Đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa của Dây Phục linh Adenia cardiophylla Mast.. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cáchợp chất phân lập được cho thấy
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐỒNG THANH HẠNH
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DÂY PHỤC LINH
Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
TP Hồ Chí Minh, năm 2020
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐỒNG THANH HẠNH
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DÂY PHỤC LINH
Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền
Mã số: 8720206
Người hướng dẫn khoa học: TS MÃ CHÍ THÀNH
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Đồng Thanh Hạnh
Trang 4TÓM TẮT
Luận văn thạc sĩ – Khóa 2018-2020Ngành: Dược liệu- Dược học cổ truyền – Mã số: 8720206
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG
CHỒNG OXY HÓA CỦA DÂY PHỤC LINH
(Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)
Đồng Thanh Hạnh Người hướng dẫn khoa học: TS Mã Chí Thành Đặt vấn đề
Dây Phục linh là một loài thuộc chi Adenia, họ Passifloraceae Rễ cây có vị hơi ngọt, tính
nóng; dùng làm thuốc bổ phổi cho người yếu phổi, hay đau ran vùng phổi và phía trên bảvai.Cho đến nay, hầu hết những công bố về thành phần hóa học của các loài trong chi Adenia chủ yếu được thực hiện trên loài A volkensii và A digitata, còn đối với Dây Phục Linh (Adenia cardiophylla) vẫn chưa có nghiên cứu về cả thành phần hóa học và tác dụng dược
lý Đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa của Dây
Phục linh (Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)” được tiến hành nhằm đóng
góp về mặt khoa học và thực tiễn của dược liệu này
Đối tượng
Thân và rễ Dây phục linh được thu hái tại tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng11/2018
Phương pháp nghiên cứu
Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH Sử dụng các phương pháp chiếtngấm kiệt với cồn 70%, chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột pha thuận, sắc ký rây phân tử,kết tinh phân đoạn để phân lập các hợp chất tinh khiết Xác định cấu trúc của các chất đãphân lập bằng phương pháp phổ học (MS, NMR)
Kết quả và bàn luận
Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cho thấy hoạt tính các cao phân đoạn giảm dần theo thứtự: cao ethyl acetat > cao n-BuOH > cao nước > cao n-Hexan 7 kg bột dược liệu được chiếtxuất với cồn 70%, phân tách lỏng – lỏng thu được các cao phân đoạn: n-hexan (48 g), ethylacetat (45 g), n-BuOH (37 g) và nước (254 g) Từ cao ethyl acetat đã phân lập và xác địnhcấu trúc của 6 hợp chất: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; acid vanillic;demethoxypinoresinol; acid succinic; tetraphyllin A và deidaclin Trong đó, AC1 là hợp chấtmới, lần đầu tiên được phân lập trong tự nhiên Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cáchợp chất phân lập được cho thấy hầu hết các hợp chất đều thể hiện tác dụng rất yếu, chỉ cóhợp chất demethoxypinoresinol có tác dụng ở mức độ trung bình (IC50 = 214,75 µg/ml)
Kết luận
Từ cao phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất đã phân lập và xác địnhđược cấu trúc của 6 hợp chất: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; acid vanillic;demethoxypinoresinol; acid succinic; tetraphyllin A và deidaclin Trong đó, AC1 là hợp chấtmới, lần đầu tiên được phân lập trong tự nhiên Các hợp chất phân lập được thử nghiệm hoạttính chống oxy hóa cho thấy hầu hết các hợp chất đều thể hiện tác dụng rất yếu, chỉ có hợpchất demethoxypinoresinol có tác dụng ở mức độ trung bình
Trang 5Master’s thesis – Academic course: 2018 – 2020
Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206
CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF ADENIA
CARDIOPHYLLA (MAST.) ENGL., PASSIFLORACEAE
Dong Thanh Hanh Supervisors: PhD Ma Chi Thanh Introduction
Adenia cardiophylla is a specie of the genus Adenia, Passifloraceae The roots of the plant
have a slightly sweet taste; used as a tonic for people with lungs inflamatory diseases Up to
now, most of the published chemical composition of species in the genus Adenia has been made mainly on A volkensii and A digitata, while there has not been any research for A cardiophylla The project "Chemical constituents and antioxidant activities of Adenia cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)" was conducted to contribute scientifically and
practically of this medicinal herb
in-exclusion chromatography, recrystallization were used for extracting and isolating Structure
of isolated compound were determined by MS and NMR spectrometric methods
Results and discussion
The antioxidant activity survey showed that the results of fractions decreased in order: ethylacetate > n-BuOH > water > n-hexane 7 kg of medicinal powder was extracted with 70%alcohol, then liquid-liquid separated to give four fractions: n-hexane (48 g), ethyl acetate (45g), n-BuOH (37 g) and water (254 g) From ethyl acetate fraction was isolated anddetermined the structure of 6 compounds: AC1; 2,3-epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol; vanillicacid; demethoxypinoresinol; succinic acid; tetraphyllin A and deidaclin In which, AC1 is anovel compound, isolated in nature for the first time Investigation of antioxidant activity ofisolated compounds showed that most of the compounds showed very weak effects, only thedemethoxypinoresinol showed a moderate effect (IC50 = 214.75 µg / ml)
Trang 6MỤC LỤC
MỤC LỤC iii
