Nghiên cứu điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài

Kết quả Quy trình định lượng natri hyaluronat trong thành phẩm thuốc tiêm natri hyaluronatliên kết chéo 24 mg/ml theo phương pháp UV-Vis đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, tínhtuyến tính, độ đú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ HẬU

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trongluận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nàokhác

Phạm Phan Thông

Luận văn thạc sĩ dược học – Khóa học 2017-2019

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ THUỐC TIÊM CHỨA NATRI HYALURONAT

TÁC DỤNG KÉO DÀI Phạm Phan Thông Người hướng dẫn: PGS TS Lê Hậu Đặt vấn đề

Acid hyaluronic là một polyme sinh học trong cơ thể người và có vai trò như mộtchất bôi trơn cho các mô liên kết Vì vậy các chế phẩm chứa natri hyaluronat – dạngmuối của acid hyaluronic thường được chỉ định trong điều trị viêm khớp, giữ ẩmcho da và mắt,… Tuy nhiên, các chế phẩm chứa acid hyaluronic tự nhiên phân hủynhanh bởi các enzyme trong cơ thể nên mục tiêu chính của đề tài là nghiên cứu điềuchế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài

Đối tượng

Nguyên liệu natri hyaluronat đạt tiêu chuẩn EP 7.0 Các tá dược khác đạt tiêu chuẩnDược điển hoặc tiêu chuẩn nhà sản xuất và phù hợp với đường tiêm truyền

Phương pháp

Xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml:

 Hòa tan natri hyaluronat trong dung môi

 Tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo

 Rửa gel và làm giảm kích thước các tiểu phân gel natri hyaluronat liên kết chéo

 Điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat có trong gel

 Đóng gel vào bơm tiêm thủy tinh và tiệt trùng

Kết quả

Quy trình định lượng natri hyaluronat trong thành phẩm thuốc tiêm natri hyaluronatliên kết chéo 24 mg/ml theo phương pháp UV-Vis đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, tínhtuyến tính, độ đúng, độ chính xác và khoảng xác định Quy trình xác định nồng độBDDE còn lại sau khi phản ứng và hàm lượng BDDE tồn dư trong thuốc tiêm natrihyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml theo phương pháp quang phổ huỳnh quang đạtyêu cầu về độ đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện

Quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo đã được xây dựng,trong đó phương pháp bay hơi dưới áp suất giảm được áp dụng để tạo gel natrihyaluronat liên kết chéo với tỉ lệ BDDE phản ứng > 60% Các thành phẩm thuốctiêm natri hyaluronat liên kết chéo đều đạt chỉ tiêu định lượng, hàm lượng BDDEtồn dư và các chỉ tiêu chung của thuốc tiêm Tiêu chuẩn kĩ thuật cho thuốc tiêmnatri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml được xây dựng

Kết luận

Đã nghiên cứu điều chế thành công thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo

24 mg/ml

THESIS ABSTRACT

Thesis for the Degree of Master Pharmaceutical Sciences – Period 2017 - 2019

ESTABLISHING PREPARATION OF INJECTION OF CROSS-LINKED

SODIUM HYALURONATE Thong Pham Phan Supervisors: Assoc Prof Le Hau, Ph D Introduction

Hyaluronic acid is a polyanionic natural polymer in the human body It functions as

an agent which increases the viscosity of body fluids and acts as a lubricant totissue Therefore, products contain sodium hyaluronate - a salt form of hyaluronic,are popularly applicated in the treatment of arthritis, alleviating dry skin and eyes

In fact, hyaluronic acid in ordinary products rapidly dissolves during the enzymatichydrolysis, so the main objective of the study is to establish preparation of injection

of cross-linked sodium hyaluronate

Materials

Sodium hyaluronate meets EP 7.0 specification Other excipients comply withPharmacopoeia standard or manufacturer’s specification and are suitable forinjectable grade

Methods

Establish preparation of injection of cross-linked sodium hyaluronate 24 mg/ml:

 Dissolution of sodium hyaluronate in solvent

 Produce cross-linked sodium hyaluronate gel

 Washing gel and control gel particles at smaller size

 Adjustment of sodium hyaluronate concentration

 Filling into glass syringes and sterilizing

Results

The assay procedure in finish product is validated by UV-Vis method and metrequirements in terms of specificity, linearity, accuracy, precision and range Theprocedure for determining the BDDE content remaining after reaction and thedetection residual BDDE in finish product was validated by fluorescencespectroscopy method and met requirements in terms of specificity, linearity, limit ofdetection and limit of quantitation

Preparation of injection of cross-linked sodium hyaluronate is established, in whichthe method of evaporation under reduced pressure is applied to create cross-linkedsodium hyaluronate gel with the BDDE content after reaction > 60% Finishproducts met requirement interms of assay, the residual BDDE and the generalcriteria of injection Technical specification of finish product was established

Conclusion

Preparation of injection of cross-linked sodium hyaluronate 24 mg/ml wassuccessfully established

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hoạt chất acid hyaluronic 3

1.1.1 Giới thiệu 3

1.1.2 Cấu trúc hóa học 3

1.1.3 Tính chất lý hóa 4

1.1.4 Cấu trúc trong dung dịch 4

1.2 Vai trò sinh lý của HA 4

1.2.1 Ứng dụng của HA trong điều trị viêm khớp 5

1.2.2 Ứng dụng của HA trong chống lão hóa da 6

1.2.3 Chống chỉ định 6

1.3 1,4-butanediol diglycidyl ete (BDDE) 7

1.3.1 Cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa 7

1.3.2 Cơ chế phân hủy của BDDE trong cơ thể 7

1.4 HA liên kết chéo 10

1.4.1 Tác nhân liên kết chéo 10

1.4.2 Các sản phẩm trên thị trường 10

1.4.3 Quy trình điều chế natri hyaluronat liên kết chéo 11

1.4.4 Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha 13

1.4.5 Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo dị pha 14

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu và trang thiết bị 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng natri hyaluronat trong

thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 17

2.2.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác nồng độ BDDE còn lại sau khi phản ứng và hàm lượng BDDE tồn dư trong thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 23

2.2.3 Công thức cho một bơm tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 26

2.2.4 Xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 27

2.2.5 Khảo sát độ nhớt của dung dịch natri hyaluronat trong các dung môi NaOH có nồng độ khác nhau 29

2.2.6 Khảo sát tỉ lệ BDDE phản ứng và điều kiện phản ứng tạo natri hyaluronat liên kết chéo 29

2.2.7 Khảo sát phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo 30

2.2.8 Khảo sát giai đoạn rửa gel để loại lượng BDDE còn lại sau phản ứng cũng như những tạp chất khác bằng nước cất pha tiêm và đệm phosphat 31

2.2.9 Lựa chọn công thức có thể làm giảm kích thước tiểu phân gel natri hyaluronat liên kết chéo 31

2.2.10 Điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat trong thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 31

2.2.11 Đóng bơm tiêm và tiệt trùng thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 32 2.2.12 Xác định tính lặp lại của quy trình 32

2.2.13 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng natri hyaluronat trong thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 33

3.1.1 Độ đặc hiệu 33

3.1.2 Tính tuyến tính 35

3.1.3 Độ đúng 37

3.1.4 Độ chính xác 38

3.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định nồng độ BDDE còn lại sau khi phản ứng và hàm lượng BDDE tồn dư trong thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 42

3.2.1 Độ đặc hiệu 42

3.2.2 Tính tuyến tính 45

3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) 47

3.3 Xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 48

3.4.1 Khảo sát độ nhớt của dung dịch natri hyaluronat trong các dung môi NaOH có nồng độ khác nhau 48

3.4.2 Khảo sát tỉ lệ BDDE phản ứng và điều kiện phản ứng tạo natri hyaluronat liên kết chéo 49

3.4.3 Khảo sát phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo 55

3.4.4 Khảo sát giai đoạn rửa gel để loại lượng BDDE còn lại sau phản ứng cũng như những tạp chất khác bằng nước cất pha tiêm và đệm phosphat 57

