Điềunày làm cho việc sản xuất thuốc phải được kiểm soát một cách chặt chẽ hàmlượng hoạt chất và tạp chất liên quan, do chỉ cần một sự thay đổi nhỏ hàmlượng hoạt chất chính hoặc có tạp ch
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu
Methyl [[4-[2-[[(3-ethyl-4-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-pyrrol-l-yl) carbonyl] amino] ethyl]phenyl]sulfonyl]carbamat (tạp chất liên quan C của glimepirid, glimepirid urethan, glimepirid carbamat).
2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
Nguyên liệu glimepirid do công ty TNHH Davipharm cung cấp: số kiểm soát
GM/171202, hàm lượng 98,63%, điều kiện bảo quản: 2 – 8 o C.
Bảng 2.1 Hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu
Stt Hóa chất – Dung môi Mục đích sử dụng Xuất xứ Độ tinh khiết
1 Methanol Tổng hợp tạp C; sắc ký Xilong 99,5%
Bảng 2.2 Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu
Stt Trang thiết bị Xuất xứ Mã hiệu
3 Cân phân tích 5 số Hàn Quốc HR – 250AZ
4 Cột sắc ký (250 x 4,6 mm; 5 m) GL Sciences InertSustain
5 Cô quay chân không Buchi R210S
6 Máy khuấy từ có gia nhiệt IKA C-MAG HS 4
7 Hệ thống HPLC – PDA Shimadzu CTO-10AS
8 Máy đo điểm chảy Buchi B545
9 Máy đo pH Inolab WTW – pH 720
10 Máy quang phổ hồng ngoại (IR) Shimadzu IRAffinity-1S
11 Máy quang phổ UV – Vis Jasco V – 730
12 Máy LC-MS nguồn ESI Agilent 1200
13 Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Advance III
14 Tủ sấy chân không Jeiotech OV-12
15 Buồng soi UV Vilber-Lourmart CN-15.LC
Phương pháp nghiên cứu
Dựa theo tài liệu tham khảo, tạp C có thể được tổng hợp bằng phản ứng thủy phân glimepirid trong môi trường acid theo Sơ đồ 2.1 [6].
Sơ đồ 2.1 Phản ứng thủy phân glimepirid trong môi trường acid/MeOH
2.2.2 Tinh chế sản phẩm tổng hợp
Sản phẩm tổng hợp C được tinh chế bằng sắc ký cột.
2.2.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sản phẩm tinh chế C được tiến hành SKLM với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau để thu được 3 sắc ký đồ cho 3 vết có Rf lần lượt ở vị trí thấp, trung bình, cao (tương ứng khoảng 0,25; 0,50; 0,75) Nếu chỉ có duy nhất một vết sắc ký trên cả 3 hệ dung môi thì sơ bộ kết luận sản phẩm tinh khiết trên SKLM.
1 - [[4- [2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrrolin-1 -carboxamido) ethyl] phenyl] sulfonyl] -3-trans-(4-methylcyclohexyl)urea
N-[[4- [2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrrolin-1-carboxamido) ethyl] phenyl] sulfonyl] methylurethan
Tiến hành: Chuẩn bị bản mỏng silica gel 60 F254; Khảo sát và lựa chọn 3 hệ dung môi có sức rửa giải phù hợp; Phát hiện vết bằng soi UV 254 nm.
2.2.3.2 Phương pháp HPLC với đầu dò PDA Độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp được xác định bằng phương pháp quy về 100% diện tích đỉnh.
Tiến hành: Thăm dò và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp; Xác định độ tinh khiết sắc ký của sản phẩm.
2.2.4 Xác định cấu trúc sản phẩm tinh chế
Sản phẩm sau khi tinh chế và thử tinh khiết sẽ được đo phổ IR để xác định sự có mặt của các đỉnh đặc trưng của các nhóm chức trong phân tử, phổ UV để xác định cực đại hấp thụ, phổ MS để xác định số khối của phân tử và các mảnh phân tử tương ứng với công thức dự kiến và phổ NMR để xác định cấu trúc.
2.2.5 Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp C bằng HPLC Áp dụng phương pháp HPLC và quy về 100% diện tích pic và điều kiện sắc ký khi thử tinh khiết sản phẩm tinh chế C bằng phương pháp HPLC-PDA. Điều kiện sắc ký: cột RP C18 (250 x 4,6 mm; 5 m); dung môi hòa tan: nước
- acetonitril (1:4, tt:tt); pha động: hòa tan 0,5 g natri dihydrophosphat trong
500 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 2,5 bằng acid phosphoric đậm đặc, thêm
500 ml acetonitril, lắc đều; tốc độ dũng: 1 ml/phỳt; thể tớch tiờm 10 àl; bước sóng phát hiện: 228 nm.
Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác khoảng 2 mg tạp C, cho vào bình định mức
10 ml, thờm dung mụi hũa tan vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm.
Mẫu trắng: Dung môi hòa tan và pha động.
Chú ý: các dung dịch được chuẩn bị trước khi sử dụng và thao tác nhanh, bảo quản dung dịch ở nhiệt độ không quá 12 o C và sử dụng dung dịch trong vòng
Tiến hành sắc ký mẫu thử, sử dụng chế độ Max plot giúp phát hiện các pic tạp chất trên toàn thang sóng 190 – 800 nm, sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic để xác định độ tinh khiết pic Chọn điều kiện sắc ký thích hợp sao cho pic tạp C tinh khiết, tách hoàn toàn các pic từ mẫu trắng và pic tạp khác (nếu có) và hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5.
Tính kết quả: bỏ qua tất cả các pic phụ trong mẫu thử có thời gian lưu tương ứng với các pic trong mẫu trắng khi xem sắc ký đồ ở bước sóng phát hiện của tạp C Độ tinh khiết tính theo chế phẩm nguyên trạng của tạp C được tính theo công thức sau:
X(%): độ tinh khiết tạp C của glimepirid.
Sa: Diện tích pic chính trong mẫu thử.
: Tổng diện tích các pic phụ trong mẫu thử (ngoại trừ các pic trong mẫu thử có thời gian lưu tương ứng với các pic trong mẫu trắng).
Thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết tạp C
Tính phù hợp hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu thử, ghi nhận giá trị các thông số sắc ký về thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), hệ số bất đối (As) ở bước sóng
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối của các thông số thời gian lưu và diện tích pic của tạp C không được lớn hơn 2,0% và hệ số bất đối của tạp C trong khoảng 0,8 - 1,5.
Tiến hành sắc ký mẫu thử và mẫn trắng.
Yêu cầu: SKĐ mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic tạp C trong mẫu thử; Trên SKĐ mẫu thử, pic tạp C phải tách hoàn toàn các pic tạp khác (nếu có) và các pic từ mẫu trắng; Pic tạp C phải đạt độ tinh khiết theo phổ UV-Vis.
Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành sắc ký dung dịch tạp C ở 6 nồng độ khác nhau, mỗi dung dịch tiêm
2 lần, xác định diện tích pic, tính giá trị trung bình.
Dung dịch gốc tạp C 2000 àg/mL (mL) 0,25 0,5 0,75 1,0 1,2 1,5
Dung môi hòa tan vừa đủ (mL) 10
Nồng độ tạp C (àg/mL) 50 100 150 200 240 300
- Vẽ đường biểu diễn diện tích pic trung bình theo nồng độ tạp C.
- Xác định các hệ số a (độ dốc), b (tung độ gốc), R (hệ số tương quan) của phương trình hồi quy (ŷ = ax + b) Tính tuyến tính được chấp nhận khi 0,995
- Sử dụng “phân tích hồi quy” để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy.
Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Độ lặp lại: Thực hiện bằng cách chuẩn bị 6 mẫu thử Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần. Độ chính xác trung gian: Tiến hành như độ lặp lại nhưng trong 2 ngày liên tiếp với cùng điều kiện làm việc và người thực hiện.
Yêu cầu: Giá trị RSD của hàm lượng phần trăm tạp C phải 2,0%.
Dựa vào cảm quan xác định hình dạng, màu, mùi của chất thử.
Xác định độ tan: cho lượng dung môi vào chất thử để ở nhiệt độ 25 ± 2ºC trong 30 phút, cứ cách 5 phút lại lắc 30 giây Độ tan được đánh giá theo Dược điển Việt Nam V.
Phổ UV-Vis: phải cho đỉnh hấp thụ tại bước sóng phù hợp với dữ liệu phổ.
Phổ hồng ngoại IR: xác định số sóng của các nhóm chức đặc trưng trong công thức cấu tạo của chất thử.
Phổ khối: xác định pic cơ bản (m/z).
Phổ NMR: xác định các tín hiệu tương ứng với độ dịch chuyển hóa học đặc trưng của chất thử trong phổ 1 H-NMR và phổ 13 C-NMR.
2.2.6.3 Giảm khối lượng do sấy khô
Xác định hàm ẩm bằng phân tích nhiệt trọng lượng (TGA).
Mẫu được cân bằng ở nhiệt độ 50 o C, gia nhiệt mẫu với tốc độ 3 o C/phút cho đến 300 o C Lưu lượng dòng khí nitơ trong suốt quá trình thực hiện là 50,0 ml/phút Cân một lượng bột khoảng 5 – 10 mg cho vào dụng cụ chứa mẫu, tiến hành đo độ ẩm bằng máy TGA Xác định hàm ẩm có trong mẫu dựa vào sự thay đổi phần trăm trọng lượng mẫu.
