Khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động điều trị rối loạn lipid huyết của hệ vi tự nhũ chứa atorvastatin trên mô hình chuột nhắt

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞBÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID HUYẾT CỦA HỆ VI TỰ NH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID HUYẾT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược

Chủ trì nhiệm vụ: PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi

Thành phố Hồ Chí Minh - 20…

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID HUYẾT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT

Cơ quan chủ quản

BÁO CÁO TÓM TẮT

KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID HUYẾT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM Cộng tác viên chính: PGS.TS Nguyễn Thiện Hải, DS Nguyễn Hoàng Anh

Nơi phối hợp thực hiện: Bộ môn Bào chế, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM

Mở đầu: Atorvastatin là một thuốc trị rối loạn lipid máu quen thuộc và hiệu quả,

tuy nhiên sinh khả dụng của thuốc lại thấp khoảng 14% và một hướng giải quyếtđầy tiềm năng là bào chế dưới dạng hệ vi tự nhũ (SMEDDS)

Mục tiêu: Khảo sát độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt và tác động điều hòa

lipid máu cấp của hệ vi tự nhũ chứa atorvastatin

chứa atorvastatin bằng phương pháp Behrens Khảo sát tác dụng hạ lipid máu cấpbởi mô hình tăng lipid máu cấp bằng cách tiêm tĩnh mạch (IV) tyloxapol liều duynhất 250 mg/kg và kiểm tra đáp ứng với thuốc đối chiếu Lipitor liều 60 mg/kg Lấymáu chuột vào 24 giờ sau khi tiêm tyloxapol để thực hiện định lượng các chỉ sốđánh giá lipid máu

atorvastatin Liều 30 mg/kg của thuốc thử nghiệm cho kết quả hạ lipid máu tươngđương với liều 60 mg/kg thuốc đối chiếu Lipitor

Kết luận: Hệ SMEDDS chứa atorvastatin có độ an toàn và thể hiện tác động điều

trị rối loạn máu trên chuột nhắt

Từ khóa: SMEDDS, atorvastatin, rối loạn lipid máu, tyloxapol

STUDY ON ACUTE TOXICITY AND ACUTE LIPID-LOWERING EFFECT

OF SELF-MICROEMULSIFYING DRUG DELIVERY SYSTEM

CONTAINING ATORVASTATIN IN MICE

Introduction: Atorvastatin is a common and effective agent to treat dyslipidemia.

However, atorvastatin is a hydrophobic substance and its bioavailability is low,about 14%; therefore, it is necessary to find a solution to improve its absorption.One of the most promising methods used widely these days is to develop a self-microemulsifying drug delivery system (SMEDDS) for atorvastatin The purpose ofthis study is to determine whether SMEDDS-atorvastatin has higher acute toxicityand higher bioavailability than the control drug

research induced acute hyperlipidemia in mice with a single dose 250 mg/kgintraperitoneal of tyloxapol to identify the acute lipid-lowering effect of SMEDDS-atorvastatin with the reduced dose compared to the control drug dose Bloodsamples were collected by cardiac puncture after 24 hours to test lipid kit

g/kg As for the acute lipid-lowering effect, a dose of 30 mg/kg test drug yields thesame result as a dose of 60 mg/kg control drug

Conclusion: SMEDDS-atorvastatin offers the use of reduced current dose of

atorvastatin with the same effect

Keywords: SMEDDS, atorvastatin, dislipidemia, tyloxapol

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID HUYẾT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NHẮT

Theo WHO, vào năm 2008, tỷ lệ rối loạn lipid ở Đông Nam Á là 30,3%; ở Tây TháiBình Dương là 36,7%; thấp hơn ở châu Âu là 53,7% và châu Mỹ là 47,7% [3] TheoHiệp hội Tim Mạch Hoa Kỳ, tổng chi phí chi trả cho bệnh tim mạch liên quan đếnrối loạn lipid máu ở Hoa Kỳ vào năm 2006 lớn hơn 400 triệu USD, trong đó chi phí

để khám chữa bệnh chiếm gần 2/3 tổng chi phí [4]