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 THỰC VẬT HỌC 3
1.1.1 Vị trí phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm thực vật học của họ Lạc tiên (Passifloraceae) 3
1.1.3 Đặc điểm loài Adenia cardiophylla 4
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 5
1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CHI ADENIA 7
1.3.1 Gây độc tế bào 7
1.3.2 Tác dụng an thần 7
1.3.3 Tác dụng chống đông máu 7
1.3.4 Tác dụng hạ đường huyết 7
1.3.5 Tác dụng chống sốt rét 8
1.3.6 Tác dụng chống oxy hóa 8
1.3.7 Tác dụng giảm đau 8
1.4 CÔNG DỤNG CỦA DÂY PHỤC LINH 8
1.5 CHẤT CHỐNG OXY HÓA VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA 9
1.5.1 Chất chống oxy hóa 9
1.5.2 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa 9
1.5.3 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro 10
2 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1 NGUYÊN LIỆU 12
Trang 72.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.4.1 Nghiên cứu về thực vật học 14
2.4.2 Thử tinh khiết 14
2.4.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 14
2.4.4 Chiết xuất, phân lập các chất 14
2.4.5 Thử tác dụng sinh học 16
3 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 19
3.1.1 Đặc điểm hình thái 19
3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá 19
3.1.3 Đặc điểm vi phẫu thân 21
3.1.4 Soi bột dược liệu 23
3.2 THỬ TINH KHIẾT 23
3.3 HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC 24
3.4 KHẢO SÁT HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA 24
3.4.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 24
3.4.2 Chiết xuất và tách phân đoạn 26
3.4.3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn 27
3.4.4 Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat (ACE) 28
3.4.5 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được trên SKLM 39
3.4.6 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 40
3.4.7 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập được từ cao ACE 51
3.5 BÀN LUẬN 52
4 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55
4.1 KẾT LUẬN 55
4.2 ĐỀ NGHỊ 56
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
6 PHỤ LỤC PL.1
Trang 8DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Vị trí phân loại của chi Adenia 3
Hình 1.2 Thân, lá, hoa, quả của loài Adenia cardiophylla 5
Hình 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu dược liệu Dây phục linh 12
Hình 3.1 Một số hình ảnh của dược liệu Dây phục linh 19
Hình 3.2 Vi phẫu và sơ đồ lá Dây phục linh 20
Hình 3.3 Vi phẫu phiến lá Dây phục linh 21
Hình 3.4 Vi phẫu thân Dây phục linh 22
Hình 3.5 Một số cấu tử trong bột dược liệu Dây phục linh 23
Hình 3.6 Sơ đồ chiết – tách phân đoạn của dược liệu Dây phục linh 26
Hình 3.7 Sắc ký đồ các cao phân đoạn Dây phục linh 27
Hình 3.8 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký cột nhanh cao ACE 29
Hình 3.9 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển ACE4 31
Hình 3.10 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký rây phân tử ACE4.34 32
Hình 3.11 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký rây phân tử ACE4.9 34
Hình 3.12 Sắc ký đồ các phân đoạn thu được từ sắc ký rây phân tử ACE4.11 35
Hình 3.13 Sắc ký đồ các phân đoạn sắc ký cột cổ điển ACE11 37
Hình 3.14 Sắc ký đồ các phân đoạn sắc ký rây phân tử ACE11.3 38
Hình 3.15 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat Dây phục linh 38
Hình 3.16 Sắc ký kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập từ cao ACE 39
Hình 3.17 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY của AC2 42
Hình 3.18 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của AC3 43
Hình 3.19 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của AC4 46
Hình 3.20 Cấu trúc hóa học của AC7 47
Hình 3.21 Các tương tác HMBC và COSY chính của AC9 48
Hình 3.22 Cấu trúc hóa học của Deidaclin (1R) và Tetraphyllin A (1S) 49
Hình 3.23 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của AC1 51
Trang 9DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Kết quả thử tinh khiết của bột dược liệu Dây phục linh 24
Bảng 3.2 Hàm lượng chất chiết được của dược liệu Dây phục linh 24
Bảng 3.3 Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật của dược liệu Dây phục linh 24
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá HTCO của các cao phân đoạn 27
Bảng 3.5 Kết quả sắc ký cột nhanh cao ACE 28
Bảng 3.6 Kết quả sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE4 30
Bảng 3.7 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.34 32
Bảng 3.8 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.9 33
Bảng 3.9 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn ACE4.11 34
Bảng 3.10 Kết quả sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE11 36
Bảng 3.11 Kết quả sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE11.3 37
Bảng 3.12 Đặc điểm trên sắc ký lớp mỏng của các chất phân lập được từ cao ACE 40
Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR của AC2 41
Bảng 3.14 Dữ liệu phổ NMR của chất AC3 43
Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR của AC4 45
Bảng 3.16 Dữ liệu phổ NMR của AC7 46
Bảng 3.17 Dữ liệu phổ NMR của AC9 48
Bảng 3.18 Dữ liệu phổ NMR của AC1 50
Bảng 3.19 Kết quả thử nghiệm HTCO của các chất tinh khiết 52
Trang 10CorrelationHSQC Heteronuclear Single Quantum
CorrelationHTCO Hoạt tính chống oxy hóa
TT Thuốc thửUV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại - khả kiến
VS Vanillin-acid sulfuric