2.2.6.4 Độ tinh khiết Độ tinh khiết tạp C được xác định bằng phương pháp HPLC và qui về 100% diện tích pic như mục 2.2.5.
Tạp chất liên quan của tạp C được xác định cùng với việc xác định độ tinh khiết tạp C bằng phương pháp HPLC và qui về 100% diện tích pic trong mục 2.2.6.4.
2.2.7 Thiết lập chất đối chiếu tạp C
Tạp C sau khi được đánh giá đạt yêu cầu chất lượng được đóng thành từng lọ nhỏ có khối lượng thích hợp Sử dụng lọ thủy tinh nâu hàn kín, có lớp đệm teflon đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy định, dán nhãn tạm ghi tên hoạt chất và đánh số thứ tự từng lọ Việc đóng gói được thực hiện trong Glove-box:
- Độ ẩm tương đối trong buồng đóng ≈ 40%.
2.2.7.1 Đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ
Lấy mẫu ngẫu nhiên theo công thức N+1 bằng phần mềm excel trong đó N là tổng số lọ Tiến hành xác định độ tinh khiết từng lọ theo phương pháp đã xây dựng Mỗi lọ được kiểm tra 2 lần.
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
Tổng hợp tạp C
Phản ứng tổng hợp tạp C là phản ứng thủy phân glimepirid trong acid.
- Với HCl, PPA (acid polyphosphoric) và H3PO4 từ nồng độ thấp đến đậm đặc, tạp C đã hình thành, tuy nhiên vẫn không đủ để cắt đứt hoàn toàn các liên kết amid dẫn đến thời gian phản ứng rất lâu và glimepirid chưa bị thủy phân hoàn toàn.
- Với H2SO4 nồng độ thấp (khoảng 40%) liên kết amid trong phân tử glimepirid không bị cắt đứt hoàn toàn Sau một thời gian dài, lượng glimepirid vẫn còn rất nhiều so với việc thủy phân bằng H2SO4 đậm đăc. Glimepirid bị cắt đứt liên kết nhanh hơn dẫn đến thời gian phản ứng ngắn hơn.
Như vậy H2SO4 đậm đăc với nhiệt độ phản ứng là nhiệt độ sôi (khoảng 70 o C) thích hợp để thủy phân glimepirid hoàn toàn trong khoảng thời gian hợp lý, thu được tạp C tinh khiết, hiệu suất phản ứng cao.
Trong quá trình tiến hành thăm dò các thử nghiệm còn nhận thấy phản ứng thủy phân glimepirid trong methanol trong môi trường acid cho ra 2 sản phẩm tạp B và tạp C Việc tiến hành phản ứng trong môi trường methanol khan ghi nhận sự tạo thành tạp C với tỷ lệ lớn hơn Do đó, tạp C được tổng hợp như sau: cân một lượng glimepirid khoảng 2,0 g (4 mmol), cho vào bình cầu, thêm
85 ml methanol, đun hồi lưu đồng thời khuấy để glimepirid tan hoàn toàn, để nguội, thêm từ từ khoảng 6 ml H2SO4 đậm đặc (0,06 mol), đun hồi lưu cho đến khi kiểm tra phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển cyclohexan – ethyl acetat – methanol (5:5:1) phát hiện bằng đèn UV 254 nm thấy không còn vết glimepirid, để nguội, trung hòa đến pH 7 bằng dung dịchKOH bão hòa (khoảng 1 g/ml), sau đó làm lạnh xuất hiện tủa mịn màu trắng,lọc để loại bỏ dung môi, rửa tinh thể thu được với nước cất (10 ml/lần x 3 lần), sấy ở 50 o C thu tủa (sản phẩm tổng hợp C) (Phụ lục 1).
Tinh chế sản phẩm tổng hợp C
Sản phẩm tổng hợp C được tinh chế bằng sắc ký cột, cụ thể như sau: nạp sản phẩm tổng hợp lên cột sắc ký Ф = 43 có chứa 50 g silica gel đã được cân bằng với hỗn hợp dung môi cyclohexan - ethyl acetat - methanol (5:5:1) trong 1 giờ, tiến hành rửa giải, hứng các phân đoạn trong từng ống nghiệm 5 ml, kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, gom các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau, tiến hành cô quay chân không và làm khô hoàn toàn trong tủ sấy chân không ở 50 o C trong 8 giờ thu được sản phẩm tinh chế C (Phụ lục 1).