3.4.5 Lựa chọn công thức có thể làm giảm kích thước tiểu phân gel natri hyaluronat liên kết chéo 59

3.4.6 Điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat trong thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 61

3.4.7 Xác định độ lặp lại của quy trình 64

3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 67

3.5.1 Tiêu chuẩn kĩ thuật 67

3.5.2 Phương pháp kiểm nghiệm 68

Chương 4 BÀN LUẬN 73

4.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài 73

4.1.1 Dung môi hòa tan 73

4.1.2 Phương pháp tạo gel natri hyaluronat liên kết chéo 73

4.1.3 Giai đoạn rửa gel natri hyaluronat liên kết chéo 74

4.1.4 Giai đoạn giảm kích thước gel natri hyaluronat liên kết chéo 76

4.1.5 Giai đoạn điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat, đóng thuốc vào bơm tiêm và tiệt trùng 77

4.1.6 Kết quả độ lặp lại của quy trình 77

4.2 Ứng dụng quy trình điều chế thuốc tiêm chứa natri hyaluronat tác dụng kéo dài vào quy mô sản xuất công nghiệp 78

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79

KẾT LUẬN 79

ĐỀ NGHỊ 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa đầy đủ

BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ete

kl/tt khối lượng trên thể tích

LOD Limit of detection

Giới hạn phát hiệnNASHA Non-Animal Stabilised Hyaluronic Acid

Acid Hyaluronic ổn định có nguồn gốc không phải là động vậtOBT Optimal Balance Technology

Công nghệ để đạt được độ đồng đều tối ưuRSD Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

STT Số thứ tự

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

tt/tt thể tích trên thể tích

USP United States Pharmacopoeia

Dược điển Hoa KỳUV-Vis Ultraviolet – visible spectrophotometry

Quang phổ tử ngoại khả kiến

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số sản phẩm natri hyaluronat liên kết chéo trên thị trường 11

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu 16

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất dung môi 16

Bảng 2.3 Danh mục trang thiết bị bào chế và kiểm nghiệm 17

Bảng 2.4 Cách pha mẫu thử độ đúng tương ứng với dung dịch mẫu thử thành phẩm 22

Bảng 2.5 Công thức cho một bơm tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 1 ml 26

Bảng 2.6 Điều kiện phản ứng và lượng BDDE khảo sát 30

Bảng 3.1 Kết quả đo độ hấp thu của dung dịch giả dược (phương pháp định lượng) 34

Bảng 3.2 Hệ số ảnh hưởng của thẩm định độ đặc hiệu (phương pháp định lượng) 35 Bảng 3.3. Nồng độ dung dịch và độ hấp thu của các dung dịch chuẩn natri hyaluronat (phương pháp định lượng) 35

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ đúng (phương pháp định lượng) 37

Bảng 3.5 Kết quả tỉ lệ hồi phục của thẩm định độ đúng (phương pháp định lượng) 38

Bảng 3.6 Kết quả độ lặp lại (phương pháp định lượng) 39

Bảng 3.7.Nồng độ dung dịch và độ hấp thu của các dung dịch chuẩn natri hyaluronat trong ngày 2 40

Bảng 3.8 Kết quả độ chính xác trung gian (phương pháp định lượng) 41

Bảng 3.9 Kết quả đo cường độ huỳnh quang của dung dịch giả dược 45

Bảng 3.10 Nồng độ dung dịch và cường độ huỳnh quang của các dung dịch chuẩn BDDE 46

Bảng 3.11 Kết quả giới hạn phát hiện 47

Bảng 3.12. Nồng độ của natri hyaluronat trong các dung dịch NaOH có nồng độ khác nhau 48

Bảng 3.13 Nồng độ dung dịch và cường độ huỳnh quang của dung dịch chuẩnBDDE (khảo sát công thức A và công thức B ở các điều kiện: 40 C trong 1 giờ,

40 C trong 2 giờ, 50 C trong 1 giờ, 50 C trong 2 giờ) 49

Bảng 3.14.Kết quả nồng độ BDDE còn lại sau phản ứng của công thức A và côngthức B ở các điều kiện: 40 C trong 1 giờ, 40 C trong 2 giờ, 50 C trong 1 giờ,

50 C trong 2 giờ 51

Bảng 3.15.Kết quả tỉ lệ BDDE phản ứng của công thức A và công thức B ở cácđiều kiện: 40 C trong 1 giờ, 40 C trong 2 giờ, 50 C trong 1 giờ, 50 C trong 2 giờ 52

Bảng 3.16 Nồng độ dung dịch và cường độ huỳnh quang của dung dịch chuẩnBDDE (khảo sát công thức B và công thức C ở các điều kiện: 50 C trong 3 giờ,

50 C trong 4 giờ, 50 C trong 5 giờ) 53

Bảng 3.17 Kết quả nồng độ BDDE còn lại sau phản ứng của công thức B và công

thức C ở các điều kiện: 50 C trong 3 giờ, 50 C trong 4 giờ, 50 C trong 5 giờ 54

Bảng 3.18 Kết quả hàm lượng BDDE phản ứng của công thức B và công thức C ở

các điều kiện: 50 C trong 1 giờ, 50 C trong 2 giờ, 50 C trong 3 giờ 55

Bảng 3.19 Thông số quy trình đông khô 56 Bảng 3.20 Giá trị pH của giai đoạn rửa gel bằng phương pháp ngâm gel với 50 ml

nước cất pha tiêm trong 1 giờ 57

Bảng 3.21 Giá trị pH của giai đoạn rửa gel bằng phương pháp ngâm gel với 50 ml

nước cất pha tiêm trong 2 giờ 58

Bảng 3.22 pH các công thức sau khi rửa gel 59 Bảng 3.23.Nồng độ dung dịch và độ hấp thu của các dung dịch chuẩn natrihyaluronat (lựa chọn công thức) 59

Bảng 3.24 Kết quả hàm lượng natri hyaluronat trong gel sau khi rửa (lựa chọn công

thức) 60

Bảng 3.25 Công thức điều chế gel natri hyaluronat liên kết chéo 61 Bảng 3.26 Kết quả pH của gel trước và sau khi rửa 61

Bảng 3.27.Nồng độ dung dịch và độ hấp thu của các dung dịch chuẩn natri

hyaluronat (điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat) 62

Bảng 3.28 Kết quả hàm lượng natri hyaluronat trong gel sau khi rửa (điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat) 63

Bảng 3.29 Kết quả hàm lượng BDDE tồn dư 64

Bảng 3.30 Công thức cho một lô với cỡ lô là 4 bơm tiêm 64

Bảng 3.31 Kết quả kiểm nghiệm bán thành phẩm 66

Bảng 3.32 Kết quả kiểm nghiệm thành phẩm 67

Bảng 3.33 Công thức cho một bơm tiêm của thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 68

Bảng 3.34 Chỉ tiêu chất lượng kĩ thuật của thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml 68

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức phân tử của HA 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của BDDE 7

Hình 1.3 Cơ chế phân hủy BDDE 9

Hình 1.4 Phản ứng tạo HA liên kết chéo của BDDE 10

Hình 2.1 Quy trình tổng quát điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 28

Hình 3.1 Phổ đồ dung dịch giả dược (phương pháp định lượng) 33

Hình 3.2 Phổ đồ dung dịch chuẩn (phương pháp định lượng) 33

Hình 3.3 Phổ đồ dung dịch mẫu thử (phương pháp định lượng) 34

Hình 3.4.Đồ thị biểu diễn sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của dung dịch natri hyaluronat chuẩn (phương pháp định lượng) 36

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của dung dịch natri hyaluronat chuẩn (độ chính xác trung gian) 40

Hình 3.6 Phổ phát xạ của dung dịch giả dược bán thành phẩm 42

Hình 3.7 Phổ phát xạ của dung dịch giả dược thành phẩm 43

Hình 3.8 Phổ phát xạ của dung dịch chuẩn 43

Hình 3.9 Phổ phát xạ của dung dịch mẫu thử bán thành phẩm 44

Hình 3.10.Đồ thị biểu diễn sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang của dung dịch BDDE chuẩn 47