Trang 11ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiềuloại thảo dược trong điều trị bệnh và nâng cao sức khoẻ Việc sử dụng các cây thuốcngày càng được chú trọng do có tiềm năng to lớn trong việc nghiên cứu phát triển cácloại cây thuốc trong điều trị bệnh
Hướng nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các loại thảo dượcđang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm Đó là những nghiên cứu cơ bảnvề xác định thành phần hoá học và tìm ra hoạt chất có tác dụng chữa bệnh và nângcao sức khoẻ con người
Dây Phục linh là một loài thuộc chi Adenia, họ Passifloraceae Tập trung chủ yếu ở
Bình Dương, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, An Giang, Kiên Giang Còn có ở Ấn
Độ, Butan, Trung Quốc, Mianma, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaixia Lương yNguyễn Văn Ẩn (An Giang) cho rằng sau khi đã chế biến, rễ cây có vị hơi ngọt, tínhnóng; dùng làm thuốc bổ phổi cho người yếu phổi, hay đau ran vùng phổi và phíatrên bả vai, thường phối hợp với các vị thuốc khác như Bí kỳ nam, Dây Bình bát, gỗcây Ngái, củ Cỏ ống và Rau dền gai, liều lượng bằng nhau, mỗi thứ một nắm nhỏ,sắc nước uống [3]
Theo các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, thành phần hóa học chính của các cây
cùng chi Adenia là protein độc, cyanogenic, lectin, polyacetylen và flavonoid, ngoài
ra còn có alkaloid
Cho đến nay, hầu hết những công bố về thành phần hóa học của các loài trong chi
Adenia chủ yếu được thực hiện trên loài A volkensii và A digitata, còn đối với Dây Phục Linh (Adenia cardiophylla) vẫn chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học và
tác dụng dược lý
Chi Adenia có nhiều tác dụng dược lý nổi bật như: kháng khuẩn, kháng viêm, chống
oxy hóa, chống đông máu, gây độc tế bào, có tác dụng trong điều trị trầm cảm, giải
lo âu
Trang 12Để đóng góp về mặt khoa học và thực tiễn của loài này, đề tài “Nghiên cứu thành
phần hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa của Dây Phục linh (Adenia
cardiophylla (Mast.) Engl., Passifloraceae)” được tiến hành với các mục tiêu chính
sau:
- Khảo sát đặc điểm thực vật học của Dây Phục linh
- Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn của Dây phục linh
- Đánh giá tác dụng chống oxy hoá trên các cao phân đoạn
- Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất từ phân đoạn tiềm năng
- Thử tác dụng chống oxy hoá trên hợp chất phân lập được
Trang 131 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.1 Vị trí phân loại
Theo phân loại của Takhtajan (2009) [37], chi Adenia được xếp vào họ Lạc tiên
(Passifloraceae) với sơ đồ vị trí phân loại được trình bày ở Hình 1.1.
Hình 1.1 Vị trí phân loại của chi Adenia
1.1.2 Đặc điểm thực vật học của họ Lạc tiên (Passifloraceae)
Đặc điểm thực vật chung của họ Lạc tiên như sau: Dây leo thân cỏ hay thân gỗ, có
thể dài đến 20 m; ngoại trừ chi Passiflora tổ Astrophea ở vùng Nam Mỹ và 2 hoặc 3 loài Adenia ở Đông Phi, là cây nhỡ không có hay có gai Lá rụng sớm, mọc so le (ngoại trừ Passiflora cochinchinensis), có lá kèm, mép nguyên hay khía răng, đơn hay có thùy, đôi khi rất sâu (Deidamia) như một lá kép; thường có tuyến trên cuống
lá, mép lá hay phiến lá, đôi khi (ví dụ Passiflora foetida) có lông giả có tuyến Cụm
hoa luôn ở nách lá và là xim, nhưng thường thay đổi do sự trụy hay do các bộ phận
Trang 14đều hoặc hơi không đều, lưỡng tính, đơn tính khác gốc, cùng gốc hay tạp tính (Adenia, Tetrapathea), thường được bao bởi 3 lá bắc (thật ra là 1 lá bắc và 2 lá bắc con mọc
trên cuống hoa); đài dính nhau ở gốc thành hình hũ hay hình ống, trên chia 5 thùy (4
ở Dilkea và Mitostemma); cánh hoa thường là 4, 5, đôi khi 0, 3, 6 hay 8, rời, đính trên
ống đài; tràng phụ rời hay dính, gồm những sợi đính thành nhiều vòng; 5 hay 10 nhị,đôi khi 4, 6 hay 8, đính trên cuống nhị nhụy hoặc đính trên ống đài, chỉ nhị rời hay
dính thành ống; bao phấn 2 ô, nứt dọc; hoa cái có khi có nhị lép dạng giùi (Adenia, Tetrapathea); 3-5, đôi khi 4 hay 8, lá noãn tạo thành bầu 1 ô, nhiều noãn, bầu không cuống (ngoại trừ ở Passiflora, hoa đực của Adenia và Tetrapathea) hoặc được mang
bởi cuống nhụy hay cuống nhị nhụy, noãn đảo; vòi nhụy có hay không có; 3-5, đôikhi 4, đầu nhụy hình đầu hay hình thận Quả mọng (có thể to bằng quả dưa hấu như
Passiflora quadrangularis) hình cầu hay hình trứng, hiếm khi thuôn dài, thịt nhày và chua, vỏ quả ngoài đôi khi dai (Dilkea) hoặc quả nang chẻ ô hình thoi, mở thành 3
mảnh vỏ Hạt có cuống dài, dẹp, có nội nhũ, mầm thẳng; vỏ hạt thường có chấm haynúm [11]
1.1.3 Đặc điểm loài Adenia cardiophylla
Tên khoa học: Adenia cardiophylla, họ Lạc tiên – Passifloraceae.
Tên khác: Thư diệp tim
Mô tả: Dây leo dài hàng chục mét, đường kính 10 mm, có tua cuốn Lá hình trái xoanrộng hoặc trái xoan mắt chim, hình tim sâu ở gốc, có tai nữa tròn, đột ngột thót nhọnthành đuôi ở chóp, dài 12 – 18 cm, có gân hình chân vịt, với hai tuyến ở trên cuống
lá Hoa thành xim dạng ngù trải ra, mang một tua cuốn Quả hình thoi rộng, dài 5 – 7
cm, rộng 25 mm, màu vàng – đỏ xỉn Hạt hình lăng kính, 7 – 8 mm, có lỗ tổ ong ởgiữa [3]
Sinh thái: mọc rải rác trong rừng rậm
Trang 15Hình 1.2 Thân, lá, hoa, quả của loài Adenia cardiophylla
Theo các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, thành phần hóa học chính của các cây
cùng chi Adenia là protein độc, cyanogenic, lectin, polyacetylen và flavonoid, ngoài
ra còn có alkaloid
Năm 1995, theo nghiên cứu của Fekadu Fullas và cộng sự, một polyacetylen được
phân lập từ lá Adennia gummifera là gummiferol [15].