Thử tinh khiết sản phẩm tinh chế C
Tiến hành thăm dò thành phần và tỉ lệ các hệ dung môi khai triển để chọn ba hệ dung môi thích hợp về sức rửa giải và cho vết sắc ký gọn Kết quả cho thấy sản phẩm tinh chế C đều cho một vết duy nhất Như vậy sản phẩm tinh chế C tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 1).
Hình 3.1 đến hình 3.5 minh họa kết quả xác định độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế C.
Hình 3.1 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu.
Hình 3.2 Sắc ký đồ pha động
Hình 3.3 Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế C
Hình 3.4 Sắc ký đồ 3 chiều sản phẩm tinh chế C
Hình 3.5 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết pic sản phẩm tinh chế C
Nhận xét: Sắc ký đồ 3 chiều của sản phẩm tinh chế C cho thấy chỉ có 1 pic chính Kết quả kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic sản phẩm tinh chế C đều tinh khiết (theo phổ UV-Vis).
Xác định cấu trúc sản phẩm tinh chế C
3.4.1 Phổ tử ngoại – khả kiến
Hình 3.6 minh hoạ phổ UV-Vis của sản phẩm tinh chế C được pha trong methanol, nồng độ 1 mg/ml Kết quả cho thấy sản phẩm tinh chế C có hai bước sóng hấp thụ cực đại trong khoảng 196 và 228 ± 2 nm.
Hình 3.6 Phổ UV-Vis của sản phẩm tinh chế C.
Phổ IR của sản phẩm tinh chế C có các đỉnh đặc trưng phù hợp với công thức cấu tạo của tạp C (Hình 3.7) Các đỉnh đặc trưng trong phổ IR của sản phẩm tinh chế C được trình bày ở Bảng 3.1.
Hình 3.7 Phổ IR của sản phẩm tinh chế C Bảng 3.1 Các đỉnh đặc trưng trong phổ IR của sản phẩm tinh chế C
max (cm -1 ) Nhóm chức max (cm -1 ) Nhóm chức
Hình 3.8 minh họa phổ khối ESI-MS(+) của sản phẩm tinh chế C có m/z 432,1184 [M+Na] + Phổ ESI-MS (-) của sản phẩm tinh chế C có m/z 408,1212 [M-H] - M phù hợp với công thức phân tử của tạp C (C18H23N3O6S, M= 409,1308).
3.4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phân tích dữ liệu phổ NMR (Bảng 3.2, Hình 3.9 và Hình 3.10) cho thấy số lượng và vị trí của proton và carbon của sản phẩm tinh chế C phù hợp với công thức cấu tạo của methyl[[4-[2-[[(3-ethyl-4-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-pyrrol-l-yl)carbonyl]amino]ethyl] phenyl] sulfonyl] carbamat (tạp C glimepirid) Các dữ liệu phổ UV, IR và MS cũng tương đồng và phù hợp với tạp C, có công thức phân tử C18H23N3O6S, khối lượng phân tử 409,5 g/mol.
Hình 3.8 Phổ MS của sản phẩm tinh chế C Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tinh chế C (Phụ lục 2)
1 H-NMR (500 MHz, DMSO): δ H (ppm) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO): δ C (ppm)
Công thức cấu tạo của tạp C
Hình 3.9 Phổ 13 C-NMR của sản phẩm tinh chế C
Hình 3.10 Phổ 1 H-NMR của sản phẩm tinh chế C
Hiệu suất tổng hợp và tinh chế tạp C
Công thức tính hiệu suất
Trong đó mtt: khối lượng thực tế thu được (0,5 g); mlt: khối lượng lý thuyết (g) W: trọng lượng phân tử của glimepirid urethan (409,5) a: số mol của glimepirid sử dụng (0,004 mol) Khối lượng lý thuyết:
Hiệu suất tổng hợp và tinh chế:
Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp C bằng HPLC
Bảng 3.3 trình bày các thông số sắc ký của tạp C.
Bảng 3.3 Các thông số sắc ký của tạp C (n=3)
Diện tích pic (àAU x giõy)
Hệ số bất đối Độ tinh khiết pic
Nhận xét: Hệ số bất đối của tạp C nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 Pic tạp C đạt độ tinh khiết (theo phổ UV-Vis).
Thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết tạp C
Tính phù hợp hệ thống
Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống được trình bày bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu thử (n=6)
Giỏ trị thống kờ t R (phỳt) S (àAU x giõy) N bk A s
RSD (%) 0,07 0,38 0,27 0,09 t R : Thời gian lưu, S: Diện tích pic, N bk : Số đĩa lý thuyết biểu kiến, A s : Hệ số bất đối
Nhận xét: Giá trị RSD của các thông số sắc ký đều nhỏ hơn 2,0% và hệ số bất đối của pic tạp C nằm trong khoảng 0,8-1,5 Như vậy quy trình xác định độ tinh khiết tạp C đạt tính phù hợp hệ thống.
