Nghiên cứu bào chế tiểu phân micro tích hợp từ các tiểu phân nano mang thuốc kháng lao isoniazid phân phối trực tiếp đến phổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ---MAI THANH DIỆN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN MICRO TÍCH HỢP TỪ CÁC TIỂU PHÂN NANO MANG THUỐC KHÁNG LAO ISONIAZID PHÂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-MAI THANH DIỆN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN MICRO TÍCH HỢP TỪ CÁC TIỂU PHÂN NANO MANG THUỐC KHÁNG LAO ISONIAZID PHÂN PHỐI TRỰC TIẾP ĐẾN PHỔI

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-MAI THANH DIỆN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN MICRO TÍCH HỢP TỪ CÁC TIỂU PHÂN NANO MANG THUỐC KHÁNG LAO ISONIAZID PHÂN PHỐI TRỰC TIẾP ĐẾN PHỔI

Ngành: Công nghệ dược phẩm – Bào chế thuốc

Mã số: 8720202

Luận văn Thạc sỹ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Đình Duy

Hồ Chí Minh – Năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Học viên

Mai Thanh Diện

TÓM TẮT

Mục đích: Điều chế được các tiểu phân micro mang các tiểu phân nano chứa INH

phân phối trực tiếp đến phối với những đặc tính phù hợp

Phương pháp nghiên cứu

Tối ưu hóa công thức điều chế tiểu phân nano chứa INH, sử dụng phần mềm Design– Expert, mô hình thực nghiệm Taguchi L9, với 4 biến số độc lập (nồng độ INH, dungmôi hữu cơ, tỉ lệ INH:PLGA và nồng độ PVA) Xác định công thức tối ưu bằng phântích phương sai và phân tích sự ảnh hưởng của các biến độc lập tới các biến phụ thuộc

Sử dụng công thức tối ưu để nghiên cứu cải thiện hiệu suất bắt giữ (EE) và khả năngtải thuốc (DL), sử dụng HP-β- cyclodextrin, gelatin và chitosan Khảo sát khả năngphóng thích, xác định cơ chế phóng thích của hệ tiểu phân nano

Điều chế tiểu phân Trojan bằng phương pháp phun sấy Các công thức phun sấy đượckhảo sát các đặc tính như: hình thể học, XRD, IR, DSC, khả năng phóng thích và đặctính khí động học

Kết quả và bàn luận

Phần mềm Design-Expert đề xuất công thức tối ưu với chỉ số mong muốn 0,95 và cácthông số sau: nồng độ INH 1%, tỉ lệ INH:PLGA = 1:2,5, dung môi hữu cơ là EA vànồng độ PVA 0,5% Thực nghiệm kiểm chứng (n = 3) cho thấy sự phù hợp với giá trị

xạ tia X, phổ DSC và phổ IR cho thấy sự tương tác giữa INH với các thành phầntrong công thức và INH tồn tại ở trạng thái vô định hình

Kết luận: Nghiên cứu điều chế được tiểu phân Trojan mang INH với các đặc tính lí

hóa và đặc tính khí động học phù hợp, là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu cải tiến

Purpose: Prepare microparticles with nanoparticles containing INH distributed

directly to the lungs with appropriate properties

Methods

Optimize the formula for preparing nanoparticles containing INH, using Design Expert software, the experimental model of Taguchi L9, with 4 independent variables(INH concentration, type of organic solvent, INH:PLGA ratio and PVAconcentrations) Determine the optimal formula by analyzing variance and analyzingthe effect of independent variables on the dependent variables

-Optimal formulation is used to improve the entrapment efficiency (EE) and drugloading (DL), with the addition of HP-β-cyclodextrin, gelatin and chitosan.Investigate the ability to release, determine the release mechanism of nanoparticles.Preparation of Trojan particles by spray-drying method Spray-drying formulas wereinvestigated for features such as: geometry, XRD, IR, DSC, drug release capacity andaerodynamic properties