Đã có rất nhiều thử nghiệm chứng minh được tác dụng phòng ngừa biến cố timmạch ở người rối loạn lipid máu của nhóm thuốc statin và điển hình có thể kể đếnthử nghiệm Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial (ASCOT) Dự án này dựtính thực hiện trong vòng 5 năm nghiên cứu ngẫu nhiên ở bệnh nhân tăng huyết ápkhông có tiền sử bệnh mạch vành có  3 yếu tố nguy cơ bệnh tim mạch được điềutrị với atorvastatin (10 mg) và placebo, nhưng đã kết thúc sớm hơn 2 năm bởi biểuhiện lâm sàng được cải thiện đáng kể ở nhóm dùng atorvastatin [4]

Tuy nhiên, atorvastatin là một thuốc thân dầu kém tan trong nước thuộc nhóm IItrong hệ thống phân loại sinh dược học, sinh khả dụng của thuốc khoảng 14% Mộttrong những cách giúp tăng độ tan cũng như sinh khả dụng của các thuốc nhóm IInói chung và atorvastatin nói riêng là điều chế dưới dạng hệ tự nhũ tạo vi nhũ tương(self-microemulsifying drug delivery system - SMEDDS) [5, 6, 7]

Hiện nay, nhóm nghiên cứu bộ môn Bào chế, Khoa Dược đã xây dựng thành côngcông thức và quy trình điều chế SMEDDS chứa atorvastatin đạt yêu cầu về độ ổnđịnh trong các môi trường pH khác nhau, bền về nhiệt động, chỉ số khúc xạ, độ truyềnqua và phân bố kích thước [44] Tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu về hệ SMEDDS,

đề tài này khảo sát độc tính cấp đường uống và khảo sát tác dụng điều trị rối loạnlipid cấp của hệ SMEDDS chứa atorvastatin trên chuột nhắt

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt đực, chủng Swiss albino, khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường,

trọng lượng 22  2 g, được cung cấp bởi Viện Vaccin và Sinh phẩm y tế Nha Trang

và Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Chuột được nuôi trong lồngkích thước 15 x 26 x 36 cm (cao x rộng x dài) có lót lớp trấu ở đáy, được nuôi ổnđịnh trong môi trường thí nghiệm 5 ngày Chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn vànước uống trong suốt thời gian thử nghiệm

2.1.2 Hóa chất, thuốc thử

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất và thuốc thử đã sử dụng trong đề tài

3 Hệ vi tự nhũ chứa atorvastatin Đại học Y Dược TP.HCM Việt Nam

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Bảng 2 Danh mục thiết bị đã sử dụng trong đề tài

 Dụng cụ mổ, kim tiêm 1 mL (VinaHanbok)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thử nghiệm sơ bộ: Cho 5 chuột uống mẫu thử liều duy nhất Nếu không có chuột

nào chết thì ghi nhận liều Dmax Nếu tất cả chuột tử vong thì giảm ½ liều Tiếp tụcgiảm liều đến khi tìm được liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100) và liều tối đakhông gây chết chuột nào (LD0)

Thử nghiệm chính thức: Mức liều khởi đầu được xác định từ thử nghiệm sơ bộ,

thường là mức liều bắt đầu quan sát được các triệu chứng ngộ độc Không dùng cácmức liều đã gây chết trong giai đoạn thử sơ bộ để khởi đầu trong thử nghiệm chínhthức Số lượng chuột mỗi lần thử là 5 con/mức liều (mỗi nhóm) bao gồm cả 1 con

đã dùng thử ở thử nghiệm sơ bộ Thử nghiệm sẽ dừng lại khi có đủ thông tin về cácmức liều theo quy định chung Khoảng thời gian nghỉ giữa các đợt thử ở mức liềukhác nhau phải đủ kết luận chuột được cho dùng ở nhóm liều trước đó sống sót,thường 3 - 4 ngày [38]

Chỉ tiêu đánh giá: Theo dõi chuột trong vòng 72 giờ, ghi nhận biểu hiện độc, mức

độc nghiêm trọng, sự xuất hiện độc, tiến triển và phục hồi của chuột trong thời gianthử nghiệm (cử động tổng quát, biểu hiện hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêutiểu, …), số lượng chuột chết/sống ở mỗi lô, lập bảng số liệu để tính toán LD50 theophương pháp Behrens (Bảng 3)

Cột (5) là tổng các số của cột (2) tính đến hàng đó, tính từ trên xuống;

Cột (6) là tổng các số của cột (3) tính đến hàng đó, tính từ dưới lên;

Tính sai số chuẩn của LD50: Vẽ đồ thị biểu diễn % chết tích lũy theo liều, từ đó xácđịnh liều gây chết 16% (LD16) và 84% (LD84).