Kết quả khảo sát tính chọn lọc cho thấy (xem Hình 3.1 đến Hình 3.5): SKĐ mẫu trắng và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic tạp C trong mẫu thử; Trên SKĐ mẫu thử, pic tạp C tách hoàn toàn các pic tạp khác và các pic từ mẫu trắng và dung môi pha mẫu; Pic tạp C đạt độ tinh khiết theo phổ UV-Vis Như vậy quy trình đạt yêu cầu về tính chọn lọc. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được tóm tắt ở bảng 3.5 Phương trình hồi quy được kiểm tra tính phù hợp và ý nghĩa của các hệ số a và b, kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của tạp C
Bảng 3.6 Phân tích tính tuyến tính quy trình xác định độ tinh khiết tạp C
Khoảng tuyến tớnh (àg/mL) 50 - 300
Diện tớch pic (àAU x giõy) Lần tiêm 1 Lần tiêm 2 Trung bình
Giá trị R nằm trong khoảng 0,995 - 1 nên có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ tạp C với diện tích pic Khoảng tuyến tính của tạp C là 50 – 300 àg/mL. Độ chính xác Độ lặp lại: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp xác định độ tinh khiết tạp C
Diện tớch pic (àAU x giõy) Hàm lượng tạp C (%)
Giá trị hàm lượng trung bình XTB 98,35 Độ lệch chuẩn 0,40 Độ lệch chuẩn tương đối RSD% 0,39
Khoảng tin cậy à 97,93 - 98,77 Độ chính xác trung gian: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp xác định độ tinh khiết tạp C
Hàm lượng tạp C (%) Độ tinh khiết trung bình XTB 98,78 Độ lệch chuẩn tương đối RSD% 0,79
Khoảng tin cậy à 98,29 – 99,28Giá trị RSD của hàm lượng phần trăm tạp C đều nhỏ hơn 2,0% nên phương pháp đạt độ chính xác.
Như vậy, quy trình xác định độ tinh khiết tạp C bằng phương pháp HPLC có tính chọn lọc, độ chính xác cao và khoảng tuyến tính rộng Độ tinh khiết sắc ký của tạp C tính theo phương pháp phần trăm diện tích pic là 98,78% tính trên chế phẩm nguyên trạng.
Xác định hàm ẩm tạp C bằng TGA
Kết quả xác định hàm ẩm bằng TGA cho thấy tạp C có hàm lượng nước là 3,39% (Hình 3.11).
Hình 3.11 Biểu đồ phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) của tạp C
Đánh giá tạp C
Kết quả đánh giá tạp C được thể hiện ở bảng 3.9 Đây là cơ sở để thiết lập chất đối chiếu.
Bảng 3.9 Kết quả đánh giá tạp C
Chỉ tiêu Phương pháp Yêu cầu
Cảm quan Tinh thể vàng nhạt, không mùi. Độ tan (Phụ lục 3) Hơi tan trong aceton, cloroform, methanol, dicloromethan, rất khó tan trong nước và ethanol Định tính
Phổ hồng ngoại max (cm -1 ) 3242,3 (N-H), 1755,2 (C=O), 1654,9
Phổ khối ESI-MS (+) có m/z = 432,1184 [M+Na] + ,
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR: xem bảng 3.2
Tạp liên quan HPLC ≤ 2,0% Độ tinh khiết HPLC ≥ 98,0% tính trên chế phẩm nguyên trạng
Thiết lập chất đối chiếu tạp C
3.9.1 Đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ
500 mg tạp C được đóng 50 lọ, mỗi lọ 10 mg và 6 lọ được lấy ngẫu nhiên theo phần mềm Excel.
Bảng 3.10 Kết quả xác định độ tinh khiết tạp C trong quá trình đóng lọ.
Số thứ tự lọ % diện tích pic Xử lý thống kê
Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon: xếp các kết quả trên theo thứ tự tăng dần, xét hai giá trị nhỏ nhất và lớn nhất theo trắc nghiệm Dixon. Không có giá trị bất thường trong kết quả định lượng đồng nhất lọ. Đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ theo phương pháp thống kê phân tích
ANOVA một yếu tố, so sánh 2 giá trị Ftn và Ftc.
Bảng 3.11 Phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA
Nguồn sai số Tổng bình phương
Bình phương trung bình F tn F tc
Giữa các nhóm 5,333E-08 1 5,333E-08 1,7582 4,9646 Trong cùng nhóm 3,033E-07 10 3,033E-08
Nhận xét: Ftn = 1,7582 < Ftc = 4,9646 Vậy các lọ trong quá trình đóng đồng nhất.