Results and discussion

Design-Expert software proposes an optimal formula with a desirability value was0.95 and the following parameters: INH concentration of 1%, INH:PLGA ratio = 1:2.5, PLGA solvent is EA and 0.5% PVA Experimental verification (n = 3) showedthe conformity with the predicted value of the software

Gelatin significantly improved EE, formula 15 with gelatin 150 bloomconcentration 9% showed best EE, reached 26,5 ± 2.5%

All formulations has an INH release good and follows the Higuchi model

Spray drying process created Trojan particles with low performance, porous particles;SEM images showed nanoparticles on the surface of Trojan Formulations with leucinconcentrations of 1.6 g/l, showed appropriate aerodynamic properties for drugdelivery into the lungs According to X-ray diffraction spectrum, DSC spectrum and

IR spectrum, we can realize the interaction between INH and the components in the

Conclusion: The study has prepared the INH-carrying Trojan particles with

appropriate physicochemical and aerodynamic properties, which is the basis forfurther improvement researchs

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG ix

BẢNG DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh lao và hóa trị liệu hiện nay 3

1.2 Isoniazid 7

1.3 Hệ thống phân phối thuốc đến phổi trong điều trị lao 9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Tối ưu hóa công thức hệ tiểu phân nano PLGA chứa INH 36

3.2 Cải thiện hiệu suất bắt giữ và khả năng tải thuốc của tiêu phân nano 41

3.3 Khảo sát sự phóng thích hoạt chất của hệ tiểu phân 43

3.4 Kết quả điều chế tiểu phân Trojan mang tiểu phân nano chứa INH 47

3.5 Khảo sát tính chất khí động học của bột khô hít 50

3.6 Khảo sát khả năng phóng thích tiểu phân nano, IR, XRD và DSC của tiểu phân Trojan 51

3.7 Khảo sát khả năng phóng thích của INH của tiểu phân nano trong Trojan 54

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 57

4.1 Tối ưu hóa công thức hệ tiểu phân nano PLGA chứa INH 57

4.2 Cải thiện hiệu suất bắt giữ và khả năng tải thuốc của tiêu phân nano 59

4.3 Khảo sát sự phóng thích hoạt chất của hệ tiểu phân 60

4.4 Kết quả điều chế tiểu phân trojan mang tiểu phân nano chứa INH 61

4.5 Khảo sát tính chất khí động học của bột khô hít 62 4.6 Khảo sát khả năng phóng thích tiểu phân nano, IR, XRD và DSC của tiểu

4.7 Khảo sát khả năng phóng thích của INH trong mẫu Trojan 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các quốc gia thuộc ba nhóm có nhiều gánh nặng về bệnh lao (TB), bệnh

lao đa đề kháng (MDR-TB), bệnh lao đồng thời nhiễm HIV (TB/HIV) 5

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Isoniazid 7

Hình 1.3 Ví dụ dạng cấu trúc của tiểu phân nano PLGA [19] 11

Hình 1.4 Cấu tạo của tiểu phân Trojan 13

Hình 1.5 Các giai đoạn phóng thích hoạt chất của tiểu phân Trojan 13

Hình 1.6 Mối liên quan giữa kích thước tiểu phân và sự lắng đọng tại phổi 14

Hình 1.7 Mô hình dụng cụ Andersen Cascade Impactor (a) và ống hít (b) 15

Hình 1.8 Cơ chế hoạt động của dụng cụ Andersen Cascade Impactor 16

Hình 2.9 Quy trình điều chế tiểu phân nano mang INH 23

Hình 2.10 Quy trình điều chế tiểu phân nano nhằm cải tiến hiệu suất bắt giữ 29

Hình 2.11 Quy trình nâng cấp cỡ lô điều chế tiểu phân nano PLGA mang INH 31

Hình 2.12 Quy trình điều chế tiểu phân micro tích hợp tiểu phân nano tải INH 33

Hình 3.13 Ảnh hưởng của các biến số độc lập đến kích thước tiểu phân 37

Hình 3.14 Ảnh hưởng của các biến số độc lập đến PDI 38

Hình 3.15 Ảnh hưởng của các biến số độc lập đến thế zeta 39

Hình 3.16 Sự tương quan giữa giá trị dự đoán và giá trị thực tế của các biến phụ thuộc Y1, Y2 và Y3 40

