Tạo mẫu sinh phẩm đông khô và đánh giá tiêu chí của mẫu ngoại kiểm sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm pcr hbv hcv

Do đó, đề tài “Tạo mẫu sinh phẩm đông khô và đánh giá tiêu chí của mẫu ngoại kiểm sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm PCR HBV – HCV” nhằm phục vụ chương trình

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN THỊ NGỌC HIẾU

TẠO MẪU SINH PHẨM ĐÔNG KHÔ VÀ ĐÁNH GIÁ TIÊU CHÍ CỦA MẪU NGOẠI KIỂM SỬ DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM PCR HBV - HCV

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN THỊ NGỌC HIẾU

TẠO MẪU SINH PHẨM ĐÔNG KHÔ VÀ ĐÁNH GIÁ TIÊU CHÍ CỦA MẪU NGOẠI KIỂM SỬ DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM PCR HBV - HCV

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất

Mã số: 8720210

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRẦN HỮU TÂM PGS.TS VĨNH ĐỊNH

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

MỤC LỤC

KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG ix

MỞ ĐẦU 1

1 Mục tiêu tổng quát 1

2 Mục tiêu cụ thể 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan tình hình bệnh Viêm gan do siêu vi 3

1.2 Viêm gan do siêu vi B (HBV) 4

1.3 Viêm gan do siêu vi C (HCV) 8

1.4 Đồng nhiễm HBV và HCV 12

1.5 Xét nghiệm chẩn đoán viêm gan do siêu vi 13

1.6 Kiểm soát chất lượng và đảm bảo chất lượng trong phát hiện và chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử 15

1.7 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Tạo mẫu sinh phẩm đông khô 37

3.2 Kết quả kiểm tra độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu HBV và HCV 39

3.3 Ứng dụng triển khai chương trình ngoại kiểm 54

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 58

4.1 Độ đồng nhất 58

4.2 Độ ổn định 58

4.3 Biện luận kết quả 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

STT Viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Dịch nghĩa tiếng Việt

1 ALT Alanin transaminase Enzyme chuyển nhóm amin của alanin

2 Anti-HBc Antibody to Hepatitis B

virus Core

Kháng thể lõi của siêu vi viêm gan B

3 Anti-Hbe Antibody to Hepatitis B

virus Envelop

Kháng thể vỏ của siêu vi viêm gan B

4 Anti-HBs Antibody to Hepatitis B

Kháng thể viêm gan C

7 CAP College of American

Pathologists

Ban nghiên cứu bệnh học Hoa Kỳ

8 cccDNA Covalently-close circular

12 DNA Deoxyribonucleic acid

13 EDTA Ethylene-diamine-tetra

acetic acid

14 ELISA Enzyme-linked

immunosorbent assay

Kỹ thuật miễn dịch gắn kết enzyme

15 EMQN European Molecular

Genetics Quality Network

Mạng lưới chất lượng di truyền phân

tử Châu Âu

16 ER Endoplasmic reticulum Lưới nội sinh chất

17 HbeAg Hepatitis B virus E antigen Kháng nguyên lõi Siêu vi viêm gan B

18 HbsAg Hepatitis B virus surface

antigen

Kháng nguyên bề mặt Siêu vi viêmgan B

19 HBV Hepatitis B virus Siêu vi viêm gan B

20 HCV Hepatitis C virus Siêu vi viêm gan C

21 HCVAg Hepatitis C virus Core

antigen

Kháng nguyên lõi của viêm gan C

22 HIV Human immunodeficiency

virus

Siêu vi gây suy giảm miễn dịch ởngười

24 IgC Immunoglobulin C Globulin miễn dịch nhóm C

25 IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch nhóm G

26 IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch nhóm M

27 ILAC International Laboratory

Accreditation Cooperation

Hiệp hội công nhận phòng thí nghiệmquốc tế

28 IUPAC International Union of Pure

and Applied Chemistry

Hiệp hội hóa học quốc tế

29 mRNA Messenger ribonucleic acid RNA thông tin

32 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi

33 RNA Ribonucleic acid

34 rt-PCR Reverse transcription PCR PCR phiên mã ngược

35 TMA Transcription-mediated

amplification

Khuếch đại qua trung gian phiên mã

36 tRNA Transportribonucleic acid RNA vận chuyển

37 TTKCXN Center for Standardization

and Quality control inMedical laboratory ofHochiminh city

Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Biểu tượng ngày Viêm gan Thế giới 3

Hình 1.2 Bản đồ dịch tễ vùng phân bố HBV 4

Hình 1.3 Mô hình cấu tạo HBV 5

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử HBV 6

Hình 1.5 Chu kỳ xâm nhiễm và tái bản của HBV 7

Hình 1.6 Phân bố nhiễm HCV trên thế giới 9

Hình 1.7 Cấu tạo HCV 10

Hình 1.8 Cấu trúc phân tử ở HCV 11

Hình 1.9 Chu trình xâm nhiễm và tái bản HCV 12

Hình 1.10 Vòng tròn thẩm định phương pháp chẩn đoán bằng PCR 16

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tổng quát sản xuất mẫu ngoại kiểm HBV-HCV 34

Hình 3.1 Lọ đông khô mẫu huyết thanh HBV (+) 38

Hình 3.2 Lọ đông khô mẫu huyết thanh HCV (+) 38

Hình 3.3 Lọ đông khô mẫu huyết thanh HCV (-), HBV (-) 38

Hình 3.4 Biểu đồ nồng độ mẫu HBV để đánh giá độ đồng nhất 39

Hình 3.5 Biểu đồ nồng độ mẫu HCV để đánh giá độ đồng nhất 40

Hình 3.6 Biểu đồ nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 25oC 41

Hình 3.7 Biểu đồ nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC 43

Hình 3.8 Biểu đồ nồng độ mẫu HBV lưu trữ 30 ngày ở 4oC và 25oC 44

Hình 3.9 Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 25oC 46

Hình 3.10 Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC 48

Hình 3.11 Biểu đồ nồng độ mẫu HCV lưu trữ 30 ngày ở 4oC và 25oC 50

Hình 3.12 Biểu đồ phòng xét nghiệm phân tích mẫu HBV 53Hình 3.13.Biểu đồ đánh giá độ đồng nhất mẫu HBV tại các phòng xét nghiệm thamgia ngoại kiểm……… ……….……… …… ……… 55Hình 3.14 Biểu đồ đánh giá độ đồng nhất mẫu HCV tại các phòng xét nghiệm thamgia ngoại kiểm……… 57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1.Kết quả đo nồng độ mẫu HBV để đánh giá độ đồng nhất……… 39

Bảng 3.2.Kết quả đo nồng độ mẫu HCV để đánh giá độ đồng nhất……… 39

Bảng 3.3 Nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 25oC……… 41

Bảng 3.4 Nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC……… 42

Bảng 3.5 Nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC và 25oC…… 43

Bảng 3.6 Nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 3 tháng ở 25oC và 4oC…… 45

Bảng 3.7 Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 25oC……… 46

Bảng 3.8 Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC……… 47

Bảng 3.9 Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC và 25oC…… 49

Bảng 3.10 Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 3 tháng ở 25oC và 4oC…… 51

Bảng 3.11 Nồng độ mẫu HBV và HCV qua quá trình vận chuyển 7 ngày……… 52

Bảng 3.12 Nồng độ mẫu HBV và HCV kiểm tra tại một số PXN………… 52

Bảng 3.13 Kết quả đo nồng độ mẫu PB0301 tại các phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm ……… ……… ……… 54

Bảng 3.14 Kết quả đo nồng độ mẫu PB0302 tại các phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm……… ……… 55

Bảng 3.15 Kết quả đo nồng độ mẫu PC0301 tại các phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm……… 56

Bảng 3.16 Kết quả đo nồng độ mẫu PC0302 tại các phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm……… 57

