Kiểm tra tính mẫn cảm, tính khánh thuốc của vi khuẩn ecoli salmonella SP phân lập từ phân lợn con ỉa phân trắng

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

PHÙNG THỊ MINH

KIỂM TRA TÍNH MẪN CẢM, TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI

KHUẨN E.COLI VÀ SALMONELLA SP PHÂN LẬP TỪ PHÂN

LỢN CON ỈA PHÂN TRẮNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Thú y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học : PGS TS BÙI THỊ THO

HÀ NỘI - 2008

LỜI CAM ĐOAN

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các

số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều

đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Phùng Thị Minh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, khoa Sau đại học, khoa Thú y đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô hướng dẫn khoa học PGS.TS Bùi Thị Tho và các thầy trong bộ môn Nội – Chẩn – Dược

- Độc chất đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu

và xây dựng luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn Đảng uỷ, Ban giám hiệu, Phòng Quản trị - Đời sống, Khoa Chăn nuôi – Thú y Trường Cao đẳng Nông Nghiệp

và PTNT Bắc Bộ đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cám ơn bộ môn vi trùng-Trung tâm Chẩn đoán thú y Trung ương, tập thể cán bộ công nhân làm việc tại trại lợn Hoàng Liễn đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho chúng tôi thực hiện đề tài

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như hoàn thành luận văn này

2.1 Hệ vi sinh vật đường ruột 3 2.2 Bệnh lợn con phân trắng 9 2.3 Một số hiểu biết về kháng sinh 17 2.4 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn 19

3 Đối tượng - nội dung - phương pháp nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp thí nghiệm 29 3.5 Phương pháp sử lý số liệu 34

4.1 Xác định sự biến động về số lượng, số loại vi khuẩn hiếu khí trong

phân lợn con theo mẹ ở trạng thái bình thường và bị bệnh LCPT 35

4.1.1 Kết quả kiểm tra số lượng, tỷ lệ các loại vi khuẩn hiếu khí có

trong phân lợn con theo mẹ ở trạng thái bình thường 36 4.1.2 Kết quả kiểm tra số lượng, tỷ lệ các loại vi khuẩn hiếu khí có

trong phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT 40 4.1.3 Sự biến động về số lượng, số loại vi khuẩn hiếu khí thường gặp

trong phân lợn con theo mẹ bình thường và bị bệnh LCPT 43 4.2 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli và

Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 49

4.2.1 Kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập được từ

phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 49

4.2.2 Kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng Salmonella sp phân lập từ

phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thínghiệm 53 4.3 Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của các chủng E.coli và

Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 56

4.3.1 Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của các chủng E.coli phân lập

từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với thuốc thí nghiệm 57

4.3.2 Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của các chủng Salmonella sp

phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí

4.4 Kết quả điều trị thử nghiệm bệnh LCPT với các thuốc Colistin -

1200, Hamcoli – S, Genta – Tylodex, Kanamycin 10% 64

DNA Deoxyribonucleic acid

E coli Escherichia coli

phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT so với bình thường 444.4 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập

từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí

4.5 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng Salmonell sp

phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc

4.6 Kết quả kiểm tra tính đơn kháng của các chủng E.coli phân lập

từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí

4.7 Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các chủng E.coli phân lập

từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí

4.8 Kết quả kiểm tra tính đơn kháng của các chủng Salmonella sp

phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc

4.9 Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các chủng Salmonella sp

phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc

4.10 Kết quả điều trị bệnh LCPT 66

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

4.1 Sự biến động của 4 loại vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong phân

lợn con theo mẹ mắc bệnh LCPT so với bình thường 46 4.2 Tỷ lệ mẫn cảm của của các chủng E.coli phân lập từ phân lợn con

theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 52 4.3 Tỷ lệ mẫn cảm của các chủng Salmonella sp phân lập từ phân lợn

con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 56 4.4 Tỷ lệ điều trị khỏi của 4 phác đồ điều trị 67 4.5 Thời gian điều trị khỏi của 4 phác đồ điều trị 68 4.6 Tỷ lệ tái phát sau khi điều trị khỏi ở 4 phác đò điều trị 64

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, chăn nuôi ngày càng chiếm vai trò quan trọng trong nền sản xuất Nông nghiệp, chăn nuôi lợn là ngành phát triển hơn cả

Tuy nhiên chăn nuôi lợn theo hướng công nghiệp cũng còn nhiều vấn

đề nan giải mà nổi lên là tình hình dịch bệnh và nguyên tắc sử dụng thuốc trong điều trị bệnh tại các cơ sở chăn nuôi Dịch bệnh luôn là mối quan tâm hàng đầu, quyết định sự thành công hay thất bại của mỗi trang trại Trong chăn nuôi lợn sinh sản, hội chứng tiêu chảy (HCTC) là hiện tượng hay gặp nhất và đáng ngại nhất Bệnh có thể gặp ở mọi nơi, mọi lúc trên tất cả các lứa tuổi của lợn, gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi Ở lợn con theo mẹ được gọi là bệnh lợn con phân trắng (LCPT)

Để phòng, trị bệnh nói chung và LCPT nói riêng rất nhiều kháng sinh

và thuốc hóa học trị liệu đã được đưa vào sử dụng Tuy nhiên việc sử dụng lan tràn có phần lạm dụng thuốc trong điều trị bệnh tại các cơ sở chăn nuôi

đã gây lên hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Hiện tượng kháng thuốc ngày càng có chiều hướng gia tăng, nó không chỉ gây thiệt hại về mặt kinh

tế, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh mà còn làm người chăn nuôi lúng túng trong việc chọn lựa kháng sinh phù hợp Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn thực sự là mối đe dọa sức khỏe cộng đồng bởi vi có những vi khuẩn kháng thuốc của vật nuôi sẽ truyền khả năng kháng thuốc cho các vi khuẩn sang gây bệnh nguy hiểm trên người thông qua nhiều con đường khác nhau

Như vậy vấn đề dùng thuốc gì, dùng như thế nào để giúp cho cơ sở và người chăn nuôi vừa có hiệu quả kinh tế, vừa cải thiện được tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh đang được người chăn nuôi và cả xã hội quan tâm

Góp phần kết hợp lý thuyết với thực tiễn sản xuất để hạn chế được sự

kháng thuốc của vi khuẩn, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Thị Tho chúng

tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “ Kiểm tra tính mẫn cảm, tính kháng thuốc

của vi khuẩn E.coli và Salmonella sp phân lập từ phân lợn con ỉa phân trắng”

1.2 Mục đích của đề tài

- Từ kết quả nghiên cứu sẽ giúp trại lợn Hoàng Liễn có cơ sở khoa học lựa

chọn kháng sinh có tính mẫn cảm cao với hai loại vi khuẩn E.coli và

Salmonella để điều trị bệnh lợn con phân trắng tại trại

1.3 Địa điểm thực hiện đề tài

- Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú Y, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

- Phòng vi khuẩn học thuộc Trung tâm chẩn đoán Quốc gia

- Trang trại chăn nuôi lợn siêu nạc Hoàng Liễn – Vũ Thư – Thái Bình

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hệ vi sinh vật đường ruột

2.1.1 Những nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường ruột

Đó là một chỉnh thể hữu cơ có sự tồn tại của các yếu tố: môi trường, hệ

vi sinh vật và mối quan hệ giữa chúng

Ở trạng thái sinh lý bình thường của con vật, hệ vi sinh vật đường ruột có sự cân bằng Điều này có được là nhờ sự tương tác giữa vi sinh vật

và môi trường đường tiêu hoá, giữa các vi sinh vật trong khu hệ vi sinh vật đường ruột với nhau

