Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số dẫn chất hydrazid hydrazon của acid benzofuran 2 carboxylic

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞBÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT HYDRAZID-HYDRAZO

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT HYDRAZID-HYDRAZON CỦA

ACID BENZOFURAN-2-CARBOXYLIC

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: ĐH Y dược Tp Hồ Chí Minh

Chủ trì nhiệm vụ: TS Phạm Ngọc Tuấn Anh

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT HYDRAZID-HYDRAZON CỦA

ACID BENZOFURAN-2-CARBOXYLIC

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày ………… )

Cơ quan chủ quản

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH Error! Bookmark not defined. 1.2 NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDRAZON 8

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CÁC HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DẪN CHẤT BENZOFURAN 12

1.4 NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP DẪN CHẤT CÓ CẤU TRÚC 5,7- DIBROMOBENZOFURAN-2-CARBOHYDRAZON 15

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 TỔNG HỢP 3,5-DIBROMO SALICYLALDEHYD 31

3.2 TỔNG HỢP ETHYL 5,7-DIBROMOBENZOFURAN-2-CARBOXYLAT 32 3.3 TỔNG HỢP 5,7-DIBROMOBENZOFURAN-2-CARBOHYDRAZID 39

3.4 TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT HYDRAZON CỦA 5,7-DIBROMOBENZOFURAN-2-CARBOHYDRAZID 40

3.5 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 53

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

4.1 KẾT LUẬN 54

4.2 ĐỀ NGHỊ 54

CFU Colony - forming unit (đơn vị khuẩn lạc)

MRSA Staphylococcus aureus kháng methicillin

MSSA Staphylococcus aureus nhạy methicillin

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Loại E coli mang gen Mcr-1 có khả năng kháng colistin 6

Hình 1.2 Lịch sử phát triển các thuốc kháng sinh 8

Hình 1.3 Cấu trúc các kháng sinh nitrofurazon, furazolidon, nitrofurantoin 9

Hình 1.4 Cấu trúc dẫn chất acid 4-fluorobenzoic ((5-nitro-2-furyl)methylen) hydrazid 9

Hình 1.5 Cấu trúc benzimidazol có hoạt tính kháng Salmonella typhimurium 10

Hình 1.6 Cấu trúc dẫn chất isonicotinoyl hydrazid 10

Hình 1.7 Cấu trúc các dẫn chất methylthiadiazol 11

Hình 1.8 Cấu trúc các dẫn chất hydrazid của acid nicotinic 11

Hình 1.9 Cấu trúc các dẫn chất của benzohydrazid 12

Hình 1.10 Dẫn chất N'-(5-cloro-2-hydroxybenzyliden)-4-(trifluoromethyl) benzohydrazid 12

Hình 1.11 Cấu trúc dẫn chất benzofuran của Abdel-Wahab và các cộng sự 13

Hình 1.12 Các dẫn chất benzofuran có hoạt tính mạnh trên MRSA do Jiang, X Liu và các cộng sự 14

Hình 1.13 Các dẫn chất benzofuran của Jingbao Liu và các cộng sự (năm 2012) 14

Hình 1.14 Cấu trúc các dẫn chất 2-salicyloylbenzofuran 15

Hình 1.15 Điều kiện phản ứng tổng hợp dẫn chất ethyl benzofuran-2-carboxylat 16

Hình 1.16 Quy trình tổng hợp dẫn chất ethyl benzofuran-2-carboxylat của Junqiang Liu và các cộng sự 16

Hình 1.17 Quy trình tổng hợp các dẫn chất benzofuran-2-hydrazon của Muhammad Taha và các cộng sự 17

Hình 1.18 Điều kiện tổng hợp benzofuran-2-carbohydrazon do Anna Baldisserotto và các cộng sự 17

Hình 2.1 Khung cấu trúc 5,7-dibromofuran-2-carbohydrazon 18

Hình 2.2 Điều kiện phản ứng tổng hợp 3,5-dibrmosalicylaldehyd 22

Hình 2.3 Cơ chế của phản ứng tổng hợp dẫn chất ethyl 3,5-dibromobenzofuran-2-carboxylat 22

Hình 2.4 Cơ chế của phản ứng tổng hợp dẫn chất

3,5-dibromobenzofuran-2-carbohydrazid 23

Hình 2.5 Cơ chế phản ứng tổng hợp các dẫn chất 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazon 23

Hình 3.1 Sắc ký đồ của 3,5-dibromosalicylaldehyd 32

Hình 3.2 Sắc ký đồ của ethyl-3,5-dibromobenzofuran-2-carboxylat 33

Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi 36

Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ mol nguyên liệu 3 37

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ kiềm 38

Hình 3.6 Sắc ký đồ của 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazid 39

Hình 3.7 Sắc ký đồ của sản phẩm 7a 43

Hình 3.8 Sắc ký đồ của sản phẩm 7b 44

Hình 3.9 Sắc ký đồ của sản phẩm 7c 45

Hình 3.10 Sắc ký đồ của sản phẩm 7d 46

Hình 3.11 Sắc ký đồ của sản phẩm 7e 47

Hình 3.12 Sắc ký đồ của sản phẩm 7f 48

Hình 3.13 Sắc ký đồ của sản phẩm 7g 49

Hình 3.14 Sắc ký đồ của sản phẩm 7h 50

Hình 3.15 Sắc ký đồ của sản phẩm 7k 51

Hình 3.16 Sắc ký đồ của sản phẩm 7l 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Cơ chế đề kháng kháng sinh của một số loại kháng sinh 3

Bảng 3.1 Bảng kết quả khảo sát dung môi tổng hợp sản phẩm 4 35

Bảng 3.2 Bảng kết quả khảo sát tỉ lệ mol nguyên liệu 36

Bảng 3.3 Bảng kết quả khảo sát tỉ lệ kiềm tổng hợp sản phẩm 4 38

Bảng 3.4 Kết quả phản ứng tổng hợp dẫn chất 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazid 7a-l 42

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng quát tổng hợp dẫn xuất 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazid 7a-l 21

Việc kiểm soát các loại bệnh nhiễm khuẩn có tỉ lệ mắc cũng như tử vong cao gặp trởngại bởi tình trạng đề kháng kháng sinh[1] Đề kháng thuốc kháng sinh, được WHOđánh giá là một vấn đề toàn cầu, gây ra nhiều khó khăn, tốn kém trong điều trị y khoa

và trở thành một gánh nặng của xã hội [2]

Một trong những loại vi khuẩn đa đề kháng thuốc kháng sinh đang được chú ý nghiên

cứu hiện nay là các chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) MRSA

