tăng sinh khối và chiều cao cây bắp, ớt, hoa cúc, cà chua, thuốc lá

Vào năm 1932 Weinding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh lên

nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “giao thoa sợi nấm”

Hiện tượng giao thoa gồm 3 giai đoạn như sau:

(1) Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh

(2) Sau sự vây quanh, sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây

bệnh cây

(3) Cuối cùng là sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng lớp tế bào của

nấm gây bệnh, làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bị phân hủy

và dẫn đến nấm bệnh bị chết

Sau này quan sát dưới kính hiển vi, hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma được mô tả như sau: Tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc với nấm gây bệnh

đã làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết Ngược lại ở những điểm không có sự tiếp

xúc của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh, nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà

nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc

cho nấm gây bệnh [34]

Một vấn đề quan trọng trong sự hình thành cơ chế đối kháng được trình bày ở nhiều báo cáo là: tùy thuộc vào dòng vi sinh vật đối kháng, nguồn gốc của chúng và điều kiện môi trường, vì thế khi chọn một tác nhân sinh học nên quan tâm đến hướng áp dụng, nguồn gốc của mầm bệnh

1.2.4 Hoạt động tiết enzim của nấm Trichoderma

1.2.4.1 Hệ enzim thủy phân chitin

Chitin là một trong những polymer phong phú nhất trong sinh học, enzim

phân giải chitin được tìm thấy ở tất cả mọi sinh vật: nguyên sinh, vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật có xương sống và không xương sống, kể cả con người

Enzim thủy phân chitin là chitinase xúc tác sự phân cắt giữa nối C1 và C4 của hai đơn vị N-acetyl- -D-glucosamin (GlcNAc) liền nhau Chúng được chia ra làm 3 nhóm: 1,4--N- acetylglucosaminidase, có thể cắt chitin ở dạng exo thành những đơn phân GlcNAc; endochitinase, thường cắt ở những vị trí bên trong dọc theo sợi chitin và exochitinase hay chitobiosidase Theo Harman và cộng sự (1993) thì exochitinase hay chitobiosidase chỉ cho ra các đơn vị diacetylchitobiose theo con đường không tạo các phân tử saccharide đơn hay đa

Hoạt động kháng nấm của chitinase được tăng cường bởi sự trợ lực của chất

kháng sinh Enzim chitinase của Trichoderma được xem là enzim có hoạt tính

kháng khuẩn mạnh nhất Hoạt động của chitinase phối hợp mạnh mẽ với các hợp chất có liên quan đến kiểm soát sinh học như kháng sinh Sự phối hợp với các enzim phân giải chitin và glucan khác đã dẫn đến sự tăng cường kỳ lạ của hoạt động thủy phân và ức chế ngay cả trong các trường hợp các enzim này có hoạt tính thấp hay không có hoạt tính khi chúng được sử dụng riêng lẻ [25]

Tuy nhiên quan trọng hơn nữa là khả năng chitinase làm tăng hiệu quả kháng nấm của các hợp chất không có bản chất enzim hay các vi sinh vật khác Chẳng hạn, Lorito và các cộng sự (1993) đã cho thấy sự phối hợp hoạt động của các enzim thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như tổng hợp có ảnh hưởng lên màng tế bào

1.2.4.2 Hệ enzim thủy phân cellulose

Cellulose là chất trùng hợp của -1,4-glucan được sử dụng như một nguồn năng lượng bởi rất nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase Hệ enzim thủy phân cellulose

của Trichoderma bao gồm 3 lớp enzim: enzim thủy giải 1,4- -D-glucan, cắt các sợi

cellulose thành các đơn vị cellobiose; endo 1,4- -D-glucanase, cắt các nối glucoside và 1,4- -D-glucosidase phân cắt các cellooligosaccharide để tạo glucose

T.reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo cellulase mạnh nhất và hệ

enzim cellulase của nó cũng mạnh nhất Có sự phối hợp của ít nhất là 2 enzim cellobiohydrolase, 2 enzim endoglucanase và 1 enzim -glucosidase trong quá trình thủy phân cellulose [37]