Bảng 4.17 Kết quả độ ổn định của mẫu HBV-HCV qua các chỉ số thống kê…… 59

MỞ ĐẦU

PCR là một kỹ thuật hiện đại, có giá trị chẩn đoán cao và cho kết quả nhanh trongxét nghiệm chẩn đoán các bệnh nhiễm vi khuẩn, siêu vi Đặc biệt trong việc chẩnđoán và điều trị bệnh viêm gan do siêu vi các loại B, C, phương pháp PCR ngàycàng được sử dụng phổ biến do tính ý nghĩa và hiệu quả trong chẩn đoán và theodõi điều trị thông qua giá trị hàm lượng và khả năng tái bản của siêu vi có trongmẫu bệnh phẩm Khả năng định lượng siêu vi chính xác phụ thuộc vào nhiều yếu tố,

có thể bao gồm: kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu đến phòng xétnghiệm; kỹ thuật ly trích và thực hiện xét nghiệm; thiết bị và hóa chất Do đó để đạtđược kết quả đáng tin cậy, phòng xét nghiệm phải tham gia chương trình ngoạikiểm để kiểm tra và so sánh kết quả xét nghiệm với các phòng xét nghiệm khác sửdụng cùng kỹ thuật và thiết bị

Trên thế giới đã có một số cơ quan, tổ chức như NRL (Úc), EuroGentest (Châu Âu),American Society for Microbiology (Mỹ) triển khai chương trình ngoại kiểm trachất lượng xét nghiệm chẩn đoán bằng PCR Tuy nhiên việc tham gia các chươngtrình còn nhiều trở ngại do chi phí cao và khó khăn trong vận chuyển mẫu

Chương trình ngoại kiểm đã được triển khai tại Việt Nam vài năm gần đây cho cáclĩnh vực xét nghiệm Sinh hóa, Huyết học, Vi sinh… nhưng vẫn chưa áp dụng đốivới lĩnh vực Sinh học phân tử nói chung và kỹ thuật PCR nói riêng vì chưa có bất

kỳ tổ chức hoặc công ty nào cung cấp mẫu ngoại kiểm hoặc chương trình ngoạikiểm tra chất lượng trong lĩnh vực xét nghiệm chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR Do

đó, đề tài “Tạo mẫu sinh phẩm đông khô và đánh giá tiêu chí của mẫu ngoại

kiểm sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm PCR HBV – HCV” nhằm phục vụ chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm

PCR cho các phòng Xét nghiệm Y khoa được thực hiện với:

1 Mục tiêu tổng quát

Tạo mẫu sinh phẩm đông khô đáp ứng các yêu cầu của mẫu ngoại kiểm dùng trongkiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng PCR HBV – HCV

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan tình hình bệnh Viêm gan do siêu vi

Viêm gan là sự viêm nhiễm ở gan do nhiều nguyên nhân trong đó chủ yếu do nhiễmsiêu vi, có 5 loại siêu vi gây viêm gan chính được xem như các loại viêm gan: A, B,

C, D và E Đây là các loại viêm gan được quan tâm nhiều nhất do gánh nặng vềbệnh tật và tử vong, đặc biệt hai loại viêm gan B và C là nguyên nhân dẫn đến hàngtriệu người bị viêm gan cấp tính và mãn tính và là căn nguyên của bệnh xơ gan vàung thư gan

Viêm gan A và E chủ yếu lan truyền qua đường tiêu hóa do thực phẩm hoặc thứcuống bị nhiễm siêu vi Trong khi viêm gan B, C và D thường do tiếp xúc với dịch

cơ thể Kiểu lan truyền chính của các loại siêu vi này bao gồm tiếp nhận máu và cácsản phẩm của máu bị nhiễm, sử dụng các thiết bị y tế bị nhiễm siêu vi, sự lây nhiễmviêm gan siêu vi B từ mẹ sang con trong giai đoạn mang thai và sinh nở, giữa cácthành viên trong gia đình và qua quan hệ tình dục

Ngày 28 tháng 7 năm 2011 được xem là ngày đầu tiên chính thức của Tổ chức Y tếThế giới đánh dấu sự gia tăng nhận thức và hiểu biết về viêm gan do siêu vi [21]

Hình 1.1 Biểu tượng ngày Viêm gan Thế giới

1.2 Viêm gan do siêu vi B (HBV)

1.2.1 Dịch tễ học

Mặc dù đã có vaccine phòng chống HBV từ năm 1982 và hiệu quả của vaccine đạtđến 95% trong việc ngăn ngừa nguyên nhân gây ung thư đứng hàng thứ 5 trên thếgiới; ước tính hiện nay vẫn có khoảng 2 tỉ người nhiễm siêu vi viêm gan B vàkhoảng 350 triệu người chuyển sang dạng mãn tính, trong đó có khoảng 600 ngànngười tử vong hàng năm [9]

Tần suất nhiễm HBV khác nhau trên thế giới và được chia thành 3 vùng dịch tễ [1]

- Vùng dịch lưu hành thấp (Tây Âu, Bắc Mỹ, Úc): bệnh hiếm ở trẻ em; 3-5 %người có anti-HBs; 0,1-0,5% người mang HBsAg mãn tính;

- Vùng dịch lưu hành vừa (Địa Trung Hải, Trung Đông, Nam Mỹ, Đông Âu, cácnước thuộc Liên Xô cũ): 20-50% người có anti-HBs; 2-7% người mang HBsAgmãn tính;

- Vùng dịch lưu hành cao (Trung Quốc, Đông Nam Á, cận sa mạc Sahara): thường ởtrẻ sơ sinh; 70-95% người có anti-HBs; 8-15% người mang HBsAg mãn tính

Hình 1.2 Bản đồ dịch tễ vùng phân bố HBV

1.2.2 Đặc tính cấu tạo và sinh sản của HBV

Siêu vi viêm gan B (HBV) là một thành viên tiêu biểu trong họ Hepaviridae - siêu

vi có vật chất di truyền là bộ gen DNA dùng tế bào gan làm vật chủ; tuy đôi khi cóthể tìm thấy lượng nhỏ DNA của HBV trong thận, lách và tế bào đơn nhân nhưngthực ra tế bào gan mới là đích thực sự của chúng

Dạng hạt hoàn chỉnh (virion) của HBV có cấu tạo vỏ kép đường kính 42nm với lớp

vỏ ngoài là lipoprotein cấu thành bởi 3 loại glycoprotein vỏ (hay còn gọi là khángnguyên bề mặt- HBsAg) [19]

Hình 1.3.Mô hình cấu tạo HBV

Bên trong vỏ này là nucleocapsid (hay còn gọi là kháng nguyên lõi- HBeAg) Lõichứa bộ gen của siêu vi và enzym polymerase đóng vai trò tổng hợp DNA siêu vitrong tế bào bị xâm nhiễm Chính việc giải trình tự bộ gen HBV DNA mà người taphân biệt được các kiểu gen dựa trên cấu trúc epitope của HBsAg – tạo nên các

phân type khác nhau (ayr, adr, adw, adyw, adwr, aywr, ay…) thường phân bố đặc trưng theo vùng địa lý Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy phân type ayr và adr

chiếm lần lượt là 60 % và 17 %, còn lại các phân type khác chiếm tỷ lệ rất nhỏ

Bộ gen của HBV là một phân tử DNA vòng có cấu trúc mạch kép không hoàn toàn,kích thước 3,2 Kb, được cấu tạo bởi 2 sợi có chiều dài không bằng nhau Chuỗi dàinằm ngoài có cực âm tính, tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là3,2Kb và mã hoá cho các thông tin di truyền của siêu vi Chuỗi ngắn nằm trong cócực dương tính thay đổi và chỉ bằng 50-80% chiều dài sợi âm HBV có cấu tạo nhỏgọn do có sự tiết kiệm trong cấu trúc bộ gen nhờ cách sắp xếp những miền giao củacác gen S, C, P và X nên có khả năng tổng hợp được nhiều protein của siêu vi [20]

Hình 1.4.Cấu trúc phân tử HBV

 Gen S: bao gồm vùng S, Pre-S1; Pre-S2 mã hoá tổng hợp các HBsAg;

+ Đoạn gen S tổng hợp nên protein S (Small) Đây là protein chủ yếu chiếm đa số

+ Đoạn gen S và Pre-S2 tổng hợp nên protein M (Medium) Vùng Pre-S2 giúpcho siêu vi bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ nó liên kết với mộtloại albumin hiện diện trong huyết thanh người.