đề kháng hầu hết các kháng sinh đang sử dụng hiện nay.Trong các nghiên cứu gầnđây của WHO đánh giá Việt Nam và một số quốc gia đang phát triển khác có tỉ lệbệnh nhân nhiễm MRSA cao nhất thế giới [3] Đứng trước thực trạng này, cần thiếtphải có sự hợp tác toàn cầu nhằm hướng tới giải quyết các thách thức của tình trạng

đề kháng kháng sinh, trong đó cần phải thúc đẩy việc nghiên cứu, tìm kiếm nhữngkháng sinh mới điều trị bệnh nhiễm khuẩn đa đề kháng nói chung và MRSA nói riêng.Trong quá trình tham khảo tài liệu, nhóm nghiên cứu nhận thấy những dẫn chất cócấu trúc hydrazon sở hữu nhiều hoạt tính sinh học như kháng viêm, chống kết tập tiểucầu, chống phân bào và đặc biệt có hoạt tính trên vi sinh vật như: kháng lao, khángnấm, kháng ký sinh trùng sốt rét Trong đó, một số dẫn chất như benzimidazol [4],isoniazid [5], nifuroxazid [6], furatsillin [7], furadonin [7] và nhiều dẫn chất khác [8a], [8b], [8c] đã và đang được nghiên cứu có phổ kháng khuẩn rộng với hoạt tính mạnh ngay cảtrên chủng đề kháng kháng sinh như MRSA Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cho

hydroxybenzoyl)-5-methyl-2-(4-methoxyphenyl) benzofuran [9] và methoxyphenyl)benzofuran-6-ol [10] có tác dụng mạnh trên các chủng vi khuẩn baogồm cả chủng MRSA Qua đó cho thấy, những dẫn chất có cấu trúc phối hợp giữabenzofuran với hydrazon là những dẫn chất có triển vọng kháng được các chủng vikhuẩn đề kháng kháng sinh như MRSA.

2-(4-Từ những luận điểm ở trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tổng

hợp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số dẫn chất hydrazid-hydrazon của acid benzofuran-2-carboxylic” với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Tổng hợp 5,7-dibromobenzofuran-2-carboxylic và dẫn chất hydrazid

2 Tổng hợp dẫn chất hydrazon của 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazid

3 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp bằng phổ IR, MS, 1H-NMR

4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất đối với các chủng vi khuẩn:

Staphylococcus aureus ATCC 29213 nhạy methicillin (MSSA), Staphylococcus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA), Streptococcus faecalis ATCC

29212, Escherichia coli ATCC 25922.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH

Thuốc kháng sinh là tất cả những chất hóa học - không kể nguồn gốc - tác độngchuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hóa thiết yếu của vi sinh vật Để có thể sửdụng trị liệu, các thuốc kháng sinh cần gây độc cho vi khuẩn nhưng không gây độccho người, tức là có tính chọn lọc

1.1.2 Tình trạng đề kháng kháng sinh

Định nghĩa

Đề kháng kháng sinh là hiện tượng vi sinh vật đề kháng lại một kháng sinh mà trướcđây vi sinh vật đã nhạy cảm, dẫn đến giảm hiệu quả của kháng sinh, thất bại trongđiều trị nhiễm khuẩn và thậm chí là lây lan sang các bệnh nhân khác Kháng khángsinh là một hậu quả của sử dụng kháng sinh, đặc biệt trong trường hợp lạm dụngkháng sinh và phát triển khi vi sinh vật đột biến hoặc có gen kháng thuốc [11]

Một số cơ chế đề kháng kháng sinh

β –lactam

Ampicillin,Cephamycin,Meropenem,Aztreonam

Ức chế sự sinhtổng hợp vách tếbào

Thủy giải, thay đổi

sự vận chuyển khángsinh, biến đổi cấutrúc đích

Aminoglycosid

Gentamicin,Streptomycin,Spectinomycin

Ức chế sự sinhtổng hợp protein

Phosphoryl hóa,

nucleotidyl hóa, biếnđổi sự vận chuyển

kháng sinh, biến đổicấu trúc đích

Glycopeptid Vancomycin,

Teicoplanin

Ức chế sự sinhtổng hợp vách tếbào

Thay đổi chu trìnhsinh tổng hợp vách tếbào

Tetracyclin Minocyclin,

Tigecyclin

Ức chế sự sinhtổng hợp protein

Monooxygen hóa,thay đổi sự vậnchuyển kháng sinh,biến đổi cấu trúc đích

Azithromycin

Ức chế sự sinhtổng hợp protein

Thủy giải, glycosylhóa, phosphoryl hóa,thay đổi sự vậnchuyển kháng sinh,biến đổi cấu trúc đích

Clindamycin

Ức chế sự sinhtổng hợp protein

Nucleotidyl hóa,thay đổi sự vậnchuyển kháng sinh,biến đổi cấu trúc đích

Streptogramin Synercid Ức chế sự sinh

tổng hợp protein

Thay đổi sự vậnchuyển kháng sinh,biến đổi cấu trúc đích

Oxazolidinon Linezolid Ức chế sự sinh

tổng hợp protein

Thay đổi sự vậnchuyển kháng sinh,biến đổi cấu trúc đích

Phenicol Cloramphenicol Ức chế sự sinh

tổng hợp protein

Acetyl hóa, thay đổi

sự vận chuyển kháng

sinh, biến đổi cấutrúc đích

Quinolon Ciprofloxacin Ngăn cản sự sao

chép DNA

Acetyl hóa, thay đổi

sự vận chuyển khángsinh, biến đổi cấutrúc đích

Lipopeptid Daptomycin Gây rối loạn chức

năng bào tương

Biến đổi cấu trúcđích

Tình hình đề kháng kháng sinh trên thế giới

Tốc độ đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trên rất nhiều chủng vi khuẩn bao

gồm các chủng gây nhiễm khuẩn bệnh viện cũng như cộng đồng như Staphylococci,

Enterococci, Gonococci, Enterobacteria (E coli, Salmonella spp, Shigella spp), Pseudomonas spp, Acinetobacter spp, Mycobacterium tuberculosis [12], [14]

Tại Úc (1992) và Philippin (2001), ciprofloxacin đã được báo cáo thất bại trong điềutrị nhiễm khuẩn do lậu cầu [15] Đề kháng ciprofloxacin thậm chí được ghi nhận ở trẻ

em và người trưởng thành trước đó chưa từng sử dụng kháng sinh quinolon.[15] Tại

Barbados, Jamaica và Trinidad đã có báo cáo về chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae

kháng cephalosporin thế hệ 3 [16] Đáng lo ngại hơn, gần đây các nhà khoa học đã tìmthấy sự xuất hiện cơ chế đề kháng của gen Mcr-1, một loại gen đột biến trong vikhuẩn, ở động vật và con người Trung Quốc, có khả năng kháng lại colistin, mộttrong các lựa chọn cuối cùng trong điều trị nhiễm khuẩn [17] Vào đầu năm 2016 một

loại E.coli mang gen Mcr-1 này cũng đã được tìm thấy trong nước tiểu của một phụ

nữ 49 tuổi, bang Pennsylvania, Hoa kỳ [18]