Bên cạnh sự tác động qua lại trong quần thể giữa nấm đối kháng và nấm

bệnh, nấm Trichoderma còn có tác động trực tiếp lên sự phát triển của cây trồng, do

trong hoạt động sống, nấm này sản sinh ra các men phân hủy glucose, cellulose Nhờ các men này mà các chất hữu cơ có trong đất được phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thụ cho cây trồng, tạo điều kiện cho cây

trồng sinh trưởng và phát triển tốt [27]

1.2.4.3 Các hợp chất kháng nấm từ Trichoderma

Theo Dennis và Webster (1975), T.viride và T polysporum có khả năng tiết độc tố trichodermin, T.hamatum tạo ra các polypeptide có bản chất kháng sinh Okuda cho rằng nhiều loài Trichoderma tiết isonitrite có bản chất kháng sinh

Trichozianine là kháng sinh peptaibol có hoạt tính kháng nấm được phát hiện

nhiều ở loài T.hazianum Trichozianine B (TB) là kháng sinh có bản chất acid,

Trichozianine A(TA) là kháng sinh trung hòa Rebuffat S và Hajji M đã tách chiết

và xác định trình tự axit amin của 7 loại TB chính, Hegnig P, Davoust D, Bodo B cũng tách chiết được 9 loại TA Trichozianine kết hợp với những enzim thủy phân vách tế bào trong quá trình ức chế sự nảy mầm và kéo dài tơ nấm trong quá trình ký sinh nấm [47]

Trichothecene từ T.hazianum có hoạt tính kháng nấm thấp nhất Trichotoxin A

là kháng sinh thuộc nhóm peptaibol được tách chiết từ T.viride Viridin là một protein kháng nấm có kích thước 65kDa được tách chiết từ T.viride Ergokonin A là

một chất có hoạt tính kháng nấm có khả năng ức chế sinh tổng hợp glucan được

tách chiết từ T longibrachiatum

Harzianin HA và saturnisporin SA IV là 2 peptide thuộc nhóm peptaibol chứa aminoisobutyric có khả năng biến đổi tính chất màng tế bào được tách chiết từ

nhiều loài Trichoderma.Tricholin là protein bất hoạt riboxom do T.viride tiết ra

chúng làm giảm sự hình thành chuỗi polysome [34]

1.2.5 Vị trí phân loại

Trichoderma spp là giống nấm khá phổ biến trong tự nhiên, tuy nhiên hệ

thống phân loại của chúng chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau khi phân loại giống nấm này

Nấm Trichoderma spp thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm bất toàn (imperfect fungi) Deuteromycetes, bộ nấm bông Moniliales, họ Moniliaceae, chi Trichoderma

[20]

Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva [27], Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; các loài Trichoderma được phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và

Hypocreanum Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có

giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea; nhóm

Hypocreanum hiếm khi gặp dưới dạng teleomorph độc lập; nhóm Saturnisporum

không tìm thấy hình thức teleomorph

Phương pháp phân loại truyền thống là dựa trên sự khác nhau về hình thái chủ yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính.Gần đây nhiều phương pháp phân loại dựa trên cấu trúc phân tử được sử dụng Kubicek và Harman (1998) [42] đã mô tả

chi tiết 33 loài Trichoderma spp., ông cho rằng: tùy từng loài nấm mà chúng có

hình dạng và kích thước khác nhau

1.2.6 Tình hình nghiên cứu về nấm Trichoderma

1.2.6.1 Trên thế giới

Được quan sát và mô tả đầu tiên bởi Person ex Gray năm 1801

Theo Bliss (1959), công bố Trichoderma có khả năng thiết lập quần thể và tái

hoạt động rất nhanh trên đất đã được xử lý khử trùng xông hơi bằng carbon

disulfide để diệt nấm Armillariamellea trên cây cam, quýt, nhưng không công bố bằng chứng quần thể nấm Trichoderma phòng chống bệnh

Ohr và cộng tác viên (1973), cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất quần thể

nấm Trichoderma trong đất có khả năng phòng trừ nấm Armillariamellea trên đất

đã được xử lý xông hơi bằng methyl bromide.Trichoderma kháng methyl bromide hơn A.mellea , vì A.mellea sản xuất ra ít chất kháng