+ Đoạn S, Pre-S1, Pre-S2 tổng hợp nên protein L (Light)

 Gen C mã hoá các protein của nucleocapsid Gen C có 2 đoạn là đoạn trướcnhân và đoạn nhân

+ Đoạn trước nhân tổng hợp HbeAg;

+ Đoạn nhân tổng hợp HbcAg

 Gen P là gen lớn nhất chiếm 80% chiều dài bộ gen mã hoá cho DNA-polymerase

(1) Phần vỏ của HBV bám vào màng tế bào gan nhờ sự nhận biết của thụ thể trênmàng tế bào gan, sau đó HBV hòa nhập với protein màng của tế bào gan và xâmnhập vào tế bào gan.

(2) Sau khi vào tế bào chất, chỉ có phần lõi chứa DNA và men DNA polymerase đivào nhân tế bào gan

(3) Tại nhân tế bào gan, DNA được sửa chữa để tạo thành DNA vòng khép kín(covalently-close circular DNA = cccDNA)

(4) cccDNA được xem là khuôn để sao chép RNA của HBV

(5) mRNA được giải mã tạo thành các protein của HBV (protein lõi, polymerase,protein X, protein bề mặt siêu vi) trong tế bào chất

(6) Protein lõi (core protein) bao bọc RNA tiền genome (RNApregenome) và menpolymerase tạo thành capsid (7)

(8,9) RNA tiền genome sẽ sao chép ngược thành DNA

(10) Capsid chứa DNA mới được tổng hợp này có thể phóng thích DNA vào nhân

tế bào gan để tạo thành cccDNA

(11) DNA sẽ được ghép thêm phần vỏ bọc trong mạng lưới nội bào (endoplasmicreticulum = ER) và thể Golgi sau đó phóng thích ra khỏi tế bào gan dưới dạngvirion hoàn chỉnh

1.3 Viêm gan do siêu vi C (HCV)

1.3.1 Dịch tễ học

Viêm gan do siêu vi C (HCV) là nguyên nhân của phần lớn các trường hợp đượcbiết đến như viêm gan không A, không B Lây nhiễm viêm gan siêu vi C chủ yếuxảy ra qua đường máu (90%), lây qua vật dính máu và vô trùng kém, dùng chungkim trong tiêm chích ma túy (70%) và qua đường tình dục [4]

Theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới (WHO), tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới

là 2,2%, khoảng 170 triệu người Tính đến năm 2015 có đến 3 triệu người Mỹ đã

nhiễm HCV trên 20 năm, trong đó có ít nhất có 375.000 người xơ gan Tỷ lệ nhiễmHCV đưa đến xơ gan là 15 - 20% sau 20 năm, tỷ lệ càng tăng nếu thời gian nhiễmcàng lâu, nếu nhiễm hơn 60 năm thì xơ gan là 71% Đa số người châu Á nhiễm lúcmới sinh thường bị xơ gan lúc trung niên; sau khi bị xơ gan do HCV tỷ lệ đưa đếnung thư gan 1,4 - 3,3% mỗi năm và tử vong 2,6 - 4% mỗi năm [4].

Hình 1.6.Phân bố nhiễm HCV trên thế giới 1.3.2 Đặc tính cấu tạo, xâm nhiễm và tái bản của HCV

HCV với vật chất di truyền là sợi đơn RNA của chủng Flavivirus, bao gồm các siêu

vi viêm gan khác (siêu vi gây bệnh sốt vàng da) và các siêu vi gây bệnh không liênquan đến viêm gan siêu vi C (chẳng hạn siêu vi West Nile) RNA của siêu vi C chứa

1 khung đọc Chuỗi polypeptid được tách thành kháng nguyên lõi và kháng nguyên

vỏ và một số protein không cấu trúc (NS) bao gồm enzym tổng hợp, enzym protease

và thụ thể đáp ứng interferon Siêu vi có một lớp vỏ lipoprotein bên ngoài bao bọcmột capsid 20 mặt có đường kính 56nm Hệ gen của siêu vi gồm một dây xoắnRNA nhận biết dương tính chứa khoảng 9600 nucleotid [8]

Hình 1.7.Cấu tạo HCV

Hệ gen của siêu vi C gồm 2 vùng:

 Vùng cấu trúc nằm ở đầu 5’ phần không sao mã gồm các gen C, E1, E2, P7 cácgen mã hoá cho các protein cấu trúc của siêu vi

 Vùng không cấu trúc nằm ở đầu 3’ phần không sao mã có các gen NS2, NS3,NS4, NS5 là các gen mã hoá cho các protein chức năng protease, RNA–polymerase

và các peptid tham gia vào quá trình sao chép siêu vi và các đoạn polyprotein [18]

Hình 1.8.Cấu trúc phân tử ở HCV

Nhiễm HCV có 10-15% khỏi bệnh, 20% người lành mang siêu vi, 60-70% viêm ganmãn tính trong đó có 20% xơ gan và 3-5% ung thư gan nguyên phát [1] HCV cóthể phát triển thành 1 dạng xơ gan hiện nay ở mức trung bình khoảng 1,5 đến 3trường hợp/ năm Tại Bắc Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản, bệnh viêm gan siêu vi C lànhân tố nguy cơ phổ biến nhất trong việc tiến triển của HCV

Việc ngăn ngừa viêm gan siêu vi C cho thấy khó khăn hơn so với HIV và HBV.Tuy nhiên, 80% tỷ lệ mắc bệnh viêm gan siêu vi C cấp tính đã được giảm trong cácthập kỷ qua, điều đó được chứng minh qua việc xét nghiệm máu từ những ngườihiến máu bị bệnh viêm gan siêu vi C và thực hiện an toàn nhằm giảm nguy cơ lâynhiễm Đã có những cải tiến đáng kể trong việc điều trị viêm gan siêu vi C [3]

Hình 1.9.Chu trình xâm nhiễm và tái bản HCV

Chu trình xâm nhiễm và tái bản HCV bắt đầu từ việc nhận biết siêu vi hiện diện vàxâm nhiễm vào tế bào gan ở người, sau khi được tiếp nhận và RNA siêu vi phântách độc lập với bộ gen RNA HCV được dịch mã bằng các ribosome của tế bào chủ

để sản sinh ra chuỗi polypeptide của HCV Chuỗi polypeptide sẽ được giải mã nhờvào các enzym peptidase của tế bào chủ sau đó enzym protease của siêu vi NS2 vàNS3 sẽ chuyển mã thành 10 loại protein khác nhau của HCV Protein không cấutrúc NS2-NS5b tương đồng và định vị bên trong tế bào gan để hình thành nên phứchợp tái lập để sản xuất hàng loạt RNA HCV Các RNA bản sao này có thể tái xâmnhiễm và sản xuất nhiều HCV nữa

1.4 Đồng nhiễm HBV và HCV

Khoảng 2% đến 10% cá thể nhiễm bệnh viêm gan C thường nhiễm luôn cả viêmgan B Trong số những người bị viên gan B mãn tính có 15% đến 20% cũng bị viêmgan C Nét đặc trưng về lâm sàng và xét nghiệm của những bệnh nhân bị đồngnhiễm HBV và HCV hơi trái ngược và khác với những cá thể chỉ bị nhiễm một loạibệnh viêm gan Các bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan có lượng siêu vi thấp hơn so

với những bệnh nhân mắc một loại bệnh viêm gan Trong số những cá thể mắc bệnhviêm gan B mãn tính thì những cá thể bị nhiễm thêm bệnh viêm gan C cấp tính cókhả năng tiến đến mãn tính chiếm tỷ lệ thấp hơn Những đặc trưng này được thừanhận là có lợi trong căn bệnh đồng nhiễm Ngược lại, những bệnh nhân bị đồngnhiễm viêm gan B và C mãn tính sẽ nhanh chóng tiến triển thành bệnh xơ gan.Những bệnh nhân bị đồng nhiễm viêm gan B và viêm gan C cấp tính thì thường bịviêm gan cấp tính nặng hơn.

