Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng nấm phytophthora sp gây bệnh sương mai trên cây cà chua

Vì có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp và ưu việt hơn so với các sản phẩm hóa học, chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng ngày càng được quan tâm sử dụng để diệt nấm g

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

HỨA THỊ VY

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG NẤM

PHYTOPHTHORA SP GÂY BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÂY

CÀ CHUA

Đà Nẵng – Năm 2019

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

HỨA THỊ VY

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG

NẤM PHYTOPHTHORA SP GÂY BỆNH SƯƠNG MAI

TRÊN CÂY CÀ CHUA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S LÊ VŨ KHÁNH TRANG

Đà Nẵng – Năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong các công trình nghiên cứu khác Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Hứa Thị Vy

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc trước sự quan tâm, dìu dắt và tận tình hướng dẫn của cô Lê Vũ Khánh Trang trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn trước sự quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ của các quý thầy, cô trong khoa Sinh – Môi trường

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Đà Nẵng, ngày tháng năm2019

Tác giả luận văn Hứa Thị Vy

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỞ ĐẦU 7

1 Tính cấp thiết của đề tài 7

2 Mục tiêu 8

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 8

3.1 Ý nghĩa khoa học 8

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Tổng quan về cây cà chua 10

1.1.1 Cây cà chua 10

1.1.2 Một số bệnh trên cây cà chua 11

1.1.3 Triệu chứng bệnh sương mai trên cây cà chua 12

1.2 Tổng quan về nấm Phytophthora sp 14

1.2.1 Đặc điểm sinh thái của nấm Phytophthora sp 14

1.2.2 Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora sp gây hại cây trồng 14

1.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp 15

1.3.1 Những nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp trên thế giới 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 21

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.2.1 Phương pháp thu mẫu 21

2.3.2.2 Phương pháp phân lập nấm bệnh Phytophthora sp 22

2.3.2.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo 22

2.3.2.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn 22

2.3.2.5 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Phytophthora sp 23

2.3.2.6 Phương pháp xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn được tuyển chọn 24

2.3.2.7 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử Error! Bookmark not defined.25 2.3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 256

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh mốc sương cà chua 27

3.2 Kết quả lây bệnh nhân tạo 29

3.3 Kết quả phân lập vi khuẩn 29

3.4 Kết quả tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Phytophthora sp 32

3.5 Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn VK15 34

3.6 Kết quả định danh loài vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử 36

3.6.1 Nuôi cấy sinh khối vi khuẩn Bacillus sp 36

3.6.2 Khuếch đại vùng gen 16S rRNA 36

3.6.3 Đọc trình tự sản phẩm PCR 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 Kết luận 42

2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số hiệu

3.6 Khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn VK15 với

3.8 Kết quả khảo sát các cơ chế đối kháng của một số

VK : Vi khuẩn

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trên thế giới, cà chua (Solanum lycopersicum) là cây rau ăn quả quan trọng

được hầu hết các nước quan tâm và phát triển vì có giá trị dinh dưỡng và mang lại hiệu quả kinh tế cao Theo thống kê của FAO (2010), diện tích cà chua sản xuất năm 2009, đạt 5.227.883 ha tăng 30% so với năm 2000 Năng suất 28,39 tấn/ha (năm 2009), sản lượng đạt 141.400.629 tấn Tại Việt Nam, cây cà chua được chú trọng đẩy mạnh đầu

tư phát triển để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm Theo số liệu thống kê năm

2013, năm 2012 diện tích trồng cà chua cả nước đạt 23.917,8 ha, tăng 11,3% so với năm 2010 (21.178,2 ha) Năng suất trung bình 252,6 - 257,9 tạ/ha, sản lượng đạt 616.890,6 tấn Tuy nhiên, quá trình sản xuất cà chua gặp nhiều khó khăn trở ngại, bởi rất nhiều tác nhân gây bệnh như côn trùng, vi khuẩn và nấm bệnh Trong đó nấm