Hình 1.1 Loại E.coli mang gen Mcr-1 có khả năng kháng colistin [19]

Tỷ lệ tử vong cao trên các bệnh nhân nhiễm khuẩn đa kháng thuốc Khoảng 25.000bệnh nhân tử vong hằng năm do các vi khuẩn đa kháng thuốc gây ra ở Châu Âu.Trong khi MRSA gây ra khoảng 90.000 ca bệnh và làm khoảng 19.000 người tử vongmỗi năm ở Mỹ [12], [20] Chi phí điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đa kháng thuốc rất cao.Chi phí mỗi năm khoảng 1,5 tỉ Euro (Châu Âu) và 20 tỉ USD (Mỹ) [12],[21]

Tình hình đề kháng kháng sinh tại Việt Nam

Phế cầu Streptococcus pneumonia, một trong những nguyên nhân thường gặp nhất

gây nhiễm khuẩn hô hấp, có tỷ lệ kháng penicillin là 71,4% và kháng erythromycin

là 92,1%, được ghi nhận là cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát cáccăn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001[22]

Theo một nghiên cứu năm 2000-2001, hơn 25% số chủng vi khuẩn phân lập được tạimột bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh đề kháng với kháng sinh cephalosporin thế

hệ 3 [22] Từ năm 2000, tỷ lệ Haemophilus influenza kháng ampicillin là 57% tại bệnh

viện Nhi Trung Ương và tại các bệnh viện ở Nha Trang [22] Một nghiên cứu khác vàonăm 2009 chỉ ra 42% các chủng vi khuẩn Gram (-) kháng với ceftazidim, 63% khángvới gentamicin và 74% kháng với acid nalidixic tại bệnh viện cũng như trong cộng

Kết quả nghiên cứu vào năm 2008 tại bệnh viện Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minhcho thấy các vi khuẩn Gram (-) không lên men đường đề kháng cao (60%) vớipenicillin và gentamicin, (36-55%) với imipenem, meropenem, cephalosporin thế hệIII, IV và levofloxacin Nhóm cầu khuẩn Gram (+) đề kháng các kháng sinh nhómquinolon và penicillin tới 60% [23].

Vào những năm 1990, tại Thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các chủng phế cầu đềkháng với penicillin, nhưng tỷ lệ này đã tăng tới 56% vào năm 1999-2000, tại cáctỉnh phía Bắc Việt Nam cũng có những báo cáo tương tự [22]

Tốc độ đề kháng kháng sinh đang tăng đột biến theo thời gian, nguyên nhân có thể

do tình trạng sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi không được kiểm soát Tốc độ đềkháng sẽ ngày một gia tăng trừ khi chính phủ các nước trên thế giới phải lập tức thựchiện những biện pháp quyết liệt

1.1.3 Nghiên cứu phát triển kháng sinh mới

Sự phát triển các thuốc kháng sinh bắt đầu vào những năm 1930 với các sulfonamid

và β-lactam mang lại những tác động y học rất lớn Theo sau là một khoảng thời gian

40 năm thành công trong việc phát hiện các kháng sinh với trên 20 nhóm kháng sinhđược khám phá và sử dụng Sau một thời gian dài không có một kháng sinh thực sựnào được phát hiện, chỉ một vài nhóm kháng khuẩn mới được xác định trong thiênniên kỷ hiện tại như oxazolidinon (linezolid), lipopeptid (daptomycin), glycylcyclin(tigecyclin), mutilin (retapamulin) Theo một thống kê, trong số 225 thuốc mới tronggiai đoạn 1998-2002 thì chỉ có 7 hoạt chất là kháng sinh, chiếm tỷ lệ 3% [24], [25]

Hình 1.2 Lịch sử phát triển các thuốc kháng sinh

Theo như nhận định của Hiệp hội các bệnh nhiễm khuẩn Hoa Kỳ (IDSA), trong vòng

10 năm tới (2020), cần phải có ít nhất 10 nhóm thuốc kháng sinh mới để điều trị cácbệnh nhiễm khuẩn do các chủng đa kháng thuốc gây ra [26], [27] Hiện tại có 40 hoạtchất trong đó 11 hoạt chất thuộc các nhóm kháng sinh mới đang trong các giai đoạnthử nghiệm lâm sàng Các hoạt chất mới này có nguồn gốc từ thiên nhiên cũng nhưtổng hợp với cơ chế tác dụng khác nhau, đặc biệt một số hoạt chất tác dụng theo các

cơ chế hoàn toàn mới [24]

1.2 NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDRAZON

Những năm gần đây, nhiều dẫn chất của hydrazon đã được tổng hợp và nghiên cứu

hoạt tính kháng khuẩn in vitro cho kết quả khả quan Một vài dẫn chất trong số đó đã

được phát triển và đưa ra thương mại hóa thành các kháng sinh điều trị bệnh như:

nitrofurazon (1), furazolidon (2) có tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram (+) [28], và

nitrofurantoin (3) (Hình 1.3) [29]

Hình 1.3 Cấu trúc các kháng sinh nitrofurazon, furazolidon, nitrofurantoin

Rollas và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất hydrazid hydrazon của acid

4-fluorobenzencarbohydrazid (4) (Hình 1.4) và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

trên S aureus, E coli, P Aeruginosa và C albicans Kết quả cho thấy dẫn chất 4 có hoạt lực kháng khuẩn tương đương ceftriaxon trên S aureus [30]

Hình 1.4 Cấu trúc dẫn chất acid 4-fluorobenzoic ((5-nitro-2-furyl)methylen)hydrazid

Các hợp chất benzimidazol có chứa nhóm chức hydrazon đã được tổng hợp và sànglọc bởi Özkay và các cộng sự cho thấy khả năng kháng khuẩn tốt [31] Trong các hợp

chất benzimidazol được tổng hợp, chất 5 và 6 (Hình 1.5) có tác dụng diệt khuẩn

Salmonella typhimurium tốt hơn tác dụng của chloramphenicol (MIC = 12,5 μg/ml),

là chất được dùng làm mẫu chứng Ngoài ra, các dẫn chất trên còn thể hiện hoạt tính

kháng các vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella

pneumoniae hay Pseudomonas aeruginosa (MIC = 25–100 μg/ml), kháng được các

vi khuẩn Gram dương như Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,

Enterococcus faecalis và Bacillus subtilis khá tốt (MIC = 25–200 μg/ml) Trong đó,

khả năng đề kháng của 2 dẫn chất trên đối với E faecalis bằng với chloramphenicol