Nhiều nghiên cứu cho rằng tần số xuất hiện cao của việc sao chép DNA siêu viHBV trong tế bào gan thậm chí trong sự vắng mặt của HBsAg Chẳng hạn nhưnhững bệnh nhân đồng nhiễm HBV và HCV cận lâm sàng cho thấy tổn thương gannghiêm trọng hơn và tần số chuyển thành bệnh xơ gan cao hơn Mặc dù những pháthiện được cho rằng hậu quả của những bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan B và Cdường như nặng hơn là nhiễm một loại siêu vi

1.5 Xét nghiệm chẩn đoán viêm gan do siêu vi

Viêm gan B, C có số lượng xét nghiệm chẩn đoán cao nhất trong các loại viêm gan dosiêu vi Xét nghiệm gần đây bao gồm chủ yếu là phương pháp huyết thanh học như miễndịch gắn kết enzym (ELISA) hoặc các phương pháp liên quan đến các kỹ thuật địnhlượng kháng nguyên siêu vi hoặc kháng thể, tuy nhiên hiện nay xét nghiệm sinh họcphân tử dựa trên phát hiện và định lượng acid nucleic được sử dụng rộng rãi hơn và được

sử dụng để đánh giá theo dõi, tiên lượng và điều trị hiệu quả

Hiện nay, có hai phương pháp phổ biến trong việc xét nghiệm xác định viêm ganHBV, HCV dựa trên chỉ số huyết thanh học và nồng độ siêu vi trong dịch cơ thể làchẩn đoán bằng huyết thanh học và chẩn đoán bằng sinh học phân tử [4],[8]

1.5.1 Chẩn đoán bằng huyết thanh học

Xét nghiệm kháng thể với bệnh viêm gan do siêu vi là xét nghiệm sàng lọc chủ yếu

sử dụng phương pháp ELISA nhằm phát hiện sự hiện diện của các kháng thể vớimột hoặc nhiều kháng nguyên Mặc dù, xét nghiệm ban đầu chỉ xác định được mộtkháng thể đối với một kháng nguyên riêng lẻ, những xét nghiệm tiếp theo sử dụng

kháng nguyên từ các vùng khác nhau của bộ gen để xác định diễn tiến của huyếtthanh học trong đáp ứng với sự xâm nhiễm của siêu vi.

Ví dụ: kháng thể đối với kháng nguyên lõi của viêm gan B (anti-HBc) thường đượcphát hiện là dấu hiệu đáp ứng của hệ miễn dịch chống lại sự xâm nhiễm của HBV

và là dấu hiệu duy nhất được tìm thấy ở những người tiêm vaccine viêm gan B.Thời gian kháng thể HBc xuất hiện bền hơn kháng thể HBs trong nhiễm bệnh tựnhiên và khả năng tồn tại là 97% trong các cá thể đã bị nhiễm trước đây 30 năm saukhi tiếp xúc Những hướng dẫn gần đây của WHO cho rằng những người có hệmiễn dịch luôn luôn đạt được anti-HBs 10 IU/ml hoặc nhiều hơn sẽ có khả năngmiễn dịch lâu dài với viêm gan B Kháng nguyên viêm gan B (HBsAg) và khángthể với kháng nguyên vỏ (anti-HBe) thường được sử dụng trong chẩn đoán việcchuyển sang HBV mãn tính

1.5.2 Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử

Phát hiện và định lượng siêu vi viêm gan B và C bằng kỹ thuật PCR- khuếch đạitrình tự DNA hoặc RNA đích của siêu vi hiện diện trong dịch cơ thể người bị nhiễmsiêu vi ngày càng phổ biến không chỉ do phương pháp này có đặc điểm chính xáccao mà còn do tính hiệu quả trong việc theo dõi điều trị

Năm 2001, WHO đã thiết lập tiêu chuẩn cho kỹ thuật khuếch đại HBV DNA; trong

đó, xét nghiệm bằng phương pháp PCR có các ngưỡng phát hiện được thấp nhấttrong khoảng 100 bản sao/ml Tuy nhiên chưa xác định rõ chu kỳ nào của HBVDNA được biểu thị cho siêu vi trong máu về phương diện lâm sàng Có hai hướngdẫn được thực hiện trong lâm sàng chọn 100.000 bản sao/ml là mức độ lâm sàngxác định siêu vi trong máu Ở hầu hết những người mang mầm bệnh HBV, 97% cóHBV DNA dưới 100.000 bản sao/ml và 89% các cá thể có lượng HBV DNA trên100.000 bản sao/ml không thể xác định rõ siêu vi với phương pháp điều trị bằngkháng thể siêu vi Dữ liệu này khuyến khích với giá trị 100.000 bản sao/ml là mứctrung bình lý tưởng để xác định siêu vi trong máu Khả năng đáp ứng thấp có thể

xảy ra trong việc điều trị với những người có hàm lượng HBV DNA dưới 100.000bản sao/ml sau ba tháng điều trị.

Xét nghiệm chẩn đoán HCV bằng phương pháp sinh học phân tử được chia thànhđịnh tính và định lượng Tiêu chuẩn quốc tế chú trọng cho việc định lượng RNAHCV, kết quả định lượng RNA HCV được dựa trên tiêu chuẩn quốc tế và và sửdụng đơn vị quốc tế/milliliter (IU/ml) Mối liên quan giữa IU/ml và bản sao/ml khácnhau đáng kể với phương pháp định lượng khác nhau Các kết quả sử dụng đơn vịIU/ml trong khoảng 1lg với 90% mẫu nhưng thường xuất hiện những kết quả tráingược nhau Mãi đến gần đây, xét nghiệm định tính có giới hạn phát hiện thấp hơn

so với xét nghiệm định lượng Tuy nhiên, một vài xét nghiệm định lượng có giớihạn phát hiện tương đương hoặc thấp hơn so với xét nghiệm định tính Hiện nay, độnhạy trong xét nghiệm định lượng liên quan đến sự khuếch đại sao chép trung gian(TMA) với giới hạn phát hiện là 5 IU/ml Về giá trị thương mại, sao chép ngược,định lượng phản ứng chuỗi enzym tổng hợp (rt-PCR) có giới hạn xác định là

50 IU/ ml Hai xét nghiệm định lượng có giá trị thương mại là định lượng rt-PCRvới giá trị đo từ 500 đến 500.000 IU/ml và định lượng bDNA với phạm vi dao động

từ 615.000 đến 8.000.000 IU/ml Một số xét nghiệm khác có sẵn các thuốc thử dùngcho việc phân tích hoặc được cung cấp từ phòng xét nghiệm tham chiếu có ngưỡngphát hiện thấp hơn tương tự như các phương pháp định tính, giới hạn phát hiện trêntương đương hoặc cao hơn định lượng DNA

Các thử nghiệm gần đây nhất dựa trên việc sử dụng phản ứng chuỗi polymerasetheo thời gian thực (Realtime-PCR) có thể phát hiện các lượng nhỏ RNA HCVxuống đến 10 IU/ml và định lượng chính xác nồng độ RNA HCV lên đếnkhoảng 107 IU/ml