Phytophthora sp gây bệnh sương mai là một trong những bệnh được coi là gây hại

nghiêm trọng nhất đến năng suất và chất lượng cà chua Hiện nay, trên thế giới cũng

như ở Việt Nam, nấm Phytophthora sp có thể làm giảm năng suất đến 40-70% tổng

sản lượng cà chua

Bệnh sương mai cà chua đã được nghiên cứu từ rất lâu nhưng đến nay bệnh vẫn

là đối tượng gây hại phổ biến và ảnh hưởng lớn đến năng suất, phẩm chất cà chua Biện pháp chủ yếu để diệt nấm bệnh là dùng thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học Tuy nhiên nếu dùng nhiều loại thuốc hóa học với liều lượng cao trong thời gian dài sẽ làm mất cân bằng trong quần thể vi sinh vật đất có ích, tạo môi trường bất lợi đối với các sinh vật có ích phát triển và tạo điều kiện để nấm bệnh, các loài côn trùng có hại kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu diệt các loài thiên địch có ích Dư lượng thuốc diệt nấm, thuốc trừ sâu hóa học còn lại trên sản phẩm nông nghiệp và trên đất sẽ làm ô nhiễm vào nguồn nước ngầm, gây ra tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe của người

và vật nuôi Ở một số nước phát triển, thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học bị hạn chế hoặc cấm sử dụng.Do đó việc tìm ra biện pháp an toàn hiệu quả phòng trừ bệnh mốc sương là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay

Trong các biện pháp phòng trừ đang được nghiên cứu để dần thay thế biện pháp hóa học thì biện pháp sinh học là một hướng đi được các nhà khoa học của nhiều nước

trên thế giới cũng như Việt Nam quan tâm Một trong những hướng cơ bản của phương pháp sinh học là tăng cường sản xuất các chế phẩm sinh học Vì có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp và ưu việt hơn so với các sản phẩm hóa học, chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng ngày càng được quan tâm sử dụng để diệt nấm gây hại cây Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tư, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trường sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe của người và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả Người sản xuất hoàn toàn có thể yên tâm sử dụng chế phẩm sinh học từ vi sinh vật để kiểm soát nấm gây hại cây trồng

Các chủng vi khuẩn đối kháng như Burkholderia, Pseudomonas, Bacillus đã và

đang được quan tâm nghiên cứu vì chúng tổng hợp một số chất ngoại bào với khả năng

ức chế sự nẩy mầm và phát triển của nấm bệnh hại cây trồng Trong nhóm vi khuẩn

đối kháng nấm, chủng Bacillus sp được xem là chuyên gia trong khả năng kiểm soát nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai trên cây cà chua

Để góp phần vào việc đa dạng hóa các chế phẩm sinh học, cải thiện và ứng

dụng chế phẩm Bacillus spp vào lĩnh vực nông nghiệp, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh

sương mai trên cây cà chua”

2 Mục tiêu

Phân lập được chủng nấm gây bệnh Phytophthora sp gây bệnh sương mai trên

cây cà chua đồng thời phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp các dẫn liệu khoa học về thành phần loài, khả năng đối kháng của một

số vi khuẩn với nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai cà chua, tạo cơ sở khoa

học cho việc nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn này để phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh mốc sương cà chua

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm sinh học trong lĩnh vực bảo vệ cây trồng tại điều kiện địa phương, nhằm góp phần nâng cao năng suất cây trồng và xây dựng nền một nông nghiệp sạch và bền vững

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây cà chua

1.1.1 Cây cà chua

Cà chua có tên khoa học là Lycopersium esculentum Millier thuộc họ cà

Solanacea, có nguồn gốc từ Nam Mỹ.[11]

Mô tả sơ bộ cây cà chua:

Cà chua là cây hằng niên, tuy nhiên trong điều kiện tối hảo nhất định cà có thể

là cây nhiều năm

Rễ: Rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn Thân: Thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân

dần dần hóa gỗ Thân mang lá và phát hoa Ở nách lá là chồi nách Chồi nách ở các vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau, thường chồi nách ở ngay dưới chùm hoa thứ nhất có khả năng tăng trưởng mạnh và phát dục sớm so với các chồi nách gần gốc

Tùy khả năng sinh trưởng và phân nhánh các giống cà chua được chia làm 4 dạng hình:

- Dạng sinh trưởng hữu hạn (determinate)

Hình 1.1 Hình ảnh mô tả cây cà chua

- Dạng sinh trưởng vô hạn (indeterminate)