Khả năng hoạt động phòng trừ sinh học của Trichoderma ở các thể tiềm sinh

và sợi nấm được công bố không chỉ trong phòng thí nghiệm mà còn trong đất (Hubbard và cộng tác viên, 1983) [36]

Ngoài ra, khả năng thứ hai của nấm Trichoderma là nấm kháng T hamatum

có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm ở Colombia có khả năng ngăn chặn nấm

R.solani (Chet và Baker,1980) [26]

Dưới nhiệt độ và tia phóng xạ gamma không thể diệt được nấm R.solani, ngược lại trên môi trường T hazianum diệt được nấm này (Nelson và cộng tác viên,1983) [49], đây là vai trò chính của Trichoderma trong phòng trừ sinh học Ngoài ra, còn một số chế phẩm khác từ nấm Trichoderma đang được các quốc

gia trên thế giới sử dụng

1.2.6.2 Ở Việt Nam

Ở nước ta, trong những năm gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu sản

xuất chế phẩm Trichoderma

Năm 1996, Tạ Kim Chi ở viện công nghệ sinh học của trung tâm khoa học tự

nhiên và công nghệ quốc gia Hà Nội đã mô tả vai trò của nấm Trichoderma trong đề

tài “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt côn trùng gây hại ở Viện Nam và khả năng ứng dụng”[13]

Hai tác giả Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Thị Hương Giang vào năm 1997 đã

mô tả vai trò của nấm Trichoderma trong tác phẩm “ Bảo vệ cây trồng bằng các

chế phẩm từ vi nấm”[8]

Tác giả Trần Thị Thuần vào năm 1998 cũng đã công bố trên tạp chí bảo vệ

thực vật về hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây

trồng [15]

Đỗ Tấn Dũng và các cộng tác viên vào năm 2001 đã mô tả đặc tính sinh học

và khả năng phòng chống một số bệnh nấm hại rễ cây trồng cạn của nấm đối kháng

Trichoderma trên Tạp chí Bảo vệ Thực vật [2]

Gần đây nhất, PGS.TS Phạm Thị Ánh Hồng và ThS Đinh Minh Hiệp ở khoa sinh, trường ĐH KHTN ĐHQG-HCM đã tiến hành đề tài điều tra khảo sát sự phân

bố của các chủng nấm Trichoderma tại TP Hồ Chí Minh và các tỉnh Đông Nam Bộ

[12]

1.3 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm và một số chế phẩm từ

nấm Trichoderma đã được sản xuất, ứng dụng

Lên men xốp sẽ thu nhận được chế phẩm sinh học dạng đính bào tử (conidiospore) của các nấm kháng, ổn định và bền vững hơn dạng Chlamydospores (bào tử chồi), vì vậy phương pháp này đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm từ lâu

Khi nuôi nấm kháng trên môi trường xốp (hạt) theo Solivey F.F (1984) đã đạt hiệu suất bào tử so với các phương pháp lên men khác để chống sâu bệnh Tuy nhiên, theo ông khả năng sống của bào tử trong chế phụ thuộc không chỉ vào điều kiện bảo quản mà còn phụ thuộc vào sự sấy khô và cơ chất dinh dưỡng Kết quả cho thấy các chế phẩm sinh học nấm diệt sâu Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana nếu bảo quản ở nhiệt độ 5-100C có thể giữ được hoạt tính trong 6-8 tháng Ngược lại bảo quản ở nhiệt độ phòng thì chỉ giữ được 6- 8 tuần Như vậy các chế phẩm sinh học từ nấm được sản xuất ra cần phải được bảo quản ở điều kiện lạnh, nơi khô ráo và sẽ có khả năng giữ được hoạt tính của chế phẩm trong khoảng thời gian 6-8 tháng [40]

1.3.1 Phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma

Người ta thường sử dụng phương pháp lên men xốp để tạo sinh khối, đã áp dụng rộng rãi trong sản xuất để diệt các loài nấm gây hại cây trồng Bởi vì, môi trường lên men xốp cho lượng bào tử / gram chế phẩm cao, quy trình đơn giản, dễ thực hiện, giá thành sản phẩm tạo ra thấp, đáp ứng được nhu cầu của người nông dân

