Nghiên cứu quy trình nhân giống cây măng tây (asparagus officinalis l ) in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ NHẬT TUYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY ASPARAGUS OFFICINALIS L.. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ NHẬT TUYÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

CÂY MĂNG TÂY (ASPARAGUS OFFICINALIS L.)

IN VITRO

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng - 2019

LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả khoá luận

Nguyễn Thị Nhật Tuyên

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện Khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức lý thuyết cũng như thực hành thí nghiệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, qua đó bản thân tôi đã trưởng thành hơn trong tư duy, bố trí và tiến hành các nghiên cứu khoa học

Để hoàn thành được Khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự tận tình giúp đỡ về mặt khoa học của TS Nguyễn Minh Lý

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô thuộc Khoa Sinh – Môi trường đã truyền dạy cho tôi rất nhiều kiến thức cũng như kĩ năng thực hành thí nghiệm trong quá trình tôi thực hiện đề tài khóa luận

Tôi cũng xin gởi lời cảm ơn đến các thành viên trong nhóm nghiên cứu, đã luôn giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm nghiên cứu trong thời gian tôi thực hiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn động viên, kích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt được kết quả tốt nhất Xin trân trọng cảm ơn

Đà Nẵng, tháng 04 năm 2019

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Nhật Tuyên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC HÌNH ẢNH 3

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY MĂNG TÂY 6

1.1.1 Đặc điểm sinh học và kĩ thuật trồng cây măng tây 6

1.1.2 Giá trị kinh tế 6

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và dược liệu 7

1.1.4 Tình hình sản xuất cây măng tây 7

1.2 NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY IN VITRO 8

1.2.1 Nghiên cứu ngoài nước 8

1.2.2 Nghiên cứu trong nước 9

1.3 GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO 10

1.3.1 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro 10

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 11

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 11

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.3.1 Khử trùng mẫu vật 11

2.3.2 Phát sinh callus in vitro 12

2.3.3 Tái sinh chồi in vitro 12

2.3.4 Nhân nhanh chồi in vitro 12

2.3.5 Tạo rễ in vitro 13

2.3.6 Bố trí thí nghiệm và xử lí thống kê 13

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 15

3.1 XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU MĂNG TÂY 15

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG (KTST) ĐẾN SỰ PHÁT SINH CALLUS TỪ MĂNG 16 3.2.1 Ảnh hưởng 2,4-D đến khả năng phát sinh callus từ măng non của cây măng tây 16 3.2.2 Ảnh hưởng của BAP + NAA đến khả năng phát sinh callus từ măng non của cây măng tây 20 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG (KTST) ĐẾN

KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI IN VITRO TỪ CALLUS MĂNG TÂY 23 3.3.1 Ảnh hưởng BAP và NAA đến khả năng phát sinh chồi in vitro từ callus

măng tây 23 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG (KTST) ĐẾN

KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO TỪ CALLUS MĂNG TÂY 25

3.4.1 Ảnh hưởng KIN đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro từ callus măng tây25

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Hiệu quả của các công thức khử trùng mẫu măng tây 15

Bảng 3.2: Sự ảnh hưởng của 2,4 – D đến sự phát sinh callus 17

Bảng 3.3: Sự ảnh hưởng của BAP + NAA đến sự phát sinh callus 20

Bảng 3.4: Ảnh hưởng BAP và NAA đến khả năng phát sinh chồi in vitro 23

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân nhanh chồi măng tây in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 26

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của MS đến khả năng tạo rễ cây măng tây in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 28

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây măng tây in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 30

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Mẫu măng tây non 11 Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 13 Hình 3.1: Mẫu măng sau 2 tuần nuôi cấy, không bị nhiễm 16 Hình 3.2: Callus phát triển trên môi trường MS có bổ sung 2,4 – D , thanh ngang tỉ lệ

5mm 19

Hình 3.3: Callus phát triển trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP và 0,5 mg/l

NAA, thanh ngang tỉ lệ 5mm 21

Hình 3.4: Callus phát triển trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP và 0,5 mg/l

