HỒ CHÍ MINHBÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI TOÀN VĂN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA ARID1A AT-RICH INTERACTIVE DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 1A TRÊN DÒNG TẾ BÀO RAW
Trang 1BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA ARID1A (AT-RICH
INTERACTIVE DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 1A) TRÊN DÒNG TẾ BÀO RAW 264.7 DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA THUỐC
Trang 2BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA ARID1A (AT-RICH
INTERACTIVE DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 1A) TRÊN DÒNG TẾ BÀO RAW 264.7 DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA THUỐC
ARTESUNATE (ART)
Mã số:
Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên)
Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019
.
.
Trang 4MỤC LỤC
DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC HÌNH iii
DANH MỤC BẢNG iii
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU iv
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4
1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm 4
2 Đối tượng và vật liệu 4
3 Phương pháp thí nghiệm 4
3.1 Nuôi cấy tế bào 4
3.2 Khảo sát độc tính tế bào của ART 4
3.3 Thiết kế mồi 4
3.4 Tách chiết RNA 5
3.5 SYBR Green Real-time RT PCR 5
3.6 Nhuộm Cresyl Violet kiểm tra sự thay đổi hình thái tế bào dưới tác động của thuốc ART 5 3.7 Phân tích dữ liệu 6
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 7
1 Độc tính tế bào của thuốc ART 7
2 Hiệu chuẩn mồi 8
3 Biểu hiện mRNA của gen ARID1A 8
4 Sự thay đổi hình thái tế bào dưới tác động của thuốc ART 9
CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN 11
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 13
Tài liệu tham khảo 14
.
.
Trang 5DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ARID1A AT-rich interactive domain-containing protein 1A
ARID1B AT-rich interactive domain-containing protein 1B
mRNA Messenger ribonucleic acid
CDKN1A Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1A
SMAD3 Mothers against decapentaplegic homolog 3
PIK3IP1 Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1
SWI / SNF SWItch/Sucrose Non-Fermentable
RealTime RT-PCR Realtime reverse transcription polymerase chain reaction
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Độc tính tế bào của thuốc ART 7
Hình 2: Đồ thị tuyến tính cho độc tính tế bào của thuốc ART 7
Hình 3: Độ sáng của mồi ARID1A và β-actin ở nhiệt độ ủ khác nhau bằng phương pháp RT-PCR A ARID1A mồi B β-actin mồi 8
Hình 4: Biểu hiện ARID1A 9
Hình 5: Sự thay đổi hình thái của tế bào khi tiếp xúc với các nồng độ ART khác nhau A: điều kiện bình thường B, C, D: tế bào được ủ ở 3, 5, 50 μM, (40X) 9
Hình 6: Hình thái của tế bào RAW 264,7 theo nồng độ ART khác nhau sau 48 giờ A: RAW 264,7 tế bào ở điều kiện bình thường B, C, D: RAW 264,7 tế bào được ủ ở 3, 5, 50 μM, (40X)10 DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Trình tự mồi cho gene ARID1A và gene chứng nội 5
.
.
Trang 6NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CỦA ARID1A (AT-RICH INTERACTIVE
DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 1A) TRÊN DÒNG TẾ BÀO RAW 264.7 DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦATHUỐC ARTESUNATE (ART)
2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:
Họ và tên: Võ Văn Thành Niệm
Ngày, tháng, năm sinh: 26/11/1990 Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Không
Chức danh khoa học: Không Chức vụ: Nghiên cứu viên
Điện thoại: Tổ chức: (+84-28) 3855 8411 Nhà riêng: Không
Mobile: 0938512888
Fax: Không E-mail: thanhniem2611@ump.edu.vn
Tên tổ chức đang công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Địa chỉ tổ chức: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM
Địa chỉ nhà riêng: 306/20 Quốc lộ 50, thị trấn Cần Giuộc, huyện Cần Giuộc, tỉnh LongAn
3 Tổ chức chủ trì nhiệm vụ (1)
:
Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Điện thoại: (+84-28) 3855 8411 Fax: (+84-28) 3855 2304
E-mail: daihocyduoc@ump.edu.vn
Website: http://yds.edu.vn/yds2/
Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM
1 Tên Khoa hoặc Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài.
.
.