- Dạng sinh trưởng bán hữu hạn (semideterminate)

- Dạng lùn (dwart)

Lá: Lá thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3 - 4 đôi lá chét, ngọn lá có 1 lá

riêng gọi là lá đỉnh Rìa lá chét đều có răng cưa nông hay sâu tùy giống Phiến lá thường phủ lông tơ Đặc tính lá của giống thường thể hiện đầy đủ sau khi cây có chùm hoa đầu tiên

Hoa: Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Sự thụ phấn chéo

ở cà chua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa các alkaloid độc nên không hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được Số lượng hoa trên chùm thay đổi tùy giống và thời tiết, thường từ 5 - 20 hoa

Trái: Trái thuộc loại mọng nước, có hình dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đến

dài Vỏ trái có thể nhẵn hay có khía Màu sắc của trái thay đổi tùy giống và điều kiện thời tiết Thường màu sắc trái là màu phối hợp giữa màu vỏ trái và thịt trái

Tại Việt Nam, việc phát triển trồng cà chua có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích, do đó cà chua là loại cây trồng được khuyến khích phát triển Tuy nhiên, việc trồng cà chua chưa được phát triển mạnh theo mong muốn vì cà chua trồng trong điều kiện nóng và ẩm ở nước ta dễ mắc nhiều bệnh gây hại đáng kể như bệnh sương mai, héo xanh, virus, khó trị Ngoài ra mùa hè vùng nhiệt đới làm cà kém đậu trái vì nhiệt độ cao nên hạt phấn bị chết (bất thụ)

1.1.2 Một số bệnh trên cây cà chua [5]

Bảng 1.1 Các bệnh phổ biến do vsv gây ra trên cây cà chua

Bệnh Tác nhân vsv Dấu hiệu chuẩn đoán bệnh

solanacearum

Héo, dịch khuẩn xuất hiện ở thân, thân biến màu nâu

nấm màu trắng xuất hiện ở gốc thân

trùng

(fulvia fulva) Nấm màu xám/tía mọc ở mặt dưới lá

1.1.3 Triệu chứng bệnh sương mai trên cây cà chua [5]

Tác giả William W Kirk và cộng sự năm 2009 [49] cho biết, bệnh sương mai

có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nơi đây cũng chính là nguồn gốc ra đời của cây khoai tây Sau đó, bệnh đã lan ra các nước châu Âu, châu Á cùng với việc di thực của cây này Bệnh được chính thức xác định đầu tiên năm 1930 ở Đức, 15 năm sau bệnh trở thành dịch nguy hiểm ở Bắc Âu, đặc biệt ở Ai-rơ-len Tác nhân gây bệnh do nấm thuộc loài

nấm Phytophthora sp

Triệu chứng trên lá: Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá tạo vết xám

xanh nhạt sau đó lan rộng vào phiến lá Phần giữa vết bệnh chuyển màu nâu đen và xung quanh vết bệnh thường có lớp cành bào tử màu trắng xốp bao phủ như một lớp mốc trắng như muối làm cho lá chết lụi nhanh chóng Ở mặt dưới lá, vết bệnh có một

lớp mốc trắng như sương (phân sinh bào tử) Bệnh nhẹ lá hơi bị cháy, bệnh nặng có thể làm toàn bộ phiến lá bị cháy khô

Triệu chứng trên thân cành: Bị bệnh từng đoạn dài, vỏ và ruột thân lúc đầu màu

nâu hoặc thâm đen, sau đó thối ướt màu nâu đen Chỗ bị bệnh nhỏ tóp lại có khi chỉ một phía thân bị thối Khi ẩm ướt, trên vết bệnh có lớp nấm trắng như sương muối bao phủ Phía trên chỗ bị bệnh, lá héo dần Cành, thân bị bệnh dễ bị gãy gục làm tán cây

xơ xác

Triệu chứng trên quả: Bệnh thường xuất hiện ở mặt trên của quả, trên quả có

những đốm màu xanh xám, có vẻ ướt, vết bệnh lớn dần, chuyển sang màu trắng đục sau đó chuyển sang màu nâu, hơi lõm, quả nhăn nheo, có viền rõ và bên trong có thể bị thối Bệnh nhẹ quả hơi nám và cứng, bệnh nặng quả không phát triển được, sau đó bị rụng

