Nghiên cứu vị trí đa hình đơn nucleotide ( rs221634 a t, rs17065417 a c) của gen lin28b trên mẫu u nguyên bào thần kinh bằng kỹ thuật phân tích nhi nóng chả phân giải cao

Phân lập DNA bộ gen từ máu toàn phần .... Kết quả kiểm tra biểu hiện LIN28B trên UNBTK .... Biểu hiện mRNA LIN28B trong các mẫu mô NB .... Cá nhân tham gia thực hi n nhi m vụ: Người tham

B 


Ọ Ƣ

NGHIÊN CỨU VỊ Ì Ơ U LE E rs221634 A>T, rs17065417 A>C) CỦA GEN LIN28B TRÊN MẪU U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH

NHI NÓNG CHẢ PHÂN GIẢI CAO

s 


ủ t e 1 sĩ Bùi Chí Bảo

.

NHI NÓNG CHẢ PHÂN GIẢI CAO

L

N S N NG T ÀN VI N T M GI NG I N U i

M L ii

N M VI T TẮT iii

DANH M C HÌNH iv

DANH MUC BẢNG v

BÁO CÁO THỐNG KÊ vi

h g I GIỚI THIỆU 1

h g II P ƯƠNG P P 4

1 Nguồn mẫu 4

2 Thiết kế th nghiệm 4

3 L a ch n và kiểu gen SNP 4

4 Thiết kế mồi 4

5 Phân lập RNA và chuyển cDNA từ huyền phù tế bào và khối u rắn UNBTK 6

6 Q-RT PCR và biểu hiện mRNA c a LIN28B 7

7 Phân lập DNA bộ gen từ máu toàn phần 8

8 h gi ị h l g ị h l ng DNA chiết xuất 8

9 Trình t Sanger 8

10 Multiplex PCR 9

11 Phân tích thống kê 10

h g III K T QUẢ 11

1 Kết quả kiểm tra biểu hiện LIN28B trên UNBTK 11

2 Kiể ịnh kết quả kiểu gen qua giải trình t Sanger 13

h g IV THẢO LUẬN – K T LUẬN 16

1 Biểu th c mRNA LIN28B trong các dòng tế bào NB 16

2 Biểu hiện mRNA LIN28B trong các mẫu mô NB 17

3 Phân tích SnaPshot 18

h g V K T LUẬN 20

T i liệ h hả 21

.

Ắ

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

SNP: Single nucleotide polymorphism

NB: Neuroblastoma

UNBTK: U nguyên bào thần kinh

LIN28B: Lin-28 Homolog B

GWAS: Genome-wide association study

OR: odds ratios

I: fi e e i e ls

.

ng cho rs221634 LIN28B 14Hình 4 Phân tích GeneMarker cho hai phản ng mở rộng mồi Phản ng iện di mao

m h c th c hiện bởi Nhà phân tích di truyền 3500 XL (Hệ sinh h c ng d ng) (A)Kiểm soát tích c c bao gồm các bộ khuế h i từ DNA CEPH; (B) Kiểm soát tiêu c c;(C) mẫu C2; (D) mẫu C3; (E) mẫu NB 157 và (F) mẫu NB159 Các thuốc nhuộm huỳnh

g c gán cho các ddNTP riêng lẻ h s : [ ] G ee , [ ] Bl , [G] Bl e [T]Red 15

.

DANH MUC BẢNG

Bảng 1 Thông tin di truyền c SNPs c ch n 4

Bảng 2 Mồi s d ng 5

Bả g 3 T g biểu hiện LIN28B với các chỉ số lâm sàng UNBTK 11

.

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NG Ĩ VIỆT NAM

ộc lập - T do - H nh phúc

y t 2

BÁO CÁO THỐNG KÊ

K T QUẢ THỰC HI TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

I THÔNG TIN CHUNG

1 tài:

NGHIÊN C U VỊ TRÍ ÌN ƠN NU LEOTI E ( s221634 >T, s17065417A>C) CỦA GEN LIN28B TRÊN MẪU U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸTHUẬT PHÂN TÍCH NHIỆT Ộ NÓNG CHẢY Ộ PHÂN GIẢI CAO

2 ủ vụ:

H và tên: BÙI CHÍ BẢO

Ng y, h g, ă si h: Nam/ Nữ: Nam

H c hàm, h c vị: Tiế sĩ

Ch c danh khoa h c: Không Ch c v : Nghiên c u viên

iện tho i: Tổ ch c: (+84-28) 3855 8411 Nhà riêng: Không

Tên tổ ch c ch trì nhiệm v : i h Y c Thành phố Hồ Chí Minh

iện tho i: (+84-28) 3855 8411 Fax: (+84-28) 3855 2304

E-mail: daihocyduoc@ump.edu.vn

1 T Kh h ặ T g , ị - i ả lý iếp h l h hiệ ề i

.