Hình 3.11.Đồ thị biểu diễn sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang của dung dịch BDDE chuẩn (khảo sát công thức A và công thức B ở các điều kiện: 40 C trong 1 giờ, 40 C trong 2 giờ, 50 C trong 1 giờ, 50 C trong 2 giờ) 50

Hình 3.12.Đồ thị biểu diễn sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang của dung dịch BDDE chuẩn (khảo sát công thức B và công thức C ở các điều kiện: 50 C trong 3 giờ, 50 C trong 4 giờ, 50 C trong 5 giờ) 53

Hình 3.13.Đồ thị biểu diễn sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của dung dịch natri hyaluronat chuẩn (lựa chọn công thức) 60

Hình 3.14.Đồ thị biểu diễn sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của dung dịch natri hyaluronat chuẩn (điều chỉnh hàm lượng natri hyaluronat) 62

MỞ ĐẦU

Acid hyaluronic (HA) là một polyme được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y học nhưđiều trị viêm xương khớp, phẫu thuật mắt và được sử dụng như một tác nhân giữ

ẩm và làm căng da để làm trẻ hóa làn da HA còn là một chất nội sinh trong cơ thể

và tồn tại trong phân lớn các mô liên kết trong dịch cơ thể như dịch khớp và dịchthủy tinh của mắt Ngoài ra, HA còn được tìm thấy ở trong da và chiếm khoảng50% lượng HA có trong cơ thể HA đóng một vai trò quan trọng trong cơ thể như làthành phần của chất nền ngoại bào, chất giữ ẩm cho da và mắt, chất tạo độ nhớt vàđàn hồi cho dịch khớp Vì vậy, sự suy giảm nồng độ HA trong cơ thể có thể dẫn đếncác bệnh lý như viêm xương khớp, lão hóa da và khô mắt,… Thông thường, các sảnphẩm trên thị trường thường sử dụng dạng muối của HA là natri hyaluronat đểthuận tiện cho việc bào chế

Hiện nay, các sản phẩm chứa natri hyaluronat được sử dụng nhiều nhất trong chốnglão hóa da Các sản phẩm này thường được tiêm dưới da để làm căng da và giữ ẩmcho da ở vị trí tiêm Tuy nhiên việc sử dụng các sản phẩm chứa natri hyaluronat tựnhiên thường có thời gian hiệu quả (khoảng 3-4 tháng) ngắn hơn so với việc sửdụng các sản phẩm chứa natri hyaluronat liên kết chéo (khoảng 6-12 tháng) Vì vậy,việc điều chế natri hyaluronat liên kết chéo là thực sự cần thiết

Mục tiêu của đề tài này là nghiên cứu quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronattác động kéo dài hay tạo sự liên kết chéo giữa các phân tử natri hyaluronat với nhau

Và tác nhân liên kết chéo được sử dụng là 1,4-butanediol diglycidyl ete (BDDE).Natri hyaluronat liên kết chéo sẽ giải phóng từ từ các phân tử HA tăng thời gianphân hủy của HA trong cơ thể kéo dài thời gian điều trị so với các sản phẩm chứanatri hyaluronat tự nhiên

Để đạt được mục tiêu trên, đề tài tiến hành nghiên cứu với các nội dung cụ thể sau:

 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng natri hyaluronat trong thuốctiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml

 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định nồng độ BDDE còn lại sau khiphản ứng và hàm lượng BDDE tồn dư trong thuốc tiêm natri hyaluronat liên kếtchéo 24 mg/ml.

 Xây dựng quy trình điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo

24 mg/ml

 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo

24 mg/ml

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hoạt chất acid hyaluronic

1.1.1 Giới thiệu

Năm 1934, Karl Meyer và cộng sự John Palmer đã phân lập ra một chất từ dịchkính của mắt bò Trong quá trình nghiên cứu, họ phát hiện ra chất đó có chứa haiphân tử đường, một trong hai phân tử đó là acid uronic và họ đặt tên cho chất đó là

“acid hyaluronic” (trong đó “hyalos” theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là thủy tinh ghépvới uronic) [18]

HA chủ yếu được tìm thấy trong chất nền ngoại bào và khoảng quanh tế bào, bêncạnh đó HA cũng được tìm thấy trong nội bào Các chức năng sinh học của HA baogồm việc duy trì độ nhớt và tính đàn hồi của chất lỏng liên kết mô như khớp xương

và thủy tinh dịch trong mắt, kiểm soát quá trình hydrat hóa của mô và quá trình vậnchuyển nước, lắp ráp các phân tử proteoglycan trong chất nền ngoại bào Ngoài ra

HA còn có vai trò như là thụ thể trung gian trong quá trình tách rời, phân chia tếbào, phát triển khối u và di căn HA là một trong những phân tử ưa nước, cùng vớitính đồng nhất và sự tương thích với mô cho phép HA được sử dụng như một chấtlàm ẩm tự nhiên trong các sản phẩm chăm sóc da [18]

1.1.2 Cấu trúc hóa học

HA còn được gọi là hyaluronan là một polyme cao phân tử, có khả năng phân hủysinh học tự nhiên HA là một glycosaminoglycans không phân nhánh và khôngsulfat hóa, nó bao gồm các chuỗi disacharid của N-acetyl-D-glucosamin và acid D-glucuronic liên kết với nhau bằng liên kết β – (1,4) glycoside và β – (1,3) glycoside[28]

n

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của HA

Công thức phân tử: (C14H20NNaO11)n Khối lượng mol: (401,34)n

1.1.3 Tính chất lý hóa

Nguồn gốc: Nguyên liệu natri hyaluronat được sản xuất bằng phương pháp lên men

với chủng Streptococcus zooepidemiaus.

Cảm quan: Natri hyaluronat có dạng bột vô định hình hoặc dạng sợi màu trắng hoặcgần như trắng

Độ tan: Natri hyaluronat khó tan trong nước, không tan trong aceton và ethanolkhan

Độ nhớt nội tại: 1,6-2,2 m3/kg

pH (nồng độ 0,5% trong nước): 5,0 – 8,5

1.1.4 Cấu trúc trong dung dịch

Trong dung dịch, HA tạo thành một dải băng xoắn được gọi là “cấu trúc cuộn” dotạo liên kết hydro với dung môi, trong đó các nguyên tử hydro ở vị trí đường trụctạo một bề mặt không phân cực còn các mạch nhánh ở vị trí xích đạo tạo một bềmặt phân cực [8]

Trong dung dịch, các chuỗi polyme của HA mở rộng ra và xoắn ngẫu nhiên Nhữngchuỗi này xoắn vào nhau ở nồng độ thấp, đây là một trong những nguyên nhân gây

ra tính lưu biến bất thường của HA Ở nồng độ cao hơn, dung dịch có độ nhớt rấtcao và phụ thuộc vào lực tác động để di chuyển Ở nồng độ 1%, dung dịch HA đặclại giống như thạch nhưng khi tác dụng một lực thì nó di chuyển rất dễ dàng Do đó

nó còn được gọi là vật liệu “giả nhựa” Nhờ vào tính chất lưu biến bất thường củadung dịch HA mà nó được xem như một chất bôi trơn lý tưởng [18]

Khối lượng phân tử của HA phụ thuộc vào số lượng disacharid có trong chuỗi.Thông thường HA ở dưới dạng muối natri và có khối lượng phân tử là 401 Da chomỗi đơn vị [14]

1.2 Vai trò sinh lý của HA

HA được phân bố khắp cơ thể người và nó tạo thành một yếu tố chính trong dịchngoại bào [23], [29] Nó hiện diện trong hầu hết trong các dịch sinh học bao gồmdịch khớp và thủy tinh dịch trong mắt [35] Nồng độ HA trung bình trong cơ thể

người là khoảng 200 mg/kg nên một người nặng 60 kg có khoảng 12 g acidhyaluronic [25] Ngoài ra, một lượng lớn HA đã được phát hiện ở trong da và nóchiếm khoảng 50% tổng số HA có trong cơ thể [14] Chức năng chính của HA làtạo ra sự bôi trơn cho các mô liên kết do đó ngăn ngừa những tác hại do các áp lựcvật lý gây ra cho tế bào và đóng một vai trò quan trọng trong việc ổn định sụn khớp[25] HA cũng có hiệu quả trong việc ức chế một số lượng lớn vi khuẩn và nấmcũng như kháng virus [13] Ngoài ra, HA còn chịu trách nhiệm trong việc điềuchỉnh sự kết dính, sự di chuyển và sư phát triển của tế bào [8].