Hình 3.17 % INH phóng thích theo thời gian của các công thức 14, 15, 16, 18 43

Hình 3.18 Hình chụp TEM của tiểu phân nano PLGA công thức 15 46

Hình 3.19 Hình chụp SEM của CT0 48

Hình 3.20 Hình chụp SEM 4 công thức phun sấy 49

Hình 3.21 Tổng hợp khảo sát tính chất khí động học của các công thức 50

Hình 3.22 Hình chụp TEM của tiểu phân Trojan 51

Hình 3.23 XRD của bột khô hít mang INH, INH tinh thể và mẫu trộn vật lý 52

Hình 3.24 Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) của mẫu bột phun sấy, INH tinh khiết và mẫu trộn vật lý 53

Hình 3.26 Kết quả %INH phóng thích mẫu bột khô hít và công thức nano 55 Hình 3.27 Đồ thị các phương trình động học mẫu bột khô hít 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phác đồ điều trị lao cho người trường thành mới mắc 6

Bảng 1.2 Tiểu phân nano tải thuốc kháng lao đã được nghiên cứu 10

Bảng 2.3 Bảng thông số kích thước tiểu phân Trojan tại từng đĩa 15

Bảng 2.4 Danh mục nguyên vật liệu cần sử dụng 19

Bảng 2.5 Danh mục thiết bị sử dụng 20

Bảng 2.6 Thiết kế thực nghiệm theo mô hình Taguchi L9 26

Bảng 2.7 Các công thức nhằm cải thiện hiệu suất bắt giữ của hệ tiểu phân nano mang INH 28

Bảng 2.8 Hướng dẫn tính khối lượng tích lũy của bột 35

Bảng 3.9 Mô hình thực nghiệm Taguchi L9 36

Bảng 3.10 Kết quả phân tích phương sai 37

Bảng 3.11 Kết quả đo các mẫu được chọn sau khi thử tối ưu 41

Bảng 3.12 Các công thức cải thiện hiệu suất bắt giữ của hệ tiểu phân nano mang INH 42

Bảng 3.13 Kích thước và PDI hệ tiểu phân của 1 số công thức cải thiện EE, DL 42

Bảng 3.14 % INH phóng thích của 4 công thức thử nghiệm (n=3) 44

Bảng 3.15 R2 dữ liệu phóng thích INH công thức 14, 15, 16 và 18 45

Bảng 3.16 Bảng thống kê các thông số của các công thức 14, 15, 16 và 18 45

Bảng 3.17 Kết quả điều chế lặp lại công thức 15 46

Bảng 3.18 So sánh các thông số giữa quy trình gốc và quy trình nâng cấp 47

Bảng 3.19 Nồng độ các chất phun sấy tạo tiểu phân Trojan 47

Bảng 3.20 Hiệu suất phun sấy tạo tiểu phân Trojan 48

Bảng 3.21 Giá trị đặc tính khí động học của các công thức bột khô hít 50

Bảng 3.22 Kết quả phóng thích của mẫu bột khô hít 55

BẢNG DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

10 FPF Fine particle fraction Phần hạt mịn

11 FI-IR Fourrier Transformation

18 MWCO Molecular weight cut off Chọn lọc khối lượng phân tử

21 PBS Phosphate buffer saline

22 PDI Polydispertion index Chỉ số phân tán

23 PLGA Poly (lactide-co-glycolide

acid)

24 PVA Polyvinyl alcolhol

tiểu phân nano

MỞ ĐẦU

Bệnh lao là một trong những thảm họa lớn nhất trong suốt chiều dài lịch sử nhân loại

Sự hiểu biết về sinh bệnh học của bệnh lao bắt đầu với công việc của Laophec đầuthế kỷ XIX, phát triển bằng chứng minh sự lây nhiễm của vi khuẩn lao bởi JeanAntoine Villemin năm 1865 và sự xác định của trực khuẩn lao với tên khoa học

Mycobacterium tuberculosis là tác nhân bệnh lý của Robert Koch vào năm 1882 [34].