NAA 22

Hình 3.5: Mẫu callus măng tây tái sinh chồi sau 3 tuần nuôi cấy được quan sát dưới kính

hiển vi soi nổi 25

Hình 3.6: Callus măng tây tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BAP + 1,0

mg/l NAA sau 4 tuần nuôi cấy 25

Hình 3.7: Nhân nhanh chồi măng tây in vitro bằng môi trường MS bổ sung KIN sau 4

tuần nuôi cấy 27

Hình 3.8: Phát sinh rễ măng tây trên môi trường thay đổi thành phần MS sau 4 tuần nuôi

cấy, thanh ngang tỉ lệ 10 mm 29

Hình 3.9: Phát sinh rễ măng tây trên môi trường thay bổ sung NAA sau 4 tuần nuôi cấy,

thanh ngang tỉ lệ 10 mm 31

Hình 3.10: Quy trình nhân giống cây măng tây (Asparagus officinalis L.) in vitro 32

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

“SỨC KHỎE”- Vấn đề luôn được đặt lên hàng đầu trong mọi thời kì phát triển của nhân loại Để đảm bảo về vấn đề trên con người phải thường xuyên cải thiện điều kiện sống, đặc biệt là bữa ăn hằng ngày Yêu cầu về nguồn thực phẩm không chỉ đảm bảo năng lượng, chất lượng an toàn thực phẩm và nhu cầu thị hiếu mà phải

có nguồn dinh dưỡng, dược tính cao giúp cải thiện và nâng cao sức khỏe con người

Vì vậy, những loại cây vừa có giá trị dinh dưỡng vừa có giá trị dược liệu đang là đối tượng được mọi người tiêu dùng ưa chuộng và các nhà khoa học hướng đến trong các nghiên cứu hiện nay

Măng tây (Asparagus officinalis L.) được biết đến là một loại cây không những

mang lại giá trị dinh dưỡng, thẩm mỹ mà còn tạo ra giá trị kinh tế cao [5] Hiện nay, măng tây được trồng, tiêu thụ rộng rãi và được người tiêu dùng ưa chuộng trên thế giới bởi lẽ đây là loại cây chứa nhiều chất dinh dưỡng, khoáng chất và vitamin rất tốt cho cơ thể [25] Ngoài ra, loại thực phẩm này rất giàu dược tính và theo kết quả nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học đã chiết xuất được 141 hợp chất hóa học quý hiếm, trong đó có đến 31 chất trực tiếp có tác dụng phòng chống và điều trị bệnh ung thư [25] Loài cây này được đánh giá là thích hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng của Việt Nam Hiện nay, ở nước ta măng tây được trồng phổ biến ở Ninh Thuận, Bình Thuận, Hải Phòng, Bình Phước và một số tỉnh thành khác Phương pháp nhân giống cây măng tây được sử dụng phổ biến là sinh sản hữu tính để tạo ra các loại giống F1 Bên cạnh đó, biện pháp nhân giống bằng rễ cũng được sử dụng tương đối rộng rãi [5]

Măng tây thường được trồng với mục đích thu hoạch măng làm rau xanh Giá măng tây trên thị trường giao động từ 80.000 - 180.000 đồng/kg và mang lại tiềm năng rất lớn để phát kinh tế cho người nông dân Tuy nhiên, tất cả hạt giống măng tây F1 được trồng tại nước ta hiện nay đều là giống nhập khẩu với giá thành cao, giao động ở mức 50 - 70 triệu đồng/kg, thậm chí có giống lên đến trên 100 triệu đồng [28],[30] Vì vậy, một yêu cầu được đặt ra hiện nay đối với ngành sản xuất măng tây là phải xây dựng được nguồn cung cấp giống nội địa với giá thành thấp để

Công nghệ sinh học là một công cụ rất quan trọng trong nhân giống và cải thiện đặc điểm di truyền của nhiều loài thực vật, bao gồm các loại cây nông nghiệp,

dược liệu có giá trị kinh tế cao Việc nghiên cứu kĩ thuật nhân giống cây măng tây in

vitro đã được nhiều nhà nghiên cứu tiến hành trong và ngoài nước Tuy nhiên, đến

nay tại Việt Nam vẫn chưa có quy trình sản xuất giống cây măng tây in vitro hoàn

thiện được ứng dụng

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Nghiên

cứu quy trình nhân giống cây Măng Tây (Asparagus officinalis L.) in vitro”

2 Mục tiêu

Xây dựng được quy trình nhân giống cây măng tây xanh (Asparagus officinalis L.) in vitro qua nuôi cấy phát sinh callus từ măng