1.2.1 Ứng dụng của HA trong điều trị viêm khớp

HA là thành phần cấu tạo quan trọng của chất nền ngoại bào, hiện diện trong sụn

và dịch khớp với nồng độ cao HA nội sinh giúp tạo độ nhớt và độ đàn hồi chodịch khớp, giúp cho khớp được bôi trơn và cần thiết để tái tạo proteoglycan trongsụn khớp Trong bệnh viêm xương khớp, nồng độ và chất lượng của HA trong sụn

và dịch khớp suy giảm, do đó liệu pháp điều trị tiêm HA ngoại sinh trực tiếp vàokhớp có thể phục hồi đặc tính đàn hồi và độ nhớt của khớp Các nghiên cứu

in vitro và in vivo cho thấy các tác động sinh lý khác nhau của HA ngoại sinh đối

lập hoàn toàn với cơ chế sinh bệnh viêm khớp như tăng cường tổng hợp tế bào sụncủa HA nội sinh và proteoglycan, ngăn ngừa sự thoái hóa và thúc đẩy quá trinh táitạo của sụn Ngoài ra, HA ngoại sinh còn giảm thiểu việc tổng hợp các chất trunggian gây viêm và chất nền ngoại bào, làm giảm các tín hiệu thần kinh và độ nhạycủa các dây thần kinh liên quan đến nguyên nhân đau do viêm khớp [27]

HA trong dịch khớp đã được chứng minh là không chuyển hóa đáng kể Thửnghiệm trên động vật cho thấy HA được chuyển hóa tại các mô xung quanh khớp,nhưng chủ yếu ở gan và thải trừ qua thận

Liệu pháp điều trị thường là tiêm trực tiếp vào khớp gối với hàm lượng

20 mg/2 ml, mỗi tuần 1 lần cho mỗi khớp gối, thời gian điều trị thường là 3-5 tuần.Sau một liệu trình cho tác động kéo dài đến 6 tháng

1.2.2 Ứng dụng của HA trong chống lão hóa da

Lão hóa da là một quá trình bao gồm rất nhiều nguyên nhân nhưng đều được quy vềbởi hai yếu tố: các yếu tố bên trong và các tác động bên ngoài Một làn da tươi trẻthường căng phồng, mềm dẻo, nhanh phục hồi nều bị tổn thương và chứa một hàmlượng nước cao Các tổn thương bên ngoài hàng ngày và quá trình lão hóa bìnhthường bên trong làm cho da mất dần độ ẩm Một chất quan trọng liên quan đến độ

ẩm của da là HA, một chất tự nhiên có khả năng giữ nước [19] HA là một chất nộisinh tập trung trên 50% ở da Ở người có độ tuổi 30 hoặc lớn hơn, HA bắt đầu bịphân hủy và mất đi, đồng thời cơ thể cũng giảm tổng hợp HA

Khi da bị lão hóa, HA ở lớp biểu bì giảm nhiều trong khi HA ở lớp hạ bì vẫn hiệndiện rất nhiều [16] Trong khi đó, quá trình tổng hợp HA ở lớp biểu bì bị ảnh hưởng

và được kiểm soát một cách riêng biệt trong quá trình tổng hợp HA ở da [30], [31].Ngoài ra, việc giảm kích thước của các polyme của HA trong quá trình lão hóa dacũng được nghiên cứu [15] Do đó, lớp biểu bì mất đi tác nhân giữ nước quan trọngnhất làm cho da mất dần độ ẩm trong quá trình lão hóa Trong khi đó, ở lớp hạ bì có

sự thay đổi lớn liên quan đến tuổi tác là sự gia tăng ái lực của HA với cấu trúc môđồng thời mất khả năng phóng thích HA đồng nghĩa với thúc đẩy quá trình liên kếtchéo của collagen Ngoài ra, HA còn là thành phần cấu tạo nên khung ngoại bào giữvững cấu trúc của da [30]

Ở người có độ tuổi 30 hoặc lớn hơn, các cấu trúc mô mềm của mặt bắt đầu suy yếu

và da mất độ đàn hồi dẫn đến xuất hiện nếp nhăn và làm mỏng lớp mỡ dưới da [26]

HA được sử dụng như một biện pháp để bù đắp sự mất khối lượng của mô mềm dotính chất làm căng phồng của HA Ngoài ra, HA còn giữ cho da có độ ẩm nhất định

để bảo vệ da các tác nhân bên ngoài Vì vậy HA được sử dụng rộng rãi trong việcđiều chỉnh các nếp gấp ở mặt và tạo ra một khuôn mặt trẻ hơn [24]

1.2.3 Chống chỉ định [39]

Các dẫn xuất HA chống chỉ định đối với bệnh nhân dị ứng với các sản phẩm natrihyaluronat

Một số sản phẩm natri hyaluronat được chiết xuất từ Streptococci nên chống chỉđịnh đối với bệnh nhân dị ứng với protein của vi khuẩn gram dương.

Một số sản phẩm natri hyaluronat được chiết xuất từ động vật nên chống chỉ địnhđối với bệnh nhân dị ứng với protein của gia cầm, lông thú và các sản phẩm từtrứng

Các dẫn xuất HA chống chỉ định đối với bệnh nhân bị nhiễm trùng ở khớp gối,vùng da đã được điều trị trước đó

1.3 1,4-butanediol diglycidyl ete (BDDE)

1.3.1 Cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa [37], [38]

Cấu trúc phân tử

BDDE có tên khoa học: 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane

Công thức phân tử: C10H18O4 Khối lượng phân tử: 202,25

Cấu trúc hóa học của BDDE được trình bày ở hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của BDDE

Tính chất lý hóa

Cảm quan: chất lỏng không màu

Độ tan: Tan được trong nước (55,5 g/L ở 20 °C)

Nhiệt độ sôi: 157-158 °C ở 11 mmHg

Khối lượng riêng: 1,049 g/ml

1.3.2 Cơ chế phân hủy của BDDE trong cơ thể [6]

BDDE là một trong những tác nhân được sử dụng để tạo HA liên kết chéo Khảnăng tạo liên kết với các phân tử HA do phản ứng của hai nhóm epoxid ở hai đầuphân tử tạo thành Ở điều kiện thích hợp (pH > 7), các nhóm epoxid phản ứng vớinhóm chức alcol của HA tạo thành các liên kết ete Độ ổn định cao của liên kết ete

là một trong những lý do mà HA liên kết chéo có hiệu quả lâm sàng kéo dài hơn

HA tự nhiên Không những thế BDDE có khả năng phân hủy sinh học và đã được

nghiên cứu nhiều Đó là những lý do mà BDDE được sử dụng nhiều như là một tácnhân để tạo HA liên kết chéo.

