Xác định sinh khả dụng và tương đương sinh học của viên hai lớp chứa metoprolol 50 mg phóng thích kéo dài và amlodipin 5 mg phóng thích nhanh

XÁC ĐỊNH SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA VIÊN HAI LỚP CHỨA METOPROLOL 50 MG PHÓNG THÍCH KÉO DÀI VÀ 5 MG AMLODIPINEPHÓNG THÍCH NHANH Đặt vấn đề: Viên nén 2 lớp bao phim MET-AMLO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HỒ CHÍ MINH - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

DÀI VÀ AMLODIPIN 5 MG PHÓNG THÍCH NHANH

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế

Mã số: 60720402

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS LÊ QUAN NGHIỆM

HỒ CHÍ MINH - 2017

XÁC ĐỊNH SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA VIÊN HAI LỚP CHỨA METOPROLOL 50 MG PHÓNG THÍCH KÉO DÀI VÀ 5 MG AMLODIPINE

PHÓNG THÍCH NHANH

Đặt vấn đề: Viên nén 2 lớp bao phim MET-AMLO 50/5 do Sapharcen sản xuất phối hợp

amlodipine phóng thích nhanh – một thuốc chẹn calci qua màng tế bào và metoprolol phóngthích kéo dài– một thuốc đối kháng chọn lọc beta1 - adrenergic vừa giúp kiểm soát huyết áphiệu quả, vừa giảm tác dụng phụ Do đó, việc xây dựng và thẩm định một quy trình định lượngđồng thời metoprolol và amlodipine trong huyết tương người tình nguyện là cần thiết, từ đógiúp xác định tương đương sinh học của MET-AMLO 50/5 so với viên đối chiếu

Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời metoprolol và amlodipine

trong huyết tương người tình nguyện và ứng dụng quy trình xây dựng được để xác định tươngđương sinh học của viên MET-AMLO 50/5 so với viên đối chiếu SELOMAXTM

50/5 trênngười tình nguyện

Phương pháp: Hỗn hợp dung môi diethylether-dicloromethan được dùng để chiết chất phân

tích, sử dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng với chất chuẩn nội làhydrochlorothiazide, cột C18 (100 x 3 mm; 5 µm), pha động MeOH - acid formic 0,4%(80:20, tt/tt) Quy trình định lượng metoprolol và amlodipin trong huyết tương được thẩm địnhtheo hướng dẫn của FDA và EMEA Một thiết kế chéo, đơn liều, ngẫu nhiên, 2 thuốc, 2 trình

tự, 2 giai đoạn được tiến hành trên 13 người tình nguyện Việt Nam khỏe mạnh trong tình trạngđói để xác định tương đương sinh học của viên MET-AMLO 50/5

Kết quả và bàn luận: Phương pháp xây dựng với khoảng tuyến tính của metoprolol từ 0.3 –

100 ng/ml với R2 = 0,9939 và amlodipine từ 0.045 – 15 ng/ml với R2 = 0,9977 Phương pháp

có độ đúng cao (phần trăm tìm lại nằm trong khoảng 93,36% - 105,15% với amlodipine và90,02% – 95,14% với metoprolol), hệ thống có tính tương thích (CV < 5%) Khoảng tin cậy90% của tỷ số giá trị trung bình AUC0-∞ và Cmax của thuốc thử so với thuốc đối chiếu nằmtrong khoảng giới hạn cho phép 80 – 125%

Kết luận: Một phương pháp LC-MS/MS nhanh, nhạy và đặc hiệu đã được xây dựng và được

thẩm định để định lượng đồng thời amlodipine và metoprolol trong huyết tương người vớihydrothiazid là chất chuẩn nội Phương pháp này được áp dụng thành công giúp xác định cácthông số dược động học và đánh giá tương đương sinh học viên nén 2 lớp MET-AMLO 50/5trên 13 người tình nguyện Viêt Nam trong tình trạng đói

Pharmacokinetics and bioequivalence evaluation of bilayer tablet containing amlodipine 50 mg as fast-release and metoprolol 5 mg as extended-release.

Background: MET-AMLO 50/5 bilayer tablet manufactured by Sapharcen company

containing amlodipine - the calcium channel blocker and metoprolol - the prototype of cardioselective β-adrenoceptor antagonist, is used in treatment of angina pectoris, cardiac arrhythmiaand hypertension A rapid, sensitive, and specific method need to be developed and validatedfor simultaneous quantative determination of metoprolol succinate and amlodipine besylate inhuman plasma to evaluate the bioequivalence of MET-AMLO 50/5 in fasted healthyVietnamese male volunteers

Objective: The aim of this study was development and validation of method for simultaneous

determination of metoprolol and amlodipine in human plasma using LC-MS/MS and applied

to bioequivalence study in healthy human volunteers

Method: The drugs were extracted by simple liquid – liquid extraction with

diethylether-dicloromethan The chromatographic separation was performed on a reversed-phase basic C18columm with a mobile phase of methanol – 0,4% formic acid (8:2, v/v) Electrosprayionization (ESI) with multiple reaction monitoring (MRM) was used to acquire the massspectra of the compounds The validation of quantitative process of MET and AMP in plasmafollows the guidance of FDA and EMEA An open-label, single-dose, randomized, 2-waycrossover study was conducted in fasted healthy Vietnamese male volunteers to evaluate thebioequivalence of MET-AMLO 50/5

Results and discuss: The calibration curves were found to be linear over the concentration

range of 0.3 – 100 ng/ml for metoprolol and 0.045 – 15 ng/ml for amlodipine The averagecorrelation coefficients obtained were 0,9939 and 0,9977 for meto and amlo, respectively Theassay method demonstrated high degree of accuracy and precision (the percentage of accuracywas in the range of 93,36% - 105,15% for amlodipine and 90,02% – 95,14% for metoprolol).The 90% CIs for the ratios of Cmax, AUC0–t, and AUC0-∞ of amlodipine and metoprolol metthe predetermined criteria for bioequivalence (80 – 125%)

Conclusion: A rapid, sensitive, and specific LC-MS/MS method was successfully developed

and validated for simultaneous quantative determination of metoprolol succinate andamlodipine besylate using hydroclorothiazide (HCTZ) as internal standard (IS) in humanplasma This method was applied to the pharmacokinetic study and bioequivalence evaluation

of fixed dose combination of MET and AMP formulation product after an administration to 13healthy human volunteers

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luậnvăn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người viết

Phan Thị Diễm Ly

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1.AMLODIPIN BESYLATE VÀ METOPROLOL SUCCINAT 2

1.1.1 Amlodipin besylat 2

1.1.2 Metoprolol succinat 8

1.1.3 Phối hợp amlodipine và metoprolol 13

1.2.PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DƯỢC CHẤT TRONG HUYẾT TƯƠNG 17

1.2.1 Phương pháp tạo tủa protein 17

1.2.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 17

1.2.3 Phương pháp chiết qua pha rắn 17

1.3.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DƯỢC CHẤT TRONG DỊCH SINH HỌC 17

1.3.1 Tính chọn lọc 18

1.3.2 Giới hạn định lượng dưới 18

1.3.3 Đường cong chuẩn và khoảng tuyến tính 18

1.3.4 Độ phục hồi 19

1.3.5 Độ chính xác 19

1.3.6 Độ đúng 19

1.3.7 Độ nhiễm chéo 20

1.3.8 Hiệu ứng nền 20

1.3.9 Độ ổn định 20

1.4.SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 21

1.4.1 Sinh khả dụng 21

1.4.2 Tương đương sinh học 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – THUỐC THỬ - TRANG THIẾT BỊ 30

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.1.2 Người tình nguyện 31

2.1.3 Chất chuẩn làm việc 31

2.1.4 Trang thiết bị 32

2.1.5 Hóa chất, dung môi 32

2.1.6 Mẫu huyết tương trắng 32

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời amlodipine và metoprolol trong huyết tương 33