Gummiferol
Năm 1982, nghiên cứu của A Ulubelen và cộng sự, phân lập được hai flavonoid từ
lá Adenia manni: 2’’-xylosylvitexin và vitexin [38].
Trang 162″-xylosylvitexin vitexin
Năm 1978, nghiên cứu của A.T.D Gondwe và cộng sự, phân lập được hai cyanogenic
glycosid từ Adenia volkensii: tetraphyllin B và epi-tetraphyllin B [17].
tetraphyllin B
Năm 1985, nghiên cứu của Fiorenzo Stirpe và cộng sự, phân lập được một lectin độc
từ Adenia volkensii là volkensin[36]
volkensin
Năm 2018, nghiên cứu của Mamta Sharma và cộng sự, phân lập và xác định cấu trúc
một lectin từ Adenia hondala là N-Acetylgalactosamin[32]
Năm 1978, nghiên cứu của Anna Gasperi-Campani và cộng sự, phân lập được một
protein độc từ Adenia digitata là modeccin [16].
Thành phần hóa học của Dây Phục Linh
Cho đến nay, hầu hết những công bố về thành phần hóa học của các loài trong chi
Trang 171.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CHI ADENIA
Chi Adenia có nhiều tác dụng dược lý nổi bật và quan trọng như: kháng khuẩn, kháng
viêm, chống oxy hóa, chống đông máu, gây độc tế bào, có tác dụng trong điều trịtrầm cảm, giải lo âu
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để chứng minh các tác dụng của chi Adenia.
1.3.1 Gây độc tế bào
Năm 2018, nghiên cứu của Mamta Sharma và cộng sự, thử nghiệm của hợp chất acetylgalactosamin trên sự ức chế phát triển của lectin từ loài Adenia hondala trêndòng tế bào HepG2 với IC50 là 4,8 μg/ml[32]
N-1.3.2 Tác dụng an thần
Năm 2015, nghiên cứu của Ismail O Ishola và cộng sự, thử nghiệm ảnh hưởng của
dịch chiết ethanol của lá Adenia cissampeloides trên tác dụng chống trầm cảm, giải
lo âu Kết quả cho thấy ở liều 100-200 mg/kg có tác dụng đáng kể trên hoạt động bơicủa chuột Cơ chế được giải thích là do tương tác của các thành phần dịch chiết thôngqua recepter dopamin D2[19]
1.3.3 Tác dụng chống đông máu
Năm 2016, nghiên cứu của Wilson Bright Nyansah và cộng sự, thử nghiệm tác dụng
chống đông máu của dịch nước phần trên mặt đất Adenia cissampeloides kết hợp với Pseudocedrela kotschyi Kết quả cho thấy dịch chiết nước có tác dụng đáng kể trên tác dụng chống đông máu in vitro và an toàn để sự dụng ở liều nhỏ hơn 2000 mg/kg[26]
Trang 181.3.5 Tác dụng chống sốt rét
Năm 2012, nghiên cứu của Kofi Annan và cộng sự, thử nghiệm chống sốt rét in vitro
trên chủng Plasmodium falciparum kháng chloroquin Kết quả cho thấy dịch chiết
ethanol của Adenia cissampeloides có tác dụng kháng ký sinh trùng với IC50 là 8,52µg/ml [9]
1.3.6 Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2012, thử nghiệm in vitro tác dụng chống oxy hóa của các dịch chiết phân đoạn khác nhau của Adenia lobata được thực hiện bởi Agoreyo và cộng sự tại Pakistan.Kết quả cho thấy phân đoạn ethyl acetat thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽvới phần trăm hoạt tính chống oxy hóa là 63,87 %[6]
1.3.7 Tác dụng giảm đau
Thử nghiệm in vivo gây đau bằng acid acetic trên chuột cho kết quả cao chiết nước
lá của loài A cissampeloides với liều 400 mg/kg cho tác dụng làm giảm số lần đau
quặn bụng ở chuột rõ rệt, số lần đau quặn bụng giảm nhiều hơn so với chứng dươngdùng diclofenac liều 1 mg/kg Cơ chế được đưa ra do sự ức chế enzymecyclooxygenase làm giảm sự phóng thích prostaglandin[26]
Tác dụng dược lý của cây Dây Phục linh
Cho đến nay, hầu hết những công bố về tác dụng dược lý của các loài trong chi Adenia
là chủ yếu, còn đối với Dây Phục Linh (Adenia cardiophylla) vẫnchưa có nghiên cứuvề thành phần tác dụng dược lý mà chỉ được sử dụng trong dân gian với những bàithuốc cổ truyền trị giảm đau, kháng viêm
Người Campuchia dùng nó để bẫy chim bằng cách dùng thóc đã ngâm nước ủ những
bộ phận khác nhau của cây này, thả cho chim ăn, chim sẽ chết khá nhanh sau khi ănthóc, nhưng thịt chim vẫn ăn được Lương y Nguyễn Văn Ẩn (An Giang) cho rằng
Trang 19vị thuốc khác như Bí kỳ nam, Dây bình bát, gỗ cây Ngái, củ Cỏ ống và Rau dền gai,liều lượng bằng nhau, mỗi thứ một nắm nhỏ, sắc nước uống.