Hình 1.2 Triệu chứng bệnh sương

mai trên lá cà chua

Hình 1.3 Triệu chứng bệnh sương mai

trên lá cành chua

1.2 Tổng quan về nấm Phytophthora sp

1.2.1 Đặc điểm sinh thái của nấm Phytophthora sp

Bệnh sương mai trên cây cà chua do nấm Phytophthora sp gây ra Nấm gây

bệnh nhờ những bào tử, chúng có thể phát tán nhờ gió chuyển từ nơi này sang nơi khác, cây này sang cây khác Bào tử theo nước mưa, nước tưới xâm nhiễm vào cây Bệnh có quan hệ chặt chẽ với thời tiết như chế độ mưa, ẩm độ, nhiệt độ Nếu nhiệt độ thấp hơn 200C có mưa (hoặc sương) bệnh phát triển liên tục Nếu vườn cà chua được bón đạm nhiều, mất cân đối hoặc trồng quá dày, tiêu thoát nước kém, trồng liên tục không có thời vụ rõ ràng, xen kẽ, không phân khu vực là những điều kiện thuận lợi để bệnh phát sinh và phát triển [5]

1.2.2 Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora sp gây hại cây trồng

Nấm Phytophthora sp là nấm ký sinh chuyên tính, sống trong tế bào thực vật

tạo thành những vòi hút sinh sản vô tính chủ yếu tạo bào tử phân sinh (conidi) trên các cành conidi đâm nhánh hơi phình rộng Cành conidi tương đối dài, conidi đơn độc hình trứng hay hình quả chanh Chỉ có một conidi trên đỉnh nhánh tạo cho bề mặt của

bộ phận bị bệnh có màu trắng rất dễ nhận dạng (William W.Kirk và cộng sự, 2009) [49]

Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Andre và David (2004) [18], hình thức

sinh sản hữu tính có một số vai trò trong vòng đời của Phytophthora sp Trường hợp những loài Phytophthora sp mang tính dị tản cho phép kết hợp những cặp gen tương

ứng Bào tử noãn có thể tồn tại trong một thời gian dài khi không có sự hiện diện của

Hình 1.4 Triệu chứng bệnh sương mai

trên quả cà chua

cây ký chủ Bào tử noãn cũng có thể nhiễm bệnh vào mô cây chủ trong điều kiện khí hậu không thuận lợi, nóng và khô

Phương thức sinh sản của các loài Phytophthora sp quyết định khả năng phát

dịch Tính đồng tản cho phép sinh sản tự do, tính dị tản tạo khả năng phát dịch Gần

đây, những loài mang tính đồng tản biểu hiện mức độ thấp của lai xa trong Invitro,

trong khi những loài mang tính dị tản chỉ ra tính lai gần ở mức độ thấp (Goodwin và cộng sự, 1994)[33]

Kết quả nghiên cứu của Andre và David (2004) [18] cho thấy chu kỳ sống của

nấm Phytophthora sp có thể bao gồm tới 3 dạng sinh sản vô tính - bào tử nang, du

động bào tử, hậu bào tử và bào tử noãn với dạng sinh sản hữu tính Sợi nấm sinh dưỡng lưỡng bội sản sinh ra bào tử nang vô tính mà có thể nảy mầm trực tiếp, hoặc có thể phân chia để sản sinh ra 8-12 bào tử động, mỗi bào tử động trải qua một quá trình lan truyền và bơi vào nang trước khi nảy mầm

Kết quả của (Letter W Burgess, 2008)[39] cho rằng Phytophthora sp thuộc lớp

nấm trứng, không phải nấm thực và sinh sản ra du động bào tử Vì vậy, phòng trừ nấm này khác với phòng trừ các bệnh do nấm thực gây ra và các thuốc dùng trong phòng trừ cũng khác Theo tác giả, các bệnh do nấm này gây hại cho cây lâu năm, rau và các cây trồng khác làm tổn thất đáng kể về kinh tế cho các nước vùng Đông Nam Á Tác

giả cũng cho biết môi trường nuôi cấy nấm Phytophthora sp Các loài Phytophthora

sp sản sinh bọc bào tử trên môi trường chọn lọc PSM nếu được đặt trong điều kiện có

