Thiết lập qui trình phân lập tế bào và nhuộm huỳnh quang từ bệnh phẩm u nguyên bào thần kinh đệm

HỒ CHÍ MINHBÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI TOÀN VĂN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO VÀ NHUỘM HUỲNH QUANG TỪ BỆNH PHẨM U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM Mã số

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO VÀ NHUỘM HUỲNH QUANG TỪ BỆNH PHẨM

U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: Tiến sĩ Huỳnh Thanh Tuấn

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO VÀ NHUỘM HUỲNH QUANG TỪ BỆNH PHẨM U

NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên)

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

STT Họ và tên

Chức danh trong quá trình thực hiện nhiệm vụ

Đơn vị công tác

Trung tâm Y Sinh học Phân

tử - Đại học Y DượcTP.HCM

MỤC LỤC

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC HÌNH iii

BÁO CÁO THỐNG KÊ iv

MỞ ĐẦU 1

Chương I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm 4

1.1 Đối tượng và vật liệu 4

1.2 Hóa chất 4

2 Phương pháp thí nghiệm 4

2.1 Thu mô từ bệnh nhân 4

2.2 Nuôi cấy tế bào 4

2.3 Nhuộm miễn dịch 5

2.4 Phân tích dữ liệu 5

Chương III. KẾT QUẢ 6

1 Phân lập và nuôi cấy sơ cấp 6

2 Nuôi cấy thứ cấp 6

3 Nhuộm miễn dịch huỳnh quang 7

Chương IV THẢO LUẬN 9

Chương V KẾT LUẬN 10

TÀI LIỆU THAM KHẢO 11

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

UNBTKĐ : U nguyên bào thần kinh đệm

MDHH : Miễn dịch huỳnh quang

EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor

PTEN: Phosphatase and Tensin homolog

IDH1 : Isocitrate dehydrogenase 1

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối u Tế bào được quan sát sau 1ngày, 2 ngày, 4 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày Bar = 50 µM 6Hình 2: Kết quả nuôi cấy thứ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối u NB49(X20) Tế bào đươcquan sát sau 3 ngày, 5 ngày, 10 ngày, bar = 50 µM 7Hình 3: Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho 2 marker Neurofilaments và Astrocyte ởngày thứ 10 (40X) 7Hình 4: Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho 2 marker Neurofilaments và Astrocyte 8

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Họ và tên: Huỳnh Thanh Tuấn

Học hàm, học vị: Tiến sĩ

Điện thoại: Tổ chức: (+84-28) 3855 8411 Nhà riêng: Không

Mobile: 0938489640

Tên tổ chức đang công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ tổ chức: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM

Địa chỉ nhà riêng:

3 Tổ chức chủ trì nhiệm vụ (1) :

Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Điện thoại: (+84-28) 3855 8411 Fax: (+84-28) 3855 2304

Tên Khoa hoặc Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài.

Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM

4 Tên cơ quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019

- Thực tế thực hiện: từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019

- Được gia hạn (nếu có): Không

Từ tháng… năm… đến tháng… năm…

2 Kinh phí và sử dụng kinh phí:

a) Tổng số kinh phí thực hiện: 5 tr.đ, trong đó:

+ Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học của nhà trường: 5 tr.đ

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí(Tr.đ)

Thời gian(Tháng, năm)

Kinh phí(Tr.đ)

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

4 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Tuấn

Huỳnh ThanhTuấn

Chủ nhiệm đềtài

2

- Lý do thay đổi ( nếu có):

5 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

6 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo kếhoạch

Thực tế đạtđược

1 Thu mô bướu 6-9 /2016 6-9 /2017

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

c) Sản phẩm Dạng III:

(Tạp chí, nhà xuất bản)

Theo

kế hoạch

Thực tếđạt được1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

được

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:

Theo

kế hoạch

Thực tếđạt được1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

chỉ nơi ứng dụng)

1

2

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

MỞ ĐẦU

U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) là u nguyên phát thường gặp nhất của hệthần kinh trung ương, chiếm 12-15% các loại u nội sọ và 50-60% u tế bào thần kinh đệm.Mỗi năm có khoảng trên 50.000 trường hợp được chẩn đoán mới, trong đó khoảng 60%

là ở nam giới Độ tuổi trung bình của các bệnh nhân được chẩn đoán u nguyên bào thầnkinh đệm là 64 Hiện nay mặc dù với sự tiến bộ của phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu đặcbiệt liệu pháp điều trị đúng đích, U nguyên bào thần kinh đệm vẫn là u có tiên lượng rấtxấu trong các u của hệ thần kinh trung ương Tỉ lệ sống sau 2 năm và 5 năm lần lượt là13,7% và 4,7%