BDDE bị thủy phân bởi cytochrom P450 tạo thành 1,4-butanediol và glycerol.1,4-butanediol chỉ tạo cảm giác kích thích, không gây mẫn cảm với nồng độ khônggây ra ảnh hưởng bất lợi là 100 mg/kg trong ngày 1,4-butanediol được chuyển hóalần lượt qua các enzyme alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase,hydroxybutyric acid dehydrogenase, succinic semialdehyde dehydrogenase tạothành acid succinic Acid succinic tiếp tục bị oxy hóa qua chu trình Krebs Mộtnghiên cứu sử dụng 14C để đánh dấu 1,4-butanediol cho thấy 1,4-butanediol khôngtích lũy trong cơ thể và phần lớn bị oxy hóa nhanh chóng tạo thành CO2 Glycerol

đã được khẳng định là một chất không gây kích thích, không gây đột biến gen,không gây quái thai và không gây mẫn cảm với nồng độ không gây ra ảnh hưởngbất lợi là 2000 mg/kg trong ngày Glycerol được chuyển hóa thành CO2 và H2Othông qua con đường trao đổi chất glycosis Vì vậy nếu hàm lượng BDDE tồn dưtrong thành phẩm ≤ 2 µg/ml (2 ppm) thì không gây độc đối với cơ thể

1,4-butanediol diglycidyl ete (BDDE)

1.4 HA liên kết chéo

HA được sử dụng nhiều trong lĩnh vực y học và mỹ phẩm tuy nhiên phần lớn đềukhông sử dụng HA tự nhiên HA tự nhiên được sử dụng rất hạn chế bởi vì nó khôngduy trì được lâu trong cơ thể người do sự phân hủy nhanh HA bị phân hủy thànhmonosaccharide bởi enzyme hyaluronidase Enzyme này cắt HA thành N-acetyl-D-glucosamin và acid D-glucuronic [36] Ngoài ra, HA còn bị phân hủy bởi các thụthể bề mặt tế bào CD44 và các phản ứng oxy hóa khác trong cơ thể [28] Vì vậy,một trong những cách để HA tồn tại lâu hơn trong cơ thể là tạo HA liên kết chéo

1.4.1 Tác nhân liên kết chéo

Có nhiều cách liên kết các phân tử HA với nhau như liên kết thông qua phản ứngvới các nhóm carboxylic (-COOH) hay hydroxyl (-OH) của chuỗi HA nhưng cáctác nhân tạo liên kết thông qua nhóm hydroxyl vẫn được sử dụng nhiều bởi vì vẫnduy trì được tính chất polyanionic tự nhiên của HA Và một trong những tác nhântạo liên kết giữa các phân tử HA thông qua nhóm hydroxyl được sử dụng rộng rãi

và được nghiên cứu nhiều nhất là BDDE Phản ứng này liên quan đến quá trình mởvòng epoxid của BDDE trong môi trường kiềm, trong đó vòng epoxid ưu tiên phảnứng với nhóm hydroxyl tạo thành liên kết ete

Hình 1.4 Phản ứng tạo HA liên kết chéo của BDDE 1.4.2 Các sản phẩm trên thị trường

Hiện nay, nhu cầu thẩm mỹ ngày càng tăng cùng với sự phát triển của các sản phẩmliên quan Trong đó, các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng làm chậm quátrình lão hóa da bằng cách làm căng bề mặt da cũng như giữ ẩm cho da được ưachuộng, tiêu biểu như hoạt chất natri hyaluronat, đặc biệt là các sản phẩm natrihyaluronat liên kết chéo cho tác dụng kéo dài Và một số sản phẩm natri hyaluronatliên kết chéo tiêu biểu được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số sản phẩm natri hyaluronat liên kết chéo trên thị trường [1], [12]

STT Sản phẩm thương

mại

Nồng độ (mg/ml)

Tác nhân liên kết Nhà sản xuất

1.4.3 Quy trình điều chế natri hyaluronat liên kết chéo

HA là một chất làm căng bề mặt da tự nhiên của cơ thể vì vậy việc tiêm HA thườngđược áp dụng trong chống lão hóa da Để thuận lợi cho việc bào chế, HA được sửdụng dưới dạng muối là natri hyaluronat và có 2 dạng bào chế thường được sử dụng

là dung dịch natri hyaluronat và gel natri hyaluronat Vì các dung dịch natrihyaluronat tự nhiên thường phân hủy nhanh trong cơ thể nên natri hyaluronat liênkết chéo thường được hay sử dụng để làm căng bề mặt da Gel natri hyaluronat làmột chuỗi dài các phân tử natri hyaluronat BDDE được sử dụng như tác nhân liênkết chéo cho phần lớn các sản phẩm thương mại như Restylane, Belotero vàJuvéderm Ngoài ra, còn có các tác nhân liên kết chéo khác như DVS, DEO… Tuynhiên để phù hợp với đường tiêm dưới da thì các sản phẩm gel natri hyalyronat

được phân tán trong các dung dịch sinh lý hoặc dung dịch đệm phosphat Hiện nay,

có rất nhiều sản phẩm natri hyaluronat liên kết chéo trên thị trường và với nhữngcông nghệ khác nhau thì các nhà sản xuất sẽ điều chế gel natri hyalruonat có đặctính khác nhau Tuy nhiên quy trình điều chế natri hyaluronat liên kết chéo với tácnhân liên kết chéo BDDE gồm những giai đoạn như sau:

- Ở giai đoạn đầu tiên, nguyên liệu natri hyaluroant được hòa tan trong dung dịchNaOH có nồng độ thích hợp để tạo môi trường phản ứng với BDDE (vì BDDE phảnứng trong môi trường kiềm)

- Ở giai đoạn thứ hai, tác nhân liên kết chéo BDDE được thêm vào để liên kết cácchuỗi natri hyaluronat lại với nhau và được điều chế thành dạng gel

- Ở giai đoạn thứ ba, rửa gel với nước cất pha tiêm và đệm phosphat để loại các tạpchất và tác nhân liên kết chéo không phản ứng

- Ở giai đoạn thứ tư, làm giảm kích thước của gel để có thể tiêm được

- Ở giai đoạn thứ năm, phân tán các tiểu phân gel natri hyaluronat liên kết chéovào dung dịch natri hyaluronat hoặc các dung dịch thích hợp khác

- Ở giai đoạn thứ sáu, bơm gel natri hyaluronat liên kết chéo vào bơm tiêm thủytinh

- Ở giai đoạn thứ bảy, tiệt trùng bơm tiêm thủy tinh có chứa gel natri hyaluronatliên kết chéo bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 121 °C trong 20 phút

Các nhà sản xuất với những công nghệ khác nhau sẽ điều chế gel natri hyaluronatliên kết chéo với chất lượng khác nhau như: tỉ lệ natri hyaluronat liên kết chéo vớinatri hyaluronat không liên kết chéo khác nhau, kích thước hạt gel natri hyaluronatliên kết chéo khác nhau,… Điển hình như công nghệ “Hylacross” trong sản phẩmthương mại Juvéderm [1] hay công nghệ “NASHA” và “OBT” trong sản phẩmthương mại Restylane [40] Ngoài ra, dạng bào chế gel natri hyaluronat cũng rấtquan trọng và ảnh hưởng đến liệu trình điều trị Trên thị trường hiện nay, có haidạng bào chế gel natri hyaluronat liên kết chéo thông dụng là dạng gel natrihyaluronat liên kết chéo đồng pha mà điển hình là sản phẩm thương mại Juvéderm

của nhà sản xuất “Allergan Medical” và dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo dịpha mà điển hình là sản phẩm thương mại Restylane của nhà sản xuất “Q-Med”.