3.9.2 Đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm
Kết quả xác định độ tinh khiết tạp C từ 2 phòng thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.12 và 3.13.
Bảng 3.12 Giá trị các thông số của hệ thống sắc ký khi định lượng tạp C tại 2 phòng thí nghiệm
PTN1: Khoa Thiết lập chất chuẩn - chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh.
PTN2: Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh.
Nhận xét: Phương pháp định lượng đạt tính phù hợp hệ thống tại hai PTN nên có thể tiếp tục tiến hành định lượng tạp C.
Bảng 3.13 Kết quả định lượng tạp C tại hai phòng thí nghiệm
Việc đánh giá độ đồng nhất lọ giữa 2 phòng thí nghiệm được thực hiện qua việc đánh giá kết quả định lượng trung bình giữa 2 phòng thí nghiệm, sử dụng phương pháp thống kê phân tích ANOVA, so sánh 2 giá trị Ftn và Ftc.
Bảng 3.14 Kết quả phân tích ANOVA
Nguồn sai số Tổng bình phương Bậc tự do
Bình phương trung bình F tn F tc
Giữa các nhóm 1,77E-07 5 3,53E-08 1,39474 5,0503 Trong cùng nhóm 5,33E-08 1 5,33E-08 2,10526 6,6079 Độ lệch 1,27E-07 5 2,53E-08
Ftn = 1,3947 < Ftc = 5,0503 Vậy kết quả định lượng giữa 2 phòng thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê Quy trình phân tích có độ lặp lại cao, độ tinh khiết chất phân tích không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá.
3.9.3 Xác định giá trị ấn định - giá trị công bố
Bảng 3.15 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp C (n = 12)
Trung bình 99,87 99,87 99,87 99,87 Độ lệch s 0,0180 0,018 0,0180 0,0180 x* mới 99,87 99,87 99,87 99,87 s* mới 0,0445 0,0204 0,0204 0,0204
Nhận xét: Sau ba lần thay đổi, s* = 0,0204 không thay đổi, khi đó giá trị x* được chọn là 99,87%
Từ kết quả trên tính z-score, kết quả tất cả 12/12 giá trị có |z| < 2,0.
Tính trung bình 12 giá trị này, kết quả thu được như sau:
- Độ không đảm bảo đo U x 1 , 25 s * / n = 0,018.
Như vậy, tạp C đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng được xác định 99,87% tính theo chế phẩm nguyên trạng, độ không đảm bảo đo 0,018, độ lệch chuẩn 0,0204 (n = 12) Tiến hành lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn và kèm theo phiếu kiểm nghiệm Bảo quản các lọ chuẩn ở nhiệt độ 2 - 8 o C, tránh ánh sáng (Phụ lục 4 và 5).
Kiểm tra tạp C trong nguyên liệu và thành phẩm chứa glimepirid
Tiến hành kiểm tra tạp C trên 2 mẫu nguyên liệu và 4 mẫu chế phẩm được mã hóa Mỗi mẫu tiến hành 2 lần Kết quả được trình bày ở bảng 3.16 Sắc ký đồ các mẫu kiểm tra được minh họa ở hình 3.12.
Bảng 3.16 Kết quả kiểm tra tạp C trong một số nguyên liệu và chế phẩm glimepirid trên thị trường
Nhận xét: Tất cả các mẫu nguyên liệu và thành phẩm đều cho kết quả kiểm tra tạp C đạt giới hạn cho phép theo quy định USP 40.
Chế phẩm Mã hóa Hạn dùng Tạp C (%)
Nguyên liệu glimepirid, mẫu 1 NL1 01/11/2022 0,01
Nguyên liệu glimepirid , mẫu 2 NL2 03/07/2021 0,01
Viên nén bao phim glimepirid 2 mg (trong nước, công ty A) CPA 23/04/2020
Viên nén bao phim glimepirid 2 mg (trong nước, công ty B) CPB 05/04/2020
Viên nén bao phim glimepirid 2 mg (trong nước, công ty C) CPC 12/09/2020
Viên nén bao phim glimepirid 2 mg (trong nước, công ty D) CPD 19/02/2020
Hình 3.12 Sắc ký đồ nguyên liệu và chế phẩm glimepirid.
Bàn luận
Hình 3.13 đề xuất cơ chế phản ứng thủy phân glimepirid trong môi trường acid để tạo thành tạp C.