Để có được sản phẩm tạo ra có nhiều bào tử, các điều kiện môi trường như độ

ẩm không khí Rh=95%; nhiệt độ đạt: 30-320C và thời gian nuôi cấy là 5-8 ngày

Thành phần các loại môi trường dùng để lên men xốp, cũng là tạo chế phẩm

nấm Trichoderma như sau:

(1) Bột ngô+ Bã đậu phộng

(2) Cám gạo+ Bột ngô mảnh

(3) Cám gạo+ bột ngô+bã đậu nành

(4) Cám gạo+ bột ngô+ bã đậu khô

(5) Lúa nấu chín

(6) Gạo nấu chín

Ngoài ra, các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tú (1997) [8] còn thí nghiệm trên

3 loại môi trường khác để nhân sinh khối Trichoderma đó là: (1) môi trường gồm

các thành phần là cám, trấu; (2) môi trường than, bùn; (3) môi trường bột thạch cao tẩm một rỉ 10%

Chế phẩm Trichoderma tốt nhất là không nên để quá 9 tháng Với chế phẩm

nấm chưa bảo quản số lượng bào tử/ gram là cao nhất nhưng sau quá trình bảo quản, lượng bào tử giảm dần, nhất là sau 12 tháng thì lượng bào tử trong chế phẩm giảm đáng kể Như vậy, thời gian bảo quản càng lâu thì càng ảnh hưởng tới chất lượng của chế phẩm nấm

1.3.2 Một số chế phẩm từ Trichoderma đã được sản xuất và ứng dụng

Với sự ra đời của thuốc trừ sâu sinh học, việc ô nhiễm và thay đổi môi trường

đã được cải thiện Các chế phẩm sinh học có độ độc cao đối với các loại gây hại cho cây trồng và an toàn đối với những loài khác kể cả con người, hiệu quả sử dụng cao nên được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp

Từ những thực tại đó, trên thế giới hiện nay đã có nhiều quốc gia sử dụng chế phẩm vi sinh để trừ sâu bệnh hại cây trồng Theo Dunin (1979) ở Liên Xô (cũ) đã sử

dụng chế phẩm Trichoderma (từ nấm Trichoderma lignorum) trên cây bông vải làm giảm 15-20% bệnh hóe do nấm Verticillium và làm tăng năng suất lên 3-9 tạ bông / hecta Sử dụng chế phẩm Trichoderma cũng làm giảm 2,5-3 lần bệnh thối rễ

cây con ở thuốc lá và rau màu Trong những năm giữa thập kỷ 80, chế phẩm

Trichoderma ở Liên Xô cũ đã sử dụng trên diện tích 3000 hecta, sử dụng

30-40g/m2 chế phẩm

Chế phẩm nấm Trichoderma ở Liên Xô (cũ) có tên thương mại là

Trichoderma với 4 dòng chế phẩm, Trichodermin-1: nấm nhân nuôi trên môi

trường dinh dưỡng giàu chất đạm và chất bột; Trichodermin-2: nấm nhân nuôi trên môi trường các phế liệu thực vật; Trichodermin-3: nấm nhân trên môi trường than bùn sấy khô và Trichodermin-4 là nấm đươc nhân theo phương pháp cây sâu các nguồn nấm Trichoderma lignorum (Trần Thị Thuần, 1999) [16]

Ngoài ra, còn một số chế phẩm khác từ nấm Trichodermia đang được các

quốc gia trên thế giới sử dụng

Ở nước ta, trong những năm gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu sản

xuất chế phẩm Trichoderma Một số sản phẩm của Viện Sinh Hoc Nhiệt Đới đưa

vào thử nghiệm trên cây rau ở Củ Chi- Thành Phố Hồ Chí Minh; Chế phẩm của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật- Trường Đại học Cần Thơ thử nghiệm trên cây xà lách xoong ở Vĩnh Long, đều cho kết quả rất khả quan

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG

- Các chủng nấm Trichoderma phân lập từ các mẫu đất ( đất thịt nhẹ, đất thịt

trung bình, đất cát pha,…) trên đất trồng ớttại thôn Lộc Mỹ, xã Hòa Bắc, thành phố

Đà Nẵng

- Nấm Fusarium gây bệnh héo vàng và Colletotrichum gây bệnh thán thư trên

cây ớt (Capsicum frutescens L.)