Sai số chuẩn của LD50 tính theo công thức:

Trong đó: k: hệ số Behrens = 0,66;

S = (giá trị LD84 và LD16 lấy từ đồ thị) (phân phối chuẩn);n: số chuột trong mỗi nhóm;

d: khoảng cách giữa các liều

Nếu sau 72 giờ chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo dõitrong 14 ngày Mổ quan sát đại thể xem bất thường của chuột chết trong thời gianquan sát Những chuột còn sống sau thời gian theo dõi cũng được mổ để xem cácphủ tạng và các cơ quan trong cơ thể có bất thường gì không

2.2.2 Mô hình gây tăng lipid máu cấp

Chuột bình thường, khỏe mạnh, được cho nhịn đói 12 giờ, chia ngẫu nhiên thành 7

lô, mỗi lô 8 con:

 Lô 1 (Lô sinh lý): tiêm tĩnh mạch (iv) NaCl 0,9%; thể tích 10 mL/kg Ngaysau đó chuột được cho uống nước cất 10 mL/kg/ngày

Chuột trong các lô còn lại được gây tăng lipid máu cấp bằng cách tiêm iv typoxapol(pha trong NaCl 0,9%) với liều 250 mg/kg thể trọng, thể tích tiêm 10 mL/kg Ngaysau đó, chuột được cho uống nước cất, thuốc đối chiếu, thuốc thử nghiệm với liềukhác nhau, thể tích uống 10 mL/kg, cụ thể như sau:

 Lô 2 (Lô chứng bệnh): uống nước cất;

 Lô 3: uống tá dược SMEDDS pha trong nước, liều ứng với 60 mg atorvastatin/kg;

 Lô 4: uống SMEDDS chứa atorvastatin pha trong nước cất liều 60 mg/kg;

 Lô 5: uống thuốc đối chiếu Lipitor®

pha trong nước cất liều 60 mg/kg;

 Lô 6: uống tá dược SMEDDS pha trong nước cất, ứng với liều 30 mg atorvastatin/kg;

 Lô 7: uống SMEDDS chứa atorvastatin pha trong nước cất với liều 30 mg/kg;

 Lô 8: uống thuốc đối chiếu Lipitor®

pha trong nước cất liều tương ứng 60 mg/kg;

Sau 24 giờ tiêm tyloxapol, lấy máu tim chuột (chuột đã được cho nhịn đói 12 giờtrước khi lấy máu) và định lượng các chỉ số lipid máu gồm cholesterol toàn phần,triglycerid, HDL-C và LDL-C [39].

Hình 1 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát tác động hạ lipid máu cấp

Định lượng các chỉ số lipid máu

Chuột thử nghiệm được cho nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi lấy máu

Lấy khoảng 1 mL máu từ tim, cho vào ống EDTA K3, ly tâm 3000 vòng/phút trong

10 phút ở nhiệt độ thường Hút huyết tương tiến hành định lượng cholesterol toànphần, triglycerid, LDL-Cholesterol, HDL-Cholesterol theo nguyên tắc enzym màu

Bảng 4 Thành phần phản ứng đo TC trong huyết tương

Nước cất (µL) 2,5

Lắc đều, ủ 5 phút 40 giây ở 37 oC Đọc mật độ quang (OD) ở bước sóng 500 nm

Bảng 5 Thành phần phản ứng đo TG trong huyết tương

Ct, Cc: nồng độ của mẫu thử và mẫu chuẩn

Điều trị: Chứng bệnh: Nước cất, po.

Đối chiếu: Lipitor ® , po.

Thuốc thử nghiệm: SMEDDS chứa atorvastatin, po.

