Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trong dịch chiết thân cây chùm ngây

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC TRẦN CÔNG TÙNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG DỊCH CHIẾT THÂN CÂY CHÙM NGÂY KHÓA L

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA HỌC

TRẦN CÔNG TÙNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH

THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG DỊCH CHIẾT THÂN CÂY CHÙM NGÂY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng, 04/2019

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA HỌC

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH

THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG DỊCH CHIẾT THÂN CÂY CHÙM NGÂY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

KHOA HÓA

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên : Trần Công Tùng

1 Tên đề tài: “ Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học trong dịch chiết thân cây chùm ngây”

2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị:

- Nguyên liệu: Bột thân cây chùm ngây

- Dụng cụ: Máy cô quay chân không, lò nung, cân phân tích, bình hút ẩm, cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, giấy lọc, phễu chiết,…

- Một số hóa chất khác cũng được sử dụng như n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, nước cất

- Thiết bị: Các thiết bị xác định cấu trúc hóa học các chất: Phổ khối GC-MS

Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại Khoa Sinh – Môi trường trường Đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng

3 Nội dung nghiên cứu:

- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: Độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại nặng

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: Thời gian và tỉ lệ Rắn/Lỏng tối

ưu

- Điều chế cao tổng và chiết lần lượt qua các dung môi, từ đó thu được từng cao ứng với mỗi phân đoạn

- Xác định thành phần hóa học trong dịch chiết cao cuối etanol

- Thử hoạt tính sinh học: Chống oxy hóa, kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư gan Hep3B

4 Giáo viên hướng dẫn : ThS.Trần Thị Diệu My

5 Ngày giao đề tài : 01/09/2018

6 Ngày hoàn thành : 20/04/2019

Chủ nhiệm khoa Giảng viên hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ, tên) (Ký và ghi rõ họ, tên)

PGS.TS Lê Tự Hải ThS Trần Thị Diệu My

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày 27 tháng 4 năm 2019 Kết quả điểm đánh giá:

Đà Nẵng, ngày 27 tháng 4 năm 2019

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký và ghi rõ họ, tên)

LỜI CẢM ƠN

Sau khi nghiên cứu và học tập tại trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà

Nẵng, bằng sự nổ lực của bản thân và sự giúp đỡ, động viên, khích lệ của thầy cô,

bạn bè và người thân, em đã hoàn thành khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành đến giảng viên – cô Trần

Thị Diệu My đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

và bài khóa luận được hoàn thành cũng như báo cáo đúng tiến độ chương trình đào

tạo

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ phòng thí nghiệm

của Khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng và Nhà trường đã hỗ trợ

kiến thức, cơ sở vật chất, trang thiết bị kỹ thuật, dụng cụ thí nghiệm giúp em hoàn

thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn gia đình và người thân, cùng các bạn bè đã động

viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn

thành khóa luận

Do những điều kiện chủ quan và khách quan, chắc chắn sẽ không tránh khỏi

những thiếu sót, nên em rất mong nhận được những lời góp ý chân tình, thiết thực

từ quý thầy cô và bạn bè để khóa luận đạt đến sự hoàn thiện và chỉnh chu nhất

Trân trọng cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày 20 tháng 4 năm 2019 Sinh viên thực hiện

Trần Công Tùng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 3

MỤC LỤC 6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 9

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 2

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 3

5 BỐ CỤC CỦA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM NGÂY 4

1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật 4

1.1.3 Trồng trọt 5

1.1.4 Công dụng 5

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM NGÂY TRONG NƯỚC 6

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM NGÂY NƯỚC NGOÀI 7

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 11

2.1.1 Nguyên liệu 11

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 11

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.2.1 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý 12

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong mẫu bột thân cây Chùm ngây 14

2.2.3 Khảo sát hàm lượng protein 15

2.2.4 Sơ đồ điều chế các cao chiết 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 23

3.1.1 Độ ẩm 23

3.1.2 Hàm lượng tro 23

3.1.3 Hàm lượng kim loại nặng 24

3.1.4 Hàm lượng protein 25

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP CHẤT HÓA HỌC CÓ TRONG MẪU BỘT THÂN CÂY CHÙM NGÂY TRONG DUNG MÔI ETHANOL 26