Trang 7hành phố Hồ Chí Minh
II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019
- Thực tế thực hiện: từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019
- Được gia hạn (nếu có): Không
Từ tháng… năm… đến tháng… năm…
2 Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 5 tr.đ, trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học của nhà trường: 5 tr.đ
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí(Tr.đ)
Thời gian(Tháng, năm)
Kinh phí(Tr.đ)
Trang 8- Lý do thay đổi (nếu có):
3 Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:
Nội dung tham gia chủ yếu
Sản phẩm chủ yếu đạt được
Ghi chú*
1
2
- Lý do thay đổi (nếu có):
4 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể
Nội dung tham gia chính
Sản phẩm chủ yếu đạt được
Ghi chú*
1 Võ Văn Thành
Niệm
Võ Văn ThànhNiệm
Chủ nhiệm đềtài
Trang 9- Lý do thay đổi (nếu có):
7 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước
Theo kếhoạch
Thực tế đạtđược
6 Khuếch đại gene ARID1A 1-2 /2019 1-2 /2019
7 Kiểm tra sự thay đổi hình thái 2-3/2019 2-3/2019
8 Viết báo cáo và tiến hành nghiệm
- Lý do thay đổi (nếu có):
III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI
.
.
Trang 10(Tạp chí, nhà xuất bản)
Theo
kế hoạch
Thực tếđạt được1
2
- Lý do thay đổi (nếu có):
d) Kết quả đào tạo:
.
.
Trang 11Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
- Lý do thay đổi (nếu có):
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:
Số
TT
Tên sản phẩm đăng ký
(Thời gian kết thúc)
Theo
kế hoạch
Thực tếđạt được1
2
- Lý do thay đổi (nếu có):
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)
3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:
.
.
Trang 12Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)
I Báo cáo tiến độ
Trang 13MỞ ĐẦU
ARID1A là một tác nhân ức chế khối u với các chức năng liên quan đến cả caretaker vàgatekeeper Vì vậy, bất hoạt ARID1A thông qua đột biến sinh dưỡng và các cơ chế ngoại ditruyền (epigenetics) khác dẫn đến mất cả hai chức năng gatekeeper và caretaker trong các tế bào,
từ đó thúc đẩy hình thành khối u Phức hợp SWI/SNF được biết là có vai trò thúc đẩy quá trìnhbiệt hóa cuối cùng của tế bào và ức chế tái tạo mô ARID1A là một tiểu phần của phức hợpSWI/SNF, liên kết trực tiếp với DNA và sự mất ARID1A trong tế bào sẽ làm phá vỡ hoạt độngđiều hòa các gen mục tiêu và biến đổi nucleosome của phức hợp này dẫn đến bất thường trongđiều hòa biểu hiện gen Giảm mức độ phiên mã hoặc mất biểu hiện protein được đánh giá ở một
số loại ung thư như: ung thư buồng trứng, ung thư cổ tử cung, ung thư vú, và ung thư ruột kết Ởung thư buồng trứng, 15% khối u mất biểu hiện ARID1A có ý nghĩa tương quan với giai đoạnmuộn và thời gian sống ngắn hơn đối với các bệnh nhân được hóa trị Mất biểu hiện ARID1Alàm tăng nguy cơ tái phát và tử vong ở những bệnh nhân ung thư khi điều chỉnh những yếu tốgây nhiễu Do đó, gen ARID1A được xem như một mục tiêu tiềm năng quan trọng cho y học cáthể trong việc điều trị ung thư Artemisinin là một loại sesquiterpene tự nhiên chiết xuất từ câythuốc thảo mộc ART là dẫn xuất tan trong nước và cũng cho thấy độc tính tế bào đối với mộtloạt các dòng tế bào ung thư bao gồm ung thư bạch cầu, u ác tính, ung thư vú, buồng trứng,tuyến tiền liệt và ung thư thận Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu biểu hiệnARID1A ở mức mRNA trong điều trị ART bằng RT-qPCR Độc tính của thuốc ART được sosánh với tế bào đơn nhân từ máu chuột để kiểm tra xem thuốc có tác dụng chống ung thư hiệuquả trên tế bào ung thư hay không Ngoài ra, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng gen ARID1A cóthể làm tăng đáng kể biểu hiện do hoạt động của thuốc ART Đồng thời, chúng tôi quan sát hìnhthái thay đổi trong RAW 264.7 tế bào thông qua tăng biểu hiện ARID1A
.
.