Hiện nay, bệnh lao vẫn là một vấn đề lớn trong cộng đồng, đặc biệt tại các quốc giađang phát triển Theo WHO, năm 2017, có khoảng 10 triệu ca mắc mới và 1,6 triệungười chết do lao, trong đó có 0,3 triệu người nhiễm HIV, chủ yếu tập trung ở một sốquốc gia đang phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia… khiến cho thế giớiphải chi ra 3,5 tỷ đô la Mỹ cho phòng và trị bệnh Tỉ lệ vi khuẩn lao đa kháng thuốccũng gia tăng nhanh chóng, với khoảng 558.000 ca năm 2017, ảnh hưởng lớn đếnviệc điều trị bệnh lao [4], [ 12], [ 37]

Để điều trị lao, không dùng đơn lẻ các thuốc trị lao mà dùng thuốc theo phác đồ Cácphác đồ điều trị bệnh lao thường kéo dài 6 – 9 tháng, sau đó duy trì tới 1 – 2 năm và

có thể lên tới 36 tháng Đây là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến tình trạngkhông tuân thủ phác đồ điều trị, dẫn đến tình trạng đa đề kháng [10]

Isoniazid (INH) là một trong những thuốc kháng lao quan trọng, được kết hợp vớicác thuốc khác trong hầu hết các phác đồ trị lao hiện nay INH có hiệu quả tốt và ítđộc tính, ít tác dụng phụ hơn một số thuốc kháng lao khác như aminosalicylic acid,capreomycin, ethionamid Do vậy, nó được sử dụng kết hợp với các thuốc kháng laokhác để điều trị lao kể cả lao đa kháng thuốc Ngoài ra, INH còn dùng để phòng ngừalao khi dùng đơn trị liệu [2], [ 4]

Một hướng điều trị mới được đề xuất là đưa thuốc vào cơ thể trực tiếp tới phổi theođường hô hấp thay vì đường uống hoặc tiêm Cụ thể là nghiên cứu dạng bột khô xônghít phân phối thuốc dạng khí dung để điều trị lao phổi Trong đó dạng bột thuốc gồmnhững hạt micro tích hợp từ các tiểu phân nano mang thuốc kháng lao phân phối trựctiếp đến phổi được quan tâm phát triển Khi các hạt bột kích thước micro được phânphối tới phế nang phổi thì các tiểu phân nano mang thuốc trị lao được phóng thích và

được thực bào bởi các đại thực bào, từ đó thuận lợi cho việc đưa thuốc trực tiếp vàotrong các tế bào nhiễm lao, giúp tăng nồng độ thuốc tại mô bệnh, cải thiện hiệu quảđiều trị, giảm đi độc tính và tăng khả năng tuân thủ cho bệnh nhân Điều chế tiểuphân micro mang tiểu phân nano chứa INH là 1 trong các phương án cải tiến việcđiều trị sử dụng INH.

Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu điều chế tiểu phân micro tích hợp từ các tiểu phân nano mang thuốckháng lao Isoniazid (INH), có thể phân phối thuốc trực tiếp đến phổi hiệu quả

Mục tiêu cụ thể

- Điều chế được tiểu phân nano PLGA chứa INH với các đặc tính phù hợp về: phân

bố kích thước tiểu phân, thể zeta, hiệu suất bắt giữ, khả năng phóng thích

- Điều chế được tiểu phân micro tích hợp từ các tiểu phân nano chứa INH và khảo sátđược các đặc tính của tiểu phân micro điều chế được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh lao và hóa trị liệu hiện nay

Bệnh lao, có nguồn gốc từ Đông Phi, là một căn bệnh, một tai họa lớn từ thời cổ đại

Nó có nguồn gốc từ vi khuẩn Mycobacterium ulcerans xuất hiện 150 triệu năm trước.