3.2.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm 26

3.3 KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT 30

3.4 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DỊCH CHIẾT TRONG PHÂN ĐOẠN N-HEXAN VÀ ETHANOL (CAO CUỐI) TỪ MẪU BỘT THÂN CÂY CHÙM NGÂY 31

3.4.1 Kết quả hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 31

3.4.2 Kết quả hoạt tính chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH 32

3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT CUỐI CÙNG MẪU BỘT THÂN CÂY CHÙM NGÂY BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ GC – MS 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

1 KẾT LUẬN 39

2 KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

AAS : Atomic Absorption Spectrophotometric

GC-MS : Gas chromatography – Mass spectrometry

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu

3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của mẫu bột thân cây Chùm ngây 23

3.2 Kết quả khảo sát hàm lƣợng tro của mẫu bột thân cây Chùm

3.3 Kết quả khảo sát hàm lƣợng một số kim loại nặng của mẫu

3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi

Nồng độ ức chế tồi thiểu MIC kháng vi sinh vật kiểm định

4.2 Kết quả hoạt tính chống oxy hóa DPPH của cao n-hexan 32 4.3 Kết quả hoạt tính chống oxy hóa DPPH của cao ethanol 32

4.4 Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào Hep3B của mẫu

5.1 Thành phần hóa học trong dịch chiết cao cuối ethanol từ mẫu

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Số hiệu

1.2 Công thức cấu tạo các hợp chất trong thân cây Chùm ngây 9

2.5 Các cao chiết từ các dung môi n-hexan, diclomethane, ethyl

3.1 Mối quan hệ giữa khối lƣợng cao chiết ethanol theo thời

3.2 Mối quan hệ giữa khối lƣợng cao chiết ethanol theo tỉ lệ

4.1 Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết ethanol thân cây Chùm

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cuộc sống hiện nay tồn tại nhiều yếu tố bất lợi đối với sức khỏe của con người, càng ngày con người càng đối mặt với nhiều căn bệnh nguy hiểm Hầu như 90% nguyên nhân của bệnh tật hay lão hóa sớm đều trực tiếp hay gián tiếp do các gốc tự do Các gốc tự do tích lũy nhiều trong cơ thể và gây ra bệnh tật Các bệnh do tác động của các chất oxy hóa ngày càng nhiều như xơ vữa động mạch, tiểu đường, cao huyết áp, ung thư,… Chất chống oxi hóa có khả năng ngăn chặn những tổn hại của quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do nên có thể ngăn chặn sự xuất hiện của bệnh tật, lão hóa Vì vậy, chất chống oxi hóa có vai trò quan trọng và không thể thiếu trong phác đồ điều trị cũng như liệu pháp dự phòng các bệnh thoái hóa và ác tính Do đó, trong thời gian gần đây, chất chống oxi hóa có nguồn gốc tự nhiên ngày càng thu hút nhiều sự quan tâm

Ở Việt Nam với khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, thích hợp cho sự phát triển của thảm thực vật, vì vậy nguồn dược liệu ở nước ta khá phong phú Một trong số

đó là Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.), loài cây rất được chú ý về hoạt tính

chống oxi hóa và khả năng kháng khuẩn của nó Cây Chùm ngây được biết đến như một vị thuốc nam để điều trị một số bệnh thông thường trong dân gian Hiện nay, những nghiên cứu trong nước trên đối tượng này chỉ mới bắt đầu và mang tính khảo sát sơ nét về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này cũng được tập trung nghiên cứu, nhưng còn nhiều hạn chế

Với những tính năng đa dạng và phong phú như thế, việc nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học, ứng dụng các phương pháp hiện đại để xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong cây Chùm ngây ở Việt Nam là một hướng nghiên cứu hết sức cần thiết, có nhiều triển vọng, có

ý nghĩa khoa học và thực tiễn cũng như tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có làm thuốc chữa bệnh Do đó, em đã lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trong dịch chiết thân cây Chùm ngây”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Khảo sát, tìm hiểu các điều kiện thích hợp chiết tách các hợp chất trong thân cây Chùm ngây

- Định danh, xác định thành phần hóa học dịch chiết từ cao cuối trong thân cây Chùm ngây, góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học