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 36

2.2.3 Xác định các thông số dược động học của viên MET-AMLO 50/5 37

2.2.4 Đánh giá tương đương sinh học của viên MET-AMLO 50/5 so với thuốc đối chiếu 38

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 39

3.1.XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPINE VÀ METOPROLOL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ 39

3.1.1 Điều kiện sắc ký 39

3.1.2 Xử lý mẫu 40

3.1.3 Chuẩn bị mẫu đường chuẩn 40

3.1.4 Chuẩn bị mẫu kiểm chứng 41

3.1.5 Chuẩn bị dung dịch chuẩn nội 42

3.1.6 Các thông số thẩm định 42

3.1.7 Kết luận 55

3.2.XÁC ĐỊNH SINH KHẢ DỤNG CỦA VIÊN NÉN MET-AMLO 50/5 55

3.2.1 Các bước thực nghiệm trước khi thử trên người tình nguyện 55

3.2.2 Tiến hành thử nghiệm 56

3.2.3 Xác định sinh khả dụng 72

3.3.ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA VIÊN NÉN MET-AMLO 50/5 VÀ SELOMAXTM 50/5 80

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 85

4.1.XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG METOPROLOL VÀ AMLODIPINE TRONG HUYẾT TƯƠNG 85

4.2.XÁC ĐỊNH SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 86

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 88

5.1.KẾT LUẬN 88

5.2.ĐỀ NGHỊ 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MUC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

muốn của thuốc

cong

CMAX Peak drug concentration Nồng độ đỉnh

EMEA The European Agency for the

Evaluation of Medicinal Products

Cơ quan đánh giá dượcphẩm Châu Âu

EDTA Ethylenediaminetetraaceticacid Acid ethylene diamin

tetraaceticFDA Food and Drug Administration Cơ quan quản lý dược

phẩm và thực phẩm MỹHIV The human immunodeficiency

LLOQ Lower Limit of Quantification Nồng độ giới hạn định

lượng dướiULOQ Upper Limit of Quantification Nồng độ giới hạn định

lượng trên

độ thấp

MQC Medium quality control Mẫu kiểm chứng ở nồng

độ trung bình

độ cao

S/N Signal to noise ratio Tỷ số tín hiệu trên nhiễu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống 42

Bảng 3.2 Kết quả xác định độ chọn lọc 43

Bảng 3.3 Tương quan giữa nồng độ và tỉ số diện tích đỉnh 45

Bảng 3.4 Hiệu suất chiết của amlodipine, metoprolol và hydroclorothiazid (n = 6) 47

Bảng 3.5 Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày (n=6) 48

Bảng 3.6 Kết quả độ đúng và độ chính xác giữa các ngày của amlodipine (n = 6) 49

Bảng 3.7 Kết quả độ đúng và độ chính xác giữa các ngày của metoprolol (n = 6) 50

Bảng 3.8 Độ nhiễm chéo (n = 6) 51

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nền mẫu (n = 6) 52

Bảng 3.10 Độ ổn định của hoạt chất trong dung dịch gốc ở nồng độ MQC 52

Bảng 3.11 Độ ổn định của hydroclorothiazid trong dung dịch gốc nồng độ 100µg/ml (n = 6) 53

Bảng 3.12 Độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương ở nồng độ LQC 53

Bảng 3.13 Độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương ở nồng độ HQC 54

Bảng 3.14 Độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương sau 24h xử lý mẫu trong buồng tiêm mẫu (n = 6) 54

Bảng 3.15 Dữ liệu về người tình nguyện 56

Bảng 3.16 Kết quả xét nghiệm sinh hóa và miễn dịch 58

Bảng 3.17 Kết quả xét nghiệm huyết học 59

Bảng 3.18 Kết quả xét nghiệm nước tiểu 60

Bảng 3.19 Giai đoạn 1 - Amlodipine 63

Bảng 3.20 Giai đoạn 2 - Amlodipine 64

Bảng 3.21 Nồng độ amlodipine của từng cá thể sau khi uống thuốc thử trong tình trạng đói 65

Bảng 3.22 Nồng độ amlodipine của từng cá thể sau khi uống thuốc đối chứng trong tình trạng đói 66

Bảng 3.23 Giai đoạn 1 - Metoprolol 67Bảng 3.24 Giai đoạn 2 - Metoprolol 68Bảng 3.25 Nồng độ metoprolol của từng cá thể sau khi uống thuốc thử trong tìnhtrạng đói 69Bảng 3.26 Nồng độ metoprolol của từng cá thể sau khi uống thuốc đối chứng trongtình trạng đói 70Bảng 3.34 So sánh giá trị Cmax, AUC0-t, AUC0-∞, Tmax metoprolol của thuốc thử (T) vàthuốc đối chứng (R) của từng cá thể trong tình trạng đói 79Bảng 3.35 So sánh giá trị LnCmax, LnAUC0-t, LnAUC0-∞, LnTmax metoprolol của thuốcthử (T) và thuốc đối chứng (R) của từng cá thể trong tình trạng đói 79Bảng 3.36 So sánh giá trị Ke và T1/2 metoprolol của thuốc thử (T) và thuốc đối chứng(R) của từng cá thể trong tình trạng đói 80Bảng 3.37 Các thông số dược động học trung bình amlodipine của thuốc thử và thuốcđối chứng trong tình trạng đói 81Bảng 3.38 Các thông số dược động học trung bình metoprolol của thuốc thử và thuốcđối chứng trong tình trạng đói 81Bảng 3.39 Kết quả so sánh sinh khả dụng với khoảng tin cậy 90% 82Bảng 3.40 Phân tích phương sai các thông số AUC0-t, AUC0-∞, Cmax (đã chuyển ln)của amlodipine trong tình trạng đói 82Bảng 3.41 Phân tích phương sai các thông số AUC0-t, AUC0-∞, Cmax (đã chuyển ln)của metoprolol trong tình trạng đói 83Bảng 3.42 So sánh giá trị Tmax và lnTmax amlodipine của thuốc thử (T) và thuốc đốichứng (R) của từng cá thể trong tình trạng đói 83Bảng 3.43 So sánh giá trị Tmax và lnTmax metoprolol của thuốc thử (T) và thuốc đốichứng (R) của từng cá thể trong tình trạng đói 84

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các kiểu phối hợp thuốc trong điều trị THA 14Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng, mẫu LLOQ, mẫu LQC, mẫu MQC, mẫuHQC 45Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ amlodipine trong huyết tương

và tỉ số diện tích đỉnh 46Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ metoprolol trong huyết tương

và tỉ số diện tích đỉnh 47Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn nồng độ amlodipine trung bình theo thời gian của thuốc thử

và thuốc đối chứng 71Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn nồng độ metoprolol trung bình theo thời gian của thuốc thử

và thuốc đối chứng 71

MỞ ĐẦU

Tăng huyết áp là một bệnh lý mang tính toàn cầu Theo thống kê của Tổ chức y tế thếgiới, hiện nay toàn thế giới có khoảng 1,13 tỷ người THA [30] Riêng ở Việt Nam, theothống kê năm 2015 đã có 47,3% người bị THA Nhiều nghiên cứu dịch tễ học lớn đãchứng minh được mối liên quan chặt chẽ giữa con số huyết áp với các bệnh lý timmạch Do đó, việc kiểm soát huyết áp là rất quan trọng và để đạt được con số huyết ápmục tiêu, phần lớn bệnh nhân phải phối hợp nhiều loại thuốc với cơ chế khác nhau, làmphát sinh nhu cầu phối hợp nhiều thành phần trong một đơn để phù hợp với phác đồ [4]Thuốc chẹn kênh canxi và thuốc đối kháng chọn lọc beta1 - adrenergic là hai trong sốnhững nhóm thuốc cơ bản thường được chọn lựa sử dụng phối hợp để điều trị tănghuyết áp và kết quả nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh hiệu quả Trong đó, sựkết hợp amlodipin - một dẫn chất của dihydropyridin có tác dụng chẹn calci qua màng

tế bào và metoprolol - một thuốc đối kháng chọn lọc beta1 - adrenergic không có hoạttính nội tại giống thần kinh giao cảm vừa giúp kiểm soát huyết áp hiệu quả vừa làmgiảm tác dụng phụ không mong muốn [4] Vì metoprolol có thời gian bán thải ngắn (3-