chiếu sáng Một số loài cũng sản sinh bọc bào tử trên môi trường PCA hoặc môi trường potato-dextrose agar (PDA) Phần lớn các loài gây bệnh ở Việt Nam là dị tản

như P.capsici, P.palmivora, P.infestans

1.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp

1.3.1 Những nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp trên thế

giới

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng phòng trừ sinh học là biện pháp hữu hiệu bảo

vệ cây trồng trước sự tấn công của bệnh hại và an toàn với môi trường Phòng trừ sinh học được định nghĩa là làm giảm mật độ của VSV gây hại hoặc hoạt động của VSV gây hại bằng một hay một số tác nhân VSV có ích khác (Baker và Cook, 1974) [20] Tác động trực tiếp của phòng trừ sinh học là sử dụng các VSV đối kháng đặc hiệu để

hạn chế tác hại của bệnh hoặc sự tồn tại của VSV gây hại Cơ chế tác động của các tác nhân VSV có ích trong phòng trừ sinh học bao gồm: Cạnh tranh dinh dưỡng và nơi cơ trú của VSV có ích và VSV gây hại; các VSV có ích sản sinh ra các chất kháng sinh, men phân giải, hoạt chất có độc tính hạn chế mật độ của VSV gây hại; ký sinh bậc hai

và tăng cường hiệu quả của các loài VSV khác dưới tác động của VSV có ích (Cook

và Baker, 1983)[23]

Những tiến bộ đạt được gần đây trong biện pháp sinh học bao gồm việc định dạng các tác nhân phòng trừ sinh học như: Tác giả Galindo (1992) [31] đã tiến hành

nghiên cứu nhiều thí nghiệm để kiểm tra khả năng phòng trừ sinh học đối với nấm P

palmivora ở cây ca cao bằng sử dụng các vi sinh vật đối kháng như Bacillus spp và Pseudomonas fluorescens cũng đã đem lại một số thành công

Hoạt động phòng trừ sinh học có thể được tiến hành một cách thủ công bằng cách đưa các vật đối kháng ngoại lai vào trong đất, hoặc bằng cách kích thích hoạt động của các đối kháng nội sinh thông qua việc bổ xung thêm các lớp che phủ hoặc phân hữu cơ (Erwin và Ribeiro,1996) [27] Chẳng hạn, sử dụng chất hữu cơ (lớp che phủ, vỏ gỗ thông được chế thành phân trộn ) có vi sinh vật hoạt động mạnh và độ pH

thấp sẽ giúp phòng chống được P.cinnamomi ở trong các cây được trồng tại các vườn ươm Mycorhizae cũng có tác dụng phòng trừ sinh học đối với P cinnamomi giống

như đã được xác định trên cây thông và dứa

Các tác giả Diby và cộng sự (2001) [25] cho rằng vi khuẩn đối kháng

Pseudomonas fluorescent có khả năng hạn chế sự phát triển của một số tác nhân gây

bệnh tồn tại trong đất Vi khuẩn này sản sinh các chất kích thích sinh trưởng như: gibberellins, cytokinins và axit acetic Các nguồn vi khuẩn này được nghiên cứu trong

phòng trừ bệnh do nấm P.capsici gây thối rễ cây hồ tiêu, hiệu quả phòng trừ đạt 70%

trong điều kiện phòng thí nghiệm Theo dõi sau 4 tháng cho hiệu quả kích thích sinh trưởng thân lá cây hồ tiêu tăng hơn 57,15% trong điều kiện nhà lưới

Bên cạnh đó vi khuẩn như vi khuẩn Bacillus spp., xạ khuẩn Streptomyces spp

và vi khuẩn huỳnh quang cũng được sử dụng nhiều để phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại do các nhóm vi khuẩn này có nhiều tiềm năng như chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có tính kháng cao đối với các loài VSV gây hại và an toàn với

các VSV khác và môi trường Vi khuẩn Basillus subtilis GBO3 được sử dụng để xử lý

hạt làm giảm bệnh thối rễ cây đậu và tăng năng suất 31% so với đối chứng (Jensen và cộng sự, 2002) [34]