Vào 5000 năm trước, thư tịch Ai Cập cổ đại đã lần đầu nhắc đến nó Các văn tự cổcủa Hi Lạp, Nam Mỹ cũng ghi nhận về căn bệnh này Nó ảnh hưởng đến sức khỏecon người trong suốt chiều dài lịch sử, với liên tiếp các đợt dịch xảy ra Bệnh lao khóđiều trị đến mức nó được coi là một trong nan y tứ chứng “phong, lao, cổ, lại” Hiệnnay, cùng với bùng nổ mạnh mẽ của HIV-AIDS, khả năng miễn dịch của con người

bị suy giảm nghiêm trọng, dẫn đến tỉ lệ người bị lao tiềm ẩn chuyển thành bệnh laotăng cao, gây nhiều khó khăn trong kiểm soát bệnh lao [1]

Bệnh lao là bệnh phức tạp chủ yếu do vi khuẩn lao có tên khoa học Mycobacterium

tuberculosis gây nên Mycobacterium tuberculosis là một trong 7 loài Mycobacterium

có thể gây bệnh ở người, bao gồm Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum,

Mycobacterium microti, Mycobacterium caprae, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium canetii, Mycobacterium mungi Vi khuẩn lao có kích thước 3 – 5 µm,

không có lông, hai đầu tròn, thân có hạt Chúng thường đứng riêng lẻ hay thành từngnhóm trên tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [4], [ 12]

Trực khuẩn lao vào cơ thể thông qua nhiều con đường khác nhau, song qua đường hôhấp là phổ biến nhất [2], [ 4] Bệnh nhân lao phổi khi ho, hắt hơi hoặc khi nói chuyện

sẽ tạo ra các hạt đờm rất nhỏ có chứa trực khuẩn lao lơ lửng trong không khí, phântán xung quanh người bệnh, người lành hít phải các hạt này khi hô hấp có thể bị lâynhiễm Ngoài ra, bệnh lao còn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua đường tiêu hóa(gây lao ruột), đường da, đường niêm mạc (gây lao mắt) song những con đường này

ít phổ biến Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi bằng đường máu qua tĩnhmạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính (như lao kê) hoặc qua nước ối (khi chuyển dạ), nhưngnhững con đường này càng ít gặp Tại đường hô hấp, khi trực khuẩn lao theo đường

hô hấp trên và cuống phổi vào phế nang phổi, các tế bào bảo vệ, chủ yếu là đại thựcbào, được huy động tới để tiêu diệt chúng Sự tương tác giữa vi khuẩn với đại thực

bào làm một số vi khuẩn lao bị chết Nhưng một số trực khuẩn lao không bị tiêu diệt,tiếp tục phát triển và nhân lên trong đại thực bào, tạo các nốt sần Trong đa số trườnghợp, tổn thương có thể tự khỏi và không có biểu hiện lâm sàng Đây là giai đoạn laotiềm ẩn [4] Khi hệ miễn dịch suy yếu, những nốt sần này vỡ ra, trực khuẩn lao đượcphóng thích sẽ theo bạch huyết và dòng máu đến các bộ phận khác của cơ thể Nhữngnơi mà bệnh lao thường phát triển bao gồm não, thanh quản, hạch bạch huyết, xươngsống, thận và đặc biệt là phổi Nếu trực khuẩn lao xâm nhập vào máu và lan tỏa khắp