4 giờ) trong khi amlodipine có thời gian bán thải dài (30-40 giờ) nên việc kết hợp trongmột viên với metoprolol theo cơ chế phóng thích kéo dài và amlodipine theo cơ chếphóng thích nhanh sẽ là biện pháp tối ưu giúp tăng hiệu quả, tăng tính thuận tiện vàgiảm chi phí điều trị cho bệnh nhân

Hiện nay sản phẩm riêng lẻ metoprolol và amlodipine đều đã qua thời kỳ bảo hộ bảnquyền, sản phẩm generic kết hợp hai hoạt chất này đã có trên thị trường thế giới Tuynhiên tại Việt Nam chưa có dạng viên phối hợp 2 thành phần này do đó viên nén baophim 2 lớp Met-Amlo 50/5 do trung tâm khoa học công nghệ Dược Sài Gòn Sapharcensản xuất sẽ đáp ứng nhu cầu sử dụng thuốc nội trong điều trị, dần thay thế thuốc ngoạinhập

Nhằm nâng cao chất lượng thuốc generic lưu hành trên thị trường và đáp ứng các yêucầu về đảm bảo chất lượng, tính an toàn và hiệu quả trị liệu của thuốc thì nghiên cứuđánh giá tương đương sinh học là hết sức cần thiết.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Xác định sinh khảdụng và tương đương sinh học của viên hai lớp chứa metoprolol 50mg phóng thích kéodài và amlodipin 5mg phóng thích nhanh”

Nội dung nghiên cứu gồm:

 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời amlodipine vàmetoprolol trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS

 Thiết lập mô hình thử nghiệm và xác định sinh khả dụng của metoprolol vàamlodipine trong huyết tương người tình nguyện trong tình trạng đói

 Đánh giá tương đương sinh học của thuốc Met-Amlo 50/5 so với viên đối chiếuSelomax 50/5 trong tình trạng đói

AMLODIPIN BESYLATE VÀ METOPROLOL SUCCINAT

1.1.1 Amlodipin besylat

1.1.1.1 Tính chất lý hóa

Tên hóa học: 3-ethyl 5-methyl

(4RS)-2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2-clorophenyl)-6-methyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat benzensulphonat

Công thức cấu tạo

Amlodipin không có ảnh hưởng xấu đến nồng độ lipid trong huyết tương hoặc chuyểnhóa glucose, do đó có thể dùng amlodipin để điều trị tăng huyết áp ở người bệnh đáitháo đường Tuy nhiên, chưa có những thử nghiệm lâm sàng dài ngày để chứng tỏ răngamlodipin có tác dụng giảm tử vong Ở nhiều nước, điều trị chuẩn để bảo vệ ngườibệnh tăng huyết áp khỏi tai biến mạch máu não và tử vong vẫn là thuốc chẹn beta vàthuốc lợi tiểu, các thuốc này được chọn đầu tiên để điều trị Tuy vậy, amlodipin có thể

dùng phối hợp với thuốc chẹn beta cùng với thiazid hoặc thuốc lợi tiểu quai và cùngvới thuốc ức chế enzym chuyển đổi angiotensin Amlodipin có tác dụng tốt cả khiđứng, nằm cũng như ngồi và trong khi làm việc Vì amlodipin tác dụng chậm, nên ít cónguy cơ hạ huyết áp cấp hoặc nhịp nhanh phản xạ.[2]

1.1.1.3 Dược động học

Khả dụng sinh học của amlodipin khi uống khoảng 60 - 80% và không bị ảnh hưởngbởi thức ăn Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau khi uống liều khuyến cáo 6đến 12 giờ Nửa đời trong huyết tương từ 30 - 40 giờ Nồng độ ổn định trong huyếttương đạt được 7 đến 8 ngày sau khi uống thuốc mỗi ngày một lần Thể tích phân bốxấp xỉ 21 lít/kg thể trọng và thuốc liên kết với protein - huyết tương cao (trên 98%) Ðộthanh thải trong huyết tương tới mức bình thường vào khoảng 7 ml/phút/kg thể trọng

do bài tiết chủ yếu thông qua chuyển hóa trong gan Các chất chuyển hóa mất hoạt tính

và bài tiết qua nước tiểu

Ở người suy gan, nửa đời của amlodipin tăng, vì vậy có thể cần phải giảm liều hoặckéo dài thời gian giữa các liều dùng

1.1.1.4 Chỉ định

Ðiều trị tăng huyết áp (ở người bệnh có những biến chứng chuyển hóa như đái tháođường) và điều trị dự phòng ở người bệnh đau thắt ngực ổn định

1.1.1.5 Chống chỉ định

Không dùng cho những người suy tim chưa được điều trị ổn định

Quá mẫn với dihydropyridin

Nếu tác dụng không hiệu quả sau 4 tuần điều trị có thể tăng liều Không cần điều chỉnhliều khi phối hợp các thuốc lợi tiểu thiazid.

1.1.1.7 Tác dụng không mong muốn

Phản ứng phụ thường gặp nhất của amlodipin là phù cổ chân, từ nhẹ đến trung bình,liên quan đến liều dùng Trong thử nghiệm lâm sàng, có đối chứng placebo, tác dụngnày gặp khoảng 3% trong số người bệnh điều trị với liều 5 mg/ngày và khoảng 11%khi dùng 10 mg/ngày

Thường gặp, ADR >1/100

Toàn thân: Phù cổ chân, nhức đầu, chóng mặt, đỏ bừng mặt và có cảm giác nóng, mệtmỏi, suy nhược

Tuần hoàn: Ðánh trống ngực

Thần kinh trung ương: Chuột rút

Tiêu hóa: Buồn nôn, đau bụng, khó tiêu

A Phương pháp quang phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của amlodipin besylate

chuẩn (ĐC).