- Thăm dò hoạt tính chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn và khả năng gây độc tế bào ung thư gan người Hep3B của một số dịch chiết từ thân cây Chùm ngây, nhằm nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tương nghiên cứu: Thân cây Chùm ngây được thu hái tại quận Sơn

từ cao cuối của thân cây Chùm ngây

- Tiến hành chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi: n-hexan, diclomethane, ethyl acetat, ethanol và nước Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa,

khả năng kháng khuẩn và khả năng gây độc tế bào ung thư gan người Hep3B

- Quá trình thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm hóa học, phòng

thí nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, thành phần hóa học và ứng dụng của cây Chùm

ngây

- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định thành

phần hóa học các chất từ thực vật

- Tổng hợp tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học và

ứng dụng của cây Chùm ngây

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Phương pháp lựa chọn, lấy và xử lý mẫu thực nghiệm

- Phương pháp trọng lượng xác định độ ẩm

- Phương pháp tro hóa mẫu xác định hàm lượng hữu cơ

- Phương pháp AAS xác định hàm lượng các kim loại nặng

- Phương pháp chiết ngâm dầm cổ điển, sau đó thử qua các nhóm dung môi

từ không phân cực đến phân cực

- Phương pháp xác định thành phần hóa học, xác định cấu trúc các cấu tử chính bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS)

- Các phương pháp sinh học thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa và kháng

khuẩn của một số dịch chiết

- Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học

5 BỐ CỤC CỦA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Khóa luận tốt nghiệp gồm 39 trang; 10 hình ảnh và 3 tài liệu tham khảo

Với: Phần mở đầu (3 trang)

+ Chương 1 – Tổng quan tài liệu (11 trang)

+ Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang)

+ Chương 3 – Kết quả và thảo luận (17trang)

Kết luận và kiến nghị (1 trang)

Tài liệu tham khảo (3 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM NGÂY

1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố

Chùm ngây, hay còn gọi là Chùm ngây cải ngựa, có tên khoa học là Moringa

oleifera Lam Họ Chùm ngây (Moringaceae) trên thế giới gồm có 1 chi và 13 loài,

tất cả trong số chúng đều là các cây thân gỗ sinh sống trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Loài cây này được trồng nhiều nơi ở các vùng nhiệt đới, và là loài duy nhất của chi Moringa có mặt tại Việt Nam

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Về hình thái học, cây nhỏ hay cây nhỡ, cao 5 – 10m Vỏ cây dày, có khía rãnh Thân non có lông Lá kép, mọc so le, 3 lần lông chim, dài 30 – 60cm, có 6 – 9 đôi lá chét hình trứng, mọc đối Cụm hoa mọc thành chùy ở kẽ lá; lá bắc hình chi; hoa màu trắng, hơi giống hoa họ Đậu; đài có 5 răng hình thuôn, uốn cong; tràng có

5 cánh hình thìa Quả dạng nang treo, dài 25–40 cm, ngang 2 cm, có 3 cạnh, chỗ có hạt hơi gồ lên, dọc theo quả có khía rãnh Hạt màu đen, tròn có 3 cạnh, lớn cỡ hạt đậu Hà Lan

Hình 1.1 Hình ảnh cây Chùm ngây

Hầu hết các bộ phận như lá, hoa, quả, hạt, rễ, thân của cây chùm ngây đều hữu dụng với con người Bằng cách canh tác chùm ngây, nhà nông có thể cải thiện đất xấu Lá, hoa và quả non của chùm ngây, với rất nhiều dinh dưỡng và nguyên tố

vi lượng, được dùng làm thực phẩm cho người và gia súc, giúp xóa đói giảm nghèo, góp phần đảm bảo an ninh lương thực, chống suy dinh dưỡng trẻ em tại các quốc gia đang phát triển

1.1.3 Trồng trọt

Cây chùm ngây rất dễ trồng, có thể trồng từ hạt, hom cành, hom củ và trồng được quanh năm Vùng thiếu nước nên trồng vào mùa mưa, tức khoảng tháng 4, tháng 5 Cây được trồng nhiều ở những vùng đất khô hạn khắc nghiệt nhiệt đới hoặc bán nhiệt đới Cây chuộng đất ráo nước, nhiều cát, dù là đất xấu cũng dễ mọc, chịu được hạn hán, ưa nắng, hầu như không bị sâu bệnh hại do đó chăm sóc cây không cần điều kiện gì đặc biệt về phân bón và nước tưới Gỗ chùm ngây khá mềm, giòn nên thân cành dễ bị gãy trong mưa bão [1] Do đó nếu trồng cây để khai thác sử dụng người trồng thường cắt ngọn cây khi đạt độ cao nhất định, vừa tiện thu hái; vừa kích thích cây đâm tược, nảy cành theo cấp số nhân như tán dù; vừa hạn chế thiệt hại do gãy đổ Tuy nhiên cây không chịu được úng ngập và dễ chết nếu không được thoát nước tốt Biểu hiện ban đầu của sự dư nước dưới rễ chùm ngây là trên lá cây xuất hiện những đốm trắng, khi đó người trồng cây cần ngưng tưới hoặc tìm cách thoát nước cho cây