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của các yếu tố ngoại sinh và nội sinh đến quá trình nhân giống vô tính cây măng tây xanh

bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về

kỹ thuật nhân giống cây măng tây

Nguồn cây măng tây in vitro là cơ sở để chủ động sản xuất nhanh, liên tục với

chất lượng cây giống tốt, giá thành rẻ, đáp ứng nhu cầu cây giống cũng như sản xuất thương phẩm măng tây xanh trên quy mô lớn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY MĂNG TÂY

1.1.1 Đặc điểm sinh học và kĩ thuật trồng cây măng tây

Cây Măng tây (Asparagus officinalis L.) có nguồn gốc từ các nước châu Âu,

Bắc Phi và Tây Á (từ phía bắc Tây Ban Nha bắc Ireland, Vương quốc Anh, và tây

bắc Đức) Măng tây (Asparagus officinalis L.) là một loại cây đa niên thân thảo,

thuộc lớp thực vật một lá mầm Lá cây hình kim, trên bề mặt lá có lông, mọc thành từng cụm Cây phát triển theo dạng bụi, măng tây có tuổi thọ trung bình khoảng 30 năm Khi trưởng thành, cây có chiều cao khoảng 100 -150 cm, tán rộng khoảng 1m Hoa đơn tính hình chuông, màu lục nhạt, có hoa đực và hoa cái trên các cây riêng biệt nhưng đôi khi cũng có hoa lưỡng tính Trái cây khi chín màu đỏ, bên trong có 4-

6 hạt màu đen [8][11] Cây măng tây có khả năng chịu hạn rất tốt nhiệt độ trung bình cao 25 – 33⸰C như ở nước ta, thích hợp để trồng ở những vùng có khí hậu nhiệt đới Ở các quốc gia vùng ôn đới lạnh lẽo, người trồng măng tây phải mất 2 - 4 tháng

ủ hạt giống, 3 - 6 tháng ươm cây, 2 năm trồng cây ra đất, đến năm thứ 3 mới thu hoạch và mỗi năm chỉ thu hoạch vỏn vẹn 3 tháng mùa xuân (3 tháng hè phải dưỡng cây, 3 tháng mùa thu cây úa vàng chết sinh lý, 3 tháng mùa đông cây ngủ đông không phát triển) Ở các quốc gia vùng nhiệt đới ấm áp như Việt Nam, thời gian ươm giống chỉ mất 2 - 3 tháng, trồng cây ra đất 6 tháng sẽ cho sản phẩm thu hoạch mỗi ngày và có thể thu hoạch 6 - 8 năm, thậm chí có thể đến 10 - 15 - 20 năm nếu chăm sóc đúng kỹ thuật, đầy đủ dinh dưỡng hữu cơ và vi sinh Cây sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện đất tơi xốp, giàu dinh dưỡng, đủ ánh sáng Cũng có thể chọn trồng cây trên nền đất thịt nhẹ, đất đỏ bazan, đất phù sa đã được cải tạo cho tơi xốp, giàu chất hữu cơ Măng của cây có dinh dưỡng cao, được dùng trong bữa ăn hằng ngày, phần lá dùng để trang trí và cắm hoa [4][8][9]

1.1.2 Giá trị kinh tế

Do những giá trị to lớn mà loại thực vật này mang lại nên hiện nay, măng tây

đã được trồng phổ biến tại Việt Nam, Sản phẩm của cây măng tây là các chồi măng non thường được gọi là rau măng tây xanh Rau măng tây xanh là nơi tập trung nhiều chất dinh dưỡng nhất của cây măng tây, là loại rau sạch cao cấp còn được

mệnh danh là loại “rau Hoàng Đế” Cây măng tây xanh bán trong các cửa hàng rau sạch hay siêu thị, giá bán măng tây hiện nay vẫn còn khá đắt do sản lượng chưa đáp ứng được nhu cầu người dùng [28]

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và dược liệu

Loài cây này rất giàu dược tính: Các nhà khoa học đã chiết xuất được 141 hợp chất hoá học quý hiếm từ cây măng tây, trong đó có tới 31 chất trực tiếp có tác dụng phòng chống và điều trị bệnh ung thư Do có chứa nhiều chất xơ nên rất tốt khi sử dụng để phòng và điều trị cho các bệnh về đường tiêu hóa như chứng táo bón chất Asparagine trong măng tây giúp lợi tiểu, phòng và điều trị các bệnh ung thư, suy gan, tiểu đường và đau bàng quang Măng tây còn giúp cung cấp chất đạm Homocystein giúp giảm stress, tăng cường trí nhớ, chống mệt mỏi khi làm việc nhất

là những người lao động trí óc [21] Theo Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ, măng tây cũng có chứa nhiều Folate và Glutathione là những chất chống ung thư và chống lão hóa rất hữu hiệu, đặc biệt rất tốt cho phụ nữ mang thai giúp hạn chế những tổn thương trong hệ thần kinh của thai nhi chất Beta-Carotene giúp phòng tránh bệnh đục thủy tinh thế Ngoài ra, măng tây còn có tác dụng chống lão hóa da, chống b o phì, làm giảm cholesterol, điều trị bệnh goutte và bệnh tim mạch tăng cường khả năng tình dục [15][18][1]