(MIC = 12,5 μg/ml)

Hình 1.5 Cấu trúc benzimidazol có hoạt tính kháng Salmonella typhimurium

Trong số các dẫn chất isonicotinoyl hydrazid được tổng hợp bởi Moldovan và các

cộng sự (năm 2011), hợp chất 7 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất Dẫn xuất

hydrazon hydrazid này có hoạt tính kháng khuẩn tương tự ampicillin (ZOI = 16 mm)

(ZOI = 15 mm) trên S aureus (Hình 1.6) Hoạt tính kháng vi khuẩn gram (+) khác (Bacillus cereus) và vi khuẩn gram (–) (E coli, Salmonella thyphimurium, Proteus

mirabilis và Salmonella enterica) là tốt đến trung bình (ZOI = 12-17 mm), khi so

sánh với các kháng sinh được sử dụng làm đối chứng: ampicillin, ciprofloxacin,gentamicin và co-trimoxazol [32]

Hình 1.6 Cấu trúc dẫn chất isonicotinoyl hydrazid

Trong một nghiên cứu khác, Kodisundaram và các cộng sự (năm 2013) đã thu được

một loạt hydrazon dị vòng methylthiadiazol Hai trong số các hợp chất tổng hợp 8 và

9 (Hình 1.7), có hoạt tính kháng B subtilis (MIC = 6,25 μg/ml) mạnh gấp hai lần so

với hoạt tính của mẫu đối chứng streptomycin (MIC = 12,5 μg/ml) Đối với vi khuẩn

gram âm, các hợp chất tổng hợp này cho thấy hoạt tính kháng K peneumoniae (MIC

= 6,25 μg/ml) gấp hai lần mẫu chứng streptomycin (MIC = 12,5 μg/ml), trong khi đó

với P aeruginosa, hợp chất 9 cho thấy hoạt tính tương đương với streptomycin (MIC

= 12,5 μg/ml) Hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của E Coli cũng cao gấp hai lần (MIC

= 12,5 μg/ml) so với đối chứng (MIC = 25 μg/ml) [33]

Hình 1.7 Cấu trúc các dẫn chất methylthiadiazol

Năm 2014, Morjan và cộng sự đã tổng hợp hydrazid mới hydrazon của acid nicotinic(Hình 1.8) Kết quả cho thấy các hợp chất được tổng hợp có hoạt tính kháng các

chủng Gram-(-) Đặc biệt là các hợp chất 10 và 11 cho thấy hoạt tính đáng chú ý đối

với P aeruginosa (MIC = 0,22 và 0,19 μg/ml) Hoạt tính của các hợp chất này chống

lại K pneumoniae khá tốt (10 với MIC = 3,12 μg/ml, 11 với MIC = 14,00 μg/ml).

Ngoài ra hoạt tính kìm khuẩn ở vi khuẩn gram dương Streptococcus pneumoniae ( 10

với MIC = 3,12 μg/ml) và kháng khuẩn S aureus (11 với MIC = 7,03 μg/ml) cũng

đáng kể [34]

Hình 1.8 Cấu trúc các dẫn chất hydrazid của acid nicotinic

Năm 2016, Dommati và các cộng sự thu được các dẫn xuất mới của benzohydrazid

và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in-vitro (Hình 1.9) Các hợp chất 12 và 13 thể hiện

hoạt tính cao nhất, nhưng vẫn yếu hơn mẫu đối chứng streptomicin trên các vi khuẩn

gram âm: E coli MTCC 2692 và P aeruginosa MTCC 2453 (ZOI = 5-13 mm) và vi khuẩn gram dương: S aureus MTCC 902 và B subtilis MTCC 441 (ZOI = 18-21

mm) [35]

Hình 1.9 Cấu trúc các dẫn chất của benzohydrazid

Trong công bố năm 2017, Martin Krátky´ và các cộng sự đã tổng hợp và đánh giá

hoạt tính kháng khuẩn của một số dẫn chất hydrazon trong đó có dẫn chất 14 (Hình

1.10) nổi bật có tác dụng tốt trên nhiều chủng vi khuẩn như: S aureus CCM 4516/08; MRSA H 5996/08; Staphylococcus epidermidis H 6966/08, thấp hơn so với mẫu

chứng chứa Bacitracin [36]

Hình 1.10 Dẫn chất N'-(5-cloro-2-hydroxybenzyliden)-4-(trifluoromethyl) benzohydrazid

Qua các tài liệu trên cho chúng ta thấy các dẫn chất mang cấu trúc hydrazon có nhiều

triển vọng kháng được vi khuẩn S aureus và nhất là các chủng MRSA.

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ CÁC HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DẪN CHẤT BENZOFURAN

Trong những công bố gần đây, nhiều cấu trúc benzofuran thể hiện khả năng ức chếenzym, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống khối u vàchống Alzheimer Trong đó, các dẫn chất benzofuran cho thấy hoạt tính kháng khuẩntiềm năng, chống lại được nhiều loại vi khuẩn Gram (+) và Gram (–), ngay cả trênnhững chủng đề kháng thuốc như MRSA

Abdel-Wahab và các cộng sự (năm 2008) đã tổng hợp một số các dẫn chất benzofuran

mới có hoạt tính sinh học chống lại các vi khuẩn (+) (Staphylococcus aureus, B.

subtilis), vi khuẩn Gram (–) (E coli) và nấm (C albicans và Aspergillus niger) Trong

số các chất được tổng hợp, dẫn chất 2-(3-(benzofuran-2-yl)-5-phenyl-

4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)-phenylthiazol (15) có bán kính vòng kháng khuẩn đối với S aureus

là 17 mm, nhỏ hơn vòng kháng khuẩn của mẫu đối chứng (amoxicillin) là 20 mm(Hình 1.11) [37]

Hình 1.11 Cấu trúc dẫn chất benzofuran của Abdel-Wahab và các cộng sự

Năm 2011, Jiang, X Liu và các cộng sự đã tổng hợp 1 dãy 13 dẫn chất benzofuranmới mang các nhóm thế aryl ở C-3 thông qua liên kết methanon, trong đó có 3 dẫn

chất có nhóm hydroxyl ở vị trí C-4’ (16, 17 và 18) và 1 dẫn chất có nhóm hydroxyl ở C-3’(19) có hoạt tính kháng MRSA (MIC của 17 và 18 là 0,78 µg/ml, MIC của 16 và