Hình 3.13 Cơ chế phản ứng thủy phân glimepirid trong môi trường acid tạo tạp C Cho đến nay, chưa có công trình nào công bố về quy trình tổng hợp tạp C được thực hiện trong đề tài Nguyên liệu trong quy trình tổng hợp là các chất dễ tìm, rẻ tiền Phản ứng tổng hợp và quy trình tinh chế cho hiệu suất cao, có thể được thực hiện ở các phòng thí nghiệm không đòi hỏi trang thiết bị tổng hợp và tinh chế hiện đại.
Quy trình xác định độ tinh khiết tạp C bằng HPLC đạt tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, độ chính xác Quy trình sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 m) rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm ở Việt Nam Thời gian sắc ký ngắn, khoảng 7 phút, pic tạp C đạt độ tinh khiết và các thông số sắc ký.
Việc kiểm soát các tạp chất liên quan trong nguyên liệu và đặc biệt là trong thành phẩm tương ứng chưa được quan tâm nhiều tại Việt Nam vì nhiều lý do như một số tạp chất chuẩn vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất đắt tiền và
Tạp C phải mua từ nước ngoài Tuy nhiên, phần lớn các chuyên luận trong dược điển nước ngoài (USP, EP, BP) cũng như dược điển Việt Nam V đều bắt buộc phải kiểm soát tạp chất liên quan Gần đây, cục Quản lý Dược Việt Nam đã có yêu cầu phải kiểm tra tạp chất liên quan một cách chặt chẽ trong nguyên liệu và thành phẩm đăng ký cho sản xuất và lưu hành Hiện nay hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia chưa cung cấp được tạp chuẩn C nên gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm tạp chất này tại các xí nghiệp dược trong nước có sản xuất thành phẩm glimepirid Việc đặt mua các tạp chuẩn này từ nước ngoài phải mất 1 – 2 tháng với giá thành rất đắt.
Kết quả đánh giá và thiết lập chất đối chiếu tạp C cho thấy chất này đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với độ tinh khiết sắc ký được xác định là 99,87% tính trên nguyên trạng Với hiệu suất toàn quy trình cao, khối lượng tạp C thu được khoảng 0,5 g cho mỗi lần tổng hợp, nên chất đối chiếu tạp C có thể cung cấp đủ cho các xí nghiệp dược trong nước có nhu cầu, góp phần làm tăng nguồn tạp chuẩn trong công tác kiểm tra chất lượng tạp chất liên quan.
Quy trình kiểm tra tạp C trong nguyên liệu và thành phẩm chứa glimepirid sử dụng quy trình trong USP 40 có sự thay đổi kích thước cột sắc ký C18 (250 x 4,0 mm; 4 m) bằng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 m) Tuy nhiên kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống của quy trình kiểm tra tạp chất C trong nguyên liệu glimepirid theo USP 40 cho thấy quy trình vẫn đạt tính phù hợp hệ thống, thời gian lưu của các pic tạp C và glimepirid đều thay đổi không đáng kể so với yêu cầu của dược điển, các pic chính đều tách tốt và đạt các thông số sắc ký. Hơn nữa, cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 m) rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm ở Việt Nam hơn Do đó có thể sử dụng quy trình trong USP 40 và cột này để kiểm tra tạp C trong nguyên liệu và thành phẩm chứa glimepirid.
Kết quả định lượng tạp C trong một số nguyên liệu và chế phẩm glimepirid trên thị trường cho thấy một số nguyên liệu và chế phẩm có hàm lượng tạp nằm dưới giới hạn cho phép Đây là một kết quả khả quan vì glimepirid là một trong những thuốc tiểu đường hiện đang được kê toa khá phổ biến, thời gian sử dụng dài và thường xuyên hằng ngày nên nếu hàm lượng tạp vượt quá giới hạn cho phép sẽ gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe của người bệnh.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận Đề tài đã hoàn thành mục tiêu đề ra, với các kết quả như sau:
- Đã tổng hợp được tạp C với hiệu suất toàn quy trình và khối lượng lần lượt là 60% và 0,5 g; độ tinh khiết sắc ký trên 99% tính trên nguyên trạng, có thể dùng làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm tạp chất C của glimepirid (số lọ chất đối chiếu tạp C đã đóng là 50 lọ, mỗi lọ 10 mg).
- Đã xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu quy trình xác định độ tinh khiết tạp
C bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA.
- Đã kiểm tra tạp chất liên quan của một số mẫu nguyên liệu glimepirid và thành phẩm tương ứng theo quy định dược điển USP 40, sử dụng tạp tổng hợp đã được thiết lập chất đối chiếu.