Theo Lê Khắc Thận (1974)[20] những vi khuẩn dường ruột giữ chức năng nhất định trong quá trình tiêu hoá và có vai trò sinh lý quan trọng đối với

cơ thể Ở trạng thái sinh lý hệ vi sinh vật đường tiêu hoá và cơ thể luôn ở trạng thái cân bằng, sự cân bằng này là cần thiết đối với cơ thể

Nhưng khi có sự tác động của các yếu tố bên ngoài vào cơ thể làm cho trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột bị phá vỡ, vi sinh vật có hại hoặc vi sinh vật gây bệnh sẽ tăng cường độc lực sinh ra tiêu chảy

Như vậy loạn khuẩn thể hiện sự biến động về số lượng và chất lượng của các nhóm vi khuẩn Có thể một loài nào đó tăng về số lượng hoặc tăng về độc lực, cũng có thể có sự đột biến hay sự bội nhiễm của vi khuẩn

2.1.2 Họ vi khuẩn đường ruột

Họ vi khuẩn đường ruột là một họ lớn, bao gồm các trực khuẩn gram

âm, sống ở ống tiêu hoá của người và động vật Chúng có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh Chúng có chung một đặc tính: không có oxydaza, hiếu khí

hoặc kỵ khí tuỳ tiện, có thể mọc ở các môi trường dinh dưỡng thông thường,

có khả năng khử Nitrat thành Nitrit, lên men sinh axit, có hoặc không sinh hơi một số loại đường Hệ vi khuẩn đường ruột bao gồm hai nhóm vi khuẩn lớn

- Nhóm vi khuẩn vãng lai: chúng xâm nhập vào cơ thể qua thức ăn

nước uống bao gồm: Staphylococcus, Streptococus, Bacillus subtilis

- Nhóm vi khuẩn thường trú: Nhóm vi khuẩn này thích ứng với môi

trường của đường tiêu hoá, trở thành vi khuẩn bắt buộc gồm: Escherichia

coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus

Đoàn Thị Kim Dung (2004) [2] khi nghiên cứu biến động về số loại và

số lượng vi khuẩn hiếu khí ở phân lợn tiêu chảy đã kết luận: bình thường ở lợn giai đoạn 1 đến 21 ngày tuổi trong phân có 5 loại vi khuẩn, số lượng vi khuẩn là 261,25x106 vi khuẩn /1 gram phân Lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi trong phân có 6 loại vi khuẩn, số lượng vi khuẩn là 237,99x106 vi khuẩn /1 gram phân

Như vậy họ vi khuẩn đường ruột có vai trò nhất định trong quá trình gây ra hội chứng tiêu chảy ở gia súc nói chung và ở lợn nói riêng Nhiều tác giả, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đưa ra kết luận nguyên nhân gây ra

tiêu chảy có vai trò quan trọng của vi khuẩn E.coli và Salmonella sp

2.1.2.1 Một số hiểu biết về vi khuẩn E.coli

Trong các vi khuẩn đường ruột, E.coli là loại phổ biến nhất và thường

xuất hiện sớm ở đường ruột người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2 giờ)

Theo Nguyễn Như Thanh (1974)[18], bình thường E.coli cư trú ở phần sau

của ruột, ít khi có mặt ở dạ dày hay phía trước của ruột non Chỉ khi nào sức

đề kháng của vật chủ yếu đi, E.coli mới phát triển mạnh về số lượng và tăng

cường độc lực, gây bệnh cho vật chủ

E.coli là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông, di động, không hình thành nha bào, bắt màu gram (-) thường thẫm ở hai đầu, ở giữa

nhạt Trong cơ thể, vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng rẽ, đôi khi

xếp thành chuỗi ngắn

E.coli là trực khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện, dễ dàng nuôi cấy ở môi trường thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH thích hợp 7,2- 7,4;

có thể phát triển được từ 5,5 - 8

Môi trường nước thịt: E.coli phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn

màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối

Môi trường thạch thường: nuôi cấy ở 37oC sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính

2 - 3mm Nuôi lâu khuẩn lạc trở thành gần như nâu nhạt và mọc rộng ra

Môi trường MacConkey: E.coli hình thành những khuẩn lạc dạng S,

màu hồng cánh sen

Môi trường Bririlliant Green Agar: khuẩn lạc E.coli dạng S, màu

vàng chanh

Môi trường thạch máu: vi khuẩn E.coli có thể gây dung huyết

Các chủng E.coli đều lên men sinh hơi mạnh các loại đường fructose, glucose, galactose, levulose, lactose Tuy nhiên cũng có một vài chủng E.coli

không lên men đường lactose

Các phản ứng sinh hoá: Indol (+); MR(+); VP(-); H2S (-)

Khử nitrat thành nitrit

Vi khuẩn E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, bao gồm kháng

nguyên thân O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên K và kháng nguyên bám dính F

Kháng nguyên F (Fimbriae hay Pilus): chức năng của kháng nguyên này là giúp vi khuẩn bám giữ vào giá thể (màng nhầy của đường tiêu hoá) hay còn gọi là bám dính

Vi khuẩn E.coli gây bệnh bởi tổng hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố

và có yếu tố không phải là độc tố

Khả năng bám dính và khả năng tạo Colicin V và khả năng sản sinh độc tố

- Khả năng bám dính: đây là yếu tố gây bệnh đặc biệt quan trọng, giúp

vi khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh E.coli gây bệnh,

bám dính lên niêm mạc ruột non nhờ một hay nhiều yếu tố bám dính Có 4 loại yếu tố bám dính đặc biệt quan trọng là: F4 (K88), F5 (K99), F6 (K987p), F41

- Khả năng tạo Colicin V:

Colicin V là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt

các loại vi khuẩn khác E.coli sản sinh Colicin V thông qua Plasmid Col Theo Brown V (1981)[33], trong hầu hết các chủng E.coli gây bệnh đều có

một loại Plasmid có chứa gen sản xuất ColicinV

- Khả năng sản sinh độc tố: E.coli có 2 loại độc: ngoại độc tố và nội độc

tố

Sản sinh độc tố được xem như là một khả năng đặc biệt quan trọng của

E.coli Cũng giống như khả năng bám dính, khả năng sản sinh độc tố là một

nhân tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli

2.1.2.2 Một số hiểu biết vềvi khuẩn Salmonella sp

Vi khuẩn Salmonella sp là trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4–0,6 x 1-3 µ, không hình thành giáp mô và nha bào Đa số các loài Salmonella đều có khả năng di động mạnh do có khoảng 7-12 lông xung quanh thân (trừ Salmonella

gallinarum-pullorum) Vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm thông thường, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở

2 đầu

Salmonella sp vừa hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy,

nhiệt độ thích hợp 37oC, nhưng có thể phát triển được từ 6- 42oC, pH thích hợp bằng 7,6, phát triển được ở pH từ 6-9

Salmonella sp gây bệnh ở gia súc sinh trưởng tốt trong điều kiện hiếu khí, kém hơn ở điều kiện kỵ khí

Môi trường nước thịt: cấy vài giờ đã đục nhẹ, sau 18h đục đều, nuôi lâu

ở đáy ống nghiệm có cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng

Môi trường thạch thường: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, trong sáng

hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa, nhỏ và trắng hơn khuẩn lạc của E coli

Môi trường thạch máu: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, màu xám, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên

Môi trường thạch Mac Conkey: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, trong suốt không màu, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên

Môi trường thạch DHL: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, ở giữa đen hoặc trong suốt không màu, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên

Salmonella sp có khả năng :

- Chuyển hoá đường: Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi

glucoz, mannit, mantoz, galactoz, levuloz, arabinoz

Tất cả các loài Salmonella không lên men lactoz, saccaroz

- Các phản ứng sinh hoá khác: Indol: -

H2S: +

Enzym khử Cacboxyn: 96% Salmonella

tiết ra enzym khử Cacboxyn đối với Lysine, Ornithine, Arginine

trong 20 phút, 100oc trong 15 phút

Các chất sát trùng thông thường: các chất sát trùng thông thường cũng

dễ phá huỷ vi khuẩn hoàn toàn: phenol 5%, HgCl 1/500, Formol 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 2 0 phút Nhưng đối với một số hoá chất như Cristal violet, lục malachit, dixitrat, muối mật với những nồng độ vừa đủ gây độc cho E coli

thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của Salmonella

Salmonella sp có thể sống trong thịt ướp muối (nồng độ muối 29%) được 4- 8 tháng ở nhiệt độ 6-12oC

Salmonella sp có 2 loại độc tố: nội độc tố và ngoại độc tố

Nội độc tố của Salmonella sp rất mạnh, với liều thích hợp tiêm tĩnh

mạch, vi khuẩn giết chết chuột bạch, chuột lang trong vòng 48h với bệnh tích đặc trưng ruột non sung huyết, mảng payer phù nề, đôi khi hoại tử Độc tố ở ruột gây độc thần kinh, gây hôn mê, co giật Nội độc tố có 2 loại: gây sung huyết và mụn loét

Ngoại độc tố: chỉ phát hiện được khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lạị cấy truyền như vậy từ 5-10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc này có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm

Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và trong nuôi cấy kỵ khí

Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột, ngoại độc tố có thể chế thành giải độc tố bằng cách cho thêm 5% formol để ở 37oC trong 20 ngày

Ở vi khuẩn Salmonella sp cần phân biệt 4 loại kháng nguyên là:

* Kháng nguyên O (O – Antigen): Kháng nguyên O của Salmonella rất phức tạp, hiện nay người ta tìm thấy 65 yếu tố khác nhau Một Salmonella có

thể có một hoặc nhiều yếu tố trong số các yếu tố đó Mỗi yếu tố người ta đánh bằng các số la mã hay số Ả rập

Do sự khác nhau giữa các loài Salmonella về cấu trúc kháng nguyên O nên ta

đã chia Salmonella thành 34 nhóm: A; B; C1; C2; C3; D1; D2; E1; E2; E3; E4; F;

G1; G2; H; I; J; L: M; N; O; P; Q; R; S; T; U; V; W; X; Y; Z; 49; 50

Mỗi nhóm vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo bởi một số thành phần nhất định được ký hiệu bằng số la mã

* Kháng nguyên H (H – Antigen): Kháng nguyên H chỉ có ở các

Salmonella có lông Các loài Salmonella đều có lông chỉ trừ Salmonella

gallinarum – pullorum

Kháng nguyên H chia làm 2 pha

- Pha 1 có tính chất đặc hiệu gồm có 28 kháng nguyên lông được biểu thị bằng mẫu la tinh thường a, b, c, d, f, h z

- Pha 2 không có tính đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với loại khác

đôi khi thành phần này có thể gặp ở Escherichia

Pha 2 gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số ả rập 1, 2, 3, 4, 5, 6 hay chữ

số la tinh thường e, n, x

* Kháng nguyên K (K - Antigen): Kháng nguyên K của Salmonella

không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ đã biết là kháng nguyên vi Bản chất của kháng nguyên vi là một phức hợp Gluxit – lipit – polypeptit gần giống như kháng nguyên O, kháng nguyên vi không tham gia vào quá trình

ở các trang trại chăn nuôi tập trung ở nước ta và nhiều nước trên thế giới, đã gây ra những tổn thất kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn, nhất là chăn nuôi lợn nái sinh sản (Lê Hồng Mận, Xuân Giao (2007) [8])

2.2.1 Diễn biến bệnh

Bệnh được chú ý theo dõi từ khoảng năm 1959, tại các cơ sở chăn nuôi tập trung Ở nước ta bệnh xuất hiện nhiều trong các trại chăn nuôi lợn nái sinh

sản tập trung trên khắp mọi miền từ Bắc chí Nam

Bệnh có thể xảy ra quanh năm, thường phát mạnh từ đông sang hè Đặc biệt khi thời tiết thay đổi đột ngột (từ oi bức chuyển sang mưa rào, từ khô ẩm chuyển sang rét ẩm), bệnh phát ra hàng loạt Sau những trận mưa to gió lớn, khí hậu thay đổi đột ngột, tỷ lệ mắc bệnh đến 100% Tỉ lệ tử vong 10% - 20%, lợn con sau khi khỏi bệnh còi cọc chậm lớn tiêu tốn thức ăn nhiều và rất dễ nhiễm các bệnh khác

2.2.2 Các tác nhân gây bệnh

Trong lịch sử nghiên cứu về bệnh LCPT, nhiều tác giả đã dày công nghiên cứu, tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh LCPT kết quả cho thấy nguyên nhân gây bệnh rất phức tạp Tuy nhiên bệnh LCPT chỉ là một hiện tượng bệnh

lý ở đường tiêu hoá, có liên quan đến rất nhiều các yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Song cho dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy thì hậu quả của nó cũng gây ra viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hoá và cuối cùng là nhiễm trùng Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, bệnh LCPT do các nguyên nhân sau:

2.2.2.1 Do vi sinh vật

- Do vi khuẩn

Khi nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh LCPT nhiều tác giả đã kết luận rằng trong bất cứ trường hợp nào của bệnh cũng có vai trò tác động của

vi khuẩn

Trong đường ruột gia súc nói chung và lợn nói riêng, có rất nhiều loài

vi sinh vật sinh sống Vi sinh vật tồn tại dưới dạng một hệ sinh thái Hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột ở trạng thái cân bằng động theo hướng có lợi cho

cơ thể vật chủ Hoạt động sinh lý của gia súc diễn ra bình thường khi hệ sinh thái đường ruột ở trạng thái cân bằng Sự cân bằng này là do sự ổn định giữa môi trường đường tiêu hoá và các nhóm vi sinh vật có mặt trong đường tiêu hoá của cơ thể vật nuôi Dưới tác động của các yếu tố gây bệnh, trạng thái cân bằng này bị phá vỡ dẫn đến hiện tượng loạn khuẩn và hậu quả là lợn bị tiêu chảy

Nhiều tác giả nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy đã chứng minh rằng khi gặp điều kiện thuận lợi, nhiều vi khuẩn ở đường tiêu hoá sẽ tăng độc tính, phát triển với số lượng lớn trở thành có hại và gây bệnh

Trương Quang (2005) [15] cho rằng do một tác nhân nào đó, trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruột bị phá vỡ, tất cả hay chỉ một loại

vi khuẩn nào đó sinh sản quá nhiều sẽ gây nên hiện tượng loạn khuẩn Loạn khuẩn là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở đường tiêu hoá, đặc biệt là gây ỉa chảy