Thời gian

(Th g, ă )

Kinh phí(T )

Thời gian(Tháng, ă )

Kinh phí(T )

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

- Lý h y ổi (nếu có):

4 Cá nhân tham gia thực hi n nhi m vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Bùi Chí Bảo Bùi Chí Bảo Ch nhiệ ề

tài2

.

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

7 Tóm tắt các nội dung, công vi c chủ yếu:

(Nêu tại mục của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo kế Th c tế t

.

1 Thu nhận mẫu mô từ bệnh nhân 4-5 /2018 4-5 /2018

2 Thiết kế mồi chuyên biệt cho vị

6 Chuẩn hóa quy trình phân tích

nhiệt ộ nóng chảy ộ phân giải

ể kiểm tra vị trí SNPrs221634 và rs17065417

III SẢN PHẨM KH&CN CỦ TÀI

1 Sản phẩ & tạo ra:

Thực tế đạt được

1

2

.

(Tạp chí, nhà xuất bản)

Theo

kế ho ch

Th c tế

c1

kế ho ch

Th c tế

c1

Kết quả

sơ bộ

1

2

2 v hi u quả do tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa h c và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

3 Tình hình thực hi n chế ộ báo cáo, kiểm tra của tài:

.

ƣơ GIỚI THI U

U nguyên bào thần kinh là một bệ h g h phổ biến gây t vong ở trẻ em, chiếmkhoảng 10% số ca t g g h Nó ó g ồn gốc từ hệ thần kinh giao cả gphát triển [1] Vị trí phổ biến nhất c a u nguyên bào thần kinh có nguồn gốc (t c là, khối

u chính) nằm ở tuyế h ng thậ iều này xảy ra ở 40% khối u c c bộ và trong 60%ờng h p bệnh phổ biến U nguyên bào thầ i h ũ g ó hể phát triển bất c i

d c theo chuỗi hệ thần kinh giao cảm từ cổ ế x g hậu Tần suất ở ị iểmkhác nhau bao gồm: cổ (1%), ng c (19%), b g (30% h g h ng thận), hoặ x gchậu (1%) Trong một số í ờng h p, không thể phát hiện thấy khối s ấp nào Ủyban hệ thố g ph n tế bào thần kinh (INSS) và hệ thố g ph hó g y ế bàothần kinh quốc tế (INRGSS) là hệ thống phân tầ g g g h guyên bào thần kinh[2] Theo INRGSS, chỉ cần có hệ thống phân lo i tiền x lý ớc s hiện diện hoặc vắngmặt c a các yếu tố r i x ịnh bằng hình ảnh (IDRF) Nói chung, trẻ e cchẩ ắc bệ h g h g y b hầ i h ó g y kiến sẽ iềutrị bằng thuố ộc tế b ph g h c chuyên sâu và gầ y, iều trị miễn dịch tiêntiến[3] Tuy nhiên, tỷ lệ sống hiện t i vẫ ới 50%, h ấu s cần thiết c a các liệupháp hiệu quả h

Các nỗ l c nghiên c u hiệp hội toàn bộ ge (GW S) ã l ổi bật các liên kết ditruyề g ể góp phần vào tính nh y cảm trong nhóm thuần tập NeuroblastomaConsortium D sở dữ liệu GWAS hiện t i, s hình thành và hình thành NB cóthể bị ả h h ởng bởi le h h h ă g ác gen liên quan Thú vị h , ínhấ ời hai hiệp hội di truyề ã x ịnh và xác nhận Nhiề ge c thiết lậpnày có ả h h ở g g y g h h ặc ch ă g c chế khối u Một số gen nh y cảm NB

h LMO1, E1, LIN28B, S 15 / S 14, B R 1 góp phần gây bệ h g ycao và một số yếu tố g y hấp h USP12, X4, IL31R , S 17B12 ã c

th c hiện và chỉ g sở dữ liệu GWAS [1] S mở rộng từ nghiên c u tiề ề

c minh h a bởi He và cộng s [4] c th c hiện với í h h ớc mẫ g ối nhỏ

h 256 ờng h p NB và 531 kiểm soát trẻ em miền Nam Trung Quốc Bốn khả ă g

.