1.1.4 Công dụng

Trong ẩm thực, lá non và thậm chí cả lá già của chùm ngây được sử dụng để nấu canh với thịt, tôm, nấm hoặc nấu suông (mùi vị tương tự rau ngót), trộn salad,

ăn sống, xào thịt, trứng, xay nhuyễn thành nước sinh tố

Lá chùm ngây phơi khô tán bột có thể để rất lâu mà không mất dinh dưỡng,

sử dụng cho nhiều món ăn như cháo, bột trẻ em, nhào bột bánh, pha nước uống

Hoa chùm ngây có nhiều mật ngọt và giàu dinh dưỡng, làm rau hoặc phơi khô dùng nấu lấy nước uống như một loại trà

Trái non được dùng xào, nấu canh, hầm xương, ninh súp như đậu cô ve và cho hương vị gần tương tự măng tây Khi già, hạt chùm ngây có thể rang ăn như đậu phộng

Rễ non của cây ăn sống hoặc làm gia vị như cải ngựa (mù tạt) Tuy nhiên tương tự rau ngót, lô hội, hạn chế sử dụng rau và các chế phẩm từ chùm ngây cho phụ nữ có thai

Sự chú ý đến công dụng của chùm ngây ngày càng tăng lên tại nhiều quốc gia trên thế giới và trong thực tế, loài cây này đã vượt ra ngoài khuôn khổ là một loại rau mà được sử dụng rộng rãi và đa dạng trong công nghệ dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát dinh dưỡng và thực phẩm chức năng Các quốc gia đang phát triển sử dụng chùm ngây như dược liệu kết hợp chữa hàng trăm loại bệnh hiểm nghèo, bệnh thông thường như phòng và trị ung thư, tiểu đường, thiếu máu, còi xương, tim mạch, kinh phong, sưng tấy, viêm nhiễm, mỡ máu, đau dạ dày, ngừa thai, ung loét, lão hóa, suy nhược cơ thể, suy nhược thần kinh, trị chứng bất lực và tăng cường khả năng ham muốn tình dục Thống kê chưa đầy đủ cho thấy chùm ngây có thể được sử dụng để điều trị đến hơn 300 căn bệnh Đặc biệt, hợp chất zeatin, với năng lực chống lão hóa mạnh mẽ, trong chùm ngây cao gấp vài ngàn lần

so với bất kỳ một loại cây nào khác Thêm vào đó, chùm ngây cũng có hai loại hợp chất phòng ung thư và chặn đứng sự tăng trưởng của khối u, khiến cây được mệnh danh là loại cây phòng ung thư

Hạt khô của cây có thể được ứng dụng để làm hoạt chất lọc nước hoặc ép lấy dầu Chất dầu trong hạt có phẩm chất tốt, màu vàng tươi sáng với một hương vị dễ chịu có được so sánh chất lượng với dầu oliver, để rất lâu không hỏng và được sử dụng làm dầu ăn hoặc dầu máy Tại các vùng ô nhiễm nơi nông thôn nghèo châu Á, châu Phi, hạt chùm ngây thường được nghiền nát hòa vào nước, để lắng, các chất cặn bẩn sẽ bị loại bỏ hoàn toàn Nước sạch này còn được sát khuẩn do tác dụng của chất dầu cay trong hạt, nên có thể dùng ngay làm nước uống

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM NGÂY TRONG NƯỚC

Năm 2010, Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM đã khảo sát được trong lá Chùm ngây có những nhóm hợp chất là: chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpenoid, coumarin, flavonoid, tannin và axit hữu cơ

Năm 2011, Đại học Y dược TP.HCM đã có công trình nghên cứu về tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của các dạng cao chiết từ lá cây Chùm ngây Kết quả cho thấy cao chiết từ lá chùm ngây trồng tại Việt Nam có tác dụng chống oxi hoá và bảo vệ gan[5]