Từ những kết quả thu được, đề tài nên được tiếp tục nghiên cứu một số nội dung sau:
- Tiếp tục sử dụng tạp tổng hợp đã được thiết lập chất đối chiếu để kiểm tra giới hạn tạp C trên nhiều mẫu nguyên liệu và thành phẩm glimepirid.
- Tiếp tục nghiên cứu theo dõi độ ổn định của chất đối chiếu tạp C để có thể tính toán chu kỳ đánh giá lại.
- Tiếp tục nghiên cứu tổng hợp và thiết lập chất đối chiếu các tạp chất liên quan khác cũng như xây dựng quy trình định lượng đồng thời các tạp chất liên quan của glimepirid.
Báo cáo tổng kết đề tài
1 Shraddha Pawar, Gangadhar Meshram, Rajendra Jadhav, Yatish Bansal
(2010), “Simulaneous determination of Glimepiride and Metformin hydrochloride impurities in sustained release pharmaceutical drug product by HPLC”, Der Pharma Chemica, 157-168.
2 British Pharmacopoeia (2017), CD-ROMs, monographs: glimepiride, glimepiride tablets.
3 USP 40 (2017), CD-ROMs, monographs: glimepiride, glimepiride tablets.
4 Ashok Kumar, Satish Rajanikant Soudagar, Pramil Kumar Mathur, Arpana Mathur, Dadaso Shankar Dalav, Sanjay Tukaram Gunjal, Uttamrao Arjunrao SaWant, Ashvini SaXena, Bimal Kumar Srivastava, Praveen Kumar Singh, Jagdish Sankla, Vij ay Dhurandhare (2007),
“Method of manufacture of compounds related to the class of substituted sulfonyl urea anti-diabetics”, United States Patent No 0255056A1.
5 Blyth Academy (2013), “Synthesis, Physico-chemical and Antidiabetic Studies of Zinc Complex of Glimepiride, An Oral Hypoglycemic Agent”,
6 Gulshan Bansal, Manjeet Singh, K.C Jindal, Saranjit Singh (2008), “LC – UV-PDA and LC-MS studies to characterize degradation products of glimepiride”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 788-
7 Petra Kovaˇr ́ıková, Jiˇr ́ı Klimeš, Jiˇr ́ı Dohnal, Lucie Tisovská (2004),
“HPLC study of glimepiride under hydrolytic stress conditions”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 205-209.
8 Rohit Ravikant Soni, Thennati Rajamannar, Rajeev Budhdev Rehani
(2006), “Process for the preparation of trans-3-ethyl-2,5-dihydro-4-methyl
Báo cáo tổng kết đề tài n-2-4-(4-methylcyclohexyl) amino.carbonyl.amino.sulfonyl.phenyl.ethyl.- 2-oxo-1h-pyrrole-1 carboxamide”, United States Patent No 7, 132, 444 B2.
9 Stanislav Radl, Kamal Jarrah (2007), “Method of manufacturing Glimepiride and the respective intermediate”, United States Patent No. 7282517.
10 Suresh Mahadev Kadam, Venkatasubramanian Radhakrishnan Tarur, Sanjay Janardham Naik, Sachin Baban Gavhane (2007), “Process for the preparation of substantially pure Glimepiride”, United States Patent No. 0082943.
11 Tarur, Venkatasubramanian, Radhakr-ishnan, Kadam, Suresh, Mahadev, Naik, Sanjay, Janardhan, Gaviiane, Sachin, Baban (2006), “A novel process for preparation of substantially pure glimepiride”, WO 2006/103690 A1.
12 Glimepirid Related Compound C (20 mg) https://store.usp.org/OA_HTML/ibeCCtpItmDspRte.jsp?sitex020:223 72:US&item(308 Ngày truy cập: 02/5/2018.
13 Maria L.A.D Lestari, Gunawan Indrayanto (2011), “Gimepiride”,
Profiles of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology,
Volume 36, Elsevier Inc., Indonesia, pp 169-204.
14 Bộ Y tế (2015), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà
15 LGC standards (2014), “Safety Data Sheet Sheet according to 1907/2006/EC”, Article 31, Glimepiride Related Compound C, D, pp 1-6.
16 Mubeen Ahmad Khan, Sukumar Shinha, Santosh Vartak, Atul Bhartiya, Shanka Kumar (2005), “LC determination of glimepiride and its related impurities”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 928-
Báo cáo tổng kết đề tài
17 Robert D Gibbons, Dulal K Bhaumik, Subhash Aryal (2009), Statistical methods for ground water monitoring – 2 nd edition, pp 296-299.
18 ISO Guide 35:2006 (2006), Reference materials – General and statistical principles for certification, p 48.
19 ISO 13528:2005 (2005), Statistical methods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparisons, p 64.
Báo cáo tổng kết đề tài