Tá dược SMEDDS: po

Tiêm IV tyloxapol, 250 mg/kg

Triglycerid Cholesterol HDL-Cholesterol LDL-Cholesterol

24 giờ

Bảng 6 Thành phần phản ứng đo HDL-C trong huyết tương

Lắc đều, ủ 4 phút ở 37 oC Đọc mật độ quang (OD) ở bước sóng 578 nm

Bảng 7 Thành phần phản ứng đo LDL-C trong huyết tương

Trong đó: ODt, ODc: OD của mẫu thử và mẫu chuẩn;

Ct, Cc: nồng độ của mẫu thử và mẫu chuẩn

Xử lý kết quả và phân tích số liệu thống kê

Các kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trịtrung bình (Mean ± SEM) và được đánh giá ý nghĩa thống kê trên phần mềm SPSS20.0 Với các biến số tuân theo luật phân phối chuẩn, sử dụng phép kiểm Student’s ttest để kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các lô Với các biến số không theo luậtphân phối chuẩn, sử dụng phép kiểm Mann - Whitney và phép kiểm Kruskal - Wallis

để kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa Sự khác biệt có ý nghĩa khi giá trị p < 0,05

3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG TRÊN CHUỘT NHẮT

Thử nghiệm sơ bộ xác định liều cao nhất không gây chết chuột (LD0) và liều thấpnhất gây chết 100% chuột thí nghiệm (LD100) của hệ SMEDDS chứa atorvastatin là0,9 g/kg và 1,5 g/kg Từ đó, thử nghiệm trên 7 lô LD50 Số lượng chuột chết /sống ởmỗi lô sau 72 giờ của SMEDDS chứa atorvastatin được trình bày ở Bảng 8

Bảng 8 Số lượng chuột chết/sống ở mỗi lô uống thuốc thử nghiệm

Sai số chuẩn của LD50 tính theo công thức: = = 0,039.

Vậy LD50 của thuốc thử nghiệm là 1,16  0,039 (g/kg) tính theo atorvastatin

Chuột chết trong thử nghiệm và chuột sống sau 14 ngày được mổ, quan sát đại thểcho thấy không có sự thay đổi về đại thể ở tất cả chuột thử nghiệm

 Liều quy đổi sang người: = 0,094 g/kg [40]

 Liều trung bình tính trên người trưởng thành nặng 60 kg: 0,094 x 60 = 5,64 g;cao gấp 70,5 lần liều tối đa của atorvastatin là 80 mg/ngày

3.2 TÁC ĐỘNG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID HUYẾT TRÊN MÔ HÌNH TĂNG LIPID CẤP TRÊN CHUỘT NHẲT

Kết quả minh họa ở các Hình 3-5

Bảng 9 Kết quả đo lipid máu

(mg/dL)

TC (mg/dL)

LDL-C (mg/dL)

HDL-C (mg/dL)

Hình 3 Nồng độ triglycerid ở các lô

Hình 4 Nồng độ cholesterol toàn phần ở các lô

Hình 4 Nồng độ LDL-C ở các lô

Hình 5 Nồng độ HDL-C ở các lô

Tỷ lệ % thay đổi các chỉ số lipid máu ở lô dùng thuốc đối chiếu và lô dùng thuốcthử nghiệm so với lô chứng bệnh được trình bày ở Bảng 10

Bảng 10 Tác động của thuốc đối chiếu và thuốc thử trên lipid máu thông qua

tỷ lệ % làm thay đổi các chỉ số lipid máu so với lô chứng bệnh

SMEDDS-atorvastatin 30 mg/kg -41,11% -21,14% -37,68% +98,50%Thuốc đối chiếu

Nhận xét:

Kết quả thu được cho thấy lô chứng bệnh có nồng độ triglycerid, cholesterol toànphần và LDL-C tăng và HDL-C giảm đáng kể so với lô sinh lý (p < 0,01); cụ thểnồng độ triglycerid tăng 13,41 lần; cholesterol toàn phần tăng 2,58 lần; LDL-C tăng2,75 lần và HDL-C giảm 4,20 lần Điều đó cho thấy việc tiêm tĩnh mạch tyloxapolliều 250 mg/kg đã gây được tình trạng tăng lipid huyết cấp trên mô hình chuột nhắt