Ở Việt Nam, hiện chưa số liệu dịch tễ học u não trong cộng đồng, tuy nhiên tỉ lệ saobào ác tính trong thực hành lâm sàng khá cao Theo nghiên cứu của tác giả Trần MinhThông, trong thời gian 7,5 năm (1/2000-7/2007) tại bệnh viện Chợ Rẫy có 1187 ca u saobào được chẩn đoán và phẫu thuật, trong đó u sao bào độ ác cao (u sao bào thoái sản, unguyên bào thần kinh đệm) chiếm 56% Hiện nay nghiên cứu căn bản về u nguyên bàothần kinh đệm ở Việt Nam chưa được phổ biến một phần vì việc chuẩn hóa quá trìnhphân lập tế bào bướu từ mẫu mô của bệnh nhân Vì thế trong nghiên cứu này chúng tôithiết lập qui trình phân lập và nhuộm miễn dịch huỳnh quang tế bào bướu trong môitrường nuôi cấy để tạo tiền đề cho các nghiên cứu về u nguyên bào thần kinh đệm về sau

Chương I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

U nguyên bào thần kinh đệm là khối u não ác tính nguyên phát phổ biến nhất, baogồm 16% của tất cả các khối u thần kinh trung ương và hệ thần kinh trung ương (13) Tỷ

lệ mới mắc trung bình được điều chỉnh theo tuổi là 3,2 trên 100.000 dân (7,8) Mặc dùUNBTKĐ xảy ra hầu như chỉ trong não, nhưng chúng cũng có thể xuất hiện trong thânnão, tiểu não và tủy sống Sáu mươi mốt phần trăm của tất cả các u thần kinh đệm nguyênphát xảy ra ở bốn thùy não: trán (25%), thái dương (20%), thùy đỉnh (13%) và chẩm(3%) theo Hiệp hội điều dưỡng thần kinh học Mỹ năm 2014 Ban đầu, UNBTKĐ đượccho là chỉ bắt nguồn từ các tế bào thần kinh đệm; tuy nhiên, bằng chứng cho thấy rằngchúng có thể phát sinh từ nhiều loại tế bào có đặc tính giống tế bào gốc thần kinh Các tếbào này ở nhiều giai đoạn biệt hóa từ tế bào gốc đến tế bào thần kinh đến tế bào thần kinhđệm, với sự thay đổi kiểu hình được xác định, phần lớn, bởi sự thay đổi phân tử trong conđường truyền tín hiệu thay vì khác biệt về loại nguồn gốc tế bào(10)

Theo kết quả từ dự án Atlas Genome Atlas (9), hơn 600 gen đã được giải trình tự từhơn 200 mẫu khối u ở người, cho thấy hồ sơ di truyền phức tạp của UNBTKĐ và thiếtlập một bộ ba lõi Con đường truyền tín hiệu thường được kích hoạt là p53, con đườngtruyền tín hiệu tyrosine kinase / Ras / phosphoinositide 3-kinase Phần lớn các UNBTKĐnguyên phát và thứ phát có sự thay đổi trong các con đường này, dẫn đến sự tăng sinh tếbào không kiểm soát và tăng cường sự sống của tế bào, đồng thời cho phép tế bào khối uthoát khỏi các trạm kiểm soát chu kỳ tế bào, lão hóa và apoptosis (4)

Sự thay đổi di truyền điển hình cho UNBTKĐ nguyên phát là sự biểu hiện của yếu tốtăng trưởng biểu bì (EGFR), đột biến gen tương đồng phosphate và tenin (PTEN) và mấtnhiễm sắc thể 10q Trong UNBTKĐ thứ cấp, đột biến isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1),đột biến p53 và mất nhiễm sắc thể 19q thường thấy (1,14,15) Ngoài ra, bốn phân nhómUNBTKĐ đã được xác định, mỗi loại có các mô hình tiến triển bệnh và kết quả sốngkhác nhau Để phân tích chi tiết hơn về các lộ trình và phân nhóm tín hiệu UNBTKĐ, độcgiả có thể tham khảo các công trình nguyên cứu của Brennan và cộng sự, 2013; Verhaak

và cộng sự, 2010; và Wang và cộng sự, 2015

Với quy trình trị liệu hiện tại là cắt bỏ khồi u kết hợp với điều trị đa phương thức,khoảng 70% bệnh nhân UNBTKĐ sẽ có tiến triển bệnh trong vòng một năm chẩn