cơ thể, chúng tạo ra vô số ổ nhiễm, trường hợp này gọi là lao kê và có tiên lượngnặng Trong vòng 2 – 12 tuần, khi trực khuẩn lao tiếp tục phát triển trong phổi, đạithực bào thực bào chúng Giai đoạn này dương tính trong phản ứng da vớiTuberculine Trực khuẩn lao được giữ trong vỏ cứng Chúng có thể tồn tại ở thể ngủbên trong đại thực bào trong nang trong nhiều năm Ở một vài người, trực khuẩn laovượt qua hệ thống miễn dịch và nhân lên rất nhanh, kết quả là từ nhiễm lao chuyểnsang bệnh lao Người bệnh lao thường truyền và phát tán vi khuẩn cho người khác.Quá trình chuyển từ nhiễm lao sang bệnh lao có thể ngay lập tức hoặc sau nhiều nămnhiễm lao Dịch cơ thể hoặc những mô tại vị trí bệnh nên được thu thập cho việc phếttìm trực khuẩn kháng cồn và kháng acid và nuôi cấy Kết quả cấy dương tính giúpxác định chẩn đoán bệnh lao Bệnh nhân lao phổi thường bị ho và X quang phổi bấtthường và có thể lây nhiễm [12]

Hiện nay, việc điều trị lao không chỉ là trị khỏi bệnh lao mà gồm nhiều mục địch khácnhau, gồm: chữa khỏi bệnh lao, ngăn ngừa tái phát bệnh lao, giảm thiểu nguy cơ tửvong và các biến chứng, phòng chống nguy cơ lây nhiễm cho cộng đồng và tránh xảy

ra tình trạng đa kháng thuốc Lúc này, các phác đồ điều trị lao được sử dụng thay vì

sử dụng các thuốc trị lao riêng lẻ Nhìn chung, trong các phác đồ, đều thực hiện theocác nguyên tắc sau: phối hợp các thuốc chống lao, dùng thuốc đúng liều, dùng thuốcđều đặn và dùng thuốc đủ thời gian theo 2 giai đoạn tấn công và duy trì Theo khuyếnnghị của Tổ chức Y tế thế giới (2011), việc điều trị lao và những trường hợp khángthuốc đòi hỏi sự kết hợp của phác đồ đa thuốc trong thời gian dài Giai đoạn đầu tiên,

với ít nhất 2 thuốc kháng lao thiết yếu, dùng hàng ngày Ở giai đoạn này, phần lớncác vi khuẩn lao bị tiêu diệt, triệu chứng diễn tiến tích cực và bệnh nhân không lâycho người khác Giai đoạn thứ hai, giai đoạn duy trì, là sự kết hợp 2 hoặc 3 thuốc đểdiệt hết các trực khuẩn lao trong tổn thương, tránh tái phát Giai đoạn tấn công thườngkéo dài 6 – 9 tháng, sau đó điều trị duy trì tới 1 – 2 năm và có thể lên tới 36 tháng.Với thời gian dài như thế, kèm theo rất nhiều tác dụng phụ của thuốc kháng lao, cácchức năng của gan và thận bị quá tải vì các tác động tích lũy của thuốc Sử dụng thuốckéo dài cũng dẫn đến tình trạng kém tuân thủ ở bệnh nhân mắc bệnh lao, gây ra đa đềkháng, tình trạng này càng nghiêm trọng hơn với sự phát triển của HIV/AIDS Tỉ lệmắc bệnh lao và đa đề kháng chủ yếu tập trung ở các nước đang phát triển, thể hiện

ở hình 1.1 [37]

Hình 1.1.Các quốc gia thuộc ba nhóm có nhiều gánh nặng về bệnh lao (TB), bệnhlao đa đề kháng (MDR-TB), bệnh lao đồng thời nhiễm HIV (TB/HIV) [37]Hiện tại, thuốc kháng lao thiết yếu gồm 5 hoạt chất: isoniazid (INH), rifampicin (RIF),pyrazinamid (PZA), ethambutol (ETB) và streptomycin (SM) Thuốc kháng lao thuộcnhóm II gồm: ethionamid (ETH) hay prothionamide, kanamycin (KM) hoặc amikacin(AMK), terizidone/cycloserin (CS), capreomycin (CAP), viomycin và para aminosalicylic acid (PAS) [31] Các thuốc nhóm II dùng khi điều trị các thuốc kháng lao