19 là < 0,39 µg/ml), tương đương với mẫu đối chứng chứa Ceftazidim (MIC =0,78

39 µg/ml) và tốt hơn mẫu chứng chứa cefotaxim (MIC = 3,12 µg/ml) (Hình 1.12) [9]

Hình 1.12 Các dẫn chất benzofuran có hoạt tính mạnh trên MRSA của Jiang, X Liu và

các cộng sựNăm 2012, Jingbao Liu và các cộng sự đã công bố việc tổng hợp và đánh giá hoạttính kháng khuẩn của các dẫn chất benzofuran có nhóm methanon ở C-3 và các nhóm

thế ở C-6 Trong số các dẫn được tổng hợp, có 3 chất 20, 21, 22 (Hình 1.13) có tác

dụng kháng MRSA tốt nhất (MIC của 20, 21, 22 lần lượt là 1,56 µg/ml; 0,78 µg/ml;3,12 µg/ml), tốt hơn các mẫu đối chứng có chứa cefradin (MIC > 200 µg/ml),ceftazidim (MIC =12,5 µg/ml), cefotaxim (MIC = 3,12 µg/ml) và Natri Penicillin(MIC = 3,12 µg/ml) [10]

Hình 1.13 Các dẫn chất benzofuran của Jingbao Liu và các cộng sự

Năm 2017, trong 1 công bố của Phuong-Thuy T Phan và các cộng sự, các tác giả đãtiến hành tổng hợp các dẫn chất 2-salicyloylbenzofuran (Hình 1.14)và thử hoạt tínhkháng khuẩn của chúng Kết quả dẫn chất 3,5-dibromo-2-(2'-

hydroxybenzoyl)benzofuran (31) có hoạt tính kháng khuẩn yếu đối với S faecalis,

MSSA, MRSA và hoàn toàn không có hoạt tính kháng khuẩn đối với E coli Trong

quá trình cải thiện, tác giả đã tổng hợp nhiều dẫn chất khác nhau của

2-salicyloylbenzofuran Qua đó thu được dẫn chất (32) có hoạt tính tốt hơn và mạnh

nhất trong các dẫn chất (MIC = 0,06 – 0,12 mM) trên cả 3 chủng vi khuẩn Gramdương kể trên Ngoài ra, dẫn chất (32) cũng thể hiện hoạt tính kháng MRSA mạnh

nhất (MIC = 0,12 mM) so với các dẫn chất 2-salicyloylbenzofuran khác được tổnghợp, nhưng vẫn thấp hơn các mẫu đối chứng ampicillin (MIC = 0,05 mM), cefuroxim(MIC = 0,05 mM) và vancomycin (MIC = 0,00004 mM) Tuy nhiên, khả năng kháng

E coli của các dẫn chất 2-salicyloylbenzofuran trong công bố đều yếu hoặc không có

[38]

Hình 1.14 Cấu trúc các dẫn chất 2-salicyloylbenzofuran 1.4 NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP DẪN CHẤT CÓ CẤU TRÚC 5,7- DIBROMOBENZOFURAN-2-CARBOHYDRAZON

Đã có nhiều phương pháp được phát triển để tổng hợp bộ khung acid carboxylic, đa số các phương pháp này đều dựa trên phản ứng ngưng tụ của một dẫnchất salicylaldehyd với một ester haloacetat, sau đó là quá trình đóng vòng với trunggian các dẫn chất acid formylphenoxyacetic Quá trình đóng vòng thường được thựchiện trong dung dịch alcol, với các xúc tác cơ bản như natri ethanolat, kali carbonat,hay phosphin

benzofuran-2-Trong công bố vào năm 2013, M Kowalewska và các cộng sự đã tiến hành tổng hợpcác dẫn chất của acid benzofuran-2-carboxylic bằng cách ngưng tụ 2-hydroxybenzaldehydvà ethyl cloroacetat, với xúc tác là kali carbonat (K2CO3) trongdung môi dimethylformamid (DMF) khan, ở nhiệt độ 92-94 oC Phản ứng đóng vòngtạo thành ethyl benzofuran-2- carboxylat [39]

Hình 1.15 Điều kiện phản ứng tổng hợp dẫn chất ethyl benzofuran-2-carboxylat

Junqiang Liu và các cộng sự đã công bố 1 quy trình tổng hợp các dẫn chất ethyl

benzofuran-2-carboxylat từ o-hydroxyacetophenon và ethyl bromoacetat được ngưng

tụ và đóng vòng benzofuran với xúc tác K2CO3 (tỉ lệ của 3 chất này lần lượt là 1:2:3)trong dung môi DMF ở 80 oC, hỗn hợp phản ứng được cho phản ứng dưới vi sóng cócông suất 350W, sau đó tăng nhiệt độ lên 160 oC và dưới vi sóng có công suất 500Wcho sản phẩm benzofuran trong vài phút [40]

Hình 1.16 Quy trình tổng hợp dẫn chất ethyl benzofuran-2-carboxylat của Junqiang Liu

và các cộng sựMuhammad Taha và các cộng sự đã đưa ra 1 quy trình tổng hợp các dẫn chất củabenzofuran hydrazon, từ dẫn chất methyl benzofuran-2-carboxylat được cho phảnứng với hydrazin hydrat trong methanol, phản ứng được đun hồi lưu trong 4 giờ, thuđược dẫn chất benzofuran-2-carbohydrazid Dẫn chất benzofuran-2-carbohydrazidtiếp tục được ngưng tụ với các dẫn chất aldehyd thơm khác nhau để thu được dẫnchất benzofuran hydrazon Phản ứng này được thực hiện trong methanol, đun hồi lưu

[41]

Hình 1.17 Quy trình tổng hợp các dẫn chất benzofuran-2-hydrazon của Muhammad Taha

và các cộng sựNăm 2018, Anna Baldisserotto và các cộng sự đã công bố 1 quy trình tổng hợp cácdẫn chất benzofuran-2-yl-carbohydrazon Quy trình bắt đầu từ giai đoạn ngưng tụsalicylaldehyd với ethyl bromoacetat tạo dẫn chất ethyl benzofuran-2-carboxylat vớixúc tác kali carbonat (K2CO3) trong dung môi acetonitril (MeCN), ở nhiệt độ hồi lưu,trong thời gian 1,5 giờ Sau đó, ethyl benzofuran-2-carboxylat được cho phản ứng vớihydrazin hydrat trong dung môi ethanol ở nhiệt độ hồi lưu, phản ứng cho sản phẩm

là các dẫn chất carbohydrazid Carbohydrazid tiếp tục được cho ngưng tụ với một dẫnchất aldehyd hay ceton thơm để thu được dẫn chất benzofuran-2-carbohydrazon, phảnứng được thực hiện trong dung môi ethanol ở nhiệt độ hồi lưu [42]