1.1.4 Tình hình sản xuất cây măng tây

Hiện nay trên thế giới có hàng trăm loại giống cây măng tây khác nhau, nhưng dùng để làm thực phẩm cho người ăn chỉ tập trung vào 3 nhóm giống chính: măng tây xanh, măng tây trắng, măng tây tím [30]

- Măng tây xanh: Đây là loại măng tây phổ biến nhất trong 3 loại măng tây Hương vị của loại này có vị hăng và đắng hơn so với măng tây trăng và tím

- Măng tây trắng: Măng tây trắng thật chất cùng giống với măng tây xanh nhưng chúng trồng không cho tiếp xúc với ánh sáng Do sống trong điều kiện bóng tối nên không thể sản sinh ra diệp lục (chất mà làm chúng chuyển thành màu xanh lá cây), trồng trong quy trình kh p kín, đầu tư lớn nên giá thành cao Măng có hương

vị tinh tế nhẹ và mềm hơn so với măng tây xanh, ngọt và ít có vị hăng, mập mạp hơn măng tây xanh

- Măng tây tím: Cũng cùng loại với măng tây xanh và trắng nhưng màu tím của chúng xuất phát từ chất anthocyanin ở mức độ cao (đây là chất chống oxy hóa mạnh) Măng tây tím có hàm lượng chất xơ thấp hơn 2 loại trên, nên mềm hơn và có thể sử dụng toàn bộ đọt từ gốc đến ngọn Đọt măng dày, có vị ngọt và thơm dịu hơn măng tây xanh và măng tây trắng

Trong đó: Giống măng tây xanh được tôi dùng để thực hiện nghiên cứu này vì tính phổ biến và khả năng thích nghi cao trong điều kiện sinh thái của Việt Nam

1.2 NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY IN

VITRO

1.2.1 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1991, Takeo saito và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu cải

thiện điều kiện nuôi cấy phôi soma Măng Tây (Asparagus officinalis L.) sử dụng bộ

lọc khí vô trùng” Callus được tạo ra từ rễ cây con hoặc chồi nách của cành non trên môi trường rắn Linsmaier and Skoo’s (Ls) bổ sung 5 µm 2,4 – dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) Khi cấy chuyển callus thu được sang môi trường LS không bổ sung chất kích thích sinh trưởng; 1% agar, các tế bào callus hình thành và phát triển thành phôi trong điều kiện nuôi cấy cây có sử dụng bộ lọc khí vô trùng Các phôi bắt đầu có dấu hiệu biệt hóa thành cây con khi chuyển sang môi trường LS không bổ sung chất kích thích sinh trưởng; 0,8 % agar [27]

Năm 1992, Amnon Levi và Kenneth C Sink "Nghiên cứu các phương pháp đã

được phát triển để sản xuất phôi soma của Măng Tây (Asparagus officinalis L.)”

trong nuôi cấy và chuyển đổi điều kiên nuôi cấy cây con trên môi trường rắn Callus phát sinh từ thân đã được nuôi cấy 2 lần trên môi trường MS bổ sung 0.54 µM naphthaleneaceticacid (NAA) và 1.4 µM 2-isopentenyladenine (2iP) Trên môi trường MS có bổ sung 54 - 107 µM NAA callus có khả năng sinh phôi cao Phôi ngừng tạo thành phôi thế hệ thứ hai khi đặt trên môi trường phát triển phôi với mức nguồn carbohydrate thấp (sucrose, glucose hoặc fructose) (2%) Ngược lại, môi trường phát triển phôi với mức carbohydrate cao (10%) làm giảm tần số của phôi thứ phát nhưng thúc đẩy sự phát triển và chuyển đổi phôi, gấp 3,6 - 8,5 lần so với 2% carbohydrate Dựa vào đặc điểm hình thành và phát triển phôi ở cả hai môi

trường trên, tiến hành kết hợp chuyển callus sang môi trường phát triển phôi với nồng độ carbohydrate cao (4 đến 10%) trong thời gian hai tuần đầu, sau đó chuyển sang môi trường phát triển phôi với nồng độ carbohydrate thấp (2%) cho tỉ lệ phát sinh cao hơn 2 đến 4 lần so với phát sinh phôi từ những nghiên cứu khác (chỉ ở mức

sinh rễ cho cây con đã sau khi nuôi cấy ở 4,8,12,16 và 20 tuần tuổi trên môi trường