đoán(12), với ít hơn 5% bệnh nhân sống sót sau năm năm sau chẩn đoán(7) Cắt bỏ khối

u là một lựa chọn cho một số bệnh nhân, và phẫu thuật cắt bỏ có thể làm giảm bớt cáchiệu ứng và triệu chứng hàng loạt, chẳng hạn như co giật, nói và thiếu hụt vận động,thường thấy khi tái phát

Phẫu thuật lặp lại có thể được yêu cầu để xác nhận chẩn đoán tái phát khối u so vớigiả mạc hoặc hoại tử phóng xạ và cũng có thể cung cấp mô để xét nghiệm phân tử để xácđịnh các tác nhân mục tiêu mới tiềm năng (3) Ý kiến thay đổi như liệu phẫu thuật lặp lại

có tăng cường hệ điều hành hay không Một số bằng chứng tồn tại rằng mức độ cắt bỏlớn hơn khi tái phát có liên quan đến khả năng sống sót được cải thiện (2,5); tuy nhiên,các nghiên cứu khác không tìm thấy lợi ích tuyệt đối về mặt sinh tồn (3), tính thấm vàphù mạch, cải thiện oxy hóa và giảm hoại tử phóng xạ khi dùng RT (6) Tuy nhiên, nó cóthể gây ra các sự kiện có khả năng đe dọa đến tính mạng, như xuất huyết, đông máu vàthủng ruột (11)

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Sinh học phân tử tại Đại học Y Dượcthành phố Hồ Chí Minh

1.1 Đối tượng và vật liệu

Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA-MB-231 là quà tặng từ các đối tác nướcngoài của phòng thí nghiệm

1.2 Hóa chất

Các kháng thể đã được sử dụng cho miễn dịch huỳnh quang: Neurofilaments ( độpha loãng 1/100, Công nghệ sinh học Santa Cruz), Astrocyte (độ pha loãng 1: 100, Côngnghệ sinh học Santa Cruz), kháng thể thứ cấp IgG Alexa (độ pha loãng 1: 2000,Invitrogen)

2 Phương pháp thí nghiệm

2.1 Thu mô từ bệnh nhân

Mẫu mô được thu từ khối u của bệnh nhân bằng phương pháp phẫu thuật và đượctrữ trong môi trường vận chuyển và đưa về phòng thí nghiệm

2.2 Nuôi cấy tế bào

Phân lập và nuôi cấy tế bào: Trong nghiên cứu này tế bào UNBTK sinh thiết từkhối mô được nuôi trong môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS),1% penicillin và streptomycin Mẫu khối u được nghiền bằng biện pháp cơ học (bầm

giúp tách mảng tế thành bào đơn và cuối cùng lọc qua màng lọc 40 µm để loại bỏ cácmảng tế bào lớn Ly tâm dịch huyền phù tế bào 1200 rpm trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi

và thu sinh khối tế bào Huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy mới bổ sung 10%

khi tế bào mọc ổn định tiến hành cấy chuyền và tiến hành thí nghiệp tiếp theo khi tế bào

ở P3

2.3 Nhuộm miễn dịch

lý, các slide được rửa với 1x PBS, cố định bằng 4% formaldehyd trong 5 phút, đtăng tinh

huyết thanh 5% trong PBS trong 1 giờ tại phòng nhiệt độ Các tế bào được ủ đầu tiên vớiNeurofilaments (1: 100) trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và được rửa 3 lần với 1x PBS Sau

PBS và nhuộm với kháng thể 2 phát huỳnh quang trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Nhân tếbào được nhuộm với DAPI

2.4 Phân tích dữ liệu

Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn của giá trịtrung bình (SE) của ba lần lặp lại Các tính toán thống kê được thực hiện bằng ANOVAhai chiều trong phần mềm vẽ biểu đồ dữ liệu GraphPad Prism Holm-testídák được sử

Chương III KẾT QUẢ

1 Phân lập và nuôi cấy sơ cấp

rất nhiều tế bào chết và xác tế bào trong môi trường Sau nhiều lần thay môi trường thìđến ngày thứ 7 tế bào đã bám vá phát triển tốt, môi trường sạch không còn mảnh vụn mônữa Theo dõi tiếp tục đến ngày 14 thì tế bào khỏe và có thể cấy chuyền (Hình 1)

Hình 1: Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối u Tế bào được quan sát

sau 1 ngày, 2 ngày, 4 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày Bar = 50 µM

2 Nuôi cấy thứ cấp

Sau khi cấy chuyền tế bào cũng phát triển khá tốt, sau 10 ngày cấy chuyền thì tếbào có hình dạng của tế bào thần kinh đệm và bao phủ hơn 60% bề mặt nuôi cấy, có thểtiến hành nhuộm miễn dịch huỳnh quang (Hình 2).