Năm 2013, Tạ Trần Kiên đã khảo sát các thành phần hóa học có trong cao MeOH ly trích từ lá cây chùm ngây Sau đó sử dụng sắc ký cột trên silicagel pha thường kết hợp với sắc ký lớp mỏng đã cô lập được các chất sau: MO17 (hỗn hợp của hai chất là 4-(α-L-Rhamnopyranosyloxy)-benzaldehyde và Niazirin); MO18 (4-(α-rhamnosyloxy)benzylamine)[4]

Năm 2016, Võ Thị Diệu đã định danh được thành phần hóa học trong các dịch chiết từ bột lá và hạt chùm ngây bằng GC-MS cũng như thử hoạt tính kháng khuẩn đối với hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và Escherichia coli [3]

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM

NGÂY NƯỚC NGOÀI

Năm 1957, B R Das, P.A Kurup, P L Narasimha Rao đã phân lập được một hợp chất có tên là Pterygospermin từ hoa của cây chùm ngây Hợp chất này có hoạt tính chóng vi khuẩn và kháng nấm

Năm 1997, Shaheen Faizi đã phân lập được thiocarbamate và isothiocyanate glycoside có trong vỏ cây chùm ngây Ông còn phát hiện thêm hai hợp chất mới O-(2’-hydroxy-3’-(2”-heptenyloxy))-propylundecanoate và O-ethyl-4-((a-Lrhamnosyloxy)-benzyl) carbamate từ phương pháp UV- VIS, sử dụng phổ 1H-NMR và 13C-NMR để xác định công thức của chúng[9]

Năm 1999, Amelia P Guevara cùng các cộng sự nghiên cứu phân lập hợp chất O-ethyl-4-(α-L-rhamnosyloxy)benzyl carbamate trong hạt chùm ngây và cùng

7 hợp chất khác đã biết tiến hành nghiên cứu về tiềm năng hoạt tính chống ung thư của chúng[10]

Năm 2006, Ping-Hsien Chuang và các cộng sự nghiên cứu tìm thấy tổng cộng 44 hợp chất có trong tinh dầu từ lá chùm ngây bằng GC-MS

Năm 2008, Julia Coppin đã tiến hành nghiên cứu về lá chùm ngây ở một số nước châu Phi và đã phát hiện có đến 12 dẫn xuất flavonoid đặc biệt là aglycones quercetin và kaempferol, carotenoids, α-carotene và β-carotene, tocopherols, γ- tocopherols và α- tocopherols và các dẫn xuất axit chlorogen Julia đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với UV- Vis và máy quang phổ khối ion hóa để xác định chúng[11]

Năm 2010, Sarot Cheenpracha cũng cộng sự đã thu được thu được ba glycoside phenolic mới trong dịch chiết ethyl acetate của quả chùm ngây Cấu trúc của các chất mới này được xác định bang phân tích quang phổ bao gồm 1D- và 2D-NMR và khối phổ Ông đã đem chúng đi thử hoạt tính chống viêm với dòng tế bào murine đại thực bào RAW 264.7 do lipopolysacarit (LPS) tạo ra[12]

Năm 2012, Yoshiki Kashiwada đã phát hiện các α- glucoside mới của axit cafeoyl quinic từ lá cây chùm ngây Cấu trúc của các hợp chất mới là 4-O-(4’-O-α-D–glucopyranosyl)-caffeoyl quinic acid và 4-O-(3-O-α-D-glucopyranosyl)-caffeoyl quinic acid được xác định bằng các phân tích quang phổ[13]

Năm 1995, Faizi và cộng sự đã nghiên cứu các hợp chất nitrile, glycoside thiocarbamate được phân lập từ lá Chùm ngây có tác dụng hạ huyết áp và hầu hết các hợp chất này rất hiếm trong tự nhiên

Năm 2003, Bharali cùng cộng sự đã nghiên cứu dịch chiết hạt Chùm ngây, cho thấy khả năng chuyển hóa enzyme chống ung thư gan, chống oxi hóa và chống ung thư da ở chuột

Năm 2007, Ping - Hsien Chuang đã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm trên dịch chiết EtOH và tinh dầu của lá và hạt Chùm ngây Kết quả cho thấy chúng có hoạt tính trên các chủng Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagophytes, Epidermophyton floccosum và Microsporum canis[14]

Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong cây Chùm ngây:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các hợp chất trong thân cây Chùm ngây

Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngan chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và dộng vật an thịt, cung nhu làm tang các màu sắc của thực vật Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và vì vậy, chúng cung là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người[2]

Các polyphenol có dặc tính chống oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hiệu ứng dáng tin cậy của chúng trong việc phòng ngừa những chứng bệnh căng thẳng oxy hóa liên quan và hấp thụ các hợp chất phenolic sẽ giảm duợc nguy co mắc các bệnh tim mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư[6]

Các loại sterol và stanol thực vật giúp làm giảm lượng LDL- cholesterol (cholesterol xấu), thành phần làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch và giảm lượng chất béo dạng trans, chất béo no và tăng cường chất xơ

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu thân của cây Chùm ngây được thu hái tại quận Sơn Trà – TP

Đà Nẵng vào tháng 9 năm 2018 Thân cây Chùm ngây – đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ rửa sạch,cắt thành những lát mỏng, phơi khô, sấy nhẹ và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu

Thân cây Chùm ngây là thuộc loài thân gỗ mềm, vỏ màu mốc xám, sinh trưởng nhanh, có thể mọc cao 5 đến 10m Sau khi đem thân cây về, cần loại sạch bụi bẩn, mủ, sau đó rửa sạch, thát thành lát với độ dày đều nhau, khoảng 2-3cm và đêm héo dưới nắng nhẹ chỗ bóng râm, chờ cho đến khi khô hẳn, rồi đem xay thành bột Lưu ý khi phơi, cần dàn đều lát thân cây trên mâm thành lớp mỏng, thỉnh thoảng đảo qua đảo lại để có độ đồng đều nhất định

Bột thân cây Chùm ngây hơi thô, màu vàng nhạt, được bảo quản trong bình hút ẩm

Hình 2.1 Thân và bột thân cây Chùm ngây

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Dung môi chiết ethanol Một số hóa chất khác cũng được sử dụng như hexan, CH2Cl2, EtOAc, nước cất

n-Các thiết bị xác định cấy trúc chất: Phổ khối GC-MS

Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị và dụng cụ khác như máy cô quay chân không, lò nung, cân phân tích, bình hút ẩm, cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, giấy lọc, phễu chiết,…

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu để xác định độ ẩm là nguyên liệu thân cây Chùm ngây, cân lấy khối lượng chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt độ 1000C Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân đến khối lượng mẫu không đổi m2

: khối lượng mẫu nguyên liệu thân cây Chùm ngây bột khô (g)

: khối lượng mẫu bột thân cây Chùm ngây sau khi sấy khô (g)

: độ ẩm của mẫu nguyên liệu (%)

Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu

từ 4 đến 6 giờ, cho đến khi thu được tro trắng

- Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu

- Sau đó cho vào nung 1 giờ lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng m2 không đổi

Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy,

là hiệu số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung

Cách tính kết quả:

Hàm lượng tro được tính bằng công thức

Trong đó:

m0 : khối lượng chén sứ ban đầu (g)

m1 : khối lượng nguyên liệu bột thân Chùm ngây (g)

m2 : khối lượng của chén sứ và nguyên liệu bột thân Chùm ngây sau khi tro hóa (g)

2.2.1.3 Hàm lượng kim loại nặng

Mẫu nguyên liệu bột thân cây Chùm ngây đem vô cơ hóa mẫu bằng cách ngâm trong dung dịch nước cường toan (HNO3 : HCl = 3 : 1) Sau 20 giờ, mẫu được hòa tan bằng dung dịch HNO3 0,5%, sau đó được lọc bằng bình định mức Lấy dung

dịch thu được đem đi xác định hàm lượng các kim loại nặng bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, tại khoa Sinh – Môi trường tại trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong mẫu bột thân cây Chùm ngây

2.2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật được chiết theo phương pháp chiết rắn – lỏng bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm: Mẫu thực vật khô được chiết với dung môi ethanol Cất loại dung môi bằng máy cô quay chân không sẽ thu được cao chiết để tiếp tục nghiên cứu

Đối với kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu thực vật (bột thân) trong bình chứa bằng thủy tinh, bịt đầu bằng giấy bạc Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả

Thực hiện chiết ngâm dầm khảo sát lượng cao thu được tại tỉ lệ và thời gian khác nhau:

+ Khảo sát theo các tỉ lệ lần lượt là 1 : 10, 1 : 15, 1 : 20, 1 : 25 và 1 : 30 với 10g nguyên liệu cho mỗi mẫu thử

+ Khảo sát theo thời gian ngâm lần lượt là 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày và

5 ngày với 10g nguyên liệu bột/ 200 mL dung môi ethanol

Hình 2.2 Khảo sát quá trình ngâm dầm bằng dung môi ethanol

2.2.2.2 Phương pháp xác định thành phần hóa học các hợp chất trong dịch chiết cao cuối

Việc định danh thành phần hóa học các cấu tử có trong dịch chiết ethanol thân cây Chùm ngây thu được bằng phương pháp chiết phân đoạn, thực hiện thông qua việc đo phổ GC – MS tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2

số 02 Ngô Quyền, Quận Sơn Trà, TP Đà Nẵng

2.2.3 Khảo sát hàm lượng protein

Việc thử nghiệm hàm lượng protein của bột thân cây Chùm ngây được đo tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 số 02 Ngô Quyền, Quận Sơn Trà, TP Đà Nẵng

2.2.4 Sơ đồ điều chế các cao chiết

Quá trình điều chế các loại cao chiết được mô tả theo hình 2.2

Hình 2.3 Sơ đồ điều chế các cao chiết

Nguyên liệu Thân cây Chùm ngây

Bột thân cây Chùm ngây

1 Xử lí, sấy khô

2 Xay nhỏ thành bột

1 Khảo sát các chỉ tiêu hóa lí

2 Khảo sát thời gian chiết, lựa chọn phương pháp chiết

3 Ngâm chiết kiệt với khối lượng lớn trong EtOH

và cất loại dung môi dưới áp suất thấp Cao tổng EtOH

1 Chiết với dung môi n-hexan

2 Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

1 Chiết với dung môi diclomethane

2 Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

1 Chiết với dung môi ethyl acetate

2 Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

1 Chiết với dung môi EtOH và nước

2 Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

1 Đo GC-MS

2 Đo hoạt tính sinh học

Cao EtOAc

Cao cuối Cao CH2Cl2

 Lần 2: Cho dung dịch EtOH hồi lưu vào bã nguyên liệu đã chiết lần 1 và thêm 1 lít EtOH tuyệt đối, bịt đầu bằng giấy bạc, ngâm khoảng 24 giờ Lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi bằng máy cô quay chân không thu được dịch đặc

 Lần 3: Cho dung dịch EtOH hồi lưu vào bã nguyên liệu đã chiết lần 2 và thêm 1 lít EtOH tuyệt đối, bịt đầu bằng giấy bạc, ngâm khoảng 24 giờ Lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi bằng máy cô quay chân không thu được dịch đặc

 Lặp lại cho đến khi thấy dịch chiết sau khi cất loại dung môi không còn thu được cao nữa thì dừng lại Tổng dung dịch EtOH tuyệt đối sử dụng là 9 lít

 Điều chế cao n-hexan, diclomethane, ethyl acetate, ethanol và cao

nước

Dồn dịch đặc tổng các lần chiết và cất loại dung môi bằng máy cô quay chân không để thu được cao, hòa tan cao trong nước cất rồi tiến hành phân lớp lần lượt với các dung môi: n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, EtOH, và H2O

Phân lớp với n-hexan, chiết 3 lần, với khoảng 500 mL n-hexan Tổng dịch chiết khoảng 400 mL, cất loại dung môi thu được cao n-hexan

Phân lớp với diclomethane, chiết 3 lần, với khoảng 500 mL CH2Cl2 Tổng dịch chiết khoảng 300 mL, cất loại dung môi thu được cao CH2Cl2

Phân lớp với ethyl acetate, chiết 3 lần, với khoảng 500 mL CH3COOC2H5 Tổng dịch chiết khoảng 400 mL, cất loại dung môi thu được cao EtOAc

Phân lớp với ethanol, chiết 3 lần, hòa tan một lượng tối thiểu vào

C2H5OH.Sau đó, cho vào một ít nước Phần còn lại không hòa tan trong các dung môi là dịch nước

Hình 2.4 Quá trình chiết phân đoạn qua các dung môi.