Ở Vân Nam (Trung Quốc) thân dây và rễ dùng làm thuốc thú y như Qua lâu [3]
DỤNG CHỐNG OXY HÓA
1.5.1 Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là một chất hoặc một nhóm hợp chất có trong các loại thực vậthay dược phẩm, khi hiện diện ở nồng độ thấp vẫn có thể làm giảm đáng kể hoặc ngănngừa các tác động có hại của các loại phản ứng oxy hoá về chức năng sinh lý bìnhthường ở người Theo định nghĩa này, không phải tất cả các chất khử tham gia vàophản ứng hóa học là chất chống oxy hóa, mà chỉ những hợp chất có khả năng bảo vệcác mục tiêu sinh học đối với quá trình oxy hóa mới đáp ứng tiêu chí này [22] Cáchợp chất chống oxy hóa có thể là enzym hoặc không phải là enzym
1.5.2 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa
Hiện nay, quá trình ức chế gốc tự do của chất chống oxy hóa được giải thích chủ yếudựa trên 2 cơ chế:
- Cơ chế 1: Quá trình chuyển electron từ chất chống oxy hóa sang gốc tự do (ElectronTransfer – ET)
M (III) + AH → AH· + M(II)
- Cơ chế 2: Quá trình chuyển nguyên tử hydro từ chất chống oxy hóa sang gốc tự do(Hydrogen Atom Transfer – HAT)
AH + X· → XH + A·
(AH: chất chống oxy hóa; X·: gốc tự do; M: kim loại chuyển tiếp)Theo cơ chế cho electron thì năng lượng ion hóa là yếu tố chính, trong khi theo cơchế cho nguyên tử hydro thì năng lượng phân ly liên kết lại là yếu tố chính quyết địnhhiệu quả của quá trình chống oxy hóa Hai cơ chế này luôn xuất hiện đan xen trongquá trình chống oxy hóa và việc phân biệt chúng rất khó khăn
Trang 20Khi một gốc tự do nhận một electron hoặc một nguyên tử hydro từ một phân tử chấtchống oxy hóa thì sẽ tạo thành một phân tử, gốc tự do mới được tạo thành có khảnăng hoạt động yếu hơn gốc tự do ban đầu và không còn khả năng gây hại nữa Ngoài
ra, chất chống oxy hóa còn có khả năng ức chế sự phân hủy của các hydroperoxydtạo ra các gốc tự do gây hại [1]
1.5.3 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro
Việc sàng lọc trong các thử nghiệm hóa học dựa trên cơ sở cơ chế hoạt động của chấtchống oxy hóa, vì vậy có mô hình thử nghiệm để đánh giá khả năng cho electron và
mô hình thử nghiệm để đánh giá khả năng cho nguyên tử hydro của chất chống oxyhóa Mỗi mô hình có thể sử dụng thuốc thử (chất oxy hóa) khác nhau Như vậy, mỗi
mô hình thử nghiệm chỉ cho thấy một khía cạnh về hoạt tính chống oxy hóa của chất,
do đó để đánh giá khả năng chống oxy hóa cần phải sử dụng nhiều hơn một mô hìnhthử nghiệm
Sàng lọc hóa học có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, có thể thực hiện hàng loạt, nhưngđây chỉ là thử nghiệm bước đầu, vì chất có hoạt tính chống oxy hóa tốt trong mô hìnhthử nghiệm hóa học chưa chắc đã có hoạt tính chống oxy hóa trong cơ thể sinh vật
Ðể nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của các chất, hiện nay có một số
Khả năng bắt gốc tự do của chất chống oxy hóa thể hiện qua giá trị IC50 (Giá trị IC50:nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do) Giá trị IC50 càng thấp,khả năng chống oxy hóa của chất thử nghiệm càng cao [22]
Trang 21Đánh giá khả năng loại bỏ các gốc tự do của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sựtạo thành gốc superoxid Gốc superoxid hình thành trong phản ứng giữa xanthin vàxanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử, sử dụng nitrobluetetrazolium (NBT), cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước sóng 550 nm.Hoạt tính chống oxy hoá của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm sự hình thànhphức chất màu tím [7].