1.6 Kiểm soát chất lượng và đảm bảo chất lượng trong phát hiện và chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử

Đối với phương pháp sinh học phân tử, kiểm soát chất lượng cần thiết trong việcphát hiện các yếu tố kìm hãm phản ứng khuếch đại, để đánh giá việc chiết tách acid

nucleic trong quá trình chiết tách mẫu bệnh phẩm và để xác định mức độ phân hủycủa acid nucleic trong quy trình chiết tách Do đó cần phải có chứng dương vàchứng âm trong tất cả các giai đoạn của xét nghiệm (theo khuyến cáo của CLIA 88).Đối với xét nghiệm định lượng, một mẫu chứng âm và hai mẫu chứng dương vớinồng độ khác nhau là bắt buộc trong mỗi lần chạy mẫu Việc thất bại trong đạt đượckết quả đúng của bất kỳ mẫu chứng nào đều được xem như là lần chạy mẫu đókhông có kết quả Chứng dương nên có nồng độ acid nucleic liên quan đến các sốliệu lâm sàng và phải ở gần ngưỡng phát hiện được của phép thử Mẫu chứng dươngđược xem như là mẫu bệnh nhân và cũng có thể sử dụng để kiểm chứng quá trìnhchiết tách.

Hình 1.10.Vòng tròn thẩm định phương pháp chẩn đoán bằng PCR

Một số mẫu chứng dương có sẵn hiện nay bao gồm mẫu bệnh nhân đã được xácđịnh nồng độ bằng phương pháp tương tự, mẫu chứng dương tổng hợp nhưArmored RNA (Ambion, Austin- Texas, Mỹ) hoặc mẫu acid nucleic tinh khiết (mặc

dù acid nucleic tinh khiết không phù hợp để kiểm soát quá trình chiết tách)

Để kiểm soát các yếu tố ức chế phản ứng, mẫu chứng nội (internal control) đượcthêm vào trong mẫu trước quá trình chiết tách, đối với những mẫu âm tính, kết quả

phải thể hiện âm tính đối với trình tự đích nhưng dương tính với trình tự của mẫuchứng nội tại Lượng mẫu chứng nội tại thêm vào phải ở gần ngưỡng phát hiện để

có thể phát hiện các yếu tố ức chế ở mức thấp Nếu tỷ lệ ức chế phản ứng không lớnhơn 1% thì việc sử dụng các chứng nội tại này không cần phải thực hiện liên tục.Các khuyến cáo nhằm xác định thực hành tốt phòng xét nghiệm Sinh học phân tửđặc biệt là có sử dụng phương pháp PCR về khu vực làm việc được chia thành 4khu vực tương ứng với thiết bị và dụng cụ [10]:

 Khu vực chứa hóa chất và chuẩn bị;

 Khu vực chuẩn bị mẫu;

 Khu vực chuẩn bị trộn hóa chất PCR và thực hiện phản ứng khuếch đại;

 Khu vực phân tích kết quả

Đảm bảo chất lượng trong xét nghiệm Sinh học phân tử phải bao gồm đảm bảocông việc của từng khu vực và Tiêu chuẩn hóa cho việc kiểm soát chất lượng trongchẩn đoán phân tử [11]:

 Quản lý chất lượng;

 Nội kiểm;

 Kiểm soát việc chuẩn bị xét nghiệm;

 Kiểm soát việc tổng hợp và khuếch đại cDNA;

 Kiểm soát phản ứng PCR;

 Chứng dương;

 Chứng âm;

 Kiểm soát kết quả;

 Ngoại kiểm tra

1.7 Ngoại kiểm tra chất lƣợng xét nghiệm

1.7.1 Khái niệm ngoại kiểm tra (External Quality Assessment – EQA)

Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (gọi tắt là ngoại kiểm tra) có ba phương thứctriển khai là thử nghiệm thành thạo (proficiency testing – PT) , kiểm tra lại/ phântích lại (rechecking/ retesting) và đánh giá tại chỗ (on-site evaluation) Trong đó thửnghiệm thành thạo là phương thức được sử dụng phổ biến cho mục tiêu đạt các tiêuchuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế [2]

Thử nghiệm thành thạo đánh giá việc thực hiện xét nghiệm của các phòng xétnghiệm thông qua so sánh liên phòng xét nghiệm (interlaboratory comparisons),nghĩa là đánh giá các xét nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hay những mẫu thửnghiệm tương tự được phân tích bởi hai hay nhiều phòng xét nghiệm theo các điềukiện đã xác định trước [2]

Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm thường được diễn giải là công tác đánh giáviệc thực hiện xét nghiệm của các phòng xét nghiệm thông qua so sánh liên phòngxét nghiệm là một công cụ quan trọng của kiểm tra chất lượng được sử dụng đểgiám sát chất lượng xét nghiệm Ngoại kiểm tra mang lại nhiều lợi ích cho phòngxét nghiệm, cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, bác sĩ lâm sàng, bệnh nhân, các cơ quanquản lý,… giúp phòng xét nghiệm so sánh kết quả xét nghiệm với các phòng xétnghiệm khác trong cùng khu vực, trong một hoặc nhiều quốc gia thông qua một đơn

vị triển khai ngoại kiểm độc lập (proficiency testing provider) [2]

1.7.2 Mục đích của ngoại kiểm tra

Ngoại kiểm tra là công cụ quan trọng giúp giám sát chất lượng xét nghiệm, cụ thể [2]:

- Đánh giá và giám sát liên tục việc thực hiện xét nghiệm của các phòng xétnghiệm tham gia;

- Xác định những yếu tố tìm ẩn có thể ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm,

từ đó phòng xét nghiệm có những hành động phòng ngừa nhằm cải tiến chất lượng

(ví dụ như những vấn đề liên quan đến quy trình thực hiện xét nghiệm, huấn luyệnnhân sự,…);

- So sánh kết quả phân tích giữa các phòng xét nghiệm tham gia và giữa cácnhóm phương pháp với nhau;

- Chứng minh độ tin cậy của kết quả xét nghiệm cho người sử dụng dịch

vụ xét nghiệm;

- Thẩm định độ không đảm bảo chuẩn của kết quả xét nghiệm;

- Đánh giá các đặc tính của phương pháp;

- Cung cấp nguồn tài liệu để đào tạo liên tục cho nhân viên phòng xét nghiệmnhằm đáp ứng những quy định của cơ quan quản lý, yêu cầu của cơ quan công nhận

và nhu cầu của chính phòng xét nghiệm

1.7.3 Các phương thức ngoại kiểm tra

vị triển khai ngoại kiểm để xem xét và khắc phục sai số nếu có [2]

Hạn chế của thử nghiệm này là quy trình sản xuất, bảo quản, vận chuyển mẫu ngoạikiểm đến các phòng xét nghiệm phải thực hiện nghiêm ngặt để tránh ảnh hưởng đếnkết quả phân tích của phòng xét nghiệm [2]

1.7.3.2 Kiểm tra lại/ phân tích lại

Phòng xét nghiệm lựa chọn mẫu nghiệm phẩm ngẫu nhiên gửi đến phòng xétnghiệm tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích và đánh giá lại các kết quảphân tích mà phòng xét nghiệm đã thực hiện [2]

Hạn chế của phương thức này là không thể phát hiện được tất cả các vấn đề tồn tạitrong phòng xét nghiệm [2].