Kết quả nghiên cứu của tác giả Anandaraj và cộng sự (2003) [17], dòng

P.fluoresceus IISR-51 có hiệu quả phòng trừ nấm Phytophthora capsici tăng so với đối

chứng là 51,6% và 38,9% đối với dòng P fluorescen IISR-6

Kết quả nghiên cứu của Woo và cộng sự (2005) [50] ở Viện NAAS, Hàn Quốc

đã sử dụng chế phẩm từ Paenibacillus illinoisensis dòng KJA-424 để hạn chế bệnh mốc sương do nấm P.capsici gây ra ở cây ớt có hiệu quả phòng trừ từ 50-63%

Ở Hàn Quốc theo Dong và cộng sự (2006) [26] đã sử dụng sản phẩm vi khuẩn

có chứa enzyme chitinase và β-1,3-glucanase đã hạn chế được 64% tỷ lệ bệnh mốc sương so với đối chứng trên cây ớt ở nhà lưới Tác giả cũng sử dụng các giống chống chịu, vệ sinh đồng ruộng, luân canh với cây khác họ cà, kết hợp các biện pháp quản

lý tổng hợp đối với bệnh mốc sương trên đã hạn chế được 54-70% bệnh trên ớt ở ngoài đồng

Hỗn hợp hai dòng vi khuẩn Bacillus là BB1 và FH17 với bã nho đã phân hủy có thể tiêt diệt tới 79-81% nấm Phytophthora capcisi gây bệnh trên cây ớt (Jang Z.Q và

cs 2006)

Theo Weller, D.M (2007) [47], vi khuẩn Pseudomonas sp là các vi khuẩn

Gram âm, sinh trưởng mạnh ở vùng rễ của cây, có khả năng đối kháng với các loại

nấm tồn tại trong đất Pseudomonas có nhiều chủng khác nhau, tuỳ từng cây và các

điều kiện sinh thái khác nhau mà nó có tính thích ứng riêng đối với mỗi một loại tác

nhân gây bệnh cây trồng Vi khuẩn Pseudomonas có một số đặc tính: có khả năng

nhân sinh khối nhanh trong điều kiện nhân tạo, kích thích hạt nảy mầm và hệ rễ cây phát triển, nâng cao hệ thống tự phòng bệnh của thực vật, có khả năng ức chế được sự phát triển của sợi nấm của một số tác nhân gây bệnh tồn tại trong đất

Nghiên cứu của Lee K J và cs (2008) [38] cho thấy Bacillus spp Dòng R33

và R13 có khả năng hạn chế sự phát triển của nấm P capcisi tới 86,8 và 71%

Stephan Olson và cộng sự (2010) [45] trường đại học Florida của Mỹ đã ứng dụng một số chủng VSV đối kháng để hạn chế bệnh trên cây cà chua như các chủng

PGPR Bacillus pumilus SE 34, EQTY, và Pseudomonas putida 89B61 được thông báo

hạn chế các nguồn bệnh: nấm, vi khuẩn, virus thực vật trên cà chua và dưa chuột, làm

giảm tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) từ 10-25% so với đối chứng Tác giả cũng

sử dụng 2 chủng Bacillus là B.amyloliquefaciens IN937a và B.subtilis GB03 cũng có khả năng hạn chế bệnh HXVK và nấm Phytophthora trên cà chua, nhưng nếu kết hợp

xử lý Actigard, thymol với các chủng VSV có ích trên kết hợp với vệ sinh đồng ruộng,

canh tác, chọn lựa dòng/giống chống chịu bệnh thì tỷ lệ bệnh HXVK giảm 47-53% trong điều kiện nhà lưới

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu sử

dụng chế phẩm sinh học đối kháng để phòng trừ một số bệnh hại cây trồng như: Chế phẩm BC (Bacillus subtilis) của Viện Bảo Vệ Thực Vật (1999) ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do nấm P.capsici [14]