thiết yếu thất bại hoặc khi nhiễm lao đa kháng thuốc, những thuốc này ít hiệu quả,độc tính cao và thường không sẵn có do giá thành cao Gần đây có 2 thuốc mới làbedaquilin và delanamid được chấp thuận để điều trị lao đa kháng thuốc song cũngchưa được áp dụng phổ biến Các thuốc quan trọng nhất trong điều trị lao vẫn là 5thuốc kháng lao thiết yếu.

Hiện nay, chương trình chống lao quốc gia ở nước ta đang thực hiện chiến lược điềutrị lao do Tổ chức Y tế thế giới khuyến cáo là điều trị hoá trị liệu ngắn ngày có kiểmsoát trực tiếp, viết tắt DOTS (Directly Observed Treatment Short – course) [1], [ 12]

Bảng 1.1.Phác đồ điều trị lao cho người trường thành mới mắc [12]

Giai đoạn tấn công – ít nhất 2 tháng Dưới 50 kg Trên 50 kgRIF/INH/PZA/ETB

4 INH-RIF được dùng điều trị lao trẻ em, nhưng đối với thể nặng có thể bổ sung thêm

S vào giai đoạn tấn công ban đầu [1] *

* Ghi chú: các thuốc trị lao đều được viết tắt Mỗi công thức có hai giai đoạn Con số đứng trước mỗi giai đoạn là thời gian của giai đoạn đó và được tính bằng tháng Con số đứng dưới và sau thuốc là số lần dùng thuốc đó trong một tuần Nếu không có con số nào đứng dưới và đứng sau một thuốc thì thuốc đó được dùng điều trị hàng ngày Các thuốc để lựa chọn dùng thay thế được biểu thị bằng chữ cái ở trong các ngoặc đơn.

Dùng thuốc bằng đường uống dễ sử dụng, chi phí thấp Tuy nhiên phải dùng liều caokéo dài mới có tác dụng diệt khuẩn tại vị trí tổn thương, do thuốc bị chuyển hóa quagan một phần So với đường uống, đường tiêm và đường phổi có sinh khả dụng caohơn Tuy nhiên đường tiêm gây đau và cần có sự hỗ trợ của nhân viên y tế Phân phốithuốc trực tiếp bằng đường phổi hiện nay đang được quan tâm phát triển [12].

Tên khoa học: Isonicotinoylhydrazin

Tên khác: INH, Rimifon

Tính chất:

Lý tính:

Bột kết tinh trắng hay hơi có ánh vàng hoặc tinh thể không màu, không mùi, vị lúcđầu hơi ngọt sau hơi đắng

Dễ tan trong nước, khó tan trong ether và chloroform

pH trong nước với nồng độ 1% là 5,5 – 6 Trong nước nồng độ 5%, pH bằng 6 – 8.Nhiệt độ nóng chảy: 171,4 oC

Độ tan: 14% (trong nước tại 25 oC), 12,5% (trong nước tại 20 oC), 2% (trong alcoholtại 25 oC), 0,1% (trong cloroform tại 25 oC)

Hóa tính:

Nhân pyridin khá bền vững, khi đốt INH với N2CO3 khan sẽ giải phóng pyridin cho

INH có tác dụng chuyên biệt trong trị lao mặc dù nó cũng có một số tác dụng trên cácchủng vi khuẩn khác INH là thuốc kháng khuẩn hay diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng

độ thuốc, thể lao và sự tiếp nhận của cơ thể INH là thuốc đầu tiên dùng để điều trị

M tuberculosis, INH có hiệu quả và ít độc hơn các thuốc kháng lao khác như

aminosalicylic acid, capreomycin, ethionamid

1.2.3 Cơ chế tác động

INH ức chế nhiều enzym Trong tế bào Mycobacteria, INH cản trở tổng hợp acid

mycolic, phá vỡ sự tổng hợp của tế bào vi khuẩn Tuy nhiên, tác động chính xác cònchưa rõ