1.7.3.3 Đánh giá tại chỗ

Đoàn đánh giá được thành lập bởi cơ quan có thẩm quyền ( Bộ Y tế, Sở Y tế,…)hoặc các tổ chức được công nhận của quốc gia ( văn phòng công nhận chất lượng,Trung tâm kiểm chuẩn xét nghiệm,…) sẽ đến đánh giá phòng xét nghiệm định kỳhoặc đột xuất Việc đánh giá này căn cứ vào bảng kiểm, những tiêu chí đã đượcduyệt Bảng kiểm sẽ khác nhau tùy thuộc vào từng lĩnh vực của xét nghiệm [2].Hạn chế của phương thức này là đòi hỏi phải tập hợp được nhóm chuyên gia điđánh giá, kiểm tra Nhóm chuyên gia này phải có trình độ chuyên môn về quản lýchất lượng,… [2]

Do phương thức thử nghiệm thành thạo mang lại hiệu quả hơn so với hai phươngthức còn lại nên được sử dụng phổ biến trong ngoại kiểm tra [2]

1.7.4 Các chương trình ngoại kiểm tra

Kiểm tra mức độ thành thạo trong chẩn đoán sinh học phân tử vẫn còn là một tháchthức do không đủ các chương trình ngoại kiểm tra để bao quát toàn bộ các phươngpháp thử nghiệm sinh học phân tử tại các phòng xét nghiệm; trong khi việc tham giangoại kiểm tra là một trong những cách thức hiệu quả nhất để kiểm tra đánh giá vànâng cao năng lực của phòng xét nghiệm [7]

Ví dụ: CAP chỉ có duy nhất chương trình ngoại kiểm tra cho xét nghiệm sinh họcphân tử trong các bệnh truyền nhiễm được chính phủ Mỹ công nhận Acrometrix(Benencia, Californina- Mỹ) cũng chỉ cung cấp chương trình ngoại kiểm tra đối vớingoại kiểm tra phương pháp nhằm kiểm tra chất lượng của các bước phân tích cơbản trong chẩn đoán sinh học phân tử như: chuẩn bị DNA / RNA, thực hiện phảnứng PCR và cách xử lý kết quả…

Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm định tính và định lượng HCV trong chẩn đoán siêu vi [9],[14],[16]; Hiệp hội Hành động Hòa Hợp Chất

RNA-lượng Châu Âu (European Union Quality Control Concerted Action) và Tập đoànBoston Biomedia phối hợp chuẩn bị và phân phát mẫu ngoại kiểm tra để đánh giáchất lượng xét nghiệm định tính và định lượng RNA HCV từ tháng 5-1999 đếntháng 2-2000 cho 57 phòng xét nghiệm với mẫu là huyết tương trữ lạnh -70oCdương tính và âm tính với HCV ở các nồng độ khác nhau.

Chương trình ngoại kiểm tra đánh giá xét nghiệm RNA HCV cũng đã được triểnkhai tại 101 trung tâm Truyền máu Italia vào năm 2002-2005 với 7 lần gửi mẫuhuyết thanh dương tính và âm tính đông lạnh ở -80oC đến các đơn vị tham gia [13].Nhu cầu về những phương thức độc lập để đánh giá việc thực hiện và đảm bảo chấtlượng tại các phòng xét nghiệm đo lường acid nucleic ngày càng nhiều, do vậy cácchương trình đánh giá độ thành thạo và chương trình ngoại kiểm tra cho từng lĩnhvực chuyên biệt bao gồm: Chương trình ngoại kiểm tra của Quốc gia Vương QuốcAnh (UK NEQAS) và Mạng lưới chất lượng Sinh học phân tử Châu Âu (EQMN).Những chương trình khác dành cho phân tích các mục tiêu riêng trong lâm sàngcũng ra đời như các chương trình của Kiểm soát Chất lượng trong Chẩn đoán Phân

tử dùng trong đánh giá phát hiện và xác định kiểu di truyền (genotyping) các vi sinh

vật gây bệnh cho người bao gồm HIV, siêu vi entero, Lao (Mycobacterium tuberculosis), lậu (Chlamydia trachomatis).

Tuy nhiên, có rất ít các mẫu đối chiếu chất lượng cao và chất chuẩn cho phòng xétnghiệm kiểm tra độ xác thực của thiết bị và các thông số phân tích tại chỗ (in house)

1.7.5 Các dạng mẫu sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra

1.7.5.1 Mẫu kiểm chuẩn được điều chế theo công thức

Mẫu dạng này được điều chế bằng cách thêm một lượng thành phần các thông sốbiết trước vào mẫu nền Giá trị đích là giá trị của thành phần trong mẫu, độ khôngđảm bảo được ước lượng từ độ không đảm bảo của nồng độ thông số trong mẫu,dụng cụ cân, đo thể tích cũng như các yếu tố liên quan trong quá trình pha trộn.Phương pháp này đơn giản nhưng phải đảm bảo độ đồng nhất khi pha [2]

1.7.5.2 Mẫu kiểm chuẩn là mẫu tham chiếu được chứng nhận (Certified reference material – CRM)

Mẫu CRM là mẫu đã biết trước nồng độ được sản xuất theo quy trình nghiêm ngặt.Giá trị đích và độ không đảm bảo là giá trị công bố của mẫu CRM

Hạn chế của phương pháp này là chi phí cao khi sử dụng mẫu cho chương trìnhngoại kiểm tra [2]

1.7.5.3 Mẫu kiểm chuẩn là mẫu được hiệu chuẩn theo mẫu CRM (Reference material – RM)

Giá trị đích xác định bằng cách hiệu chuẩn mẫu kiểm chuẩn với mẫu CRM, độkhông đảm bảo được ước lượng từ độ không đảm bảo công bố của mẫu CRM và sai

số lặp lại trong phân tích [2]

1.7.5.4 Mẫu kiểm chuẩn là mẫu mù

Trong trường hợp không có mẫu CRM, mẫu kiểm chuẩn có thể là mẫu chưa biết trướcnồng độ Giá trị đích được xác định dựa vào sự đồng thuận của các PXN tham chiếu [2]

1.7.6 Mẫu sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm PCR HBV-HCV

Mẫu thử nghiệm thành thạo hoặc mẫu ngoại kiểm tra chất lượng có thể được lấy từnhiều nguồn khác nhau tùy thuộc vào mục đích của chương trình kiểm tra và phùhợp với quy định của Quốc gia và quốc tế [5]

Đánh giá thực tế việc thực hiện những phương pháp xét nghiệm chẩn đoán mangtính chất phân tử trong các phòng xét nghiệm lâm sàng là rất cần thiết, trong nhiềutrường hợp quy định những mẫu ngoại kiểm tra được lấy từ đối tượng con người.Những mẫu này có thể là mẫu “dương tính” từ bệnh nhân hoặc những cá nhân đanghiện diện với điều kiện bệnh lý thích hợp, hoặc là mẫu “âm tính” đối với những cánhân không mắc bệnh (“bình thường”)

Trách nhiệm của Tổ chức cung cấp chương trình ngoại kiểm tra bao gồm cung cấpmẫu ngoại kiểm tra là đảm bảo những nguyên vật liệu này không bị tổn hại trongsuốt quá trình sản xuất, bảo quản và phân phối dù cho những loại mẫu bệnh phẩmkhác nhau dùng trong chẩn đoán thì có những yêu cầu về đặc tính mẫu, loại mẫu vàhình thức mẫu cũng như điều kiện bảo quản khác nhau.