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Mẫu đất thu thập tại Lộc Mỹ- Hòa Bắc - Đà Nẵng

- Phân lập, nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Sinh lý- Hóa sinh, Khoa Sinh- Môi trường, Trường Đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng

- Phòng thí nghiệm trường Cao Đẳng lương thực thực phẩm Đà Nẵng

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng vi nấm Trichoderma đối với nấm Fusarium gây bệnh héo vàng và Collectotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt (Capsicum frutescens L.) tại thôn Lộc Mỹ, xã Hòa Bắc, thành phố Đà Nẵng

- Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm

2.2.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2011 đến tháng 03/2012

2.3 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

2.3.1 Nguyên liệu

- 60 mẫu đất ( đất thịt nhẹ, đất thịt trung bình, đất cát pha,…) trên đất trồng ớt

tại thôn Lộc Mỹ, xã Hòa Bắc, thành phố Đà Nẵng

- Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone

- Các loại hóa chất khác: thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)

- Các dung môi: etanol, iso-propanol, metanol, aceton của Trung Quốc

2.3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Máy cất nước Hamilton - Tủ ấm, tủ sấy

- KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất [3], [5]

+ Yêu cầu chung: tuân thủ các nguyên tắc chung của phương pháp lấy mẫu

về tính điển hình, tính ngẫu nhiên và tính chất của mẫu không bị thay đổi trước khi

đến được phòng thí nghiệm

+ Thu mẫu:

Nguyên tắc:để đảm bảo mẫu đại diện, các điểm lấy mẫu phải được phân bố ngẫu nhiên trong diện tích đất điều tra, theo phương pháp lấy điểm theo đường chéo

Mẫu đất được lấy xa đường đi, lấy ở tầng canh tác bề mặt từ 5 – 20cm ở các vị trí khác nhau (4 - 5 vị trí) Chọn một ô vuông diện tích 1m2, xác định 4 điểm ở các góc vuông của ô và tâm của ô vuông

Dùng xẻng đã rửa sạch và lau cồn để lấy mẫu đất Đầu tiên loại bỏ lớp đất dày 2-3 cm trên cùng vì lớp đất này có thể đã bị xâm nhiễm bởi các vi sinh vật bên ngoài Sau đó lấy những tảng nguyên vẹn theo độ sâu của lớp đất nghiên cứu Mỗi

mẫu lấy khoảng 0,3- 0,5kg Các mẫu này được trộn đều trong một túi nilon đã khử trùng, sau đó lấy ra khoảng 1kg cho vào túi nilon khác Buộc túi lại, ghi các thông tin đầy đủ lên nhãn

Đánh dấu địa điểm để tháng sau lấy tại những địa điểm này

Mẫu đất sau khi lấy về được phân lập ngay hay bảo quản trong tủ lạnh ở 40C, sau đó phân tích càng sớm càng tốt [3]

Mẫu đất được lấy trên vùng đất đã chọn trong 6 tháng, từ tháng 11 đến tháng

4, mỗi tháng lấy mẫu 1 lần Mẫu đất được bỏ trong túi nilon đen cột chặt để hạn chế

sự thoát hơi nước làm giảm độ ẩm Các mẫu được tiến hành phân tích ngay trong ngày

2.4.2 Phương pháp phân lập các chủng vi nấm Trichoderma

* Phương pháp chuẩn bị mẫu để phân tích vi sinh vật[1],[3]

Lấy đất đã trộn đều đem trải lên một miếng thủy tinh khô đã lau cồn và hơ trên ngọn lửa Trộn đất thật kỹ bằng bay rồi trải đều ra Dùng kẹp sắt gắp bỏ các rễ cây

và các vật lạ khác Trước khi dùng bay và kẹp sắt, phải hơ chúng trên ngọn lửa và làm nguội trong không khí