Theo Mai Văn Trị và Nguyễn Thúy Bình (2003) [13], bón phân hữu cơ sinh học

đã làm tăng hoạt động của VSV đối kháng dẫn đến ngăn chặn sự phát triển của nấm

Phytophthora palmivora, làm giảm tỷ lệ bệnh trên vườn sầu riêng

Trần Hà và cộng sự (2007)[3], xác định vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được phân lập từ vùng rễ của cây hồ tiêu ở Quảng Trị bằng phương pháp PCR, kết quả nghiên cứu tính đối kháng cho thấy trong 5 chủng, có 1 chủng Pseudomonas

fluorescens SS101 có khả năng tiêu diệt được du động bào tử nấm Phytophthora gây

chết nhanh cây hồ tiêu trong vòng 60 giây, nghiên cứu khả năng ức chế bệnh chết nhanh trong điều kiện nhà lưới cũng chỉ ra có hiệu quả giảm bệnh, theo dõi 60 ngày

sau trồng ở công thức không xử lý tỷ lệ bệnh là 40%, ở công thức được xử lý

Trần Thị Thu Hà (2011) [4], Trường Đại học Huế, đã thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas putida phòng trừ bệnh chết nhanh

(Phytophthora capsici) triển trên hồ tiêu” đạt được kết quả hiệu lực phòng trừ từ 61 -

Chế phẩm gồm 2 chủng vi khuẩn B subtilis và B Flexus của Phạm Thị Thuý Hoài (2014) [6] ứng dụng trong phòng trừ bệnh do nấm P.capsici Hiệu lực phòng trừ

của chế phẩm đối với chỉ số bệnh đạt từ 30,98% đến trên 79,25%

Trần Ngọc Khánh & cộng sự (2015) [9] đã tuyển chọn và định danh được 2

chủng vsv kháng nấm Phytophthora infestans là Bacillus amyloliquefaciens và xạ khuẩn Streptomyces toxytricini Hiệu quả phòng trừ bệnh mốc sương trong các thí

nghiệm đạt 72,6%-75,3% sau 21 ngày xử lý bằng tổ hợp VSV đối kháng BS2

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu bệnh của cây cà chua bị bệnh sương mai (lá, quả, hoặc thân) lấy từ các vườn trồng cà chua tại phường Hòa Thọ Đông, P Hòa Khánh Nam, Xã Hòa Phú,

TP Đà Nẵng

- Vi khuẩn đôi kháng với nấm Phytophthora sp phân lập được từ các mẫu đất

của các vườn trồng cà chua tại phường Hòa Thọ Đông, P Hòa Khánh Nam, Xã Hòa Phú, TP Đà Nẵng

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và định danh chủng nấm mốc Phytophthora sp gây bệnh sương mai

- Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Phương pháp thu mẫu

- Phương pháp thu mẫu nấm bệnh: Thu thập tất cả các loại triệu chứng bệnh

hại trên tất cả các bộ phận của cây cà chua Các mẫu bệnh được đựng trong ống tuýp hoặc các túi xi măng, giấybáo và ghi rõ thông tin (Phương pháp thu thập VSV gây hại theo phương pháp nghiên cứu BVTV, quyển I, ấn hành 1997, 1998 của Viện BVTV và Lester W Burgess và cộng sự, 2008) [14]

Xác định mẫu và tiến hành thu

Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng

tử

- Phương pháp thu mẫu đất: Thu thập đất vùng rễ cây cà chua khỏe trong

ruộng bị bệnh và ruộng không bị bệnh mang về phòng thí nghiệm phân lập, mỗi mẫu thu 100g đất, mẫu được đựng trong từng túi riêng biệt, ghi ngày tháng năm và địa điểm thu mẫu và để khô tự nhiên trong phòng thí nghiệm

2.3.2.2 Phương pháp phân lập nấm bệnh Phytophthora sp

- Cắt các mô có triệu chứng thành từng miếng nhỏ và khử trùng bề mặt bằng 1% NaOCl (sodium hypochlorite) trong 1 phút sau đó rửa 2-3 lần trong nước cất vô trùng

- Đặt các mô đã làm sạch bề mặt lên môi trường thạch nước ép V8 đã khử trùng trong đĩa Petri (Nước ép V8 bổ sung L-Asparagine, CaCO3, glucose, chiết xuất men và agar) được sửa đổi bằng kháng sinh PARP (pimarcin 400 400l; ampicillin 250 mg; rifampicin 1.000μl; và pentachloronitrobenzene 5 ml . L -1 phương tiện) ủ ở nhiệt độ 25-280C trong khoảng 2- 3 ngày để cho sợi nấm phát triển mọc trên môi trường Khi nấm đã mọc, ta cấy chuyền sang môi trường PDA