Đánh giá bằng phản ứng với hydro peroxid
Đánh giá bằng hoạt tính ức chế gốc tự do NO
Nguyên tắc:
NO phản ứng với oxy tạo ra sản phẩm bền vững là nitrit và nitrat Hoạt chất ức chế
NO được cho phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả là làm giảm sản phẩm nitrit tạothành trong dung dịch nước
Nồng độ nitrit được xác định bằng phản ứng trắc quang sử dụng thuốc thử Griess tạothành hợp chất màu diazo bền vững và có bước sóng hấp thụ cực đại ở 540 nm (thuốcthử Griess là hỗn hợp dung dịch N-1-napthylethylene diamine dihydrochloride (NED)
và sulfanilamide trong môi trường H3PO4) Dựa trên sự giảm nồng độ nitrit tạo thành,tính được khả năng bắt gốc tự do NO của hoạt chất theo tỷ lệ phần trăm ức chế.[5]
Trang 222 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dây Phục linh (Adenia cardiophylla (Mast.) Engl.), 35 kg thân và rễ dược liệu tươi
được thu hái vào tháng 11 năm 2018 tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang; mẫu đượclưu tại bộ môn Dược Liệu, Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP.HCM Dây Phục Linhđược phơi khô, xay thành bột, bảo quản ở nhiệt độ phòng
Thân rễ Đoạn thân mang tua cuốn
Thân rễ cắt lát
Hình 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu dược liệu Dây phục linh
Dung môi dùng trong chiết xuất và phân lập: cồn 96%, n – hexan, ethyl acetat, n
-butanol, methanol, cloroform, acid acetic, aceton, acid formic, acid sulfuric
- Bộ hoá chất phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật
- Thuốc thử: FeCl3, vanillin – sulfuric (VS)
- Silicagel GF254 bản nhôm tráng sẳn (Merck) dùng trong sắc ký lớp mỏng
Trang 23- Dùng cho mục đích đánh giá hoạt tính chống oxy hóa: DPPH (Sigma-Aldrich, sốlô: STBH0044), vitamin C (DSM-UK, số lô: 00490114)
- Bình chiết ngấm kiệt
- Máy cô quay Buchi 1 lít, 20 lít
- Bếp cách thuỷ (Memmert, Model ULM 500)
- Tủ sấy Gallenkamp (Anh), tủ sấy chân không
- Đèn UV bước sóng 254/365 nm
- Lò nung Carbolites CSF1200 (Anh)
- Cân điện tử độ nhạy 0,1 g (Sartorious)
- Cân phân tích BP-221S (Sartorious)
- Máy siêu âm
- Kính hiển vi quang học CX-21 (Olympus)
- Phễu Buchner, bình hút chân không, máy bơm chân không
- Máy đo phổ UV-Vis (Shimadzu, UV-1700)
- Máy đo LC/MS, máy HPLC
- Tủ lạnh
- Máy xác định độ ẩm MA-45 (Sartorious)
- Các thiết bị sắc ký, xác định cấu trúc:
+ Cột sắc ký: cột VLC (7 x 60 cm), (5 x 60 cm); cột sephadex LH-20 (2,5 x 60cm); cột cổ điển (2,4 x 40 cm), (2,6 x 50 cm), (2 x 30 cm), (1,4 x 20 cm)
+ Hệ thống đo khối phổ (Micromass Quattro micro API – Waters)
+ Hệ thống đo phổ cộng từ hạt nhân (NMR) BRUKER NEO ADVANCED 400MHz, tại Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh
- Các dụng cụ thí nghiệm khác: bình sắc ký, erlen, ống đong, bình lắng gạn, becher,đũa khuấy, kẹp ống nghiệm, kẹp bản mỏng …
Trang 242.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Nghiên cứu về thực vật học
Khảo sát đặc điểm hình thái dược liệu
- Mô tả bộ phận dùng của dược liệu, đặc điểm thực vật học dựa trên quan sát câytươi
- Khảo sát đặc điểm vi phẫu của dược liệu: quan sát vi phẫu cắt ngang của thân, lácủa dây Phục linh sau khi nhuộm kép trên kính hiển vi
- Khảo sát vi học bột dược liệu: dược liệu khô được xay mịn hoàn toàn để làm mẫukhảo sát vi học nhận xét cảm quan, quan sát trên kính hiển vi để tìm các cấu tửđặc trưng và so sánh với tài liệu (nếu có)
2.4.2 Thử tinh khiết
- Độ ẩm dược liệu được tiến hành bằng máy xác định độ ẩm MA-45
- Tro toàn phần: thực hiện theo phụ lục 9.8, Dược điển Việt Nam V
- Tro không tan trong acid hydroclorid theo phụ lục 9.7, Dược điển Việt Nam V
- Kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thực hiện độc lập và kết quả thu được có giátrị ổn định
2.4.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Nguyên liệu chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự: diethylether, cồn, nước
Xác định các nhóm hoạt chất chính trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hoá họcđặc trưng theo phương pháp Ciulei cải tiến
2.4.4 Chiết xuất, phân lập các chất
Thăm dò phương pháp chiết
- Chọn kỹ thuật chiết: ngấm kiệt, đun hồi lưu, ngâm lạnh, …
- Kiểm tra dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng với các thuốc thử thích hợp: dung dịch
Trang 25- Khảo sát sơ bộ tác dụng chống oxy hoá và/hoặc hoạt tính kháng viêm của các caochiết.
- Chọn dung môi chiết thích hợp cho hoạt tính chống oxy hoá cao nhất
Chiết xuất cao toàn phần
Các mẫu nguyên liệu sau khi thu hái được loại bỏ phần hư hỏng, rửa sạch, thái nhỏ, phơitrong bóng râm rồi sấy ở 50 – 60 °C cho đến khô, sau đó, mẫu được xay thành bột.Mẫu dược liệu (7,0 kg mẫu dược liệu khô) được chiết bằng cồn 70% Dịch chiết thuđược tiến hành lọc, cất loại dung môi dưới áp suất thấp, thu được cao toàn phần.Cao toàn phần thu được từ dịch chiết của dược liệu được phân tán vào nước và được
chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần theo trình tự n-hexan, ethyl acetat và n-BuOH để tiến hành phân tách các nhóm chức có độ phân cực khác nhau
ra khỏi cao toàn phần Cô quay áp suất thấp thu được các cao phân đoạn tương ứng
Tách phân đoạn
Dùng kỹ thuật phân bố lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực khác nhau
(n-hexan, chloroform, ethyl acetat, …)
Theo dõi quá trình tách phân đoạn bằng phản ứng hoá học trên ống nghiệm và sắc kýlớp mỏng, phát hiện bằng UV và các thuốc thử thích hợp, thu được các phân đoạnđơn giản
Khảo sát tác dụng chống oxy hoá trên các phân đoạn này, chọn các phân đoạn có tácdụng chống oxy hoá tiến hành phân lập các chất tinh khiết
Phân lập các chất tinh khiết
Dùng phương pháp sắc ký cột nhanh, sắc ký cột cổ điển, sắc ký cột Sephadex cùngvới hệ dung môi đã khảo sát để tách các cao phân đoạn thành các phân đoạn nhỏ hơn
Tinh khiết hoá
Trang 26Dùng các phương pháp loại tạp thích hợp để làm sạch rồi kết tinh lại.