1.4.4 Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha

Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha là các phân tử natri hyaluronatđược hòa tan và phản ứng tạo liên kết chéo thông qua một hoặc hai giai đoạn Trong

đó các phân tử natri hyaluronat khối lượng phân tử cao cùng pha với các phân tửnatri hyaluronat khối lượng phân tử thấp nên không có các hạt nhìn thấy bằng mắtthường [5], [9], [17], [21] Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha dựatheo quy trình bào chế được chia thành hai nhóm nhỏ: dạng gel natri hyaluronat liênkết chéo đồng pha một giai đoạn và dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồngpha nhiều giai đoạn [5], [9], [17], [21]

1.4.4.1 Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha một giai đoạn

Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha một giai đoạn được điều chế bằngcách hòa tan natri hyaluronat và phản ứng với tác nhân liên kết chéo trong một giaiđoạn duy nhất, điển hình là sản phẩm thương mại Juvéderm với công nghệ

“Hylacross” [1] Juvéderm được sản xuất bởi Lea Derm, một công ty con củaCorneal Group (Paris, Pháp) Juvéderm được phát triển ở trên thị trường Mỹ bởiInamed (California, Mỹ) và hiện nay được bán bởi Allergan Medical (California,Mỹ) Hiện nay, sản phẩm Juvéderm đã được phát triển với sáu công thức khác nhauvới nồng độ natri hyaluronat khác nhau và trong khoảng từ 18 mg/ml đến 30 mg/ml.Trong đó hai sản phẩm của Juvéderm nổi tiếng trên thị trường Mỹ là JuvédermUltra và Juvéderm Ultra plus với nồng độ natri hyaluronat lần lượt là 24 mg/ml và

30 mg/ml Juvéderm Ultra và Juvéderm Ultra plus đã được FDA phê duyệt vàotháng 6 năm 2006 Trong đó, Juvéderm Ultra được sử dụng cho các nếp nhăn vàkhuyết điểm sâu còn Juvéderm Ultra plus được sử dụng cho các nếp nhăn sâu hơnnữa chẳng hạn như nếp gấp mũi Tất cả các sản phẩm Juvéderm đều được sản xuất

từ nguyên liệu natri hyaluronat được lên men từ vi khuẩn Streptococci của ngựa.Các phân tử natri hyaluronat được liên kết chéo bằng BDDE theo quy trình điều chếgel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha một giai đoạn được phân tán trong đệm

phosphat có pH từ 6,5 – 7,3 Với nồng độ natri hyaluronat cao hơn và tỉ lệ liên kếtchéo nhiều hơn các sản phẩm natri hyaluronat liên kết chéo khác, Juvéderm đượcđánh giá duy trì lâu hơn [12].

1.4.4.2 Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha nhiều giai đoạn

Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha nhiều giai đoạn được tạo ra bằnghai giai đoạn liên kết chéo Bước đầu tiên là giai đoạn tạo liên kết chéo với mộtlượng natri hyaluronat xác định Tiếp theo, một lượng mới natri hyaluronat xác địnhđược thêm vào và một giai đoạn liên kết chéo tiếp theo được thực hiện [3] VàBelotero là sản phẩm thương mại duy nhất được FDA phê duyệt dưới dạng gel liênkết chéo đồng pha nhiều giai đoạn [2] Belotero được sản xuất bởi MerzPharmaceuticals (California, Mỹ) và được FDA phê duyệt vào tháng 12 năm 2011[34] Belotero được sản xuất từ nguyên liệu natri hyaluronat không có nguồn gốc từđộng vật và có nồng độ natri hyaluronat là 22,5 mg/ml với tác nhân liên kết chéo làBDDE trong hai giai đoạn phản ứng liên tiếp [2]

1.4.5 Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo dị pha

Dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo dị pha với sản phẩm thương mại làRestylane và Perlane đã được FDA phê duyệt Trong đó bước tạo liên kết chéo sẽtạo ra một khối gel lớn chứa các phân tử natri hyaluronat đã liên kết chéo [7] Từkhối gel đó sẽ tạo ra các hạt gel có kích thước xác định để có thể tiêm dưới da được[32] Và các hạt gel chứa các phân tử natri hyaluronat liên kết chéo có kích thướcxác định sẽ được phân tán vào dung dịch natri hyaluronat không liên kết chéo tạo radạng gel hỗn dịch [11], [20] Vai trò của dung dịch natri hyaluronat không liên kếtchéo hoạt động như một chất bôi trơn làm cho gel hỗn dịch có thể được đẩy quađược đầu kim tiêm [11] Restylane đã được FDA chấp thuận vào tháng 12 năm

2003 [12] và Perlane đã được FDA chấp thuận vào năm 2007 [2] và đều được sảnxuất bởi Q-Med (Thụy Điển) và được bán ở thị trường Mỹ bởi Medicis, Inc (Mỹ).Restylane và Perlane được sản xuất từ nguyên liệu natri hyaluronat được lên men từ

vi khuẩn Streptococci của ngựa được biết đến là công nghệ NASHA và đều có tácnhân liên kết chéo là BDDE với nồng độ natri hyaluronat là 20 mg/ml [12] Hai sản

phẩm thương mại Restylane và Perlane chỉ khác nhau về kích thước hạt natrihyaluronat liên kết chéo Trong đó các hạt natri hyaluronat liên kết chéo củaRestylane có kích thước khoảng 250 µm còn các hạt natri hyaluronat liên kết chéocủa Perlane có kích thước khoảng 550 µm [11] Có nghĩa là bước tạo gel natrihyaluronat liên kết chéo của Restylane và Perlane sẽ được thực hiện trong cùng mộtquy trình Sau đó, khối gel sẽ tạo ra những hạt có kích thước xác định, hạt nào cókích thước khoảng 250 µm sẽ được phân tán vào dung dịch natri hyaluronat khôngliên kết chéo tạo thành sản phẩm thương mại Restylane còn những hạt natrihyaluronat liên kết chéo có kích thước khoảng 500 µm sẽ được phân tán vào dungdịch natri hyaluronat không liên kết chéo tạo thành sản phẩm thương mại Perlane.

Vì dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo dị pha được điều chế bằng cách phân táncác hạt có kích thước từ 250-500 µm vào dung dịch natri hyaluronat nên có thể nhìnthấy được bằng mắt thường các hạt gel natri hyaluronat liên kết chéo Ngoài ra có

sự phân hủy nhanh chóng của các phân tử natri hyaluronat không liên kết chéo ởdạng dung dịch còn các phân tử natri hyaluronat liên kết chéo thì phân hủy lâu hơntrong khi dạng gel natri hyaluronat liên kết chéo đồng pha thì sự phân hủy đồng đềuhơn giữa phần natri hyaluronat không liên kết chéo và natri hyaluronat liên kết chéo[11], [20], [22] Vì vậy đề tài này sẽ hướng đến nghiên cứu quy trình điều chế thuốctiêm natri hyaluronat liên kết chéo theo phương pháp bào chế gel dạng liên kết chéođồng pha một giai đoạn

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và trang thiết bị

Các nguyên liệu, tá dược, hóa chất, dung môi, trang thiết bị bào chế và kiểmnghiệm sử dụng trong nghiên cứu điều chế thuốc tiêm natri hyaluronat tác dụng kéodài được trình bày trong bảng 2.1, bảng 2.2 và bảng 2.3

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu

Natri hyaluronat EP 7.0 Bloomage freda Biopharma,

Trung Quốc (số lô: 17060911)

Kali dihydrophosphat khan BP 2015 Merck, Đức

Dinatri hydrophosphat dihydrat USP 39 Merck, Đức

Acid hydrocloric 10% (kl/tt) EP 9.4 Merck, Đức

Natri hydroxid BP 2017 Merck, ĐứcNước cất pha tiêm TCCS Công ty cổ phẩn Nanogen,

Việt Nam

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất dung môi

Hóa chất, dung môi Tiêu chuẩn Nhà sản xuất

Dinatri tetraborat Hóa chất Honeywell Fluka, MỹAcid sulfuric 98% (kl/kl) Hóa chất Merck, Đức

Nicotinamid Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm thuốc TP

Hồ Chí Minh(số lô: QT054 111116)

Kali hydroxid Hóa chất Merck, Đức

Tryptone casein soya broth Hóa chất Merck, Đức

Bảng 2.3 Danh mục trang thiết bị bào chế và kiểm nghiệm

Cân phân tích Sartorius CPA225D

Bể cách thủy Zhengzhou Greatwall HWCL-3

Memmert WNB 22

Soniclean 500HD

Máy khuấy từ gia nhiệt Labtech LMS-1003

Hệ thống bay hơi dưới áp suất giảm Zhengzhou Greatwall

Máy đo quang phổ huỳnh quang Hitachi F-7100

Máy đo quang phổ UV-Vis Thermo scientific Evolution 220

Lưới thép kích thước 50 mesh (300 µm) WS Tyler

Lưới thép kích thước 200 mesh (75 µm) WS Tyler

Máy đông khô Shanghai Pharma LYO-7.5Máy hấp tiệt trùng Sturdy SA-300VF

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng natri hyaluronat trong thuốc tiêm natri hyaluronat liên kết chéo 24 mg/ml

Phương pháp định lượng natri hyaluronat bằng phương pháp quang phổ UV-Vis.Các chỉ tiêu được thẩm định bao gồm: độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độchính xác, khoảng xác định

Phương pháp định lượng hàm lượng natri hyaluronat thông qua hàm lượng acidglucuronic dựa vào phản ứng giữa acid glucuronic với carbazol [33]

Chất chuẩn: sử dụng nguyên liệu natri hyaluronat (kết quả định lượng đạt 99,8%)

làm chất chuẩn

Điều kiện phương pháp quang phổ UV-Vis

- Thuốc thử A: Hòa tan 0,95 g dinatri tetraborat trong 100 ml acid sulfuric 98%

(kl/kl)

- Thuốc thử B: Hòa tan 0,125 g carbazol vào 100 ml ethanol khan.