Chuẩn bị mẫu đo bằng phương pháp tạo bột nhão

B Tiến hành phương pháp sắc ký lớp mỏng trong phép thử A cho tạp chất liên quan.Trên sắc ký đồ dung dịch thử (2) phải cho vết chính tương ứng về vị trí, kích thước vàmàu sắc với vết chính của dung dịch đối chiếu (2) khi quan sát dưới đèn tử ngoại 366nm

C Hòa tan 5 mg chế phẩm trong vừa đủ 100 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 N trong

methanol (TT) Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch thu được trong khoảng từ 300 nm

đến 400 nm có một cực đại tại bước sóng 360 nm Độ hấp thụ riêng tại bước sóng cựcđại từ 113 đến 121

Định lượng

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Điều kiện sắc ký:

Cột thép không gỉ (15 cm x 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 m)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 237 nm

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

Thể tích tiêm: 10 l

Dung dịch thử: Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong pha động, pha loãng thành 50,0 ml

với cùng dung môi Hút chính xác 5,0 ml dung dịch thu được pha loãng thành 100,0 mlbằng pha động

Dung dịch chuẩn: Hòa tan 50,0 mg amlodipin besilat chuẩn (ĐC) trong pha động, pha

loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi Hút chính xác 5,0 ml dung dịch thu được phaloãng thành 100,0 ml bằng pha động

Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu

Tính hàm lượng của C20H25ClN2O5.C6H6O3S dựa vào diện tích pic đáp ứng của dungdịch thử và dung dịch chuẩn và hàm lượng được công bố của C20H25ClN2O5.C6H6O3Strong amlodipin besilat chuẩn

Pha động: dd đệm pH 3.0, methanol và acetonitril theo tỷ lệ 50:35:15

Phương pháp LC-MS/MS [13]

Xử lý mẫu: chiết lỏng – lỏng với dung môi ethyl acetat

Điều kiện sắc ký: Cột Diamond C18 (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) ở 300

C với cột điềunhiệt

Thể tích tiêm mẫu: 20 μL

Tiến hành: chương trình rủa giải Gradient với tỷ lệ pha động và tốc độ dòng thay đổi.Pha động gồm (A) nước và (B) là hỗn hợp methanol phối hợp với 10 mM ddammonium acetate được thực hiện như sau:

Thời gian (phút) % Pha hữu cơ Tốc độ dòng

Metoprolol không có những tính chất chủ vận - beta, và có rất ít tác dụng ổn địnhmàng Thuốc có tác dụng giảm lực co cơ và nhịp tim.

Metoprolol đã đƣợc chứng minh là một thuốc chống tăng huyết áp có hiệu lực khi dùngmột mình hoặc kết hợp với thuốc lợi tiểu loại thiazid Thuốc có hiệu lực chống tănghuyết áp nhƣ propranolol, methyldopa, và những thuốc lợi tiểu loại thiazid, và có hiệulực bằng nhau ở tƣ thế nằm ngửa và đứng

Do ngăn cản tác dụng làm tăng tần số tim, tăng huyết áp, tốc độ và mức độ co cơ tim củacatecholamin, metoprolol làm giảm nhu cầu oxygen của tim ở mọi mức độ gắng sức,điều này làm cho thuốc có ích trong điều trị dài hạn chứng đau thắt ngực Tuy nhiên, ởnhững người bệnh có suy tim, sự chẹn beta - adrenergic có thể làm tăng nhu cầu oxy dotăng độ dài sợi cơ thất trái và tăng áp lực buồng tim cuối tâm trương.

Trong một nghiên cứu lâm sàng lớn (1.395 người bệnh được phân phối ngẫu nhiên),

mù kép, có kiểm tra với placebo, đã chứng minh metoprolol làm giảm 36% tỷ lệ tửvong ở thời gian 3 tháng đối với những người bệnh nghi ngờ hoặc đã xác định là cónhồi máu cơ tim

1.1.2.3 Dược động học

Sau khi uống, metoprolol được hấp thụ gần như hoàn toàn, nhưng khả dụng sinh họctương đối thấp (khoảng 40%) do sự chuyển hóa ban đầu Nồng độ của thuốc tronghuyết tương thay đổi trong phạm vi rộng (tới 17 lần), có lẽ do những khác biệt ditruyền trong tốc độ chuyển hóa

Metoprolol chuyển hóa mạnh bởi hệ thống monooxygenase ở gan, và chỉ 10% thuốc đãuống được đào thải dưới dạng không biến đổi trong nước tiểu Nửa đời của metoprololphóng thích tức thời từ 3 đến 4 giờ

Khả dụng sinh học toàn thân và nửa đời của metoprolol ở người bệnh suy thận khôngkhác ở mức độ có ý nghĩa lâm sàng so với người bình thường Do đó, thường không cầnphải giảm liều đối với người bệnh suy thận mạn tính

Tác dụng chẹn beta có ý nghĩa (được đánh giá bằng giảm tần số tim khi luyện tập) xuấthiện trong vòng 1 giờ sau khi uống, và thời gian kéo dài phụ thuộc vào liều Sau khitiêm truyền metoprolol trong thời gian 10 phút, đã đạt chẹn beta tối đa ở khoảng 20phút

Tác dụng chẹn beta tối đa tương đương giữa liều uống và tiêm tĩnh mạch ở tỷ lệ khoảng2,5:1

So với viên metoprolol truyền thống, sau khi dùng viên nén metoprolol succinate phóngthích kéo dài, nồng độ đỉnh trong huyết tương thấp hơn, thời gian để đạt nồng độ đỉnhdài hơn và sự biến thiên đỉnh – đáy thấp hơn đáng kể Nồng độ đỉnh của metoprololsuccinate PTKD trung bình từ một phần tư đến một phần hai nồng độ đỉnh trong huyếttương thu được sau khi dùng một liều tương ứng của metoprolol thông thường, uống1lần/ngày hoặc chia theo liều Ở trạng thái ổn định, sinh khả dụng trung bình củametoprolol sau dùng viên nén metoprolol succinate PTKD, trong khoảng liều từ 50 đến

400 mg một lần mỗi ngày, là 77% so với các liều đơn metoprolol truyền thống Sinh khảdụng của metoprolol cho thấy có sự liên quan tăng theo liều và không bị ảnh hưởng đáng

kể bởi thực phẩm sau khi dùng viên nén phóng thích kéo dài metoprolol succinate

1.1.2.4 Chỉ định

Viên nén metoprolol điều trị tăng huyết áp Có thể dùng metoprolol riêng biệt hoặc kết

hợp với thuốc chống tăng huyết áp khác

Metoprolol điều trị dài hạn đau thắt ngực

Metoprolol tiêm và viên được chỉ định điều trị người bệnh đã xác định hoặc nghi ngờ

có nhồi máu cơ tim cấp ổn định về mặt huyết động, để làm giảm tử vong tim mạch.Metoprolol tiêm tĩnh mạch có thể bắt đầu điều trị ngay khi tình trạng lâm sàng ngườibệnh cho phép Hoặc có thể bắt đầu điều trị trong vòng 3 đến 10 ngày sau khi xảy ranhồi máu cơ tim cấp tính

Metoprolol có thể dùng điều trị rất tốt bệnh suy tim độ trung bình hoặc độ nhẹ khángtrị với các phương pháp điều trị suy tim khác Liều lượng phải rất thận trọng và tăngliều rất chậm

Metoprolol được dùng điều trị loạn nhịp tim

1.1.2.5 Chống chỉ định

Trong điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực, metoprolol chống chỉ định đối với

những người bệnh có nhịp tim chậm xoang, blốc tim lớn hơn độ I Sốc do tim, và suytim rõ rệt

Trong điều trị nhồi máu cơ tim, metoprolol chống chỉ định đối với những người bệnh

có tần số tim dưới 45 lần/phút; blốc tim độ II hoặc độ III; blốc tim độ I rõ rệt (khoảng P

- R 0,24 giây; huyết áp tâm thu dưới 100 mm Hg; hoặc suy tim từ vừa đến nặng)

1.1.2.6 Liều dùng

Cách dùng:

Thuốc uống metoprolol là dạng metoprolol tartrat và metoprolol succinat và thuốc tiêmtĩnh mạch metoprolol là dạng metoprolol tartrat Có thể dùng thuốc tiêm tĩnh mạch ởgiai đoạn sớm nhồi máu cơ tim cấp được xác định hoặc nghi ngờ Nên uống metoprololtartrat cùng hoặc ngay sau bữa ăn Thức ăn có vẻ không ảnh hưởng đến khả dụng sinhhọc của viên metoprolol succinat giải phóng chậm Liều metoprolol tartrat cho hàngngày có thể là liều duy nhất hoặc chia thành liều nhỏ Metoprolol succinat viên giảiphóng chậm phải nuốt (không nhai) uống 1 lần trong ngày