Kết tinh ở nhiệt độ lạnh, lọc lấy tinh thể, rửa bằng dung môi thích hợp, sấy trong tủsấy chân không cho đến khô
Xác định cấu trúc các chất phân lập được
Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng
Xác định các hằng số vật lý, phổ UV
Dựa trên các dữ liệu phổ IR, MS và các phổ NMR 1 chiều, 2 chiều (1H-NMR, 13CNMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY) Phổ NMR được thực hiện tại Viện Kiểmnghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh, độ dịch chuyển hoá học (δ) được tính theothang ppm Dung môi đo là MeOD, CDCl3, DMSO
Khả năng bắt gốc tự do của chất chống oxy hóa thể hiện qua giá trị IC50 (Giá trị IC50:nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do) Giá trị IC50 càng thấp,khả năng chống oxy hóa của chất thử nghiệm càng cao
Cách tiến hành:
Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của mẫu được xác định bằng phương pháp đo quang
Trang 27Hỗn hợp phản ứng có thể tích 200 μL, gồm 100 μL mẫu khảo sát ở các nồng độ 400μg/mL, 200 μg/mL, 100 μg/mL; 50 μg/mL, 25 μg/mL; 12,5 μg/mL; 6,25 μg/mL …
Đại lượng đánh giá:
Tác dụng bắt gốc tự do DPPH được đánh giá qua giá trị IC50 Giá trị IC50 được địnhnghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do Giá trị IC50 càngnhỏ thì mẫu có hoạt tính càng cao
Cách xác định giá trị IC50:
+ Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau
+ Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, xây dựng đường hồi
quy có dạng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế và x là nồng độ).
+ Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần
đúng, chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và cũng tiến hành vẽ đường thẳng y
= ax + b Thay y = 50% vào phương trình, sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồng độ
Trang 28Ưu nhược điểm, khả năng ứng dụng của phương pháp
- Ưu điểm: Kỹ thuật dễ dàng, hiệu quả và nhanh chóng, phù hợp đối với rất nhiều đốitượng mẫu
- Nhược điểm: Gốc DPPH tan trong các dung môi hữu cơ nhưng tan hạn chế trongnước
- Khả năng ứng dụng của phương pháp: Ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sàng lọchoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất nguồn gốc tự nhiên, tổng hợp hay bán tổnghợp
Trang 293 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.1 Đặc điểm hình thái
Dây phục linh (Adenia cardiophylla) là dây leo, đường kính khoảng 10 mm, có tua
cuốn Lá hình trái xoan rộng, hình tim sâu ở gốc, thót nhọn thành đuôi ở chóp, dài 12– 18 cm, có gân hình chân vịt, với hai tuyến ở trên cuống lá Hoa thành xim dạng ngùtrải ra, mang một tua cuốn Quả hình thoi rộng, dài 5 – 7 cm, rộng 2,5 cm, màu vàng
- đến đỏ Hạt dài 7 – 8 mm, có lỗ tổ ong ở giữa
Hình thái của đối tượng nghiên cứu có các đặc điểm tương đồng với các mô tả trongtài liệu tham khảo [3]
Hình 3.1 Một số hình ảnh của dược liệu Dây phục linh
3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá
Vi phẫu lá hình cánh diều, gân lá hai mặt lồi nhọn
Gân chính: Trên dưới có nhiều lớp mô dày góc Dưới mô dày là mô mềm Bó libe gỗhình lưỡi liềm, gỗ bên trên và libe ở dưới Trên vùng libe gỗ chính có bó libe gỗ phụ.Tinh thể calci oxalat hình cầu gai tập trung nhiều ở vùng libe
Phiến lá: biểu bì trên dưới hình chữ nhật tương đối to Nhu mô diệp lục hình giậugồm có 2 tầng Biểu bì trên và biểu bì dưới thỉnh thoảng có những tế bào chứa calci
Trang 30oxalat dạng khối Tiếp đến là mô mềm giậu, dưới mô mềm giậu là mô mềm khuyết.Trong mô mềm giậu có chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai.
Hình 3.2 Vi phẫu và sơ đồ lá Dây phục linh
Trang 31Hình 3.3 Vi phẫu phiến lá Dây phục linh
3.1.3 Đặc điểm vi phẫu thân
Vi phẫu tiết diện gần tròn Vùng vỏ chiếm khoảng 1/3, vùng trung trụ chiếm khoảng2/3 tiết diện vi phẫu
Vùng vỏ: Biểu bì là một lớp tế bào hình chữ nhật kích thước không đều Bên dưới là
2 – 3 lớp tế bào mô dày, tiếp đến là mô mềm phiến
Vùng trung trụ: Nội bì gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, kích thước không đều, có đaicaspary rõ Trụ bì gồm 1 vòng các cụm mô cứng xếp rải rác Tinh thể calci oxalathình cầu gai nằm rải rác Libe 1 gồm các cụm 4 – 5 lớp tế bào vách uốn lượn, xếp lộnxộn, kích thước không đều, tập trung chủ yếu ở dưới các cụm mô cứng Libe 2 gồm
6 – 8 lớp tế bào xếp xuyên tâm Gỗ 2 gồm 1 – 2 mạch, phía trong là gỗ 1 gồm 2 – 3mạch phân hóa ly tâm Trong cùng là mô mềm tuỷ, có khuyết
Trang 333.1.4 Soi bột dược liệu
Bột thân và rễ màu vàng đậm, không mùi, vị ngọt
Quan sát bột dược liệu thân và rễ Dây phục linh dưới kính hiển vi quan sát được cáccấu tử: mảnh bần, mảnh mô mềm, mạch mạng, mạch vạch, tinh bột, tinh thể calcioxalat hình cầu gai, cụm mô cứng và tế bào mô cứng
Hình 3.5 Một số cấu tử trong bột dược liệu Dây phục linh
Thực hiện theo DĐVN V, phụ lục 9.6, 9.7, 9.8 Tiến hành trên 3 mẫu, lấy kết quả
trung bình Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1.