- Dung dịch chuẩn gốc: dung dịch 0,5 mg/ml natri hyaluronat trong nước cất Cân

chính xác khoảng 50 mg natri hyaluronat cho vào bình định mức (BĐM) 100 ml,thêm khoảng 50 ml nước cất, siêu âm cho tan, thêm nước cất vừa đủ đến vạch, lắcđều

- Dung dịch chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng để đạt các dung dịch chuẩn

có nồng độ lần lượt là: 0,10 mg/ml natri hyaluronat, 0,15 mg/ml natri hyaluronat,0,20 mg/ml natri hyaluronat, 0,25 mg/ml natri hyaluronat, 0,30 mg/ml natrihyaluronat

- Mẫu trắng: nước cất pha tiêm.

- Dung dịch mẫu thử bán thành phẩm 1 (áp dụng cho việc lựa chọn công thức

sau khi làm giảm kích thước tiểu phân gel): Cân 20-30 mg gel natri hyaluronat vàoống nghiệm có nắp đậy, thêm chính xác 1,0 ml nước cất vào ống nghiệm có nắpđậy, lắc đều

- Dung dịch mẫu thử bán thành phẩm 2 (áp dụng cho việc xác định hàm lượng natri hyaluronat sau khi làm giảm kích thước tiểu phân gel): Cân chính xác khoảng

300 mg gel natri hyaluronat cho vào cốc có mỏ 25 ml, thêm 1 ml acid sulfuric 98%(kl/kl), lắc cho tan, chuyển toàn bộ dung dịch trên vào BĐM 10 ml, tráng cốc có mỏ

2 lần, mỗi lần 3 ml nước cất, thêm từ từ nước cất đến vạch, lắc đều Lặp lại 2 lần đểthu được ba dung dịch mẫu thử bán thành phẩm

- Dung dịch mẫu thử thành phẩm: Cân chính xác khoảng 90 mg gel natri

hyaluronat cho vào cốc có mỏ 25 ml, thêm 1 ml acid sulfuric 98% (kl/kl), lắc chotan, chuyển toàn bộ dung dịch trên vào BĐM 10 ml, tráng cốc có mỏ 2 lần, mỗi lần

3 ml nước cất, thêm từ từ nước cất đến vạch, lắc đều Lặp lại 2 lần để thu được badung dịch mẫu thử

- Dung dịch giả dược: dung dịch tá dược không chứa hoạt chất Chuẩn bị mẫu tá

dược: cân và hòa tan các thành phần để thu được 10 ml dung dịch tá dược Cânchính xác khoảng 90 mg dung dịch tá dược trên cho vào cốc có mỏ 25 ml, thêm 1

ml acid sulfuric 98% (kl/kl), lắc cho tan, tráng cốc có mỏ 2 lần, mỗi lần 3 ml nướccất, chuyển toàn bộ dung dịch trên vào BĐM 10 ml, thêm từ từ nước cất đến vạch,lắc đều Lặp lại 2 lần để thu được ba dung dịch giả dược

Hút chính xác 1,0 ml mỗi dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu thử bán thành phẩm 1,dung dịch mẫu thử bán thành phẩm 2, dung dịch mẫu thử thành phẩm, dung dịchgiả dược cho vào ống nghiệm có nắp đậy, lặp lại 2 lần để thu được ba ống nghiệmmỗi dung dịch Hút chính xác 1,0 ml mẫu trắng cho vào ống nghiệm có nắp đậy.Các ống nghiệm chứa các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu thử bán thành phẩm 1,dung dịch mẫu thử bán thành phẩm 2, dung dịch mẫu thử thành phẩm, dung dịchgiả dược, mẫu trắng được làm lạnh trong bồn nước đá Thêm vào mỗi ống nghiệm5,0 ml thuốc thử A, đóng nắp lại và lắc đều Đặt các ống nghiệm vào trong bồn cáchthủy và đun trong 10 phút ở 95 C Sau đó, làm lạnh trong bồn nước đá 15 phút vàthêm vào mỗi ống nghiệm 0,2 ml thuốc thử B, đóng nắp lại và lắc đều Tiếp theo,đặt các ống nghiệm vào lại bồn cách thủy và đun trong 15 phút ở 95 C Để nguộicác ống nghiệm ở nhiệt độ phòng

- Bước sóng: 530 ± 2 nm.

Dùng mẫu trắng để hiệu chỉnh độ hấp thụ, tiến hành đo độ hấp thụ của các dungdịch chuẩn rồi tính kết quả trung bình độ hấp thụ ở mỗi nồng độ Vẽ đồ thị biếnthiên giữa nồng độ dung dịch và độ hấp thu Lập phương trình hồi quy và xác lập hệ

Trong đó: Csample: Nồng độ natri hyaluronat trong dung dịch mẫu thử

(mg/ml) được tính dựa trên đường tuyến tính chuẩn

C%: Hàm lượng chuẩn natri hyaluronat (%)V: Thể tích của dung dịch mẫu thử (1 ml)D: Khối lượng riêng của mẫu thử (g/ml)

msample: Khối lượng cân của mẫu thử (g)Công thức tính hàm lượng natri hyaluronat trong dung dịch mẫu thử bán thànhphẩm 2:

ℎà𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 (𝑚𝑔/𝑚𝑙) = 𝐶𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 × 𝐶% × 𝑉 × 𝐷

Trong đó: Csample: Nồng độ natri hyaluronat trong dung dịch mẫu thử

(mg/ml) được tính dựa trên đường tuyến tính chuẩnC%: Hàm lượng chuẩn natri hyaluronat (%)

V: Thể tích của dung dịch mẫu thử (10 ml)D: Khối lượng riêng của mẫu thử (g/ml)

msample: Khối lượng cân của mẫu thử (g)Công thức tính định lượng natri hyaluronat trong thành phẩm:

đị𝑛ℎ 𝑙ượ𝑛𝑔 (%) = 𝐶𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 × 𝐶% × 𝑉 × 𝐷

100𝐿Trong đó: Csample: Nồng độ natri hyaluronat trong dung dịch mẫu thử

(mg/ml) được tính dựa trên đường tuyến tính chuẩnC%: Hàm lượng chuẩn natri hyaluronat (%)

V: Thể tích của dung dịch mẫu thử (10 ml)D: Khối lượng riêng của mẫu thử (g/ml)

msample: Khối lượng cân của mẫu thử (g)L: Hàm lượng natri hyaluronat trên nhãn (24 mg/ml)Kết quả định lượng natri hyaluronat trong thành phẩm là giá trị định lượng trungbình 3 dung dịch mẫu thử thành phẩm

- Tiêu chuẩn:

 Hệ số tương quan R2 ≥ 0,998

 % định lượng natri hyaluronat trong mẫu thành phẩm nằm trong khoảng

90 – 110% hàm lượng trên nhãn tương ứng với 21,6 mg/ml – 26,4 mg/ml

 Xác định hàm lượng natri hyaluronat trong mẫu bán thành phẩm

Aplacebo: Độ hấp thu dung dịch giả dược

ASTD_0,2: Độ hấp thu dung dịch chuẩnV: Thể tích của dung dịch mẫu giả dược (10 ml)D: Khối lượng riêng của mẫu giả dược (g/ml)