Hình 2.5 Các cao chiết từ các dung môi n-hexan, diclomethane, ethyl acetate, ethanol và nước

2.2.5 Thử hoạt tính sinh học cao n-hexan và cao cuối

Phân đoạn dịch chiết n-hexan và ethanol

được xác định hoạt tính chống oxy hóa quét gốc tự

do DPPH; hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và

thử tác dụng ức chế tế bào ung thư trên dòng tế bào

ung thư gan tại Phòng thử hoạt tính sinh học – Viện

Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

Hình 2.6 Mẫu cao chiết n-hexan

2.2.5.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết thân cây Chùm ngây để nghiên cứu hoạt tính sinh học

Trong phạm vi của đề tài, tôi lựa chọn cao phân đoạn của dịch chiết n-hexan

từ cao tổng ethanol để thử hoạt tính chống oxy hóa và kháng vi sinh vật kiểm định

và cao phân đoạn của dịch chiết ethanol từ cao cuối để thử hoạt tính chống oxy hóa

và thử tác dụng ức chế tế bào ung thư gan

2.2.5.2 Phương pháp đánh giá hoạt t nh qu t gốc tự do PPH

Nguyên lý

1,1- Diphenyl 1-2 picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím và

có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2- Diphenyl-1-1picryhydrazine (DPPH-H) có màu vàng Đo độ giảm hấp thụ ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa[16]

Kết quả được tính theo công thức sau:

- : Mật độ quang trung bình của mẫu thử

- : Mật độ quang trung bình của mẫu control (không có mẫu thử, chỉ có DPPH, coi như giá trị ức chế 0%)

2.2.5.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế ATCC: 3 chủng vi khuẩn

Gram – (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853,

Salmonella enterica ATCC12228), 3 chủng Gram + (Enterococcuc faecalis

ATCC13124, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245), 1 chủng Nấm men Candida albicans ATCC10231 được cung cấp bởi

viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia[17]

Các bước tiến hành

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ [3] Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá

trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) Mẫu ban đầu được pha

loãng trong DMSO ở dải nồng độ giảm dần: 256µg/ml, 128µg/ml, 64µg/ml, 32µg/ml, 16µg/ml, 8µg/ml, 4µg/ml và 2µg/ml với số thí nghiệm lặp lại N=3

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×104CFU/ml

Tiến hành thử: lấy 5,12 l dung dịch mẫu thử có nồng độ 10mg/ml vào hàng đầu tiên có chứa 100l môi trường LB rồi pha loãng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có chứa 50l cho đến khi đạt được nồng độ là 2 g/ml, thêm 50 l dung dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×104 CFU/ml, ủ ở 37oC Sau 24h, xác định sơ bộ

giá trị MIC bằng quan sát Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử

thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và được xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data Chất đối chứng là kháng sinh Streptomycin và Kanamycin cho các chủng vi khuẩn Nistatin và cyclohexamide cho nấm

2.2.5.4 Phương pháp đánh giá độc tế bào

Nguyên lý

Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ giảm màu vàng của MTT MTT tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể Có thể dùng một số dung môi hữu cơ (isopropanol) để vừa phá huỷ màng tế bào

và hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này ở 570nm[18]

Chuẩn bị các dòng tế bào

Các dòng tế bào ung thư được cung cấp bởi GS Jeong-Hyung Lee, trường

ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc Tế bào ung thư được nuôi cấy in vitro theo phương

pháp Mosmann và cs [3] Các dòng tế bào nuôi cấy ở 37oC trong môi trường RPMI

1640 hoặc DMEM có bổ sung huyết thanh nhau phôi bò 10% (FBS), 100U/ml penicillin và 100mcg/ml streptomycin trong tủ nuôi cấy CO2 5% trong 48 giờ

Các bước tiến hành:

Tế bào được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM ở

37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) và streptomycin sulphate (100µg/mL) Sau đó chúng được nuôi cấy trong giếng phiến 96 với thể tích là 200

µl, mật độ 2-5 x 105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào) Sau 24 giờ, chúng được thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO Sau 72h, cho phản ứng

với 0.5 mg/mL µl MTT, ủ 4h ở 37oC và 5% CO2 Sau đó hút bỏ hết môi trường trên

bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol Độ hấp thụ được đo ở 570

nm Camptothecin được sử dụng làm đối chứng dương

Tính kết quả

Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính

Giá trị CS(%) được tính theo công thức:

Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i

x : giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) sẽ được chọn ra cho thử nghiệm bước tiếp theo hòa tan trong isopropanol Độ hấp thụ được đo ở 570 nm