- Sơ bộ phân loại các chủng nấm mốc gây bệnh trên cà chua

+ Sử dụng các khóa phân loại của S B Marthu Olga Kongsdal (2000) [44], J Taylor (2007) [36], Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam [5]

+ Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên thạch

+ Quan sát các đặc điểm vi học dưới kính hiển vi quang học

2.3.2.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo [7]

Lây bệnh nhân tạo được thực hiện theo phương pháp lá tách rời (Koch): Đặt úp

lá cà chua lên môi trường thạch nước (water agar) trong đĩa petri sau đó dùng Micropipet nhỏ vào giữa mỗi lá 30µl dung dịch bào tử nấm sương mai Với mỗi mẫu giống lây bệnh được lặp lại 3 lần Sau khi lây nhiễm, hộp petri được đậy kín lại giữ trong tủ ổn định 170C Đánh giá bệnh được thực hiện sau 7 ngày

2.3.2.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Phân lập:Các mẫu được phân lập trên môi trường thạch LB (Luria-Bertani) Tiến hành pha loãng mẫu với nước cất vô trùng ở các nồng độ từ 10-10-10-12 Hút 100µl dịch pha loãng mỗi mẫu trang đều khắp mặt thạch LB trên đĩa petri Nuôi ở tủ ấm ở nhiệt độ 300C-320C trong khoảng 18-20 giờ để thu được các khuẩn lạc riêng lẽ rồi tách thuần các chủng đã phân lập Sau đó xác định các chủng vi khuẩn bằng phương

pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào, bào tử dưới kính hiển vi và dựa theo khóa phân loại của Bergey [2]

Phương pháp nhuộm Gram [2]

- Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, lấy 1-3 khuẩn lạc dàn đều trên lam kính và kéo một ít nước muối sinh lý vào để tránh làm loãng mẫu nhuộm

- Để khô tự nhiên Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn

lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay)

- Đổ thuốc nhuộm tím kết tinh lên tiêu bản, để 1 phút, rửa nước

- Đổ dung dịch lugol lên tiêu bản, để 1 phút, hất bỏ đi

- Tẩy màu bằng cồn 900 cho tới khi không còn màu tím kết tinh

- Rửa qua nước

- Đổ thuốc nhuộm Safranin lên tiêu bản, để 30s

- Rửa qua nước

- Thấm giấy hoặc để khô ở không khí

- Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100 có nhỏ dầu soi

- Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím (do màu tím kết tinh) còn vi khuẩn Gram âm có màu đỏ hồng (đỏ Safranin)

Phương pháp nhuộm bào tử [2]

Các bước tiến hành:

- Làm vết bôi trên phiến kính, cố định tế bào

- Nhỏ dung dịch A lên vết bôi, hơ nóng nhẹ bên dưới để bay hơi, tránh để sôi Thêm dần dần thuốc nhuộm để không bị khô cạn, giữ trong 5 phút Đợi nguội, đổ thuốc nhuộm đi

- Dùng dịch B rửa cho đến khi vừa thấy vừa hết màu đỏ, rửa nước

- Nhuộm lại bằng dung dịch B trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô

- Soi kính: dùng vật kính dầu

Kết quả: Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh

2.3.2.5 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm

Phytophthora sp

Khảo sát khả năng đối kháng nấm của các dòng vi khuẩn đã phân lập được từ đất vườn trồng cà chua, tiến hành bằng phương pháp cấy kép Trong đó, đĩa petri chứa

môi trường PDA được chia làm 4 góc, nấm được cấy vào giữa đĩa, vi khuẩn được cấy vào 3 góc cách tâm khoảng 3cm và góc còn lại là đối chứng Sau 2 ngày ủ ở nhiệt độ

300C, tiến hành quan sát sự hình thành vùng kháng nấm và tính hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn được tính theo công thức (Han và cs., 2015)[29]:

Trong đó, I là hiệu lực đối kháng (ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn), R

là bán kính hệ sợi nấm đối chứng, r là bán kính hệ sợi nấm có chủng vi khuẩn (cm)

2.3.2.6 Phương pháp xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn

- Phương pháp tiến hành: Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiếm kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trên phiếm kính, ghi nhận sự sủi bọt nếu có

Đọc kết quả:

- Dương tính: sủi bọt khí