Trang 14CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Gen ARID1A (AT-rich interactive domain-containing protein 1A) cũng được gọi làBAF250a, P270, B120 và SMARCF1, chiều dài sản phẩm của nó xấp xỉ 86.080 cặp base với 20exon Ngoài ra, ARID1A thuộc về một thành viên cốt lõi của phức hợp SWI / SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable) Một số tiểu đơn vị SWI / SNF, chẳng hạn như BAF155,BAF250a / b (ARID1A / B) và BRG1 được báo cáo là ảnh hưởng đến việc tự gia hạn và phânhóa ở nhiều mô và tế bào gốc phôi (ES) [1, 2] ARID1A có thể được biểu hiện trong nhiều môbình thường; tuy nhiên đột biến ARID1A có thể làm giảm mức biểu hiện[3] Hơn nữa, ARID1Anằm trên nhiễm sắc thể 1p36.11, nơi thường được phát hiện trong ung thư[4] Khi đột biếnARID1A xảy ra, nó có thể dẫn đến sự thay đổi rất nhiều gen (CDKN1A, SMAD3, MLH1 vàPIK3IP1) bởi vì nó bị mất chức năng chuyển hóa nhiễm sắc thể và có thể gây ung thư[5] Hầuhết các đột biến ARID1A là dịch khung hoặc vô nghĩa Đôi khi, đó là hai điểm "điểm nóng" độtbiến Thứ nhất, đột biến xảy ra xung quanh tín hiệu xuất của hạt nhân sao cho protein ARID1A
bị giảm Thứ hai, đột biến ảnh hưởng đến sự tương tác giữa ARID1A và các tiểu đơn vị khác củaphức hợp SWI / SNF Kết quả là, nó có thể bị mất cân bằng phức tạp [6, 7] Đồng thời, nhiềunghiên cứu đã được tìm thấy rằng biểu hiện ARID1A có thể được giảm hoặc bị mất trong cácbệnh ung thư khác nhau Đặc biệt, một số bài báo về sự biểu hiện của mRNA và protein củaARID1A ở nhiều khối u chỉ ra rằng 6% của 236 khối u bị giảm mức phiên mã và lớn hơn 30%khối u phổi bị giảm biểu hiện ARID1A[8] Mặt khác, các tế bào ung thư được di căn và tiênlượng xấu khi biểu hiện của mRNA và protein của ARID1A bị giảm[9] Vì lý do này, nhiều nhànghiên cứu cho rằng ARID1A đóng vai trò là một gen ức chế ung thư
Thuốc artesunate (ART) là một loại thuốc được gọi là Artemisinin là một loạisesquiterpene tự nhiên chiết xuất từ cây thuốc thảo mộc của Trung Quốc Artemisia annua L.ART đã được sử dụng để điều trị sốt rét với sự chấp thuận của chính phủ Trung Quốc, đặc biệt làchống sốt rét não[10] ART là dẫn xuất tan trong nước và cũng cho thấy độc tính tế bào đối vớimột loạt các dòng tế bào ung thư bao gồm ung thư bạch cầu, u ác tính, ung thư vú, buồng trứng,tuyến tiền liệt và ung thư thận [11, 12] Hơn nữa, có một lượng lớn các báo cáo về cơ chế tácdụng của ART đối với các tế bào ung thư, chẳng hạn như cảm ứng tổn thương DNA oxy hóa; ứcchế sự hình thành mạch máu[13]; và cảm ứng apoptosis[14] Tương tự như vậy, một số nghiêncứu khẳng định rằng ART có thể gây ra sự khác biệt trong ống nghiệm cũng[15] Các nghiên cứutrước đây đã tiết lộ rằng ART có thể ức chế sự tăng sinh tế bào và ức chế sự hình thành mạch
.
.
Trang 15máu trong các dòng tế bào khối u trong ống nghiệm và in vivo như ung thư vú, ung thư phổi, ungthư ruột kết, ung thư tuyến tụy và ung thư biểu mô tế bào gan[16, 17] Tuy nhiên, có rất ít thôngtin có sẵn về tác dụng chống ung thư / khối u của ART trên vi rút bệnh bạch cầu do Abelson gây
ra Vì vậy, trong nghiên cứu của tôi, chúng tôi đã kiểm tra tác dụng chống ung thư / khối u củaART trên vi rút bệnh bạch cầu do Abelson gây ra
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu biểu hiện ARID1A ở mức mRNA trongđiều trị ART bằng RT-qPCR Độc tính của thuốc ART được so sánh với tế bào đơn nhân từ máuchuột để kiểm tra xem thuốc có tác dụng chống ung thư hiệu quả trên tế bào ung thư hay không.Ngoài ra, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng gen ARID1A có thể làm tăng đáng kể biểu hiện dohoạt động của thuốc ART Đồng thời, chúng tôi quan sát hình thái thay đổi trong RAW 264.7 tếbào thông qua tăng biểu hiện ARID1A Vì những lý do trên chúng ta có thể kết luận rằng thuốcART không chỉ khuyến khích thuốc chống ung thư hiệu quả mà còn góp phần vào sự phân biệt tếbào trên RAW 264.7 tế bào khi biểu hiện gen ARID1A tăng lên
.
.