Liều dùng:

Phụ thuộc theo đáp ứng của người bệnh Phải kiểm tra huyết áp vào thời gian cuối liều

để xem huyết áp có được duy trì tốt suốt ngày không

Tăng huyết áp: Liều bắt đầu thông thường là 50 - 100 mg mỗi ngày, uống một lần hoặcchia thành liều nhỏ, dùng một mình hoặc phối hợp với một thuốc lợi tiểu Có thể tăngliều cách một tuần (hay dài hơn) cho tới khi đạt giảm huyết áp tối ưu Thường liềudùng có tác dụng tối đa trong vòng 1 tuần Liều hiệu quả thường là 50 - 300 mg mỗingày Khi dùng thuốc mỗi ngày một lần mà có hiệu quả và có thể duy trì giảm huyết áptrong cả ngày, thì liều thấp hơn (đặc biệt 50 mg) không thể duy trì được tác dụng đầy

đủ vào cuối thời gian 24 giờ, và có thể cần dùng liều hàng ngày lớn hơn hoặc dùngnhiều lần hơn

Viên giải phóng chậm: Liều hàng ngày giống như trên nhưng uống 1 lần

Liều người cao tuổi: Người cao tuổi có thể tăng hoặc giảm nhạy cảm với tác dụng củaliều thông thường ở người lớn

Liều trẻ em: Chưa được xác định

1.1.2.7 Tác dụng không mong muốn

Phần lớn ở mức độ nhẹ và có tính nhất thời

Thường gặp, ADR > 1/100

Thần kinh trung ương: Mệt mỏi, chóng mặt, trầm cảm

Tim mạch: Nhịp tim chậm, thở nông, giảm huyết áp, giảm tuần hoàn ngoại biên (lạnhcác chi)

Da: Ngứa, ban, phản ứng quá mẫn

Dạ dày - ruột: Ợ nóng, ỉa chảy, khô miệng, đau bụng

Hô hấp: Thở khò khè, khó thở

1.1.2.8 Phương pháp định tính và định lượng metoprolol trong chế phẩm

Theo British Pharmacopoeia 2013 [17]

Định tính

Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại đối chiếu củametoprolol succinat chuẩn

Định lượng

Hòa tan 0,250 g trong 40 ml acid acetic khan Chuẩn độ với axit percloric 0,1 M,

xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế

1 ml dung dịch axit percloric 0,1M là tương đương với 32,64 mg C34H56N2O10

Thể tích tiêm mẫu: 20 µL và thời gian chạy mẫu là 5 phút

1.1.3 Phối hợp amlodipine và metoprolol

1.1.3.1 Tổng quan về phối hợp thuốc trong điều trị tăng huyết áp[4]

Theo các khuyến cáo trước đây, lựa chọn điều trị khởi đầu THA bao giờ cũng bằngphác đồ đơn trị liệu, nếu không đạt mục tiêu trị liệu mới chuyển sang phối hợp thuốc.Tuy nhiên gần đây, nhìn vào các thử nghiệm lâm sàng lớn về điều trị THA, người tanhận thấy rằng để đạt được mục tiêu điều trị, phần lớn bệnh nhân cần phối hợp thuốcđiều trị THA

Các thuốc điều trị THA có thể phối hợp với nhau trong điều trị nếu chúng thỏa mãn cácyêu cầu sau:

- Các thuốc này có cơ chế tác dụng khác nhau

- Đã có chứng cứ về việc phối hợp các thuốc này đem lại hiệu quả cao hơn so vớidùng đơn độc từng thuốc.

- Việc phối hợp này giúp bệnh nhân dung nạp thuốc tốt hơn, giảm thiểu tác dụngkhông mong muốn của từng thuốc

Các kiểu phối hợp thuốc theo hướng dẫn của Bộ Y tế 2010, dựa trên khuyến cáo củahội tim mạch học/hội THA châu Âu, được tóm tắt như sau:

1.1.3.2 Một số nghiên cứu về hiệu quả phối hợp thuốc amlodipine và metoprolol

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về phối hợp thuốc amlodipine và metoprolol

so với từng dạngriêng lẻ của nó

N=402

Đa trung tâm, ngẫunhiên, mở

Nhận bệnhHA: 140 - 180mmHg/90-114 mmHg

Bn chia 5 nhóm: amlo 25/2.5; 50/5; met

met-XL 50; met met-XL 25;

amlo 5, theo dõi 8 tuần

FDCs củametoprolol vàamlodipine hiệuquả và an toàn trênbệnh nhân THAnhẹ đến TB Các kiểu phối hợp thuốc trong điều trị THA

Hình 1.1 Các kiểu phối hợp thuốc trong điều trị THA

ở bệnh nhân Ấn ĐộTHA từ nhẹ đến TB

N=101

NC mở, marketing

post-Trong đó, 64 bn dùngmet-amlo 25/5 mg; 37

bn dùng met-amlo50/5; theo dõi 8 tuần

Giảm huyết áp tâmthu và tâm trươngđáng kể có ý nghĩathống kê ở tuần 4

và tuần 8

Sự kết hợp này là

an toàn, hiệu quả

và được dung nạptốt trên quần thểnghiên cứuPatel PB và

cộng sự - 2011

[24]

So sánh hiệu quả củaviệc kết hợp 2 viênđơn metoprolol 25

mg và amlodipine 2.5

mg so với từng thànhphần riêng lẻ ở bệnhnhân THA ở vùngGujarat

N=150Song song, ngẫu nhiên,

đa trung tâmNhận bệnh: HA 140-180/90-114

Chia 3 nhóm met-amlo25/5 mg; met 50 mg;

amlo 5 mg; theo dõi 12tuần

Phối hợpamlodipine 25mg

và metoprolol 5mghiệu quả hơn liềugấp đôi viên riêng

lẻ để đạt HA mụctiêu trên bệnhnhân THA nhẹ đếnTB

2, Tỷ lệ đáp ứng ở 2nhóm và khả năngdung nạp của thuốcnghiên cứu

N=148Song song, ngẫu nhiên,

đa trung tâmNhận bệnh: HA tâmtrương 90-109

76 bn dùng meto-amlo25/2.5

72 bn dùng losar-amlo25/2.5; sau 4 tuần tăngliều gấp đôi nếu khôngđáp ứng

Theo dõi 12 tuần

Liều cố định phốihợp met-amlo cóhiệu quả và dungnạp tốt như amlokết hợp losartantrong điều trị THA

1.1.3.3 Một vài chế phẩm kết hợp trên thị trường

Bảng 1.2 Một số chế phẩm kết hợp trên thị trường

1 Selomax 50/5mg Amlodipine Bensylate Astra Zeneca

Tablet 10s 5mg+ Metoprolol Succinate 50mg

2 Acord-M (5mg/

50mg)

Amlodipine Besylate5mg+ Metoprolol Succinate 50mg Invision

3 Amlovas-XM

(2.5mg/ 25mg)

Amlodipine Bensylate2.5mg+ Metoprolol Succinate 25mg

Macleods (ProcareAHT)

6 Amlogard Met

5/50 Tablet 10s

Amlodipine Bensylate5mg+ Metoprolol Succinate 50mg Pfizer

7 Metocard AM Tab

10s

Amlodipine Bensylate5mg+ Metoprolol Succinate 50mg Torrent Pharma

8 Supermet AM Amlodipine Bensylate

5mg+ Metoprolol Succinate 50mg Abbott India

9 Metolar-AM-50mg

Tab 10s

Amlodipine Bensylate5mg+ Metoprolol Succinate 50mg Cipla

1.1.3.4 Phương pháp định lượng đồng thời metoprolol succinat và amlodipine besylat trong huyết tương

Phương pháp sử dụng hydrochlorothiazide (HCTZ) là chất chuẩn nội Việc tách sắc kýđược thực hiện trên cột C18 với pha động methanol-nước chứa 0,5% axit formic (8:2,v/v); tốc độ dòng là 1 ml/min với thể tích tiêm mẫu là 25 µL và thời gian chạy mẫu là

3 phút Phương pháp được thẩm định ở nồng độ từ 1-100 ng/ml đối với metoprolol và

1-15 ng/ml đối với amlodipin trong huyết tương người MRM tại m/z 268.10-103.10,m/z 409.10-334.20 và m/z 296.00-205.10 đã được sử dụng để ghi phổ của metoprolol,amlodipine và hydroclothiazid.