Hình 1.18 Điều kiện tổng hợp benzofuran-2-carbohydrazon do Anna Baldisserotto và các

cộng sự

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các dẫn chất carbohydrazon Tiếp nối các công trình nghiên cứu trước và từ kết quả tổng quan tàiliệu về hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất hydrazid - hydrazon, chúng tôi thiết

5,7-dibromobenzofuran-2-kế khung cấu trúc 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazon như Hình 2.1

Hình 2.1 Khung cấu trúc 5,7-dibromofuran-2-carbohydrazon 2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.2.1 Nguyên liệu

17 Kali carbonat Trung Quốc

2.2.2 Dung môi

3 N,N-dimethylacetamid Trung Quốc

6 Methanol Trung Quốc

cô quay 100 ml, ống đong 50 ml, becher 200ml, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, cột sắc

ký, bình sắc ký, hộp petri, chai đựng mẫu, ống nghiệm, eppendoff, đèn cồn

Thiết bị:

– Cân điện tử kỹ thuật

– Cân phân tích Satorius

– Máy khuấy từ gia nhiệt– Hệ thống lọc áp suất giảm

– Máy cô quay chân không R210S, Buchi (Thụy Sĩ)

– Tủ sấy, tủ sấy chân không Jeiotech (Hàn Quốc)– Máy đo nhiệt độ nóng chảy Sanyo-Gallenkamp

– Máy quang phổ hồng ngoại IR Affinity-Ls Shimadzu

– Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR brukerAvance Ⅲ 500 Hz

– Máy vortex Labnet, Mỹ

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học

Trong đề tài này, chúng tôi tổng hợp dẫn xuất carbohydrazon theo sơ đồ 2.1

5,7-dibromobenzofuran-2-Sơ đồ 2.1 5,7-dibromobenzofuran-2-Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazid 7a-l

Quy trình tổng hợp dẫn chất 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazon trải qua 4 giaiđoạn:

Giai đoạn (1) xuất phát từ 5-bromosalicylaldehyd 1 tạo dẫn xuất thế 3,5-dibromo salicylaldehyd 2 Giai đoạn (2) là phản ứng Williamson giữa 3,5- dibromosalicylaldehyd 2 với ethyl cloroacetat 3 tạo thành dẫn xuất ether phenolat,

sau đó đóng vòng nội phần tử bằng phản ứng ngưng tụ aldol tạo thành ethyl

3,5-dibromobenzofuran-2-carboxylat 4 Giai đoạn (3) là phản ứng cộng ái nhân kèm tách loại giữa ethyl 3,5-dibromobenzofuran-2-carboxylat 4 với hydrazin hydrat tạo 3,5- dibromobenzofuran-2-carbohydrazid 5 Giai đoạn (4) là phản ứng ngưng tụ giữa dẫn xuất carbohydrazid 5 với các dẫn xuất acetophenon 6a-l tạo các dẫn xuất 5,7- dibromobenzofuran-2-carbohydrazon 7a-l.

Giai đoạn (1), phản ứng thế brom vào 5-bromosalicylaldehyd được thực hiện với tácnhân thế là NBS trong dung môi acetonitril (MeCN) có mặt muối amoni acetat(NH4OAc) Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ 50 oC, trong thời gian 1 giờ Sản phẩm thuđược là 3,5-dibromosalicyaldehyd như hình 2.3 [43]

Hình 2.2 Điều kiện phản ứng tổng hợp 3,5-dibrmosalicylaldehyd

Giai đoạn (2), phản ứng ngưng tụ giữa 3,5-dibromosalicylaldehyd với ethylcloroacetat và đóng vòng benzofuran được thực hiện theo tỉ lệ 3,5-dibromosalicylaldehyd/ethyl cloroacetat/K2CO3 là 1:2:2 Phản ứng được thực hiện trong dung

môi N,N-dimethylacetamid ở nhiệt độ 92-94 oC [39] Cơ chế của phản ứng ở giai đoạn

2 được trình bày trong hình 2.3

Hình 2.3 Cơ chế của phản ứng tổng hợp dẫn chất ethyl

3,5-dibromobenzofuran-2-carboxylat

Giai đoạn (3) là phản ứng giữa ester ethyl-3,5-dibromobenzofuran-2-carboxylat vớihydrazin hydrat, tạo dẫn chất carbohydrazid Phản ứng này được thực hiện với tỉ lệ 2nguyên liệu là 1:1, xảy ra trong dung môi ethanol khan, đun hồi lưu ở nhiệt độ 75-80

oC [42] Cơ chế của phản ứng được trình bày trong hình 2.4

Hình 2.4 Cơ chế của phản ứng tổng hợp dẫn chất

3,5-dibromobenzofuran-2-carbohydrazidGiai đoạn thứ (4) là phản ứng ngưng tụ giữa dẫn xuất 3,5-dibromobenzofuran-2-carbohydrazid và các dẫn chất acetophenon với xúc tác acid Phản ứng này được tiếnhành trong dung môi ethanol, đun hồi lưu Sản phẩm thu được ở bước này là các dẫnchất 5,7-dibromobenzofuran-2-carbohydrazon [42] Cơ chế của phản ứng được trìnhbày trong hình 2.5

Để tinh chế các chất rắn, có thể sử dụng phương pháp kết tinh lại Hòa tan các sảnphẩm vào lượng tối thiểu dung môi thích hợp, có thể đun nóng để đảm bảo hòa tanhoàn toàn Sau khi lọc, làm lạnh dung dịch, để yên cho chất hữu cơ kết tinh từ từ Khi

hạ nhiệt độ, độ tan của chất hữu cơ sẽ giảm nên được tách ra dưới dạng tinh thể

Phương pháp sắc ký cột

Trong đề tài này, sắc ký cột là phương pháp cuối cùng được sử dụng để phân lập vàtinh chế sản phẩm Phương pháp này được sử dụng khi không thể tinh chế sản phẩmbằng các phương pháp kết tinh lại Ưu điểm của phương pháp này là có thể thu đượcsản phẩm tinh khiết cao nhưng lại có hạn chế là tốn nhiều dung môi để thực hiện.Các giai đoạn thực hiện sắc ký cột gồm:

Chuẩn bị

Chuẩn bị mẫu: Mẫu thử có thể ở dạng bột khô nhưng tốt nhất là ở dạng dung dịch kháđậm đặc trong một dung môi không quá phân cực so với hệ dung môi sắp dùng đểtriển khai cột Để có được mẫu dưới dạng bột khô thì trộn dung dịch mẫu với mộtlượng giá tơi xốp vừa đủ, bốc hơi hết dung môi