So với lô chứng bệnh, lô tá dược SMEDDS ứng liều chứa 60 mg/kg có nồng độtriglycerid và HDL-C khác biệt không ý nghĩa (p > 0,05), cholesterol toàn phầntăng 1,34 lần và LDL-C giảm 1,22 lần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05); trong khi ở lô

tá dược SMEDDS ứng với liều 30 mg/kg, các chỉ số lipid khác biệt không có ýnghĩa so với lô chứng bệnh (p > 0,05) Điều này có thể giải thích là do trong thànhphần tá dược nền sử dụng để tạo SMEDDS có một số chất thuộc nhóm tá dược lipidnhư capryol 90 (propylenglycol mono caprylat, trong đó caprylat là acid béo) vàcremophor RH40 là polyethylen glycol 40 hydrogennat castor oil về bản chất là dầuthực vật lấy từ cây thầu dầu, chứa 90% acid béo Tuy nhiên, đến này chưa có tài

liệu báo cáo về ảnh hưởng của tá dược hệ SMEDDS lên chuyển hóa của cơ thể nóichung cũng như các chỉ số về lipid huyết nói riêng Do đó, cần nghiên cứu thêm vềảnh hưởng của tá dược SMEDDS cũng như liều giới hạn để tránh ảnh hưởng của tádược lên các chỉ số lipid huyết cũng như hiệu quả điều trị.

Ở lô SMEDDS atorvastatin liều 60 mg/kg, nồng độ triglycerid và cholesterol toànphần giảm đáng kể so với lô tá dược tương ứng (p < 0,01) So với lô chứng bệnh,nồng độ triglycerid giảm 62,54% (p < 0,05); cholesterol toàn phần giảm 47,82% (p

< 0,01), LDL-C giảm 38,79% (p < 0,01) và HDL-C tăng 50,41% (p < 0,01) Vớicùng liều 60 mg/kg, thuốc đối chiếu làm giảm 45,06% nồng độ triglycerid, 27,46%LDL-C và tăng 49,28% HDL-C (p < 0,01); làm giảm 16,55% cholesterol toàn phầnnhưng không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p > 0,05)

Ở liều cho uống 30 mg atorvastatin/kg, thuốc SMEDDS làm giảm 41,11% nồng độtriglycerid, 21,14% cholesterol toàn phần, 37,68% LDL-C và tăng 98,50% HDL-C

so với lô chứng bệnh (p < 0,01) trong khi thuốc Lipitor làm giảm 28,13% nồng độtriglycerid, 10,13% cholesterol toàn phần, 23,81% LDL-C và tăng 120,01% nồng

độ HDL-C so với lô chứng bệnh (p < 0,01)

Như vậy, với cùng một liều cho uống, dạng thuốc SMEDDS thể hiện tác dụng giảmnồng độ triglycerid cao gấp khoảng 1,4 lần (p > 0,05) và giảm cholesterol toàn phầncao gấp 2,0 đến 2,9 lần (p < 0,05), giảm LDL-C gấp khoảng 1,5 lần (p > 0,05) sovới thuốc đối chiếu Lipitor trong khi tác dụng làm tăng HDL-C khác biệt khôngđáng kể (p > 0,05) Khi cùng giảm ½ liều cho chuột uống (từ 60 mg/kg xuống 30mg/kg), tác dụng lên các chỉ số lipid đều bị ảnh hưởng, trong đó ảnh hưởng nhiềunhất là cholesterol toàn phần và HDL-C Cụ thể, đối với thuốc SMEDDS, ở liều 30mg/kg tác dụng hạ triglycerid giảm 34%, hạ cholesterol toàn phần giảm 56%, tácdụng hạ LDL-C chỉ giảm 3% và tác dụng tăng HDL-C tăng 95% so với liều 60mg/kg Đối với thuốc Lipitor, ở liều 30 mg/kg tác dụng hạ triglycerid giảm 38%, hạcholesterol toàn phần giảm 39%, tác dụng hạ LDL-C giảm 13% và tác dụng tăngHDL-C tăng 143% so với liều 60 mg/kg Đặc biệt, tác dụng trên các chỉ số lipid củadạng SMEDDS liều 30 mg/kg tương đương với Lipitor liều 60 mg/kg (p > 0,05)