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DƯỢC CHẤT TRONG HUYẾT TƯƠNG

1.1.4 Phương pháp tạo tủa protein

Protein thường chiếm một tỷ lệ rất lớn trong huyết tương, gây khó khăn trong quá trìnhphân tích, do đó để dễ dàng trong phân tích, người ta thường loại protein trong huyếttương bằng dung môi hữu cơ như acetonitrile, methanol, cồn isopropyl…hoặc có thểdùng các acid mạnh như acid tricloacetic, acid percloric,…

1.1.5 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Tùy vào bản chất của dược chất mà người ta chọn lựa dung môi chiết thích hợp, đa sốcác dung môi được lựa chọn phải dễ tìm, ít độc và chiết được tối đa dược chất Các loạidung môi thường được sử dụng: n-hexan, diethyl ether, isopropanol, chloroform,…pHcủa môi trường cũng cần phải được lưu ý để việc chiết xuất đạt hiệu quả mong muốn

1.1.6 Phương pháp chiết qua pha rắn

Đây là một phương pháp hữu hiệu cho việc chuẩn bị mẫu Phần lớn chiết qua pha rắnđược sử dụng ở giai đoạn xử lý mẫu ban đầu cho các phương pháp sắc ký như sắc kýlỏng hiệu năng cao, sắc ký khí…Việc chiết qua pha rắn làm cho mẫu được tinh khiếthơn, tăng độ nhạy của phương pháp phân tích sắc ký, bảo vệ cột vì loại bớt các thànhphần trong hỗn hợp

Mẫu phân tích được cho đi qua pha rắn, các phân tử chất cần phân tích được giữ lại vàđược phong phú hóa trên pha rắn, sau đó những thành phần này được rửa giải bằngnhững dung môi thích hợp

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DƯỢC CHẤT TRONG DỊCH SINH

HỌC

Cơ sở để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất trong dịch sinh họcdựa vào các chỉ tiêu về tính chọn lọc, đường cong chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn

định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, độ phục hồi (hiệu suất chiết), hiệu ứng nền và

độ ổn định của dươc chất trong sinh học [12, 20]

1.1.7 Tính chọn lọc

Tính chọn lọc của một phương pháp phân tích là khả năng cho phép xác định một cáchchính xác sự hiện diện của các thành phần trong mẫu phân tích Để xác định tính chọnlọc người ta tiến hành phân tích các mẫu trắng trên ít nhất 6 nguồn của dịch sinh họctương ứng (huyết tương, nước tiểu hoặc những loại dịch sinh học khác) Mỗi mẫu trắngđược kiểm tra về độ nhiễu và độ chọn lọc để xác định chắc chắn giới hạn định lượngdưới

Nếu định lượng đồng thời nhiều chất thì mỗi chất phân tích phải được kiểm tra để đảmbảo rằng không có sự tương tác lẫn nhau

1.1.8 Giới hạn định lượng dưới

Giới hạn định lượng dưới là lượng chất thử ít nhất trong mẫu mà phương pháp kiểmnghiệm có thể định lượng được, đồng thời đạt yêu cầu về độ đúng và độ chính xác:điểm thấp nhất của đường chuẩn sẽ được xem như giới hạn dưới của định lượng nếunhư đáp ứng của nó so với đáp ứng của mẫu trắng ít nhất bằng 5 lần (tỷ số S/N ≥ 5), và

có thể xác định với độ lặp lại trong khoảng ±20%, độ đúng từ 80-120%

1.1.9 Đường cong chuẩn và khoảng tuyến tính

Để xây dựng đường cong chuẩn các mẫu thử nên được chuẩn bị trên cùng một dịchsinh học như mẫu thử trong nghiên cứu bằng cách cho chất đối chiếu đã biết trướcnồng độ vào dịch sinh học Nồng độ của chất đối chiếu dùng xây dựng đường chuẩnphải dựa vào phạm vi định lượng được dư đoán trong nghiên cứu thực tế

Đường chuẩn bao gồm từ 6-8 điểm trừ điểm 0 nằm trong phạm vi cần định lượng có cảgiới hạn định lượng dưới, với yêu cầu độ lệch không vượt quá 20% tại giới hạn đinhlượng dưới và không quá 15% ở các nồng độ khác

1.1.10 Độ phục hồi

Độ phục hồi của một chất phân tích trong định lượng là đáp ứng ghi nhận được từ mộtlượng chất phân tích thêm vào và chiết ra từ dịch sinh học, được so sánh với đáp ứng từnồng độ thực của chất phân tích Độ phục hồi là hiệu suất chiết của phương pháp phântích trong một giới hạn nhất định Độ phục hồi của chất chiết được không nhất thiếtphải là 100% nhưng phải ổn định, chính xác và lặp lại Độ phục hồi thực nghiệm đượcxác định tại 3 nồng độ cao, trung bình và thấp

1.1.11 Độ chính xác

Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ sát gần giữa các kết quả thửnghiệm riêng lẻ đo được của một chất phân tích khi phương pháp được áp dụng có tínhlặp lại với nhiều mẫu dịch sinh học có cùng thể tích Độ chính xác được thực hiện ítnhất tại 3 nồng độ trong phạm vi định lượng và với mỗi nồng độ tiến hành ít nhất trên 5mẫu thử khác nhau Độ chính xác ở mỗi mức nồng độ có RSD không được vượt quá15%, riêng tại LLOQ thì không được vượt quá 20% Độ chính xác bao gồm độ lặp lạigiữa các lần thử nghiệm, độ chính xác trung gian giữa các ngày thử nghiệm khác nhauhoặc người phân tích hoặc thiết bị dụng cụ khác nhau và độ sao chép lại giữa cácphòng thí nghiệm khác nhau

1.1.12 Độ đúng

Độ đúng của một phương pháp là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trịthực (về nồng độ) của chất phân tích Độ đúng được xác định bằng cách lặp lại quátrình phân tích mẫu đã biết hàm lượng chất phân tích Độ đúng được xác định bằngcách thực hiện ít nhất trên 5 mẫu cho mỗi nồng độ Và tối thiểu nồng độ trong khoảngnồng độ dự định đo sau này Giá trị trung bình của phần trăm độ lệch nằm trongkhoảng ±15% so với giá trị thực, riêng tại LLOQ cho phép ±20% Độ lệch của giá trịthực so với giá trị trung bình dùng để đánh giá độ đúng