Chuẩn bị chất hấp phụ: lượng chất hấp phụ thường gấp 30 – 60 lần lượng mẫu sẽdùng nếu mẫu ít tạp, con số này có thể là 100 – 200 lần

Chuẩn bị cột: thường dùng cột thủy tinh trung tính, trong suốt, thành tương đối dày,nên có nút mài kín, khóa tốt, có hoặc không có lưới thủy tinh xốp Kích thước cột phùhợp Sau khi kiểm tra, cột được rửa sạch, sấy và gắn trên một giá vững chắc Nếu cộtkhông có lưới thủy tinh xốp thì phải lót một lớp bông, tránh nhét chặt bông mà nênnén một lớp bông dày khoảng 1 – 2 cm ở phần thân cột ngay phía trên vòi thoát.Chuẩn bị dung môi triển khai: có thể lựa chọn hệ dung môi nhờ tài liệu tham khảonhưng thường nhất là phải dò tìm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng trên cùng loạipha tĩnh Hệ dung môi này trên sắc ký đồ SKLM cho kết quả sau:

Các vết có di chuyển, có tách nhau, không bị kéo thành vệt dài

Các vết cần tách có Rf khoảng 0,25 – 0,35.

Ghi chú: Không nên triển khai cột sắc ký ngay với hệ dung môi vừa chọn bằng sắc

ký lớp mỏng mà phải dùng hệ dung môi cùng dãy nhưng kém phân cực hơn để chạycột

Chuẩn bị dụng cụ khác: các loại pipet, quả bóp, phễu, ống đong, bình pha dung môi,ống hứng phân đoạn, bộ sắc ký lớp mỏng, hệ thống cô quay thu hồi dung môi…

Nhồi cột: gồm phương pháp bột khô và phương pháp hỗn dịch

Ổn định cột

Nạp mẫu

Nạp mẫu dưới dạng bột khô: Rắc đều mẫu lên lớp dung môi vừa đủ nằm trên đỉnh cộtNạp mẫu dạng dung dịch: đưa nhẹ nhàng dung dịch mẫu vào lớp dung môi chừa trênđỉnh cột Khi nạp mẫu xong, mở khóa cột chậm cho toàn bộ dung dịch mẫu thấm đềuvào chất hấp phụ Khi mẫu vừa thấm hết, dùng dung môi rửa lòng cột vài lần cho thậtsạch

Nạp dung môi khai triển

Bơm dung môi nhẹ nhàng vòng quanh miệng cột

Bảo vệ bề mặt cột

Có thể dùng một miếng giấy lọc cắt sẵn thả trên mặt thoáng của dung môi Khi giấylọc chìm dần và nằm sát trên đỉnh cột thì dùng một lượng nhỏ hỗn dịch chất hấp phụđồng loại rót nhẹ nhàng vào lớp dung môi phía trên Lớp bảo vệ mặt cột này có bềdày thường vào khoảng 1,5 – 2 cm là đủ

Khai triển cột

Để khai triển cột được nhanh, dung môi nên được nạp đầy cột Dung môi sẽ đượcthay đổi sau cho độ phân cực thay đổi không đột ngột Tỷ lệ của dung môi phân cựchơn trong hệ dung môi sẽ được tăng từ từ

Theo dõi cột và thu phân đoạn

Cần theo dõi khả năng tách: quan sát màu, chấm trên bản mỏng silicagel F 254 soi

Nhiệt độ nóng chảy

Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo điểm chảy, đọc kết quả khoảng nhiệt độ nóngchảy: nhiệt độ chất bắt đầu chảy đến khi chất chảy hoàn toàn, tiến hành 3 lần, lấy kếtquả trung bình

Quang phổ hấp thu hồng ngoại (IR)

Phổ hấp thu IR là tập hợp các vạch phổ biểu diễn sự phụ thuộc độ truyền qua T% vào

số sóng ῦ : T= f(ῦ)

Đối với phổ IR ghi nhận bởi máy quang phổ hồng ngoại tán sắc, độ lập lại của giá trị

độ truyền qua T% (hay nói cách khác là độ hấp thu) là rất thấp, do đó cường độ củavân phổ ít được xem xét như giá trị định lượng (thường dùng trong các phổ khác) màchỉ được xem như giá trị ước lượng trong định tính với ba mức độ: mạnh, trung bình

và yếu

Khi phân tích phổ IR thường phân phổ thành ba vùng:

Vùng nhóm chức: vùng phổ có số sóng từ 4000–1300 cm-1 chứa các vân hấp thu củahầu hết dao động các nhóm chức –OH, –C=O, –C=N, –C=C…

Vùng dấu vân tay: vùng phổ có số sóng từ 1300–910 cm-1 và các dao động co giãn

Vùng nhân thơm: vùng phổ có số sóng 910–650 cm-1, chứa các vân hấp thu của daođộng biến dạng ngoài mặt phẳng của liên kết C–H trong nhân thơm.

Các sản phẩm trong nghiên cứu ở dạng rắn Kỹ thuật này được tiến hành như sau:Mẫu sau khi được tinh chế bằng các phương pháp khác nhau, sấy trong tủ sấy áp suấtgiảm cho hết dung môi Đưa mẫu vào máy IRAffinity-1S để đo phổ hấp thu hồngngoại Các sản phẩm trong nghiên cứu được đo trên máy quang phổ hồng ngoạiIRAffinity-1S SHIMADZU được đặt tại bộ môn Hoá Hữu Cơ – Khoa Dược, trườngĐại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

– Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR): đo phổ 1H-NMR trên máy cộng hưởng từhạt nhân hãng Bruker AC-500 MHz (Viện Hóa học Khoa học và Công nghệ ViệtNam) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR): đo phổ 13C-NMR trên máycộng hưởng từ hạt nhân hãng Bruker AC-500 MHz (Viện Hóa học Khoa học và Côngnghệ Việt Nam)

– Phổ cộng hưởng từ hạt nhân sơ bộ khẳng định cấu trúc và vị trí các nhóm thế củacác dẫn chất tổng hợp được

Phổ khối (MS)

Tiến hành ghi phổ trên máy phổ LC-MS IT TOF 2/12 có độ phân giải cao có thểphân biệt được cấu trúc của các ion có số khối được ghi nhận tới số thập phânthứ 4 (Viện Kiểm nghiệm thuốc Hồ Chí Minh) Phổ MS cho thông tin về khốilượng phân tử

2.3.4.1 Vi sinh vật dùng trong thử nghiệm

Staphylococcus aureus ATCC 29213 nhạy methicillin (MSSA)

Staphylococcus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA)