Trang 16CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm
Nghiên cứu được thực hiện trong phòng thí nghiệm Thần kinh học và Liệu pháp miễndịch, Trung tâm Sinh học phân tử tại Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
2 Đối tượng và vật liệu
Dòng tế bào Tế bào RAW 264,7 là quà tặng từ các đối tác nước ngoài của phòng thínghiệm
3 Phương pháp thí nghiệm
3.1 Nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào được sử dụng trong nghiên cứu này là RAW 264,7 (ATCC) được tăng trưởngthường xuyên ở mức 5% CO2-95% không khí ở 37oC trong DMEM chứa 10 mM glucose vàđược bổ sung 10% FBS, 1 mM pyruvate, HEPES 10mM, 50μM 2-mercaptoethanol, 100Upenicillin / mL và 100g streptomycin / mL trước khi thí nghiệm
3.2 Khảo sát độc tính tế bào của ART
Tế bào RAW 264,7 được cấy trên đĩa 96 giếng với mật độ 6x104 tế bào / giếng và nuôicấy trong 24h Sau đó, môi trường nuôi cấy được thay thế bằng nhiều nồng độ thuốc Artesunate(ART) từ 80 μM đến1μM trong 24h Tiếp theo 20μL dung dịch MTS / PMS được cho mỗigiếng và ủ trong 3 giờ ở 37oC Độ hấp thụ được ghi nhận ở bước sóng 490nm và bước sóngtham chiếu là 630nm sử dụng máy đọc ELISA (Biotek)
Trong đó:
OD490e: giá trị mật độ quang của mẫu có thuốc
OD490b: giá trị mật độ quang của mẫu trống
Tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót càng thấp, độc tính tế bào của mẫu thử càng cao
3.3 Thiết kế mồi
.
.
Trang 17Cặp mồi đặc hiệu cho cDNA của gen ARID1A và β-actin (chứng nội) được thiết kế bằngCLC Main Workbench 5.5 Độ đặc hiệu của mồi được kiểm tra bằng Primer-BLAST, reversetranscription PCR (RT-PCR) và xác định lại bằng phân tích nhiệt độ nóng chảy
Bảng 1 Trình tự mồi cho gene ARID1A và gene chứng nội
3.5 SYBR Green Real-time RT PCR
Mẫu cDNA chạy Real-time PCR bằng SYBR Green I Takara kit sử dụng máyMasterCycler® RealPlex (Eppendorf, Đức) Khuếch đại theo chu trình nhiệt biến tính 10 phút ở95oC, sau đó chảy 40 chu kỳ với biến tính 5 giây ở 95oC và bắt cặp/kéo dài trong vòng 1 phút ở58oC Kết quả được phân tích theo phương pháp 2^-Ct của Livak
ΔΔCT = (CT ARID1A - CT β-actin) tế bào RAW 264.7– (CT ARID1A - CT β-actin) tếbào đơn nhân thu từ máu chuột
.
.
Trang 19CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
1 Độc tính tế bào của thuốc ART
Tế bào RAW 264,7 được xử lý với các nồng độ khác nhau của ART sau 24 giờ và ủ vớihỗn hợp MTS/PMS trong 3 giờ ở 37oC Tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót sau khi xử lý với cácnồng độ của ART được biểu thị trong Hình 1 Giá trị IC50 của ART được xác định là 7μM trên
đồ thị đường cong tuyến tính Hình 2, (P <0,0001)
Hình 1: Độc tính tế bào của thuốc ART
Hình 2: Đồ thị tuyến tính cho độc tính tế bào của thuốc ART
y = -16.67ln(x) + 91.082R² = 0.9466
0102030405060708090100
Trang 202 Hiệu chuẩn mồi
Để tìm nhiệt độ lai ủ tối ưu cho các mồi của gene ARID1A và β-actin , chúng tôi đã thửnghiệm một loạt nhiệt độ trên và dưới mức Tm của mồi từ 49oC đến 60o
C Tất cả các nhiệt độđều tạo ra sản phẩm nhưng ở nhiệt độ 49o
C, cả 2 mồi đều cho sản phẩm là 2 băng sáng rõ nhất ở
vị trí 376 bp tương ứng cho gene ARID1A và 329 bp cho gene β-actin (Hình 3) Do đó 49oC lànhiệt lai độ tối ưu được lựa chọn cho cả hai mồi để tiến hành các thí nghiệm sau
Hình 3: Độ sáng của mồi ARID1A và β-actin ở nhiệt độ ủ khác nhau bằng phương pháp
RT-PCR A ARID1A mồi B β-actin mồi
3 Biểu hiện mRNA của gen ARID1A
Biểu hiện gene ARID1A giữa lô đối chứng và lô thử thuốc được xác định bằng kỹ thuậtRT-qPCR Cụ thễ tế bào được xử lý với ba nồng độ ART: 3μM, 7μM và 50μM và so sánh biểuhiện với mẫu đối chứng không xử lý thuốc Các nồng độ khác nhau của ARTgây ra một thay đổiđáng kể trong biểu hiện gen ARID1A Biểu hiện ARID1A tăng dần tương ứng với sự tăng nồng
độ ART
.
.