1.1.13 Độ nhiễm chéo

Độ nhiễm chéo nên được giải quyết và giảm thiểu trong suốt quá trình phân tích Trongsuốt quá trình thẩm định độ nhiễm chéo nên được đánh giá bằng cách tiêm các mẫutrắng sau khi tiêm mẫu nồng độ cao hoặc dung dịch chuẩn ở ULOQ Nhiễm chéo củamẫu trắng sau khi tiêm mẫu chuẩn nồng độ cao không nên quá 20% của LLOQ và 5%cho IS

1.1.14 Hiệu ứng nền

Hiệu ứng nền được đánh giá khi sử dụng phương pháp MS, sử dụng ít nhất 6 lô huyếttương khác nhau

Với mỗi chất phân tích và chất chuẩn nội, yếu tố nền nên được tính toán cho mỗi một

lô, bằng cách tính tỷ số diện tích peak với sự có mặt của yếu tố nền (đo bằng việc phântích mẫu nền trắng được thêm chuẩn sau khi đã được xử lý) so với diện tích peak khikhông có sự hiện diện của yếu tố nền (dung dịch tinh khiết của chất phân tích)

Độ ảnh hưởng của nền mẫu được thực hiện trên ít nhất 6 lô tại 2 nồng độ cao và thấp(tối đa gấp 3 lần LLOQ và gần ULOQ) Giá trị trung bình của phần trăm độ lệch nằmtrong khoảng ±15% so với giá trị thực

sau mỗi lần xác định được so sánh với giá trị trung bình của nồng độ tương ứng ở ngàybắt đầu thử nghiệm độ ổn định dài hạn

1.1.15.3 Độ ổn định đông và rã đông

Độ ổn đinh của chất phân tích được xác định sau 3 chu kỳ làm lạnh và rã đông Thựchiện ở ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ cao và thấp được làm lạnh ở nhiệt độ bảo quản dựkiến trong 24h và rã đông ở nhiệt độ phòng, khi rã đông hoàn toàn các mẫu được làmlạnh trở lại trong vòng 12 – 24h giống lần đầu, sau 3 chu kỳ như thế mẫu được đem điphân tích Nếu mẫu phân tích không ổn định ở nhiệt độ dự kiến thì phải làm lạnh ởnhiệt độ -700C

SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

1.1.16 Sinh khả dụng

Sinh khả dụng là đặc tính của dạng thuốc chỉ tốc độ và mức độ hay tỷ lệ của thànhphần có hoạt tính, gốc hoạt tính hay chất chuyển hóa có hoạt tính được hấp thu vàotuần hoàn chung và sẵn sàng ở nơi tác động [5]

Để đánh giá sinh khả dụng của thuốc thường căn cứ vào các thông số dược động sau:

- AUC: diện tích dưới đường cong của đồ thị biểu diễn sự biến thiên của nồng độthuốc trong máu theo thời gian, là số lượng toàn thể thuốc được hấp thu vào tuầnhoàn chung AUC thay đổi khi số lượng dược chất được hấp thu thay đổi

- Tmax: thời gian thuốc đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương

- Cmax: nồng độ đỉnh trong huyết tương

- T1/2: thời gian bán thải – thời gian cần thiết để một nửa lượng thuốc thải ra khỏituần hoàn

T1/2 =

- Ke: hằng số vận tốc thải trừ (là độ dốc của đường thẳng biểu diễn logarit nồng độthuốc theo thời gian)

Sinh khả dụng của một dạng thuốc có thể được xác định bằng phương pháp trực tiếphoặc gián tiếp.

Sự lựa chọn phương pháp tùy thuộc vào mục tiêu nghiên cứu, khả năng phân tích thuốctrong dịch sinh học, đặc tính dược lực của thuốc, đường sử dụng và bản chất dạngthuốc,…

Có thể dùng các thông số dược động học, dược lực học, các quan sát lâm sàng kể cảcác thử nghiệm in vitro để xác định sinh khả dụng của thuốc theo các phương pháp sau:

- Phương pháp đo nồng độ thuốc trong huyết tương (là phương pháp thông dụngnhất cho phép xác định trực tiếp các đại lượng biểu thị sinh khả dụng)

- Phương pháp đo lượng thuốc bài tiết trong nước tiểu (hoặc trong các dịch bàitiết khác)

- Phương pháp đo phản ứng dược lực cấp

- Phương pháp quan sát lâm sàng

- Phương pháp đo sự phóng thích thuốc invitro.

1.1.17 Tương đương sinh học

1.1.17.1 Khái niệm tương đương sinh học

Là các chế phẩm tương đương dược học hoặc thay thế dược học có SKD giống nhau,như vậy là hai chế phẩm có Tmax, Cmax, AUC không khác nhau có ý nghĩa thống kê(mức khác biệt được chấp nhận không quá 20%)

Chế phẩm tương đương sinh học hoặc có thể được xem là có hiệu quả trị liệu tươngđương

Trường hợp mức độ hấp thu (AUC, Cmax) không khác nhau, sự khác nhau về tốc độ hấpthu (Tmax) do cố ý, được ghi trong nhãn, không quan trọng với việc đạt nồng độ trị liệutrong cơ thể trường hợp bệnh mạn tính và được xem không có ý nghĩa lâm sàng, vẫnđược chấp nhận tương đương sinh học

1.1.17.2 Nghiên cứu tương đương sinh học[5, 10, 11, 21]

a Các loại nghiên cứu TĐSH

Nghiên cứu đơn liều, tình trạng đói

So sánh tốc độ và mức độ hấp thu của dạng thử và dạng đối chiếu khi dùng một liềuduy nhất trong tình trạng đói Liều dùng duy nhất có thể tương ứng với một đơn vị củadạng có hàm lượng cao nhất hoặc nhiều đơn vị với lượng thuốc không quá liều mộtngày áp dụng trong trường hợp 1 đơn vị cho nồng độ quá thấp không thể định lượngđược trong dịch sinh học

Phải không ăn trong ít nhất 10h, dùng thuốc với 240 ml nước, 4h sau được ăn sáng vớisuất ăn tiêu chuẩn

Loại nghiên cứu này được xem là nhạy nhất nhằm đánh giá và so sánh tính chất phóngthích, hấp thu của hai dược phẩm

Áp dụng cho trường hợp thực phẩm có ảnh hưởng đến phóng thích và hấp thu dượcchất từ dạng thuốc thông thường

Bắt buộc phải thử khi xác định SKD/TĐSH của dạng thuốc uống PTKD

Nghiên cứu đa liều ở trạng thái ổn định

Nhằm xác định SKD/TĐSH sau khi dùng thuốc nhiều lần và đạt trạng thái ổn định.Được khuyến cáo áp dụng khi xác định SKD/TĐSH trong những trường hợp như:

Có sự khác nhau về tốc độ nhưng không khác nhau về mức độ hấp thu

Có sự biến thiên quá lớn về sinh khả dụng giữa các đối tượng

Nồng độ thuốc quá nhỏ không thể định lượng chính xác nếu dùng đơn liều

Xác định SKD/TĐSH của các dạng PTKD.

b Các mô hình thiết kế trong thử nghiệm xác định SKD/TĐSH

Các mô hình thiết kế thông dụng là thiết kế chéo và thiết kế song song Mỗi kiểu thiết

kế có ưu và nhược điểm riêng, được ưu tiên lựa chọn trong những tình huống khácnhau Sự lựa chọn tùy thuộc vào nhiều yếu tố:

- Số công thức cần so sánh

- Đặc tính về phân bố của dược chất

- Mục tiêu nghiên cứu

- Sự biến thiên giữa cá thể và trong cùng cá thể

- Sự kéo dài thời gian nghiên cứu và số thời kỳ cho phép

- Chi phí khi thêm đối tượng so với chi phí khi thêm thời kỳ

- Tỷ lệ bỏ cuộc…

Mô hình thiết kế chéo (crossover design)