Thực tế vi khuẩn E.coli cư trú ở ruột già và phần cuối ruột non, khi gặp

điều kiện thuận lợi sẽ nhân lên với số lượng lớn ở lớp sâu tế bào thành ruột, đi vào máu đến các nội tạng Trong máu, nhờ cấu trúc kháng nguyên O và khả năng dung huyết vi khuẩn chống lại các yếu tố phòng vệ không đặc hiệu Tại các cơ quan nội tạng vi khuẩn này tiếp tục phát triển và sự cư trú của chúng làm con vật rơi vào trạng thái bệnh lý

Đoàn Thị Kim Dung (2004)[2] cho biết khi lợn bị tiêu chảy số loại vi khuẩn và tổng số vi khuẩn hiếu khí trong một gram phân tăng lên rất nhiều so với lợn ở trạng thái bình thường Khi phân lập tác giả cho rằng các vi khuẩn

đóng vai trò quan trọng trong hội chứng tiêu chảy như: E.coli, Salmonella sp

Tô Thị Phượng (2006)[13] khi nghiên cứu sự biến động của

Salmonella và E.coli ở lợn qua các lứa tuổi cho thấy 100% các mẫu phân đều phân lập được vi khuẩn E.coli dù lợn tiêu chảy hay không tiêu chảy Đối với

vi khuẩn Salmonella tỷ lệ phân lập phụ thuộc vào từng lứa tuổi, lợn từ 1- 21 ngày tuổi 81,35% mẫu phân phân lập được vi khuẩn Salmonellasp, lợn từ 22 -

60 ngày tuổi 85,71% mẫu phân có nhiễm Salmonella sp

- Do virus

Đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu và kết luận một số virus như: Rota - virus, TGE, Enterovirus, Parvovirus, Adenovirus có vai trò nhất định gây hội chứng tiêu chảy ở lợn Sự xuất hiện của virus đã làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hoá, suy giảm sức đề kháng của cơ thể và gây ỉa chảy thể cấp tính

- Do ký sinh trùng

Ký sinh trùng trong đường tiêu hoá là một trong những nguyên nhân gây hội chứng ỉa chảy Khi ký sinh trong đường tiêu hoá ngoài việc chúng cướp đoạt chất dinh dưỡng của vật chủ, tiết độc tố đầu độc cơ thể vật chủ, chúng còn gây tác động cơ giới làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hoá và là cơ hội khởi đầu cho một quá trình nhiễm trùng Có rất nhiều loại ký sinh trùng đường ruột tác động gây ra hội chứng ỉa chảy như sán lá ruột lợn, giun đũa lợn

Theo Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996)[6] sán lá ruột lợn và giun đũa lợn ký sinh trong đường tiêu hoá, chúng làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hoá, gây viêm ruột ỉa chảy

thiện, nên khả năng miễn dịch và phòng vệ của cơ thể chưa tốt Vì thế mà lợn con là đối tượng chịu nhiều tác động của điều kiện ngoại cảnh

+ Do kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng

Vấn đề chăm sóc nuôi dưỡng có vai trò hết sức quan trọng Việc thực hiện đúng quy trình kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng sẽ đem lại sức khoẻ và tăng trưởng cho lợn Khi thức ăn chăn nuôi không đảm bảo, chuồng trại không hợp lý, kỹ thuật chăm sóc không phù hợp là nguyên nhân làm cho sức

đề kháng của lợn giảm, tăng nguy cơ mắc bệnh

Theo Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1996)[4] khi lợn bị bệnh LCPT

có liên quan đến trạng thái stress như: thời tiết lạnh ẩm hoặc nóng ẩm đột ngột, thức ăn cho lợn mẹ thay đổi bất thường về lượng đạm và chất béo, chất khoáng và vitamin

Hệ thống dạ dày - ruột đặc biệt mẫn cảm với stress Ngay ở giai đoạn báo động của quá trình stress, nhu động ruột tăng, thậm chí gây ỉa chảy cấp tính Nếu tác nhân stress tác động với cường độ mạnh, kéo dài thì chắc chắn xảy ra viêm dạ dày - ruột Tiếp theo quá trình viêm của dạ dày bởi stress, các

vi khuẩn có trong đường tiêu hoá đã làm bệnh trầm trọng hơn, tổn thương nặng hơn Các tác nhân stress sẽ tạo điều kiện “ mở đường” cho vi khuẩn phát

triển, nhất là E.coli

2.2.3 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn bằng cách trực tiếp hay gián tiếp xâm nhập vào đường ruột của lợn Trong ruột, khi có đủ các điều kiện thuận lợi vi khuẩn nhân lên với số lượng lớn, sản sinh yếu tố kháng khuẩn Yếu tố này tiêu diệt hoặc hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột khác, đặc biệt các vi khuẩn có lợi

(Bacillus.subtylis, các vi khuẩn Lactic) Vi khuẩn E.coli trở thành vi khuẩn có

số lượng lớn trong đường ruột Khi có số lượng lớn chiếm ưu thế vi khuẩn tràn lên ruột non

Ở ruột non, nhờ kháng nguyên bám dính vi khuẩn bám dính vào lớp tế bào biểu mô nhung mao ruột, nhờ yếu tố xâm nhập vi khuẩn xâm nhập vào trong lớp tế bào biểu mô Từ đó vi khuẩn phát triển và nhân lên lần thứ nhất làm phá huỷ lớp tế bào này gây ra viêm ruột Cũng tại đây vi khuẩn sản sinh độc tố đường ruột Độc tố đường ruột tác động vào quá trình trao đổi muối - nước làm cho nước và chất điện giải không được hấp thu từ ruột vào cơ thể Nước được tập trung nhiều ở ruột cùng với khí do vi khuẩn trong ruột lên men làm cho ruột căng ra Sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích vào

hệ thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột đẩy nước và phân ra ngoài, gây nên tiêu chảy

2.2.4 Triệu chứng - bệnh tích

v Triệu chứng của bệnh:

Nói chung lợn con mắc bệnh thường không sốt, phân lỏng, màu trắng như vôi, lầy nhầy, tanh khắm, có khi lẫn máu, lợn bệnh hay bị nôn và luôn ở trạng thái khát nước

Bệnh có thể diễn ra theo hai thể: thể gây chết nhanh và thể kéo dài

• Thể gây chết nhanh:

Những lợn con từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi thường mắc thể này

Sau 1-2 ngày đi ra phân trắng, lợn gầy sút nhanh, lợn bú kém, rồi bỏ bú hẳn, ủ rũ, đi đứng siêu vẹo

Niêm mạc mắt nhợt nhạt, bốn chân lạnh, có con hay đứng riêng một chỗ và thở nhanh Trạng thái phân chuyển từ ỉa nát rồi đến loãng Số lần đi ỉa tăng từ 1 - 2 lần trong ngày lên tới 4 - 6 lần Màu phân từ xanh đen biến thành màu xám (màu tro bếp) rồi màu trắng đục, trắng hơi vàng Mùi tanh, khắm Phân dính vào đít, đuôi

Bệnh thường kéo dài 2 - 4 ngày Trước lúc chết có hiện tượng suy nhược, co giật hoặc run run Tỷ lệ chết có thể 50 - 80% số con ốm

• Thể kéo dài

Thường xảy ra ở lợn 20 ngày tuổi trở lên Bệnh có thể kéo dài 7- 10 ngày Lợn vẫn bú, sau bú kém dần, phân màu trắng đục, phân hơi vàng Có con mắt có dử Niêm mạc nhợt nhạt Nếu không khỏi thì lợn bị suy nhược, rồi chết sau hàng tuần bị bệnh

v Bệnh tích:

Khi lợn chết, xác gầy, phần thân sau bê bết phân Mổ khám bệnh tích thấy dạ dày giãn rộng, ở đường cong lớn các bờ bị nhồi máu, dạ dày chứa đầy sữa đông vón, không tiêu, màu trắng hoặc màu xám trắng Ruột non căng phồng chứa đầy hơi với những đám xuất huyết ở thành ruột Nhìn từ ngoài vào thấy niêm mạc ruột non bị tróc làm cho thành ruột mỏng ra Hệ thống lâm

ba ruột tụ huyết Các cơ quan nội tạng khác: tim, gan, thận, phổi ít biến đổi

2.2.5 Phòng và trị bệnh

Ngay từ những ổ bệnh đầu tiên phát sinh trong các cơ sở chăn nuôi tập trung, người ta nghĩ đến những phương pháp phòng bệnh (vệ sinh chuồng trại, chống lạnh, ẩm, nuôi dưỡng tốt mẹ và con, bổ sung các thành phần dinh dưỡng còn thiếu vào khẩu phần) Sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh, thảo mộc vào điều trị bệnh

2.2.5.1 Phòng bệnh

- Dùng chế phẩm sinh học

Đó là dùng các vi khuẩn có lợi để phòng trị bệnh Các nhóm vi khuẩn

thường dùng là Bacillus subtilis, Colibacterium, Lactobacillus…Các vi khuẩn

này khi được đưa vào đường tiêu hoá của lợn sẽ có vai trò cải thiện tiêu hoá thức ăn, lập lại cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế và khống chế vi sinh vật có hại

- Phòng trị bằng nguyên tố vi lượng

Lợn con bú sữa mẹ thường thiếu sắt vì sữa mẹ không cung cấp đủ cho

lợn con Do đó lợn con thường rối loạn tiêu hoá và dẫn đến tiêu chảy

Vì vậy, lợn con cần được tiêm bổ sung Dextran sắt để phòng bệnh thiếu máu và nâng cao sức đề kháng cho lợn con

- Cải thiện các điều kiện nuôi dưỡng lợn nái và lợn con

Nuôi dưỡng lợn nái đúng khẩu phần quy định bao gồm đủ lượng đạm, bột đường, vitamin khoáng đa lượng và vi lượng, chất béo vừa đủ…sẽ đảm bảo cho thai phát triển tốt và lợn con sau khi sinh có sức đề kháng với bệnh

Chú ý cho lợn con ăn thức ăn bổ sung sớm sau 1 tháng tuổi, trong đó có

bổ sung các loại khoáng vi lượng, sulfat đồng, sulfat coban…

Giữ gìn chuồng trại sạch sẽ kín ấm vào mùa đông , mát mẻ vào mùa hè…Đặc biệt chú ý đến nhiệt độ, độ ẩm chuồng nuôi khi lợn con bị bệnh

2.2.5.2 Điều trị bệnh

Khi bệnh phát ra ở đàn lợn thì phải khẩn trương điều trị với những biện pháp thích hợp và chăm sóc chu đáo đàn lợn Một số kháng sinh sau đây thường được sử dụng riêng rẽ hoặc phối hợp để điều trị như: Tetracyclin, Neomycin, Biomycin, Gentamycin

Dùng một số kháng sinh có nguồn gốc thảo mộc cũng có thể điều trị bệnh lợn con phân trắng

- Viên Tô mộc dùng theo công thức sau: Tô mộc 500g và Ngũ bột tử 300g, hai thứ sắc đặc trộn lẫn vào thức ăn cho 100 lợn con ăn

- Palmatin: chiết xuất từ cây Hoàng đằng, dùng dạng viên với liều 50mg/lợn con

Có thể dùng các loại thuốc như: Becberin, hay dùng các loại cây có hợp chất tannin cao như: búp Sim, búp ổi, quả Hồng xiêm, vỏ quả và vỏ thân cây Lựu, cây Liêu đông…

Thực tế cho thấy hiệu quả điều trị của các thuốc trên ngày càng giảm dần ở hầu hết các địa phương nói chung và trại Hoàng Liễn nói riêng Làm

cho các nhà chăn nuôi rất khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị

2.3 Một số hiểu biết về kháng sinh

2.3.1 Khái niệm

Kháng sinh là thuật ngữ Việt Nam phiên âm từ danh từ Hán Việt (kháng sinh tố) Danh pháp quốc tế là antibiotic Danh từ này trước kia chỉ một nhóm chất hữu cơ có cấu tạo hoá học phức tạp, phần lớn trong số đó lúc đầu do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sản sinh ra Với nồng độ thấp đã có tác dụng (cả invitro và invivo) ức chế hay tiêu diệt sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây bệnh nhưng không hay ít gây độc cho người, gia súc, gia cầm

Ngày nay, khái niệm kháng sinh có rộng hơn, nó còn bao gồm cả những chất có nguồn gốc từ thực vật thượng đẳng – Phytoncid, và những kháng sinh khác do con người tổng hợp lên, dựa vào cấu trúc hoá học của các chất tự nhiên Các thuốc này không chỉ tác dụng với vi khuẩn mà còn tác dụng chống đơn bào kí sinh

Ngoài ra cũng còn có những chất hoá dược có tác dụng giống như kháng sinh hay bắt chước kháng sinh (antibiomimeties) Một số thuốc hóa học trị liệu có cơ chế tác dụng như kháng sinh gồm: các dẫn xuất của Sunfamid, 5- nitroimmidazol, nhóm Quinolon, nhóm dẫn xuất nitrofuran…

2.3.2 Phân loại kháng sinh

Theo Hoàng Tích Huyền (1993)[5], Bùi Thị Tho (2003)[23]

Có nhiều cách phân loại kháng sinh, tuỳ theo mục đích nghiên cứu và cách sử dụng thuốc Để tiện cho việc chọn thuốc trong nghiên cứu và trong điều trị, kháng sinh được chia theo những nhóm sau:

• Nhóm β – lactamim gồm:

+ Penecillin tự nhiên: Penecillin G, Penecillin O, Penecillin V… + Penecillin bán tổng hợp: Oxacillin, Ampicillin, Amoxicillin…

+ Các Cephalosporin: Cephalosporin thiên nhiên và bán tổng hợp hay tổng hợp như Cephalothin, Cephaloridin, Cephacetril, Cephapirin…

• Nhóm Aminoglucozid – AG gồm:

Streptomycinva Gentamicin, Neomycin, Kanamycin…

• Nhóm Phenicol gồm: Chloramphenicol, Thiamphenicol…

• Nhóm Tetracyclin gồm: Tetracyclin, Oxytetracyclin…

• Nhóm Macrolid và đồng loại: Erythomycin, Oleandomycin, Lincomycin, Clindamycin, Rifamycin, Tylosin, Spiramycin…

• Nhóm Polypeptid gồm: Colistin, Polymycin…

Để thuận tiện cho việc sử dụng và phối hợp kháng sinh, trong lâm sàng người ta

có thể chia kháng sinh ra làm 2 nhóm: nhóm diệt khuẩn và nhóm kìm khuẩn

• Nhóm diệt khuẩn: Các kháng sinh thuộc nhóm này bao gồm: Penicillin, Cephalosporin, Polymycin, Aminoglycosid, Trimethoprim – Sulfamethoxazol

• Nhóm có tác dụng kìm khuẩn: Tetracyclin, Chloramphenicol, Macrolid, Trimethoprim, Erythromycin, Sulfamid

2.3.3 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh

Mỗi loại thuốc tuỳ thuộc vào nguồn gốc, cấu trúc hóa học, tính chất lý, hóa mà chúng có các cơ chế tác dụng lên vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tuỳ theo tác dụng chọn lọc của từng thuốc mà người ta chia ra các cơ chế tác dụng sau:

- Kháng sinh ức chế tổng hợp màng vách tế bào vi khuẩn

- Kháng sinh ức chế tổng hợp Protein của vi khuẩn

- Kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp Nucleotid

Hiện nay có khoảng 30 chất có tác dụng phá huỷ sự trao đổi RNA và 20 chất phá huỷ sự trao đổi DNA như Actinomycin, Mitomycin, Novobiocin…

2.4 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn

Các nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ lợn, mèo Luca Guardabassi (2004)[39] cho biết: các nghiên cứu đã chỉ ra nhiều vi

khuẩn E.coli, Staphylococcus intermedius, Enterococci, Salmonella sp

typhimurium phân lập từ lợn xuất hiện sự đa kháng với nhiều loại kháng sinh thường được sử dụng Nhóm Fluoroquinolon mới được sử dụng rộng rãi ở những năm gần đây nhưng cũng đã xuất hiện nhiều vi khuẩn có xu hướng

kháng với thuốc: Pseudomonas, Staphylococcus intermedius, E.coli,

Streptococcus phân lập từ lợn bị viêm đường tiết niệu và bị viêm ruột Nghiên cứu tính kháng thuốc của các vi khuẩn phân lập ở người và động vật, một số tác giả Luca Guardabassi (2004){39}, CJ Teale (2002){32} cho biết: với các chủng phân lập ở người, có 56% chủng kháng với Ampicillin, 38% kháng với SXT, 34% kháng với Chloramphenicol, 34% kháng với AMC Với các chủng

phân lập từ gia súc, gia cầm có 71% chủng kháng với Streptomycin, 63% chủng kháng với Tetracyclin, 20% kháng với Gentamycin, 16% kháng với SXT và Ampicillin Còn các chủng phân lập từ lợn, mèo thì cho thấy tỷ lệ kháng thuốc khá cao, có 82% chủng kháng Sulfamethoxazole/ Trimethoprime, 76% chủng kháng với Streptomycin, 67% kháng với Tetracycline

Việc sử dụng rộng rãi các loại kháng sinh điều trị, kích thích sinh trưởng, bảo quản thực vật, xử lý môi trường nước đã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc mang plasmid có chứa gen kháng thuốc tồn tại trong cơ thể động vật cũng như môi trường sống Do vậy ngày nay, mọi thuốc kháng sinh đi vào thị trường đều nhanh chóng bị đánh bại bởi những gen đề kháng mới mà chúng xuất hiện ngẫu nhiên do những đột biến ở vi khuẩn (Nguyễn Phước Tương (2002)[27]

2.4.1 Khái niệm

Trong quá trình đấu tranh giữa con người và bệnh tật, loài người đã tìm

ra vũ khí sắc bén: Kháng sinh và các thuốc hoá học trị liệu, để khống chế và tiêu diệt các bệnh nhiễm khuẩn Nhưng trên thực tế do lạm dụng, sử dụng kháng sinh quá mức dẫn đến vi khuẩn gây bệnh đã xuất hiện thêm vũ khí bảo

vệ mới đó là hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Hiện tượng kháng thuốc phát sinh do vi khuẩn tiếp xúc nhiều lần với các thuốc hoá học trị liệu hoặc do truyền từ vi khuẩn đề kháng sang vi khuẩn mẫn cảm Ngày nay các nhà vi khuẩn học trên thế giới đã công nhận rằng sự kháng thuốc cũng là một trong những yếu tố gây bệnh quan trọng của vi khuẩn Theo Jacob A.E (1997)[39],

đã nghiên cứu các plasmid độc có tính di truyền cũng như khả năng truyền

ngang các yếu tố này của E.coli Trong đó ông có nói nhiều đến các Plasmid

kháng thuốc Các yếu tố kháng thuốc được tạo ra dưới ảnh hưởng của thiên nhiên và bàn tay con người tác động

Theo Nguyễn Phước Tương (2002)[27] Sức đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn là do đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể, nhờ đó chúng sống sót qua sự tấn công của kháng sinh và cuối cùng tạo nên một quần thể mới kháng với loại kháng sinh đó

Như vậy trong thế giới sinh vật nói chung, vi sinh vật gây bệnh nói riêng, muốn sinh trưởng, phát triển và bảo toàn nòi giống buộc chúng phải phát sinh biến dị, đột biến để thích nghi với môi trường sống mới

Theo Nguyễn Thị Thuận (1981)[25] vi khuẩn phân chia tế bào mỗi lần

40 phút, như vậy cứ 22 giờ mỗi tế bào đột biến sẽ có 109 đời con Qua một ngày một đêm, đời con của tế bào đột biến đã tăng lên rất nhiều và tạo ra một dòng vi khuẩn mới Nhờ phương pháp đánh dấu các nhà khoa học đã chứng minh sự xuất hiện đột biến tự nhiên ở vi khuẩn đã làm thay đổi đặc tính thích nghi của chúng, mà hoàn toàn không đòi hỏi chúng phải tiếp xúc với các yếu

tố cần thiết cho sự xuất hiện các đặc tính ấy Cũng nhờ phương pháp này, đã giải thích sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn một phần cũng tuân theo quy luật biến đổi ngẫu nhiên khách quan không phụ thuộc vào việc

tế bào có tiếp xúc với các chất kháng sinh hay không

Hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng có rất nhiều công trình nghiên cứu về tính kháng thuốc và tính đột biến của vi khuẩn Đây

là một vấn đề lớn đã và sẽ tập trung được sự chú ý của nhiều nhà khoa học

2.4.2 Phân loại kháng thuốc

Dựa vào nguồn gốc hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn được chia thành hai loại:

v Kháng thuốc tự nhiên

Bản thân vi khuẩn bình thường đã có sẵn những men hay một chất x nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh hoặc có thể loại vi khuẩn đó không có vị trí công kích, điểm tác dụng của kháng sinh

Ví dụ: các vi khuẩn Gram (-) không chịu tác dụng của Penecillin

v Kháng thuốc thu được:

Vi khuẩn thu được những yếu tố kháng thuốc trong quá trình sống do

sự đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc (Nicholas F N 1987) Khi có được các yếu tố kháng thuốc như Plasmid, factor R hay episome nó có khả năng truyền ngang các yếu tố kháng này giữa các chủng của cùng loài và giữa các loài với nhau

Kháng thuốc thu được chia làm hai loại:

* Đột biến kháng: là sự đột biến xuất hiện dưới ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc Ở đây tác nhân gây đột biến là các thuốc hoá học trị liệu Các tác nhân này đã gây nên những biến đổi ở bộ máy di truyền của tế bào vi khuẩn

* Kháng thuốc lây lan: hiện tượng kháng thuốc này do các đơn vị di truyền plasmid tạo nên Các plasmid nằm ngoài nhiễm sắc thể, trong tế bào chất và có thể truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác

2.4.3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn

Sự nảy sinh khả năng kháng thuốc của vi khuẩn là rất nhanh và ở diện rộng Trước đây, điều này chỉ được giải thích bằng một cơ chế cổ truyền đó là: khả năng kháng thuốc của vi khuẩn có được do các biến đổi ở hệ gen của chúng Sự gia tăng về tần số gen kháng thuốc gây ra do chọn lọc rồi di truyền theo chiều dọc (vertical transfer) từ bố mẹ di truyền cho con cái Trong thực

tế khả năng kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu do khả năng truyền các gen kháng thuốc theo chiều ngang (horizontal transfer) giữa các vi khuẩn với nhau trong cùng một thế hệ hoặc giữa những loài vi khuẩn khác họ với nhau