bệ h g h ở g ời[5] ặc biệt, LIN28B, kết h p với NANOG, OCT4 và SOX2, duytrì tr ng th i g y a các tế bào gốc phôi và thậm chí giúp tái lập trình các tế bàokhác biệt thành các tế b ă g i i [6] Ng i , LIN28B ả h h ở g ến tính

nh y cảm c a tế bào thần kinh và s biểu hiện bệnh thông qua khả ă g g ấp tín hiệugây g h g y g h ph c t p cho s can thiệp iều trị g g l i Một cách

ch n l , h p ei LIN28B h l ột chất c chế ớc bằ g h gă hặn quátrình từ các tiền chất let-7 thành các miRNA let-7 ởng thành ch a nhiề ờngkhác h Gi h le -7 ó g ột vai trò trong chế biến c chế khối u thông qua s imlặng c a các chấ g y g h hí h ( h R S, MY , Ks) ặ g bởi siều hòa c ó g g h [7] Biểu hiện thấp c a let-7 gi h hấn m nh tỷ

lệ số g só g h y h h ớng c a u nguyên bào thần kinh S khuế h i gen MYCN,thuộc h MY , c tìm thấy trong khoả g 25% ờng h p g hặt chẽvới các bệ h ó g y ũ g h hệ thống khám lâm sàng kém MYCN khuế h ichung là viết tắt phổ biến nhấ c s d g g g y e bl s Ge y cbiế ế h l ột yếu tố phi ã iều chỉnh s ă g si h ế bào, chu kỳ tế bào và quátrình apoptosis Hiệ y, l ý, ge LIN28B ã x ị h ũ g ã x ịnh là

có ả h h ở g ến biểu hiện RAN oncogene trong m ng tín hiệu LIN28B-RAN-AURKA[8] RAN, một thành viên c gi h R s GTP ses hỏ, nổi tiếng với vai trò c a nótrong buôn bán h h , c biểu hiện quá m c trong các khối u ác tính khác nhau, và

hú ẩy AURKA (Aurora kinase A) phosphoryl hóa RAN là một thành phần h l aLIN28B ng ý biểu th LIN28B l ă g R N RN p ei ó hể dẫ ếngiảm tỷ lệ sống tổng thể Các nỗ l c c a GWAS (nghiên c u liên kết toàn bộ hệ ge ) ã

.

nêu bật các SNPs di truyề g ể góp phần vào tính nh y cảm c a NB GWAS bởiDiskin et al (2012) và mở rộng GWAS bởi e e l (2016) ã hỉ ra hai nhận xét về genLIN28B (rs17065417 A> C và rs221634 A> T)

Trong nghiên c y, SNP y c d kiến sẽ c kiểm tra trên một thuầntập g ời Việt Nam s d g ph g ph p ó g hảy ộ phân giải cao (HRM) và phântích thố g ể x ịnh các biến thể phổ biến có liên quan với g h g y b hần

i h g y S ó, ết quả s ó c so sánh với các mẫu chuẩ ( x ịnhkiể ge ) ể xác nhậ x ị h ph g ph p ó g hảy ó ộ phân giải ũ g hmối g g y hế phát âm c a gen LIN28B

.

ƣơ ƢƠ

Trong nghiên c u này, chúng tôi nhằm m í h ối hó xé ghiệm hie

nóng chảy ể x ịnh các biến thể g ge LIN28B s ó ph í h hống kê mốiliên quan với u nguyên bào thần kinh và các thông số lâm sàng ở trẻ em Việt Nam

Trong nghiên c y, hú g i ã h n 25 mẫu máu từ trẻ em dân tộc Việt Nam

h g li ến di truyền với u nguyên bào thần kinh nguyên phát mới c chẩn

án ch yếu từ ă 2015 ến 2017 t i Bệnh việ Nhi ồng 2, Thành phố Hồ Chí Minh

ữ , hú g i ũ g yển d ng 25 tình nguyện viên không bị g h g ờiViệ N T y hi , ộ tuổi c a các mẫ ối ch ng hầ h h g ể phù h pvới các mẫu NB do s chấp thuận thu thập máu từ trẻ em Tất cả các mẫ ltrữ ở -20⁰C Rõ ràng, nhữ g g ời h gi iền vào s ồng ý tham gia nghiên c u

3 Lựa chọn và kiểu gen SNP

SNP li ế NB c xuất bản trong một bài báo (He et al., 2016)rs221634 A> T

Bảng 1 Thông tin di truy n của s ƣợc chọn

Name Symbol

GenBankaccessionnumber

dbSNP Location Position Variation

4 Thiết kế m i

Trong nghiên c u này, cặp mồi b ầ c thiết kế trên CLC Main Workbench(Qiagen Bioinformatics) Các tiêu chí chính trong quá trình l a ch n mồi l : ầu tiên,chiều dài tổng thể c a mỗi mồi nên từ 20 ến 24 bp; th hai, GC% phải là 50% và trong

.