Mẫu sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm chẩn đoánviêm gan do siêu vi ở người có thể có hai dạng mẫu xuất phát từ dịch cơ thể (huyếtthanh, huyết tương hoặc máu toàn phần) như mẫu dạng lỏng và dạng đông khô tuynhiên cần phải đảm bảo các tiêu chí về:

 Độ đồng nhất của mẫu trong cùng lọ và trong cùng lô sản xuất;

 Độ ổn định của mẫu qua thời gian sản xuất và phân phối đến PXN cho đến khikết quả được gửi về Tổ chức cung cấp chương trình ngoại kiểm tra [15]

Dạng mẫu đông khô đã được một số nước nghiên cứu đưa vào sản xuất mẫu chochương trình ngoại kiểm tra Sinh hóa, Vi sinh,…nhưng đối với chương trình ngoạikiểm tra chất lượng xét nghiệm PCR của NRL- Úc vẫn sử dụng dạng mẫu lỏng Tuynhiên, RNA và DNA là những dạng vật chất di truyền sinh học do đó dễ bị tác động

và phân hủy bởi điều kiện môi trường như nhiệt độ Do vậy để bảo quản chất lượngcủa DNA và RNA cần phải có những điều kiện nghiêm ngặt trong bảo quản và vậnchuyển ở mức từ -20oC đến -70oC Năm 2006, Wang và cộng sự đã nghiên cứudạng đông khô cho mẫu chuẩn sử dụng trong chẩn đoán HCV bằng Realtime-PCR

sử dụng huyết tương và plasmid để thiết lập các đường chuẩn trong quy trình [17]

do những đặc tính ưu việt của mẫu dạng đông khô như điều kiện bảo quản và vậnchuyển đơn giản, thời gian bảo quản lâu và an toàn trong vận chuyển, tuy nhiên việc

sử dụng plasmid để điều chỉnh lượng bản sao của siêu vi trong mẫu dễ kiểm soáttrong nghiên cứu invitro, đối với mẫu dương tính thật có nguồn gốc từ bệnh nhânthì việc kiểm soát hàm lượng bản sao siêu vi ban đầu và sau đông khô cần đượcnghiên cứu có hệ thống trước khi triển khai thành mẫu ngoại kiểm tra sử dụng trongchương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm PCR HBV-HCV

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Mẫu sinh phẩm đông khô từ huyết thanh của người nhiễm HBV - HCV và ngườikhông mang bệnh

Dụng cụ, thiết bị

Đề tài sử dụng các thiết bị, dụng cụ tại trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm Tp HCM như:

- Máy luân nhiệt PCR iCycler của Biorad;

- Hệ thống IQTM5 Real-time PCR Detection Systems của Biorad;

- Máy đông khô Christ dryer: BETA 1- 8 Ldplus;

- Bộ xét nghiệm IVD NK qPCR – VB quant kit của Nam Khoa Biotek Co.

đạt chứng nhận ISO 9001: 2000, GMP-GLP, mức phát hiện 50IU/ml mẫuthử bao gồm:

 HBV TQ PCR Plus Mix dành cho khuếch đại acid nucleic

DNAPREP-BOOM dành cho chiết tách DNA từ bệnh phẩm

 Chứng nội, chuẩn và chứng âm

- Bộ xét nghiệm IVD NK qPCR – VC quant kit của Nam Khoa Biotek Co.

đạt chứng nhận ISO 9001: 2015, ISO 13485, GMP-GLP, mức phát hiện50IU/ml mẫu thử bao gồm:

RT-qPCR HCV Mix dành cho khuếch đại acid nucleic

 IVD NK RNAprep kit dành cho chiết tách RNA từ bệnh phẩm

 cDNAsynthesis Tổng hợp cDNA từ RNA

 Chứng nội, chuẩn và chứng âm

- Mẫu huyết thanh bệnh nhân;

- Mẫu huyết thanh người lành đông lạnh đã xét nghiệm âm tính với HIV,HBsAg và anti-HCV

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm

Thời gian tiến hành nghiên cứu từ tháng 06 năm 2017 đến tháng 08 năm 2018

2.2.1 Tạo mẫu sinh phẩm đông khô

2.2.1.1 Phương pháp thu, gom mẫu

- Mẫu được thu gom trong vòng 6 tháng, từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2017 Saukhi phân tích xác định mẫu dương tính HCV, HBV; từng loại mẫu được dán nhãn

và trữ trong điều kiện nhiệt độ -20oC cho đến khi đạt thể tích cho mỗi loại mẫu

- Mỗi loại mẫu được để tan hoàn toàn trong điều kiện nhiệt độ phòng thínghiệm, trộn đều được chia vào các lọ dùng trong quá trình đông khô, mỗi lọ 0,5 mldung dịch

- Mẫu máu toàn phần của bệnh nhân hoặc người được chẩn đoán bị nhiễm siêu

vi viêm gan được thu thập từ các bệnh viện, phòng xét nghiệm ( PXN ) đựng trongống nghiệm 5ml không chứa chất chống đông;

- Ly tâm ở 3.000 vòng trong 10 phút để tách huyết thanh;

- Bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi ly trích DNA, RNA

2.2.1.2 Phương pháp kiểm tra mẫu HBV, HCV

 Phương pháp ly trích HBV DNA từ mẫu bệnh phẩm

Dùng bộ kit thương mại NKDNAPREP-BOOM của công ty Nam Khoa để ly tríchHBV DNA có trong mẫu huyết thanh Bộ Kit này dựa trên nguyên tắc dùng

Guanidine Thiocyanate (GuSCN) phá hủy hoạt tính các nuclease và làm cho DNAtrong mẫu bám vào các hạt Silica, nhờ đó tách chiết được DNA qua hạt silica này.Phương pháp này đóng vai trò rất quan trọng vì nó phải đảm bảo dịch DNA ly tríchđược có chứa HBV DNA.

Phương pháp tiến hành:

- Cho 900 µl guanidine thiocyanate 30 µl hỗn dịch Silica và 100 µl mẫu huyếtthanh vào 1 tube Eppendorf 1,5 ml Vortex hỗn dịch này và sau đó lắc trong máylắc ngang 100 vòng/phút hay lắc tay úp ngửa trong 10 phút;

- Vortex lần nữa trong 5 giây và ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 15 giây Dùngmáy hút, hút bỏ phần nước nổi Để tránh bị mất Silica, chừa lại khoảng 10 µl trênlớp Silica;

Rửa hai lần Mỗi lần cho 1 ml nước cất vào cặn silica rồi vortex vài giây để hòasilica vào dung dịch, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 giây, hút bỏ phần nổichừa lại cặn silica;

- Tiếp theo rửa 2 lần nữa, mỗi lần với 1 ml ethanol 70% với cách như trên

- Sau đó 1 lần cuối cùng với 1 ml acetone;

- Hút bỏ phần nước nổi, sau đó làm khô Silica ở 56o

C trong khoảng 10 phút trongmáy cách thủy hay block nhiệt;

- Thêm 50 µl đệm TE 1X Vortex cho đến khi Silica giải hấp phụ hoàn toàn;

- Ủ 56o

C trong 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút

Pha loãng dịch nổi 1:5 trong TE 1X bằng cách cho 10 µl dịch nổi này vào một tubeeppendorf chứa sẵn 40 µl TE 1X Dịch nổi pha loãng này chính là dịch tách chiếtsẵn sàng cho phản ứng PCR hay real-time PCR Dịch nổi không pha loãng có thểgiữ lại trong tủ -20oC để lưu cho đến khi cần thiết phải kiểm tra lại

 Ly trích RNA

Ly trích RNA toàn phần bằng bộ kít RNA PREP của công ty Nam Khoa và sử dụng

100 µl mẫu huyết thanh và 10 µl mẫu chứng nội (IC)

guy n t c:

- Phương pháp này dùng Guanidine 14M và Urea, phối hợp với Phenol và cácchất tẩy khác để làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein trongmẫu thử bị vón lại, DNA tan trong phase phenol, còn RNA thì nằm lại trong phasenước và sẽ được tách khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâmlắng tách RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hỗtrợ của tRNA và glycogen

 Thêm vào mỗi tube đã chứa sẵn 100 µl mẫu thử 20 µl HCV RNA-IC;

 Thêm 300 µl R1 vào 100 µl mẫu thử, làm thuần nhất mẫu thử với R1 bằngcách dùng pipette hút lên xuống nhiều lần; ủ dịch thuần nhất ở 30o

C) (có thể dùng máy ly tâm thường);