Streptococcus faecalis ATCC 29212

Escherichia coli ATCC 25922

2.3.4.2 Định tính - xác định độ nhạy cảm của chất thử đối với vi khuẩn

- Lấy 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường Tryptic Soy Broth (TSB)

- Ủ từ 2 – 6 giờ ở 37 oC để hoạt hóa vi khuẩn

- Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu đượctương đương với McFarland 0.5, là khoảng 1,5 x 10 8 CFU/ml

- Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

Chuẩn bị môi trường:

- Môi trường hoạt hóa vi khuẩn thử nghiệm: Nutrient Broth (NB) hay (TSB)

- Môi trường thử nghiệm: Thạch Mueller - Hinton (MHA) Môi trường MHA đượcnấu chảy và đổ hộp sao cho có được lớp thạch dày khoảng 3 - 4 mm Nếu bề mặtthạch bị đọng nước cần ủ khô mặt thạch bằng cách mở nắp hộp và để trong tủ ấm 35

- 37 oC trong 15 - 30 phút

Tiến hành thử:

- Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền trọc vi khuẩn đã chuẩn bị, ép que trênthành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoayhộp 60o

- Để hộp mở nắp trong tủ ấm 3 – 5 phút cho ráo mặt

- Đục lỗ đường kính 3 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng

- Chất thử được nhỏ vào trong lỗ khoảng 30 μl

- Tiến hành song song với một lỗ chứng chỉ nhỏ DMSO, không có chất thử

- Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch

- Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35 – 37 oC trong 16 - 18 giờ Nếu vi khuẩn là MRSA thì ủtrong 24 giờ

Đọc kết quả:

- Lỗ chứng chứa DMSO không ức chế sự phát triển của vi khuẩn

- Chất thử có khả năng kháng khuẩn khi xung quang lỗ có vòng kháng khuẩn

Vòng kháng khuẩn

2.3.4.3 Định lượng - xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất thử

- Phương pháp pha loãng hay phương pháp pha loãng bán định lượng (Semi –quantitative dilution test)

- Kết quả được thể hiện bằng nồng độ chất thử tối thiểu (µg/ml) có khả năng ức chế

sự mọc của vi khuẩn

- Nguyên tắc: chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ từ thấp tới cao theocấp số nhân trong môi trường nuôi cấy Mỗi nồng độ chất thử được cấy một lượng vikhuẩn nhất định và được nuôi cấy trong vòng 18 – 24 giờ Nồng độ chất thử thấp nhất

mà ức chế được sự phát triển của vi khuẩn được gọi là giá trị MIC

Môi trường:

- Môi trường MHA được phân chia vào các ống nghiệm với một thể tích chính xác,

để đảm bảo các đĩa thạch có độ dày đồng đều; hấp tiệt trùng ở 121 oC, 15 phút

- Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO Khi

sử dụng pha loãng bằng môi trường thử nghiệm hoặc pha trực tiếp với môi trườngthử nghiệm sao cho tạo thành dãy nồng độ trong môi trường thử nghiệm (có nồng độsau bằng ½ nồng độ trước, đơn vị µg/ml) như sau: 1024 ; 512; 256; 128; 64; 32; 16;8; 4; 2

- Cho chất thử vào môi trường đã để nguội về 45 – 50 oC, lắc đều để đạt được nồng

độ cuối cần thử nghiệm

- Đổ vào đĩa petri, độ dày thạch khoảng 3 – 4 mm

Vi khuẩn:

- Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ

- Lấy 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB

- Ủ từ 2 – 6 giờ ở 37 oC để hoạt hóa vi khuẩn

- Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng nước muối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu đượctương đương với McFarland 0.5, là khoảng 1,5 x 108 CFU/ml

- Pha loãng dịch vi khuẩn 10 lần để đạt mật độ khoảng 107 CFU/ml

Tiến hành:

- Đĩa thạch được đánh số cho vị trí các chủng vi khuẩn

- Làm khô mặt đĩa thạch có chất thử và đĩa chứng không có chất thử

- Cho 1 – 2 μl huyền phù dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn trên thạch

là 104 CFU/ml

- Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khô

- Lật ngược đĩa thạch đã cấy và ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 16-18 giờ Đối với MRSAphải ủ trong 24 giờ

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN3.1 TỔNG HỢP 3,5-DIBROMO SALICYLALDEHYD

3.1.1 Tiến hành

Cho từ từ NBS (2,12 g, 11,94 mmol) vào bình cầu 100 ml đã có sẵn bromosalicylaldehyd (2,00 g, 9,95 mmol) và amoni acetat (0,08 g, 1 mmol) trong

5-CH3CN (30 ml) Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 50 ℃ trong 1 giờ Sau đó, thêm

10 ml nước vào hỗn hợp phản ứng để kết thúc phản ứng Chiết bằng DCM và rửa lạivới nước 10 ml x 3 lần Tách riêng phần dung môi hữu cơ, làm khan bằng Na2SO4 vàbốc hơi dung môi bằng máy cô quay áp suất giảm thu được chất rắn màu vàng sậm

Tinh chế: kết tinh lại bằng hệ dung môi DCM : n-hexan = 3:1 Sấy sản phẩm trong tủ

sấy chân không

Kết quả: thu được 2,4 g, hiệu suất 86%

DCM : n-hexan (1:1) DCM : n-hexan (1:2) PE : EtOH (3:1)

Vết C: mẫu chuẩn

Hình 3.1 Sắc ký đồ của 3,5-dibromosalicylaldehyd Kết luận

Từ các kết quả trên có thể kết luận sản phẩm thu được là:

3.2.1 Tiến hành

Cho 3,5-dibromo salicylaldehyd 2 (0,28 g, 1 mmol) và ethyl cloroacetat 3 (0,12 g, 1

mmol) vào bình cầu 2 cổ 100 ml Hòa tan hỗn hợp trong DMF (2 ml) rồi thêm kalicarbonat (0,2 g, 1,5 mmol) vào hỗn hợp phản ứng Lắp sinh hàn, khuấy đều đun hồilưu ở nhiệt độ 100 ℃, theo dõi phản ứng bằng SKLM hệ dung môi DCM : n-hexan(1:1) Sau đó, thêm 10 ml nước vào bình phản ứng để kết thúc phản ứng Chiết bằngDCM (5 ml x 3 lần) và rửa lại với nước (10 ml x 2 lần) Tách riêng phần dung môihữu cơ, làm khan bằng Na2SO4 và bốc hơi dung môi bằng máy cô quay áp suất giảmthu được dung dịch sánh màu vàng nâu

Tinh chế: sắc ký cột với hệ dung môi DCM : n-hexan = 1:2.

Kết quả: thu được 0,09 g, hiệu suất 26%