ờng h p S ge Se e es, í h h ớc khuế h i phải nằm trong khoảng từ 300 ến

700 bp, y l í h h ớc phù h p ể ph í h S ge h h g ể ó c kết quảchấ l ng cao, thiết kế mồi c hú g i c coi là chiều dài mồi, chênh lệ h ộ dài

c a cặp mồi, chiều dài sản phẩm PCR, tỷ lệ GC, nhiệ ộ nóng chảy (Tm), kẹp GC, hìnhthành mờ (bao gồm cả mờ và t mờ), cấu trúc kẹp ó í h ặc hiệu c a phần mềmPrimer BLAST, Primer3Plus và OligoAnalyzer 3.1

Bảng 2 M i sử dụng

r ers 5’  3’

System dbSNP Forward Reverse Amplic

on size(bp)

Conc.(μM)

Sanger

Sequencing

rs17065417

CTCCATGATAA

ACCGAGAGG

ACCCATTCACC

AGATACAGG

rs221634

CTCAGGTTGGTTCTCGTTAG

ATACACGTCTC

CTCCATGATAA

ACCGAGAGG

ACCCATTCACCA

GATACAGG

rs221634

CTCAGGTTGGTTCTCGTTAG

ATACACGTCTCC

PCRmix(μM)

AGGGAAGArs2216

34

ACCCCAAAATA

PCRmix(μM)

lin-28 homolog

B

LIN28B

GCCCCTTGGATATTCCAGTC

AATGTGAATTCCACTGGTTCTCCT

ầu tiên, chiều dài tổng thể c a mỗi mồi nên từ 20 ến 24 bp; th hai, GC% phải là 50%

g ờng h p S ge Se e es, í h h ớc khuế h i phải nằm trong khoảng từ

300 ế 700 bp, y l í h h ớc phù h p ể phân tích Sanger thành công D a trên cáctiêu chí này, cả ộ ặc hiệ ộ nh y c a thiết kế mồi ều cao về mặt lý thuyết Mỗicặp mồi h gi bằng phần mề BL ST, L , P i e 3Pl s I T ể ch n nhiệt

ộ phù h p về mặt lý thuyết cho từng cặp mồi

Việc tối hó bắ ầu từ nhiệ ộ b ầ ề xuất bởi phần mềm CLC cho PCRiểm cuối và phần mềm IDT cho PCR thời gian th ể h gi h ộ nh y ộ

ặc hiệu c ầu dò mở rộng trong thí nghiệm th ba, một PCR lồ g h c thiết

kế ể khuế h i một khuế h i bổ s g ể ảm bảo mỗi ầu dò ho ộng trong PCRghép kênh sau

5 Phân lập RNA và chuyển cDNA từ huy n phù tế bào và kh i u rắn

UNBTK

.

RN c chiết xuất từ các tế bào huyền phù và các khối u rắn thông qua RNeasy

Mi i Ki (Qi ge ) Q h y c tuân th nghiêm ngặt theo giao th c c a nhà sảnxuất Qiagen

Các sản phẩm cDNA từ các mẫu RNA mô và tế b ớ ó ã c tổng h pthông qua bộ PrimerScript TM Chuỗi 1 cDNA Tổng h p c T Q y h ccung cấp bởi Takara Co., Nhật Bản

6 Q-RT PCR và biểu hi n mRNA của LIN28B

i b ớc RT- P R ã c th c hiện thông qua hệ thống PCR thời gian th cMastercycler ep Realplex (Eppendorf) Mỗi phản g P R c th c hiện trong tổng thể

í h 20 μL h 10 μL hỗn h p 1X SYBR Green PCR Master (Hệ thống sinh h c ng

d ng), mồi 5 0 μM (I T, I ) ẫ N ph l ã g 30X ối với thí nghiệm c thể

y, B2M ặt làm kiểm soát nội bộ, mô Dorsal Root Ganglion từ g ời bình

h ờ g c coi là kiể s g í h iểm soát tiêu c c không có mẫ iều kiện

p xe bao gồ b ớc biến tính ở 95 g 1 phú , s ó l 40 h ỳ tiếp theo 95oC

g 15 gi y 52 ( ối với B2M) hoặ 62 ( ối với LIN28B) ể h gi ỹ

l ỡng hiệu quả c a các phản ng RT-qPCR, một chu trình nhiệ ờng cong nóng chảy

ã c áp d g ể phát hiện bất kỳ mồi nào hoặc khuế h i h g ặc hiệu, và các sảnphẩ P R c phân tích thêm bằ g iện di trên gel agarose 2%