MS bổ sung 0,1 ppm NAA sau 2 tuần nuôi cấy cho tỷ lệ ra rễ > 75% Thí nghiện (2):

Tiến hành tiền xử lý mẫu cây măng tây in vitro bằng cách chuyển chúng sang môi

trường MS trong vòng 10 ngày rồi sau đó cấy chuyển đổi môi trường Môi trường tạo rễ là MS có bổ sung 0,5 mg/l BA; 0,05 mg/l KT; 1 mg/l PP333; 3% sucrose và 0,8 % agar, kết quả sau 12 ngày nuôi cấy cho tỉ lệ phát sinh rễ đến 80 % [19]

1.2.2 Nghiên cứu trong nước

Năm 2015, Ngô Phương Ngọc và Lâm Ngọc Phương “Nghiên cứu vi nhân

giống cây Măng Tây (Asparagus officinalis L.)” Giai đoạn khử trùng mẫu cây,

clorin 10% ở thời gian 25 phút là thích hợp; Giai đoạn nhân chồi, sử dụng mẫu cấy đoạn thân trên môi trường MS bổ sung Kinetin 4 mg/l là thích hợp; Giai đoạn tạo rễ,

sử dụng mẫu cấy chồi ngọn trên môi trường MS bổ sung 1-naphthalene acetic acid (NAA) 3 mg/l là thích hợp; giai đoạn cây con thuần dưỡng đạt tỉ lệ sống cao dao động 67,5 – 72,5% [6]

Năm 2018, Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Thị Thu Ngà, Trần Thị Hồng “Nghiên

cứu nuôi cấy in vitro Măng Tây (Asparagus officinalis L.)” gồm 4 thí nghiệm được

bố trí theo hình thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 3 lần lặp lại Chúng tôi

đã tìm ra nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp cho việc nhân giống măng tây Kết quả cho thấy: (1) Giai đoạn khử trùng hạt Măng Tây bằng khí Clo ở thời gian 3 giờ là thích hợp; (2) Giai đoạn nhân chồi, sử dụng đoạn thân cấy trên môi trường MS có bổ sung BAP 2,5mg/l cho kết quả tốt nhất; (3) Giai đoạn ra rễ, sử

dụng mẫu cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,2 mg/l đạt kết quả tốt cho việc

tạo cây hoàn chỉnh [7]

1.3 GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO

1.3.1 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (tissue culture) hay nuôi cấy in vitro đều là thuật

ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống

nghiệm chứa môi trường chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin,

đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng Kỹ thuật

nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền [5]

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ

mô lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước đây, phương pháp này được sử

dụng để nghiên cứu đặc tính cơ bản của tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy Hiện

nay các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm

năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và

thương mại trong đời sống hằng ngày của con người [5]

rãi vào việc giữ giống và nhân nhanh sản lượng các loại thực vật quý hiếm, có giá trị

dược liệu, giá trị kinh tế cao hoặc đang đứng trước nguy cơ suy thái đa dạng sinh

học (tuyệt chủng) Một số nhóm cây đã và đang ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

rất hiệu quả như: Sâm Ngọc Linh, Ba Kích tím, các loại lan dược liệu khác [3],[5]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Măng tây thu từ giống măng tây xanh F1 của công ty TNHH Linh Đan Ninh Thuận – Linh Đan Group, được trồng tại Trại thực nghiệm khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

Hình 2.1: Mẫu măng tây non 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học nuôi cấy

mô và tế bào thực vật, khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học

Đà Nẵng từ tháng 9/2018 - 4/2019

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát thời gian và hóa chất đến khả năng khử trùng mẫu măng tây

(Asparagus officinalis L.);

Khảo sát khả năng ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng phát sinh callus;

Khảo sát khả năng ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái

sinh chồi in vitro từ callus;

Khảo sát khả năng ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng

nhân nhanh chồi in vitro;