Theo Clower R.C [34], Cohen S.N [35]…có ba phương thức để vi khuẩn có thể truyền kháng theo chiều ngang:

- Sự biến nạp hay chuyển nạp (Transformation):

- Tải nạp (Transduction):

- Sự tiếp hợp (Conjugation):

Có hai đặc trưng của Plasmid kháng thuốc đã giúp chúng hình thành sự kháng thuốc và gieo rắc tính kháng thuốc trong tự nhiên đó là: khả năng tiếp hợp của plasmid và sự có mặt của transposoms (các nhân tố chuyển hoán) trong bộ gen của Plasmid Các gen kháng thuốc nằm trên các plasmid hay các nhân tố chuyển hoán làm lan rộng các gen kháng thuốc giữa các vi khuẩn

Trong ba phương thức kể trên thì phương thức sinh sản tiếp hợp là quan trọng nhất Qúa trình này bao gồm quá trình truyền các phiên bản của Plasmid

từ tế bào này sang tế bào khác Vai trò quan trọng của sự sinh sản tiếp hợp là

có nhiều gen quan trọng tham gia vào quá trình kháng thuốc kháng sinh nằm trong plasmid Plasmid mang một hay nhiều gen kháng thuốc kháng sinh gọi

là nhân tố R

Đáng chú ý là các vi khuẩn này thể hiện tính đa kháng với nhiều loại

thuốc và được chuyển từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác kể cả E.coli qua sự

tiếp xúc tế bào đơn giản Một số Plasmid R cho tính kháng với 8 loại kháng sinh, một số khác cho tính kháng với các kim loại nặng Một số Plasmid có phổ chủ rộng và có thể được chuyển giữa một số giống vi khuẩn khác nhau .Điều này có ý nghĩa quan trọng cho sự phổ biến của chúng

2.4.4 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn E.coli

Yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh của E.coli nằm trong

plasmid Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột

nói chung và E.coli nói riêng có khả năng tồn tại, nhân lên và chuyển giao

giữa các chủng vi khuẩn Do vậy, nó có vai trò hết sức quan trọng trong việc gieo rắc tính kháng thuốc Sử dụng một loại thuốc hoá học trị liệu nào điều trị

E.coli trong một thời gian dài thì vi khuẩn sẽ có khả năng kháng không chỉ thuốc đó mà cả các thuốc khác nữa (Bùi Thị Tho (2006)[24])

Các nhà khoa học Liên Xô cũng đã xác nhận: “Các nhân tố R không

những có thể truyền sang nhiều loài E.coli khác nhau mà còn có khả năng

truyền cho phẩy khuẩn tả, trực khuẩn nhiệt thán, proteus, vi khuẩn dịch hạch

– Pasteurella”, phát hiện được việc truyền các plasmid kháng thuốc ở E.coli

còn do các mảnh thực khuẩn thể đảm nhiệm

Các nhà khoa học khác Cohen S.N (1980)[35], Clowes R (1973)[34], Smith H.R (1984)[40] đã tổng kết một cách tương đối đầy đủ cơ chế hình thành kháng thuốc là do khả năng di truyền, cách lan truyền yếu tố kháng giữa vi khuẩn cùng dòng, giữa các vi khuẩn gram (-), gram (+), giữa các vi khuẩn gram (+) với gram (-) hay ngược lại Trong quá trình làm thí nghiệm tìm hiểu bản chất của sự lan truyền tính kháng đa thuốc giữa các dòng vi khuẩn đều thấy rằng

E.coli có khả năng cho và nhận sức kháng cao hơn Salmonella sp Cụ thể là

E.coli 73%, Salmonella sp chỉ có 47% Từ các kết quả đã nghiên cứu trong nhiều năm, Smith H.W (1967)[40] và cộng sự đã đi đến kết luận: "Các chủng E.coli là

nguồn chủ yếu về tính kháng kháng sinh lan truyền trong các chủng vi khuẩn có

ở đường tiêu hoá của người và gia súc"

Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1996)[4], khi nghiên cứu tính mẫn cảm

và tính kháng thuốc của E.coli phân lập từ phân của lợn con bị bệnh PTLC đã công bố kết quả: 40% E.coli kháng Streptomycin, 50% kháng Sulfamid, 12%

kháng Chlotetracyclin và có 2,2 % kháng Chloramphenicol Về hiện tượng đa

kháng, các tác giả cũng cho biết đã có 17,5% E.coli đa kháng với hai loại thuốc Streptomycin và Sulffamid; 6,5% E.coli đa kháng với ba loại thuốc

Streptomycin, sulffamid và Chlotetracyclin

2.4.5 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella sp

Cũng giống như các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột khác,

Salmonella sp có các gen kháng thuốc nằm trong plasmid, chúng có thể tồn tại, nhân lên và phát tán rộng rãi trong quần thể vi sinh vật Hiện tượng kháng

thuốc của vi khuẩn Salmonella sp đã thu hút sự nghiên cứu của nhiều nhà

khoa học trong và ngoài nước

Bochna (1979)[31] nghiên cứu tác dụng của thuốc kháng sinh đã cho

biết: khi điều trị cho gia súc bằng một số thuốc thấy thuốc này bị vi khuẩn kháng lại

Griggs (1994)[38] nhận xét rằng: việc sử dụng thường xuyên một số loại kháng sinh phòng và trị bệnh gia súc, gia cầm dẫn tới làm tăng khả năng kháng kháng sinh của nhiều chủng vi khuẩn Theo Gibb (1991)[37]: có nhiều

chủng Salmonella sp gây bệnh Salmonellosis ở người được phân lập tại nhiều

nước, một hay nhiều loại xác định có mang đặc tính kháng kháng sinh

Nghiên cứu của Dean (1982)[36] cho thấy khả năng kháng lại các kim loại nặng như Ag, As, Hg của vi khuẩn đường ruột, trong đó có vi khuẩn

Salmonella sp

Theo nhiều nghiên cứu chủng Salmonella sp cho đến nay kháng lại 4 loại

kháng sinh là Ampicillin, Streptomycin, Dehydrochlotetracylin và Sulfamid, chỉ còn kháng sinh thuộc nhóm polypeptide trong đó có Polymicin B vẫn còn tác dụng invitro với tất cả các chủng phân lập được trong các ca bệnh

Trong báo cáo về tình trạng kháng thuốc có ghi nhận tại một số nước Châu Âu, Luca Guardabassi (2004)[39] cho biết:

Các chủng đa kháng Salmonella sp DT 104 thường kháng với ít nhất 5

loại kháng sinh bao gồm: Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamid và Tetracyllin Cũng theo tác giả trong số 80 con lợn tiêu chảy

phân lập được Salmonella sp có 14% kháng Amoxycillin/Clavulanic Acid

(AMC), 6% kháng Sulphamethoxazol- Trimethoprim (SXT)

Theo Bùi Thị Tho (1996)[22] có 44,45% số chủng Salmonella sp kháng

lại Chloramphenicol, 44,45% kháng lại Ampicillin, 63,64% kháng lại Streptomycin, 72,73% kháng Sulfonamid và chưa có chủng nào kháng Furazolidon

3 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng

* Đối tượng nguyên cứu của đề tài là lợn con theo mẹ từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi bị bệnh LCPT được nuôi tại trại Hoàng Liễn - Vũ Thư - Thái Bình

Lợn nghiên cứu được chia thành 3 nhóm:

- Nhóm I: lợn con từ sơ sinh đến 7 ngày tuổi

- Nhóm II: lợn con từ 8 ngày tuổi đến 14 ngày tuổi

- Nhóm III: lợn con từ 15 ngày tuổi đến 21 ngày tuổi

Lợn thí nghiệm đều được chọn từ những lợn mẹ đã được tiêm các loại vacxin phòng bệnh do virus theo quy trình chuẩn

3.2 Nội dung

3.2.1 Xác định sự biến động của hệ vi sinh vật hiếu khí ở đường tiêu hoá

của lợn con từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi để thấy rõ vai trò của E.coli

và Salmonella sp trong bệnh LCPT

3.2.2 Kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli và Salmonella sp phân

lập được từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với một số thuốc thí nghiệm

3.2.3 Kiểm tra tính kháng thuốc của các chủng E.coli và Salmonella sp

phân lập được từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với một số thuốc thí nghiệm

3.2.4 Xác định hiệu quả điều trị của một số thuốc sau khi làm kháng sinh

đồ trong điều trị bệnh LCPT tại trại

3.3 Nguyên liệu

3.3.1 Các môi trường phổ thông tự chế trong phòng thí nghiệm

- Môi trường nước thịt: Dùng để nuôi cấy vi khuẩn

- Môi trường thạch thường: Dùng để kiểm tra hình thái khuẩn lạc,

đếm tổng số vi khuẩn

3.3.2 Môi trường chuyên dụng

Dùng để phân lập, giám định vi khuẩn Gồm các môi trường chế sẵn của hãng Oxoid

- Môi trường MacConkey Agar: dùng để phân lập và giám định vi

khuẩn E.coli

Tính chất của khuẩn lạc: E.coli có màu đỏ cánh sen, không có dịch nhầy Các Enterococcus (như Streptococcus trong phân) cho khuẩn lạc đỏ, tròn, nhỏ liti Staphylococcus cho khuẩn lạc màu hồng thẫm, đục

- Môi trường Brilliant Green Agar: đây là môi trường dùng để phân

lập và giám định Salmonella sp

Tính chất của khuẩn lạc: Salmonella cho khuẩn lạc màu hồng, môi trường xung quanh màu đỏ sáng E.coli có màu vàng chanh Các loài Proteus,

một số chủng cho khuẩn lạc màu đỏ

- Môi trường Chapman: đây là môi trường phân lập và giám định

Tính chất khuẩn lạc: khuẩn lạc Streptococcus nhỏ, trong, dạng S Một

số khuẩn lạc khác màu hơi đen

3.3.3 Giấy tẩm kháng sinh: được bảo quản lạnh

- Do hãng Oxiod của Anh sản xuất bao gồm các loại:

Amoxicillin, Enrofloxacin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Norfloxacin, Sulfamethoxazole – Trimethoprim, Tetracyclin, Penicillin

3.3.4 Các kháng sinh được sử dụng trong đề tài

- Nhóm β - Lactamin Gồm có: Amoxycillin, Clavulanic

Hoạt phổ kháng sinh của các thuốc thuộc nhóm β - Lactamin tương đối rộng Có tác dụng trên cả vi khuẩn gram (-),gram (+) Tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên da, đường ruột

- Nhóm Aminoglycosid gồm có: Kanamycin, gentamycin, Neomycin Các Amynoglycosid có tác dụng tương đối rộng, chủ yếu với vi khuẩn Gram (-) như cầu trực khuẩn, cầu khuẩn Điều trị bệnh đường tiêu hoá, viêm

vú, viêm đường sinh dục

- Nhóm Dapeptid gồm có: Colistin Điều trị các bệnh do Salmonella,

* Colistin – 1200 là thuốc uống có thành phần là:

+ Colistin sulphat 120.000.000UI + Tá dược vừa đủ 100g

3.3.4 Dụng cụ thí nghiệm:

- Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp, buồng cấy, cân điện tử, đĩa lồng, ống nghiệm, đèn cồn, bếp điện, bình tam giác các loại, ống đong, giấy đo pH…

- Hoá chất: dung dịch NaOH 10%, muối tinh, pepton, cồn sát trùng 70%

3.4 Phương pháp thí nghiệm

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu:

- Mẫu được lấy trực tiếp ở hậu môn hoặc lấy ngay sau khi lợn mới thải

- Mẫu phân lấy được bảo quản trong lọ thuỷ tinh vô trùng có nắp được bảo quản lạnh ngay ở nhiệt độ 4oC

3.4.2 Phương pháp nuôi cấy xác định số lượng vi khuẩn/ gram phân:

* Chuẩn bị:

- Mẫu phân với lượng >5 gam

- Ống nghiệm định lượng 20 ml vô trùng

* Phương pháp xử lí mẫu

Mẫu lấy về cấy chuyển ngay vào môi trường nước thịt, đặt trong tủ ấm

37oC/24h Sau đó dùng que cấy vô trùng để chuyển sang các loại môi trường phân lập

* Phương pháp nuôi cấy:

Cân 1 gam phân cho vào ống nghiệm vô trùng nghiền nát với 9 ml nước sinh lí ta được nồng độ pha loãng 10-1, dùng syringe vô trùng trộn đều nhiều lần sau đó hút 1 ml dung dịch này sang ống thứ 2 đựng 9 ml nước sinh

lí vô trùng, trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến nồng độ pha loãng thích hợp để nuôi cấy

Cách nuôi cấy: Dùng syringe vô trùng hút 0,1ml dịch pha loãng ở các

nồng độ đã chọn vào một đĩa môi trường Mỗi nồng độ ở mỗi môi trường cấy trên 3 đĩa lồng Cấy bằng phương pháp làng đều dịch pha loãng trên bề mặt thạch Sau đó để các đĩa thạch vào tủ ấm 37oC/24h

* Xác định số lượng:

Chúng tôi sử dụng phương pháp Koch: ở mỗi nồng độ chuẩn cho từng loại phân, rồi cấy ra 3 đĩa thạch đếm số lượng khuẩn lạc (CFU) trong 3 đĩa thạch rồi lấy trung bình Số lượng CFU tương đương với số lượng vi khuẩn

* Tính kết quả: nếu tiến hành pha loãng mẫu ở nồng độ x và cấy 0,1 ml mẫu pha loãng vào môi trường, để tủ ấm nuôi cấy sau 24h thì khi đó số lượng

vi khuẩn (X) trong 1 gam phân được tính theo công thức:

X = 10.a.b

Trong đó X: tổng số vi khuẩn có trong một gam phân

a: là tổng số khuẩn lạc trung bình trên 1 đĩa thạch Petri

b: nồng độ pha loãng 10-x

3.4.3 Phương pháp xác định số loại, số lượng vi khuẩn có trong mẫu phân:

Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường để trong tủ ấm

37oC/18 - 24 giờ, đếm tổng số khuẩn lạc Đồng thời từ nồng độ thích hợp nuôi cấy trên các môi trường chuyên dụng xác địnácố loại,số lượng từng loại khuẩn lạc

v Môi trường thạch thường:

+ E.coli: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, ướt, màu tro hay

trắng nhạt, hơi lồi

+ Salmonella sp: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, trong hoặc

hơi xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa

+ Staphylococcus sp: khuẩn lạc dạng S, tròn bóng, rìa gọn, mặt lồi,

có màu vàng

+ Streptococcus sp: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám, bóng…

v Môi trường thạch MacConkey:

+ E.coli: hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu hồng cánh sen + Salmonella sp: khuẩn lạc tròn, trong không màu, nhẵn bóng, hơi