P R iểm cuối b h h ờ g c th c hiện trong phản g 15 μL ới Bộ ệm10X, 3,75 eachM mỗi dNTP, Khởi ộng nóng 0,5 U Takara Taq Polymerase (Takara,Nhật Bản), mồi 7,5 μM (I T, I ), ầu vào 75-100 g N ớ ù g T ớc cácphản ng PCR, mỗi mẫ c pha loãng xấp xỉ ến nồ g ộ ó li s ó c

ị h l ng bằng Máy quang phổ kế NanoDrop Không giố g h P R hời gian th c,các kết quả c phân tích bằng công c bán ị h l ng - I geJ, ó, ần có một dải

rõ ràng, riêng biệt cho mỗi mẫ iệ i gel iểm mấu chốt trong thí nghiệm này là

y iều kiện nhất quán trong suốt 40 mẫ , ặc biệt là giữa hai gen c a một mẫuhoặc nói cách khác, các yếu tố gây nhiễu và các biến bị giảm càng nhiều càng tốt Ví d ,

40 mẫ ã c th nghiệm trên hai gen, tổng cộng, 80 phản g P R ã c th chiện; Vì vậy, khó có thể ch y ồng thời 80 ố g P R, lý ó, ỗi bảng gồm 20 phản

.

ng (bao gồm 10 mẫu, một mẫu cho hai ge ) ã c ch y cùng nhau thông qua

Ge e p M s e y le ® p (Eppe f) iều kiện cycler nhiệt bao gồ b ớcbiến tính ở 98 g 3 phú , s ó 40 h ỳ ở 98oC trong 10 giây, 58oC trong 20giây và 72oC trong 72 giây, tiếp theo là phần mở rộng cuối cùng ở 72oC trong 3 phút.Mỗi bả g s ó h gi ồng thời theo cặp gel g se 2% c phân tíchbằng phần mềm ImageJ

7 Phân lập DNA bộ gen từ máu toàn phần

DNA bộ ge c chiết xuất từ máu toàn phần c g ời tham gia thông qua Bộ

l c làm s ch DNA bộ gen c a Thermo Science GeneJET (Thermo khoa h c) Quá trình

y c th c hiệ he h ớng dẫn c a nhà sản xuất

8 ị lƣợ v ị lƣợng DNA chiết xuất

Tất cả các mẫ N ị h l g iều kiện bằng Máy quang phổ Vis UV Vis (The S ie e) ặc biệt, PCR-RFLP yêu cầu một mẫu DNA tinh khiết,

UV-ó, 260 / 280 ẫn nằm trong khoảng từ 1,8 - 2,2 ế 260 / 230 h g ới1,5 (mặc dù ph m vi d kiến là 2,0-2,2) g hú ý, ồ g ộ DNA phải 70 g / μl;

ó, các mẫ g c tránh do chấ l ng DNA thấp ũ g h ẫu

g l h h g c chấp nhậ i ể kiểm tra tính toàn vẹn c N , iện

i gel c th c hiện ở 100 V trong 30 phút trong 2% (wt / vol) agarose

9 Trình tự Sanger

B ầu từ tập h p mẫ h g ó g h hệ NB, 8 mẫ c ch ể

th c hiện phân tích trình t tr c tiếp Các mẫ c giải trình t t i một vị trí c thể trêngen LIN28B có ch a SNP quan tâm ch a một cặp mồi (Bảng 2) Mỗi phản g 15 μL

b ầu bao gồm 1,5 μL 10X B ffe , 3,75 e hM ỗi dNTP, 0,5 U Takara Taq

polymerase Hot Start (Takara, Nhật Bả ), 7,5 μM ỗi mồi (IDT, Inc.), 40-50 ng DNA

ge i P R ù g N ớc Quy trình PCR bắ ầu với b ớc biến tính ở 98oC trong

3 phú ớ ó ến 40 chu kỳ 98oC trong 10 giây, 58oC trong 20 giây và 72oC trong 20

gi y s ó l b ớc mở rộng cuối cùng ở 72oC trong 3 phút thông qua Mastercycler ®

p (Eppe f) B ớc tinh chế c th c hiện theo quy trình c a ExoSAP-IT TM PCRSản phẩm làm s ch Thuốc th (Thermo khoa h c) với 2 μL e zy e hỗn h p trên mỗi 3

μL sản phẩm PCR Các sản phẩ P R c ở 37oC trong 15 phút và 75oC trong 15

.