Dùng bay lấy một ít đất từ các điểm khác nhau trên tấm kính cho vào một chén

sứ đã khử trùng và biết trọng lượng để cân trên cân kỹ thuật 1 g mẫu trung bình của đất

Để tách các vi sinh vật ra khỏi các hạt đất, cần phải xử lý mẫu theo một cách riêng Sử dụng phương pháp phân lập của Egorov

- Cân 1g mẫu, đem nghiền nhỏ, cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước cất

- Lắc trên máy với tốc độ 220 vòng/phút trong 10 phút, ta thu được dịch mẫu với độ pha loãng 10-2

- Dùng pipep vô trùng lấy 1 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng, lắc đều, ta thu được dịch mẫu có độ pha loãng là 10-3 Tiếp tục pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6

* Phương pháp phân lập vi nấm Trichoderma [6]

- Môi trường phân lập: môi trường PDA

Khoai tây 200 g

Glucose 20 g

+ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ đặc trưng của Trichoderma cấy truyền sang ống

giống đến khi thuần chủng

2.4.3 Phương pháp giữ giống

Để bảo quản giống cho những nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi thực hiện theo phương pháp của Egorov Ống giống được giữ ở nhiệt độ 4 - 60C, 2 tháng cấy chuyển một lần [3]

2.4.4 Phương pháp thử tính đối kháng của Trichoderma đối với các chủng nấm

gây bệnh trên cây ớt [9],[12]

- Môi trường thử tính đối kháng của Trichoderma: Môi trường nước giá đỗ

- Các chủng nấm Trichoderma sử dụng để thử nghiệm khả năng đối kháng

được nuôi thuần chủng trên môi trường giá đỗ sau 5-7 ngày

- Rót môi trường nước giá đỗ vào đĩa petri, để nguội và kiểm tra nhiễm tạp sau

24 giờ

- Kẻ 1 đường ở giữa petri (phần đáy)

- Cấy nấm Trichoderma và 1 trong 2 chủng nấm bệnh đã chọn trên 2 điểm đối

xứng nhau trên đường vừa kẻ

- Mỗi nghiệm thức nhắc lại 2 lần, mỗi lần nhắc lại 3 đĩa petri

- Ủ ở nhiệt độ phòng Theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển của

Trichoderma và chủng nấm gây bệnh thực vật

* Cơ sở đánh giá tính kháng của nấm Trichoderma:

- Phần nấm Trichoderma phát triển bao phủ qua phần nấm gây hại

- Phần nấm gây hại bị bào mòn dần ở mép khuẩn lạc

- Phần nấm Trichoderma phát triển và khống chế làm cho phần nấm gây hại

không phát triển được

Chúng tôi phân loại tính kháng ở các mức:

 Kháng mạnh: Nấm Trichoderma tấn công và phân hủy hoàn toàn nấm gây

hại, ký hiệu (3+) (hình 2.1a)

 Kháng trung bình: Nấm tấn công và phân hủy một phần nấm gây hại, ký hiệu (2+) (hình 2.1b)

 Kháng yếu: Nấm Trichoderma ngăn chặn sự phát triển của nấm gây hại, ký

hiệu (1+) (hình 2.1c)

 Không kháng: Nấm gây hại gần như phát triển bình thường, xâm nhập vào

vùng phát triển của Trichoderma, ký hiệu – (hình 2.1d)

TR: Trichoderma

NB: nấm bệnh

Hình 2.1: Phương pháp đánh giá tính kháng của nấm Trichoderma trên đĩa peptri với các chủng nấm gây bệnh,A: Trichoderma, B: các loại nấm gây bệnh

a Trichoderma kháng mạnh với nấm gây bệnh (3+)

b Trichoderma kháng trung bình với nấm gây bệnh (2+)

c Trichoderma kháng yếu với nấm gây bệnh (1+)

d Trichoderma không kháng nấm gây bệnh (-)

* Chỉ tiêu theo dõi

- Chỉ tiêu 1: theo dõi các mẫu thử đối kháng cho đến khi có ít nhất một chủng

Trichoderma ức chế hoàn toàn nấm gây bệnh thực vật Lúc này, so sánh khả năng

đối kháng giữa các chủng Trichoderma đối với nấm gây bệnh

- Chỉ tiêu 2: theo dõi các mẫu thử đối kháng cho đến khi các chủng

Trichoderma thể hiện khả năng đối kháng tối đa trong thời gian tối đa 14 ngày

b

a

2.4.5 Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của chế phẩm Trichoderma