Trang 34Bảng 3.1 Kết quả thử tinh khiết ủa bột dược liệu Dây phục linh
Tro toàn phần (%) 6,61 6,44 6,72 6,59 Tro không tan trong acid (%) 1,78 1,83 1,70 1,77
Nhận xét: Dược liệu đạt các giá trị tiêu chuẩn độ ẩm, độ tro toàn phần và tro không
tan trong acid hydrocloric lần lượt là 8,09 %, 6,59 % và 1,77 %
Hàm lượng chất chiết được của dược liệu Dây phục linh được thực hiện theo DĐVN
V với kết quả được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Hàm lượng chất chiết được của dược liệu Dây phục linh
Dung môi Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Cồn 96 % 4,95 4,99 4,78 4,91 Cồn 70 % 5,67 5,58 5,71 5,65
Cồn 50 % 3,74 3,66 3,56 3,65
Nhận xét: Xác định hàm lượng chất chiết được của dược liệu Dây phục linh với các
dung môi có độ cồn khác nhau cho thấy cồn 70 % cho hàm lượng chiết được cao nhất
là 5,65 %
3.4.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu Dây phục linh đượctrình bày ở Bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật của dược liệu Dây phục linh
Nhóm hợp chất Thuốc thử
Kết quả định tính các dịch
Trang 35Pha loãng/cồn
Ghi chú:
( ̶ ) : không có (+) : có ít (+++) : có nhiều(±) : không rõ (++) : có (++++) : có rất nhiều
Không có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết
Có thể có phản ứng nhưng không thực hiện
Nhận xét: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy dược liệu Dây
phục linh có chứa các nhóm hợp chất: triterpenoid tự do, flavonoid, proanthocyanin
Trang 363.4.2 Chiết xuất và tách phân đoạn
7 kg bột dược liệu thân và rễ Dây phục linh (Adenia cardiophylla) được chiết ngấm
kiệt với 105 L ethanol 70% (tỷ lệ chiết 1:15), cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảmthu được 2 L dịch chiết đậm đặc (ACTP)
Dịch chiết đậm đặc được chiết phân bố lần lượt với các dung môi: n-hexan (2 L × 3 lần), ethyl acetat (2 L × 3 lần) và n-BuOH bão hòa nước (2 L × 3 lần) Các dịch chiết
phân bố được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn:
cao n-hexan (ACH, 48 g), cao ethyl acetat (ACE, 45 g), cao n-BuOH (ACB, 37 g) và
cao nước (ACN, 254 g)
Sơ đồ chiết – tách phân đoạn của dược liệu Dây phục linh được trình bày ở Hình 3.6
7 kg bột thân và rễ Dây phục linh
2L dịch chiết đậm đặc
Cao n-hexan (ACH, 48 g)
Cao H 2 O (ACN, 254 g)
Chiết với n-hexan (2 L × 3 lần)
Cô áp suất giảm
Chiết với ethyl aceat (2 L × 3 lần)
Cô áp suất giảm
Chiết với n-BuOH (2 L × 3 lần)
Cô áp suất giảm
Cô cách thủy Chiết với EtOH 70% (105 L)
Cô áp suất giảm
Trang 37Các cao phân đoạn được sơ bộ phân tích trên SKLM cho các sắc ký đồ được trìnhbày ở Hình 3.7.
Hình 3.7 Sắc ký đồ các cao phân đoạn Dây phục linh
3.4.3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn
Các cao phân đoạn được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phươngpháp DPPH thực hiện trên đĩa 96 giếng
Kết quả thử nghiệm được trình bày ở Bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá HTCO của các cao phân đoạn
Nhận xét: Bằng thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên đĩa 96 giếng cho
thấy cao ethyl acetat (ACE) có tác dụng tốt nhất với giá trị IC50 là 179,8 µg/ml; các cao
còn lại thể hiện hoạt tính theo thứ tự giảm dần: cao n-BuOH (ACB) > cao nước (ACN)
Trang 383.4.4 Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat (ACE)
3.4.4.1 Sắc ký cột cao ACE
Cao ACE được phân tách bằng phương pháp sắc ký cột nhanh để thu được các phânđoạn đơn giản hơn, thuận tiện cho quá trình phân lập các hợp chất tinh khiết sau này
Điều kiện sắc ký
- Cột thủy tinh trung tính, đường kính 6 cm, chiều dài 60 cm
- Pha tĩnh: 500 g silica gel cỡ hạt 40 – 63 μm
Bảng 3.5 Kết quả sắc ký cột nhanh cao ACE
Trang 403.4.4.2 Phân lập AC1
Cao ACE sau khi cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thì xuất hiện tủa Tinh chế tủa
qua phễu thủy tinh xốp thu được 5,16 g chất bột vô định hình, màu trắng, đặt tên là AC1.
3.4.4.3 Phân lập AC2, AC3, AC4, AC5 và AC6 từ phân đoạn ACE4
Phân đoạn ACE4 được tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột cổ điển
Điều kiện sắc ký
- Cột thủy tinh trung tính, đường kính 2,2 cm, chiều dài 1 m
- Pha tĩnh: 100 g silica gel cỡ hạt 40 – 63 μm
Bảng 3.6 Kết quả sắc ký cột cổ điển phân đoạn ACE4
Phân đoạn Phân đoạn hứng Khối lượng (mg)