Mplacebo: Khối lượng cân của mẫu giả dược (g)L: Hàm lượng natri hyaluronat trên nhãn (24 mg/ml)

- Tiêu chuẩn:

 Mẫu giả dược không cho phổ hấp thụ UV trong khoảng bước sóng 350-800 nm

 Phổ đồ của dung dịch mẫu thử thành phẩm phải tương đương với dung dịchchuẩn trong khoảng bước sóng 350-800 nm

 Hệ số ảnh hưởng của dung dịch giả dược ≤ 2%

2.2.1.2 Tính tuyến tính

Cách pha chế như mô tả ở phần dung dịch chuẩn

- Tiến hành: Đo độ hấp thu của các dung dịch chuẩn, mỗi dung dịch 3 lần Vẽ đồ thị

biến thiên giữa nồng độ dung dịch và độ hấp thu Lập phương trình hồi quy và xử lý

thống kê để xác định ý nghĩa của các hệ số của phương trình và ý nghĩa của hệ sốtương quan R2.

- Tiêu chuẩn: hệ số tương quan R2 ≥ 0,998

Bảng 2.4 Cách pha mẫu thử độ đúng tương ứng với dung dịch mẫu thử thành phẩm

Đo độ hấp thu của các dung dịch

Tính tỉ lệ hồi phục theo công thức:

𝐹 = 𝑙ượ𝑛𝑔 ℎ𝑜ạ𝑡 𝑐ℎấ𝑡 𝑡ì𝑚 𝑙ạ𝑖𝑙ượ𝑛𝑔 ℎ𝑜ạ𝑡 𝑐ℎấ𝑡 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 × 100

- Tiêu chuẩn: tỉ lệ hồi phục của phương pháp phải nằm trong khoảng từ 98-102%.

Phương pháp xác định nồng độ BĐE bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang.Các chỉ tiêu được thẩm định bao gồm: độ đặc hiêu, tính tuyến tính, giới hạn pháthiện (LOD).

Phương pháp xác định nồng độ BĐE thông qua việc đo cường độ phát huỳnhquang được tạo ra giữa BĐE và nicotinamid [10]

Điều kiện phương pháp quang phổ huỳnh quang

- Dung dịch thuốc thử: dung dịch nicotinamid 0,125 M, dung dịch acetophenon

15% (tt/tt) trong ethanol khan, dung dịch KOH 1 M, dung dịch acid formic

- Dung dịch chuẩn gốc: dung dịch 0,4 mg/ml BĐE trong nước cất Cân chính

xác khoảng 40 mg BĐE cho vào BĐM 100 ml, thêm nước cất vừa đủ đến vạch,lắc đềụ

- Dung dịch chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng để đạt các dung dịch chuẩn

có nồng độ lần lượt là: 0,5 µg/ml BĐE (dung dịch chuẩn C1), 1,0 µg/ml BĐE(dung dịch chuẩn C2), 2,0 µg/ml BĐE (dung dịch chuẩn C3), 4,0 µg/ml BĐE(dung dịch chuẩn C4), 8,0 µg/ml BĐE (dung dịch chuẩn C5)

- Mẫu trắng: nước cất.

- Dung dịch mẫu thử bán thành phẩm: Cân chính xác khoảng 0,25 g dung dịch

natri hyaluronat sau khi phản ứng với BĐE cho vào cốc có mỏ 100 ml, thêm chínhxác 50 ml nước cất, lắc ở tốc độ 50 vòng/phút trên máy lắc trong vòng 24 giờ Lọcqua màng lọc 0,22 µm Lặp lại 1 lần nữa để thu được dung dịch mẫu thử bán thànhphẩm thứ haị

- Dung dịch mẫu thử thành phẩm: Cân chính xác khoảng 0,55 g gel natri

hyaluronat cho vào lọ 5 ml, thêm chính xác 1 ml nước cất, lắc ở tốc độ

50 vòng/phút trên máy lắc trong vòng 24 giờ Lọc qua màng lọc 0,22 µm Lặp lại 1

lần nữa để thu được dung dịch mẫu thử thành phẩm thứ hai

- Dung dịch giả dược bán thành phẩm: dung dịch không chứa BDDE Chuẩn bị

mẫu tá dược bán thành phẩm: cân và hòa tan nguyên liệu HA trong dung dịch

NaOH để thu được 5 ml dung dịch tá dược bán thành phẩm Cân chính xác khoảng

0,25 g dung dịch tá dược cho vào cốc có mỏ 100 ml, thêm chính xác 50 ml nước

cất, lắc ở tốc độ 50 vòng/phút trên máy lắc trong vòng 24 giờ Lọc qua màng lọc

0,22 µm Lặp lại 1 lần nữa để thu được dung dịch giả dược bán thành phẩm thứ hai

- Dung dịch giả dược thành phẩm: dung dịch đệm phosphat lọc qua màng lọc

0,22 µm Chuẩn bị hai dung dịch giả dược

Hút 200 µL mỗi dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu thử bán thành phẩm, dung dịch

mẫu thử thành phẩm, dung dịch giả dược bán thành phẩm, dung dịch giả dược thành

phẩm, mẫu trắng cho vào ống nghiệm có nắp đậy Thêm vào mỗi ống nghiệm

100 µL dung dịch nicotinamid 0,125 M, đóng nắp lại và lắc đều Đặt các ống

nghiệm vào trong bồn cách thủy trong 2 giờ ở 37 C Thêm vào mỗi ống nghiệm

1 ml dung dịch acetophenon 15% (tt/tt) trong ethanol khan và 1 ml dung dịch KOH 1M Sau đó, làm lạnh các ống nghiệm này trong bồn nước đá 20 phút và thêm

vào mỗi ống nghiệm 5 ml acid formic, đóng nắp lại và lắc đều Tiếp theo, đặt các

ống nghiệm vào lại bồn cách thủy và đun trong 5 phút ở 60 C Sau đó, các ống

nghiệm được làm lạnh trong bồn nước đá 15 phút và để ổn định ở nhiệt độ phòng 15

phút trước khi đo

- Bước sóng kích thích: 370 ± 2,5 nm

- Bước sóng phát xạ: 430 ± 2,5 nm

Dùng mẫu trắng để hiệu chỉnh cường độ huỳnh quang, tiến hành đo cường độ

huỳnh quang của các dung dịch chuẩn Vẽ đồ thị biến thiên giữa nồng độ dung dịch

và cường độ huỳnh quang (FI) Lập phương trình hồi quy và xác lập hệ số tương

quan R2

Tính nồng độ BDDE còn lại sau phản ứng theo công thức sau:

𝑛ồ𝑛𝑔 độ (µ𝑔/𝑚𝑙) = 𝐶𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 × 𝑚𝑑𝑑

𝑉𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒

𝑉𝑑𝑑Trong đó: Csample: Nồng độ BDDE trong dung dịch mẫu thử (µg/ml) được

tính dựa trên đường tuyến tính chuẩn

mdd: Khối lượng cân của dung dịch natri hyaluronat trước

phản ứng (g)

msample: Khối lượng cân của mẫu thử (g)

Vsample: Thể tích của mẫu thử (ml)

Vdd: Thể tích của dung dịch natri hyalruonat trước phản ứng

(ml) Nồng độ BDDE sau phản ứng trong dung dịch mẫu thử được xác định là giá trị trung bình của nồng độ BDDE sau phản ứng trong dung dịch mẫu thử

trong khoảng bước sóng 320-720 nm

 Đo cường độ huỳnh quang của các dung dịch giả dược

- Tiêu chuẩn: các thành phần trong dung dịch giả dược không ảnh hưởng đến cường

độ huỳnh quang của BDDE

2.2.2.2 Tính tuyến tính

Cách pha chế như mô tả ở phần dung dịch chuẩn