Hình 2: Kết quả nuôi cấy thứ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối u NB49(X20) Tế bào

đươc quan sát sau 3 ngày, 5 ngày, 10 ngày, bar = 50 µM

3 Nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Sau khi cấy chuyền tế bào phát triển ổn định đến ngày thứ 10 thì tế bào được tiến hànhnhuộm miễn dịch huỳnh quang với 2 marker cho tế bào thần kinh đệm là Neurofilaments vàAstrocyte để xác nhận khả năng phân lập thành công tế bào thần kinh đệm Kết quả nhuộm chothấy các tế bào điều biểu hiện cao các marker cho tế bào thần kinh đệm

Hình 3: Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho 2 marker Neurofilaments và

Astrocyte ở ngày thứ 10 (40X)

DAPI Neurofilaments Astrocyte Merge

Tế bào tiếp tục được duy trùy và cấy chuyền tới ngày thứ 20 để kiểm tra khả năng sốngsót của tế bào thần kinh đệm Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang vẫn cho thấy sự

biểu hiện cao của 2 protein Neurofilaments và Astrocyte, chứng tỏ tế bào thần kinh đệmvẫn phát triển tốt

DAPI Neurofilaments Astrocyte Merge

Hình 4: Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho 2 marker Neurofilaments và Astrocyte

Chương IV THẢO LUẬN

Thuật ngữ U nguyên bào thần kinh đệm được giới thiệu bởi Cushing vào nửa saucủa thế kỷ XIX, trong khi ca phẫu thuật đầu tiên trên một bệnh nhân bị loại khối u nàyđược tiến hành tại Vienna vào năm 1904 UNBTKĐ là một khối u nguyên phát của não,bao gồm một nhóm các khối u không đồng nhất về mặt di truyền và kiểu hình 90% cáctrường hợp đa dạng glioblastoma phát triển de novo (glioblastoma nguyên phát) từ các tếbào thần kinh đệm bình thường bằng phương pháp khối u đa nhân 10% u thần kinh đệmcòn lại là các trường hợp u thần kinh thứ phát, phát triển thông qua tiến triển từ các khối

u thấp (u tế bào hình sao khuếch tán hoặc anaplastic), mất khoảng 4 năm5 năm Bệnh uthần kinh đệm thứ phát được chẩn đoán chủ yếu ở những người có độ tuổi trung bình 39tuổi, phát triển chậm hơn và tiên lượng tốt hơn Mặc dù cơ sở di truyền, cũng như các conđường phân tử làm cơ sở cho sự phát triển của u thần kinh đệm thứ phát và thứ phát làkhác nhau, hai loại này cho thấy không có sự khác biệt về hình thái

Nghiên cứu về UNBTKĐ còn bị hạn chế bởi thiếu mô hình nghiên cứu chính xác.Trong nghiên cứu này nhóm tiến hành phân lập tế bào UNBTKĐ từ khối u của bệnh nhânnắm phát triển một mô hình nghiên cứu chính xác cho loại ung thư này Tế bào phân lập

từ khối u sẽ mang 2 đặc điểm nổi bất là: có các đặc tính chung của UNBTKĐ và mangmột vài đặc tính chuyên biệt đặc trưng cho từng bệnh nhân một Phát triễn mô hình tế bàophân lập từ khối u sẽ giúp tạo ra tiền đề cho mô hình y học cá thể, từ đó sẽ giúp ta9ng caohiệu quả điều trị và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân

Với phương pháp quan sát hình thái bên ngoài và nhuộm miễn dịch huỳnh quang

để xác nhận sự tồn tại và phát triển của tế bào thần kinh đệm phân lập từ khối u đã chứng

tỏ thành công bước đầu của đề tài Tuy nhiên cần tiến hành thêm các nghiên cứu để xácnhận một cách chính xác hơn sự tồn tại của các tế bào thần kinh đệm phân lập từ khối ucủa bệnh nhân, từ đó cũng cố thêm tính chính xác của đề tài Tuy nhiên nhiên trong giớihạn của đề tài thì không thời gian để tiến hành thêm các thí nghiệm khác Các nghiên cứu

kế thừa tiếp sẽ sẽ rất cần thiết và sẽ giúp hoàn thiện khả năng hướng tới y học cá thểtrong tương lai