 Hút cẩn thận khoảng 300 µl dịch nổi vào tube vô trùng khác tránh không hútphase giữa Thêm 300 µl R3 rồi tiếp tục giữ 30o

C trong 10 phút Ly tâm13.000 vòng trong 10-20 phút trong máy ly tâm lạnh;

 Dùng micropipet hoặc máy hút chân không hút bỏ phần nước nổi, tránhkhông làm mất cặn RNA đóng trên 1 bên đáy tube (rất khó thấy) rửa cặn ởđáy tube với 1ml R4 dùng ly tâm lạnh 8.000 vòng trong 5 phút;

 Dùng micropipet hoặc hút chân không hút bỏ phần nước nổi Làm khô cặn ở

55oC trong 10-15 phút (nên thực hiện ngay tại bể nhiệt khô hay trong máycách thủy);

 Thêm vào cặn khô 40 µl R5 vào tube, giữ ở 55-60o

 Định lượng HBV DNA bằng kỹ thuật real-time PCR

Phương pháp real-time PCR dùng Taqman probe FAM/HEX để tính toán lượngHBV DNA có trong 1ml huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mãn tính

Phương pháp này dựa trên phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu có chiềudài khoảng 190bp từ gen polymerase của HBV Ngay khi đoạn DNA 190bp xuấthiện trong phản ứng PCR, taqman probe được gắn FAM/HEX sẽ lập tức bắt cặp đặchiệu vào trình tự đích của đoạn DNA này và bị thủy giải liền sau đó bởi enzym taqpolymerase (nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease) trong quá trình tổng hợp mạch bổsung ở giai đoạn kéo dài Chính vì bị thủy giải bởi taq polymerase mà FAM – chấtphát huỳnh quang gắn ở đầu 5’ được tách khỏi chất hấp thụ huỳnh quang gắn ở đầu3’ nhờ đó khi chiếu tia cực tím hay tia laser, tín hiệu huỳnh quang này sẽ tới đượcđầu đọc của máy Real-time PCR Căn cứ vào lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽbiết được sự hiện diện của HBV DNA trong mẫu có hay không và nhiều hay ít Mẫuchứa nhiều DNA đích sẽ có chu kỳ ngưỡng Ct sớm hơn mẫu chứa ít DNA đích.Căn cứ vào sự tương quan Ct của mẫu bệnh phẩm với Ct của mẫu chuẩn đã biếttrước nồng độ, sẽ biết được số lượng bản sao HBV DNA ban đầu trong 1ml mẫuhuyết thanh sau khi hiệu chỉnh thông số E% (hiệu quả PCR) về trong khoảng 90%-105%, hệ số tương quan R2 về ≥ 0,999 và độ dốc slope tương đương -3,32 bằngphần mềm IQ5 tích hợp trong hệ thống

Để đảm bảo tối ưu kết quả định lượng, bộ kit HBV TQ PCR Plus Mix đã được thiết

kế sao cho:

- Kiểm tra được thao tác của người thực hiện phản ứng có chuẩn hay khôngbằng cách cho sẵn 3 mẫu chuẩn NK

HBVDNA vào trong mix Điều này phản ánh qua

hệ số tuyến tính của đường chuẩn xây dựng từ 3 mẫu chuẩn NK

HBVDNA đã biếttrước nồng độ khi phân tích kết quả định lượng trên phần mềm IQ5;

- Kiểm tra phản ứng có đạt độ nhạy hay bị ức chế hay không bằng cách dùngchứng nội tại NK

HBVDNA-TQ-IC, đây là đoạn DNA cho vào chung với mẫu ICdùng chung primer với mẫu nhưng khác probe đặc hiệu Probe của IC được gắn HEX;

- Kiểm tra phản ứng PCR có ngoại nhiễm hay không bằng cách chạy cùng lúcchứng âm – mẫu huyết thanh của người bình thường.

Thông số thiết lập để chạy phản ứng Real-time PCR khi dùng kit HBV TQPCR Plus Mix:

C trong 15 giây; 60oC trong 1 phút

Kết quả thu được chia thành 4 nhóm nếu 3 đường đồ thị chuẩn tương ứng với thanggồm 3 NKHBVDNA có nồng độ ban đầu đã biết vẫn hướng lên bình thường và Ctcủa chúng tuyến tính:

- Nhóm bị kết luận ức chế: nghĩa là trong mẫu bệnh phẩm chứa nguyên nhânnào đó làm cho phản ứng PCR không thực hiện được Điều này thể hiện qua đường

đồ thị của mẫu và IC không cắt đường baseline;

- Nhóm âm tính: tức là không có HBV DNA trong mẫu Điều này thể hiện quađường biểu diển nằm ngang trên đồ thị của mẫu nhưng với kênh màu HEX đường

IC phải hướng lên cắt baseline;

- Nhóm dưới ngưỡng phát hiện: tức là có HBV DNA trong mẫu nhưng lượngnày rất thấp (nhỏ hơn 200 bản sao trong 1ml mẫu) Điều này có thể thấy khi đường

đồ thị IC hướng lên cắt đường baseline và đường đồ thị mẫu hướng lên nhưngkhông cắt đường baseline;

- Nhóm dương tính: là nhóm mẫu có chứa HBV DNA lượng nhiều hơn 200 bảnsao/ml Điều này khẳng định khi đường đồ thị mẫu cắt đường baseline và tạo thànhgiá trị Ct tương ứng

 Cách tính nồng độ siêu vi

Dựa vào các số lượng bản sao DNA của HCV chuẩn và chu kỳ ngưỡng của mẫuchuẩn, chúng ta sẽ biết được số lượng bản sao HCV-cDNA ban đầu của mẫu

Sau khi đã có đường chuẩn, xác định số lượng bản sao ban đầu của HCV-RNAtrong các mẫu thử bằng cách phân tích kết quả tại từng giếng chứa mẫu thử trongchương trình CFX manager và giếng chứng (-).

Để tính số lượng bản sao trong 1ml mẫu thử trước khi tách chiết RNA, chúng ta sẽnhân số bản sao của từng giếng mẫu thử với hệ số k (hệ số có liên quan đến độ thuhồi mẫu sau tách chiết của mẫu và thể tích mẫu được tách chiết Nếu thể tích mẫuđược tách chiết là 100µl thì hệ số k=71)

2.2.1.3 Phương pháp đông khô

Thuật ngữ Lyophilization (đông khô) là một quá trình tạo nên sản phẩm háo nước;vật liệu trong quá trình đông khô bị làm cho đông lạnh và khô sau khi đã loại trừnước; đặc tính của sản phẩm nhanh chóng hút lại dung môi và phục hồi lại tính chấtban đầu của sản phẩm [6],[12]

Quy trình đông khô được xác định như là một hệ thống ổn định, trong đó sản phẩm

sẽ được làm lạnh trước, sau đó lượng dung môi sẽ được làm giảm đi lần đầu tiênbằng sự thăng hoa (bước làm khô nhanh 1) và sau đó bằng tách hấp thu (bước làmkhô nhanh thứ 2) và cuối cùng là hoàn tất quy trình bằng đậy kín nắp các lọ đựngmẫu đông khô

Đông lạnh: Nhiệm vụ chủ yếu của quá trình đông lạnh là tách dung môi ra khỏi chấttan Với hệ sử dụng dung môi hòa tan là nước, nước sẽ tạo thành các tinh thể đá,chất tan sẽ được giam trong khoảng khe giữa các tinh thể đá Nhiệt độ cần thiết choviệc hoàn tất cho quá trình đông lạnh phụ thuộc vào đặc tính hòa tan và các thànhphần cấu tạo Việc đông lạnh có thể được tiến hành trong thiết bị đông lạnh kháchoặc bên trong các ngăn của máy đông khô Quá trình làm đông là bước quan trọngtrong quá trình đông khô