đối với nấm bệnh [4]

* Nguyên tắc

Lên men xốp thu nhận chế phẩm dạng bào tử đính có khả năng chống lại các loại nấm gây bệnh hại cây trồng Sau đó thử nghiệm khả năng chống các loại nấm bệnh trên môi trường tốt nhất

* Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường đối kháng (giá đỗ), hấp khử trùng 1210C trong 15 phút,

để nguội 50-600C rồi đổ 20ml môi trường trên vào đĩa peptri vô trùng có kích thước bằng nhau (10cm)

Các đĩa đối chứng được cấy 1 điểm ở giữa đĩa peptri với chủng nấm bệnh Mỗi nghiệm thức nhắc lại 3 lần

Các đĩa thí nghiệm: nấm bệnh được cấy một chấm ở giữa đĩa peptri Sau 1

ngày, lấy chế phẩm Trichoderma rắc đều xung quanh nấm bệnh, cách nấm bệnh

khoảng 0,5 cm

Các đĩa đối chứng và thí nghiệm đươc nuôi ở nhiệt độ 300C Quan sát đướng kính khuẩn lạc nấm bệnh sau 24, 48, 72, 96 giờ sau khi rắc chế phẩm

Hình 2.2:Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng của chế phẩm nấm

Trichoderma đối với nấm bệnh

2.3.6 Phương pháp lên men trên môi trường xốp [9]

Chọn các chủng nấm Trichoderma có tính đối kháng tốt sau thí nghiệm đánh giá khả năng kháng của các chủng nấm Trichoderma để lên men Thử nghiệm với

thành phần cơ chất làm môi trường gồm: cám và trấu

* Môi trường lên men xốp: có thành phần là cám và trấu theo 3 công thức

được trình bày trong bảng 2.1:

Bảng 2.1: Thành phần môi trường lên men xốp các công thức trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau đến việc nhân sinh

khối Trichoderma dạng rắn

Công thức thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đa yếu tố với 3 lần lặp

lại Sau khi lên men xong, đếm số lượng bào tử và tính mật độ Trichoderma bằng

phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trên môi trường dinh dưỡng đặc ở các độ pha loãng khác nhau của các mẫu nghiên cứu (phương pháp Koch) [1]

Số lượng VSV có trong 1g chế phẩm được biểu thị bằng đơn vị CFU/g (Colony Forming Unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc) là số khuẩn lạc được hình thành từ tế bào VSV ban đầu trên môi trường nuôi cấy trong điều kiện phù hợp mà mắt thường có thể quan sát được

Tính kết quả theo công thức:

Ni =

W

D

Ai. i 10

Trong đó:

Ni : tổng số CFU trong 1g chế phẩm ở mỗi độ pha loãng

Ai : số khuẩn lạc trung bình trên 1 hộp petri ở mỗi độ pha loãng

10 Ai : số lượng VSV trong 1ml dịch mẫu ở mỗi độ pha loãng

Di : độ pha loãng

W : trọng lượng khô của 1g mẫu chế phẩm

Mật độ tế bào trung bình N trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Ni ở các nồng độ pha loãng khác nhau [12]

*Cách tiến hành

Cân thành phần cơ chất theo đúng tỷ lệ Cho thêm vào 15ml nước cất Khử trùng các loại cơ chất ở nhiệt độ 1200C, áp suất 1atm, trong thời gian 30 phút Sử dụng các hộp xốp kích thước 15cm x 20cm để lên men Cắt 7 khoanh thạch nấm

Trichoderma được chọn nghiền nát cho vào môi trường và trộn đều Ủ các hộp xốp

trong phòng kín cho đến khi bào tử nấm mọc xanh đầy mặt hộp đem đi sấy khô ở nhiệt độ 350C cho đế khi độ ẩm còn khoảng 12% cho vào máy xay nhuyễn và để vào hộp nhựa giữ ở nhiệt độ phòng (250C)