Khảo sát khả năng ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo

rễ in vitro

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Khử trùng mẫu vật

Mẫu măng tây non khỏe mạnh, sạch bệnh cắt thành đoạn 20,0 – 30,0 mm rửa sạch dưới vòi nước chảy, rửa bằng xà phòng 10 phút sau đó xả nước 3 lần

Mẫu được mang vào tủ cấy vô trùng, khử trùng bằng cồn 70⸰ trong cốc với các khoảng thời gian khác nhau (30s, 1 phút, 3 phút, 5 phút) sau đó được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần Mẫu tiếp tục được khử trùng trong dung dịch Javel 5% trong khoảng thời gian 5 phút Sau đó tiếp tục rửa mẫu bằng nước cất đã hấp vô trùng 3 lần

Mẫu sau khi được khử trùng, cắt bỏ 2 phần đầu tiếp xúc, cắt các đoạn măng non thành các đoạn nhỏ hơn có bề dày 1,0 – 1,5 mm, đường kính 4,0 – 5,0 mm được cấy lên môi trường

Đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu sau 3 tuần nuôi cấy thông qua các chỉ tiêu: tỉ

lệ mẫu nhiễm (%)

2.3.2 Phát sinh callus in vitro

Mẫu sau khi khử trùng được nuôi cấy trên các môi trường bổ sung: MS cơ bản; 3% saccrose; 0,7% agar; 2,4-D (0 – 4,0 mg/l), BAP (1,0 – 4,0 mg/l) + NAA (0,5 – 2,0 mg/l), (Tỉ lệ 2:1); pH= 5,8 - 5,9

Đánh giá hiệu quả phát sinh callus mẫu sau 3 tuần nuôi cấy thông qua các chỉ tiêu: tỉ lệ phát sinh callus (%), kích thước callus (mm)

2.3.3 Tái sinh chồi in vitro

Callus măng tây sau khi phát sinh (3 tuần), (đường kính 10,0 – 13,0 mm) được chuyển sang môi trường bổ sung: MS cơ bản; 3% saccrose; 0,7% agar; BAP (1,0 – 4,0 mg/l) + NAA (0,5 – 2,0 mg/l), (Tỉ lệ 2:1); pH= 5,8 – 5,9

Đánh giá hiệu quả phát sinh chồi sau 4 tuần nuôi cấy thông qua các chỉ tiêu: tỉ

lệ phát sinh chồi (%), số chồi/callus, chiều cao chồi (mm)

2.3.4 Nhân nhanh chồi in vitro

Chồi măng tây sau khi được tái sinh từ callus (3 tuần), (chiều cao 20,0 – 30,0 mm) được cắt chuyển sang môi trường bổ sung: MS cơ bản; 3% saccrose; 0,7% agar; Kinetine (1,0 – 4,0 mg/L); pH= 5,8 – 5,9 Đánh giá hiệu quả nhân nhanh chồi

sau 4 tuần nuôi cấy thông qua các chỉ tiêu: tỉ lệ nhân chồi (số chồi/mẫu), hình thái chồi, chiều cao chồi (mm)

2.3.5 Tạo rễ in vitro

Chồi Măng tây in vitro (dài 20,0 – 30,0 mm) nuôi cấy trên các môi trường bổ

sung: ½ MS; ¼ MS; MS cơ bản; 3% saccrose; 0,7% agar; NAA (0,5 – 2,0 mg/l); pH

b, Xử lí số liệu và thống kê

Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần Số liệu được xử lí thống kê theo chương trình Excel Mỗi công thức tiến hành lặp lại 3 lần Khảo sát trên 10 chai thủy tinh có dung tích 500 ml, mỗi chai cấy 6 mẫu/khoảng cách 10 mm

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU MĂNG TÂY

Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi sinh vật khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các bước nghiên cứu tiếp theo Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng…

Mẫu sau khi được khử trùng, cắt bỏ 2 phần đầu của măng, cắt các đoạn măng thành các lát mỏng dày 1,0 mm – 1,5 mm được cấy lên môi trường MS có bổ sung 3% saccarose, 0,7 % agar, pH = 5,8 và chất ĐHST 1,0 mg/l 2,4- D Thực hiện 6 công thức khử trùng, sau đó theo dõi trong vòng 2 đến 3 tuần những mẫu không bị nhiễm vi sinh vật bắt đầu phát sinh callus

Kết quả được biểu hiện ở bảng dưới đây:

Bảng 3.1: Hiệu quả của các công thức khử trùng mẫu măng tây

Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa

thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05