Là cách thiết kế chia thành nhóm ngẫu nhiên có một hoặc nhiều đối tượng Mỗi thuốc

sẽ nhận nhiều hơn một loại thuốc ở từng thời kỳ khác nhau

Đối tượng trong mỗi nhóm nhận một trình tự thuốc liên tiếp giống nhau

Một thiết kế chéo được xem là hoàn toàn nếu mỗi trình tự có một loại thuốc

Nghiên cứu chéo có mô hình kiểu s x p trong đó s là số trình tự của công thức đượcdùng ở p thời kỳ khác nhau

Mô hình thiết kế song song (parallel design)

Là kiểu thiết kế trong đó mỗi đối tượng nhận một và chỉ một loại thuốc một cách ngẫunhiên Thiết kế song song đơn giản nhất là thiết kế hai nhóm so sánh hai công thức,mỗi nhóm có số đối tượng giống nhau hoặc ba nhóm khi cần nhóm chứng trắng

Khi nghiên cứu lâm sàng pha II, pha III hoặc xác định sinh khả dụng, tương đươngsinh học bằng phương pháp dược lực hoặc phương pháp so sánh lâm sàng, thiết kếsong song thường được dùng

Nhóm (chia ngẫu nhiên) Xử lý

Tóm lại, nghiên cứu nên được thiết kế sao cho có thể phân biệt được ảnh hưởng củacông thức thuốc với các ảnh hưởng khác Nếu cần so sánh 2 chế phẩm, thiết kế chéo, 2trình tự, 2 giai đoạn được xem là lựa chọn tốt nhất

Giai đoạn rửa giải (thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn - washout)

Thời gian giữa 2 thời kỳ dùng thuốc phải đủ dài để liều đã dùng ở thời kỳ trước đượcthải loại hết trước khi dùng liều sau (thời gian đủ để thải loại hết) Trong các nghiêncứu ở trạng thái ổn định, thời gian thải loại của liều cuối cùng dùng trước đó có thểchồng lên quá trình tích lũy (build – up) của liều thứ 2, miễn là thời kỳ tích lũy đủ dài(ít nhất là dài gấp 3 lần thời gian bán thải)

Lấy mẫu

Thời điểm và khoảng thời gian lấy mẫu phải được lập sao cho có thể ước lượng được

Cmax và bao phủ đường cong nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian đủ để cóthể ước lượng chính xác mức độ hấp thu Nói chung, điều này có thể đạt được nếu giátrị AUC tính từ các số liệu đo được ít nhất bằng 80% của giá trị AUC ngoại suy tới vôcùng Nếu cần phải ước tính chính xác thời gian bán thải, cần lấy ít nhất 3 - 4 mẫutrong đoạn logarit tuyến tính của pha thải trừ

Với hầu hết các thuốc, chỉ 12-18 mẫu là đủ, ví dụ 1 điểm lúc thời gian bằng 0, 2 điểmtrước Cmax, 4-5 điểm xung quanh Cmax, và 7-8 điểm trong pha thải trừ Tuy nhiên, khi

thời gian bán thải của thuốc nguyên thủy hoặc hoạt chất quá dài, nên lấy mẫu máutrong ít nhất 72 giờ.

Để nghiên cứu sinh khả dụng ở trạng thái ổn định khi biết có sự khác nhau giữa cácliều buổi sáng và tối hoặc đêm, (có nghĩa là nếu biết được nhịp thời gian trong ngày cóảnh hưởng tới sinh khả dụng), nên lấy mẫu theo chu kỳ trọn 24 giờ

Với các thuốc có thời gian bán thải dài, có thể ước tính sinh khả dụng tương đối bằngcách sử dụng một phần AUC khi khoảng thời gian lấy mẫu được thuyết minh hợp lý.Trong trường hợp này thời gian lấy mẫu nên đủ để đảm bảo so sánh quá trình hấp thu

Người tình nguyện

Số người tình nguyện yêu cầu được xác định dựa vào:

a) biến thiên do sai số liên quan tới các tính chất cơ bản được ước tính từ thínghiệm thăm dò (pilot), từ các nghiên cứu trước hoặc các tài liệu đã côngbố,

b) Mức ý nghĩa thống kê mong muốn,c) Độ lệch mong muốn so với thuốc đối chứng phù hợp với tương đươngsinh học (delta, tức là phần trăm sai khác so với 100%) và

d) Hiệu lực thống kê yêu cầu

Các tiêu chuẩn lâm sàng và phân tích được áp dụng cũng có thể ảnh hưởng tới số ngườitình nguyện được xác định bằng thống kê Tuy nhiên, nói chung số lượng tối thiểungười tình nguyện không nên nhỏ hơn 12, trừ khi được thuyết minh hợp lý

Tiêu chuẩn tuyển chọn:

- Người tình nguyện nam khỏe mạnh, tuổi từ 18-45, chỉ số BMI từ 18-27 kg/m2;cân nặng ít nhất 50 kg

- Huyết áp tâm thu trong khoảng từ 100 mmHg đến dưới 140 mmHg và tâmtrương trong khoảng từ 60 mmHg đến dưới 90 mmHg

- Nhịp tim đều, tần số trong khoảng từ 60 lần đến 90 lần/phút

- Không nghiện rượu, không nghiện thuốc lá, không sử dụng các chất gây nghiện

- Không có tiền sử bệnh và tại thời điểm nghiên cứu không mắc các bệnh caohuyết áp, hạ huyết áp thế đứng, hạ đường huyết khi đói, khó nuốt, tiểu đường,bệnh về hô hấp, tiêu hóa, nhiễm trùng, di truyền; không bị suy giảm chức nănggan và thận, nột tiết, hệ thần kinh hoặc bệnh tâm thần, miễn dịch, huyết học,bệnh di truyền, bệnh lao

- Không đang mắc các bệnh nhiễm trùng

- Xét nghiệm HIV/AIDS, HBsAg và anti HCV âm tính

- Không có tiền sử dị ứng với thuốc đang nghiên cứu hoặc các thuốc tương tự

- Theo ý kiến của bs lâm sang, kết luận đủ sức khỏe dựa trên dấu hiệu sinh tồn,tiền sử bệnh và kết quả xét nghiệm

Tiêu chuẩn loại trừ:

- Kết quả khám, xét nghiệm không đạt trong giới hạn bình thường đáng kể

- Bị bệnh nặng 08 tuần trước khi tham gia uống thuốc nghiên cứu

- Mới tình nguyện hiến máu hoặc mới tham gia các đề tài thử thuốc trong vòng 2tháng trước khi uống thuốc nghiên cứu

- Không tự nguyện tham gia nghiên cứu

- Không tuân theo nội dung quy định cho người tình nguyện

Tiêu chuẩn hóa nghiên cứu

Điều kiện thử nghiệm nên được tiêu chuẩn hóa để giảm tối thiểu sự khác biệt do tất cảyếu tố liên quan trừ các yếu tố về thuộc về mẫu thuốc thử nghiệm Vì thế, chế độ ăn, đồuống và hoạt động thể lực cần được tiêu chuẩn hóa Người tình nguyện phải nhịn đói ítnhất trong đêm trước khi dùng thuốc Nếu có các khuyến cáo đặc biệt liên quan sửdụng thực phẩm hoặc tương tác với thực phẩm thì nghiên cứu phải được thiết kế mộtcách phù hợp

Thời gian ăn trong ngày nên được xác định rõ và thể tích của nước uống nên hằng định(ít nhất 150ml), vì lượng nước uống sẽ ảnh hưởng nhiều tới việc vận chuyển dạng