Sự đề kháng: khi sử dụng một mình sẽ xuất hiện các chủng lao đề kháng Tỷ lệ vikhuẩn lao đột biến kháng thuốc là 10-6 Không có sự đề kháng chéo giữa INH và cácthuốc kháng lao khác trừ ethionamid

1.2.4 Chỉ định

INH được sử dụng trong tất cả các phác đồ điều trị bệnh lao Ngoài ra, INH là thuốcduy nhất được sử dụng trong việc dự phòng lao, sử dụng cho các nhóm đối tượng sau:thường xuyên tiếp xúc với bệnh lao phổi AFB (+) chưa tiêm phòng BCG, nhiễm HIV

có test Mantoux (+), test Mantoux (+) đang được điều trị đặc biệt (thuốc giảm miễndịch, corticosteroid kéo dài )

1.2.5 Chống chỉ định

Chống chỉ định: Mẫn cảm với Isoniazid, viêm gan, suy gan nặng, viêm đa dây thầnkinh, động kinh

Thận trọng: Suy gan, suy dinh dưỡng, nghiện rượu, suy thận mạn tính, đái tháo đường

và nhiễm HIV – cần uống phòng hàng ngày 10 mg pyridoxin do nguy cơ viêm dâythần kinh ngoại biên, động kinh, tiền sử loạn thần, mang thai và cho con bú, loạnchuyển hóa porphyrin

1.2.6 Tác dụng không mong muốn

Rối loạn tiêu hóa bao gồm buồn nôn, nôn, ỉa chảy và đau, táo bón, khô miệng.Phản ứng tăng nhạy cảm bao gồm sốt, phát ban, đau khớp, ban đỏ đa dạng, ban xuấthuyết thường gặp trong những tuần đầu điều trị

Bệnh lý thần kinh ngoại biên

Rối loạn máu bao gồm mất bạch cầu hạt, thiếu máu tan máu

Thiếu máu không tái tạo; viêm dây thần kinh thị giác, bệnh loạn thần độc, co giật,viêm gan (đặc biệt là ở người trên 35 tuổi và người hay uống rượu) – phải ngừngthuốc Hội chứng giống luput ban đỏ toàn thân, pellagra, tăng phản xạ, khó tiểu tiện,tăng đường huyết và to vú đàn ông

1.3 Hệ thống phân phối thuốc đến phổi trong điều trị lao

1.3.1 Tiểu phân nano tải thuốc kháng lao.

Tiểu phân nano là các tiểu phân phân tán cấu tạo đa phân tử có kích thước từ 1 nmđến 1000 nm Tiểu phân nano mang thuốc thường được nghiên cứu nhằm cải thiện

độ hòa tan Đặc biệt, chúng được dùng như một phương tiện vận chuyển chuyên biệtđưa thuốc đến đích tác động, tránh việc thuốc bị phân bố khắp cơ thể làm giảm liềutrị liệu và gây độc tính Dạng bào chế này thường được gọi là thuốc điều trị tại đích

và các tiểu phân phân tán được gọi là tiểu phân vận chuyển [1], [3] Trong cơ thể cáctiểu phân nano tải thuốc thường được phóng thích theo các nguyên tắc như khuếchtán, trương nở, làm mòn

Gần đây, nhiều nghiên cứu đang tập trung vào các tiểu phân nano có thể phân phốibằng đường qua phổi, đặc biệt là dạng tiểu phân polyme, tiểu phân nano lipid rắn,

nano liposome, nano micel Từ đó thấy được việc phân phối trực tiếp thuốc chống laođến phổi có những lợi điểm như: giảm độc tính, đạt nồng độ thuốc cao hơn tại vị trínhiễm trùng và không phải trải qua chuyển hóa lần đầu qua gan [1], [ 3] Hiệu quảcủa tiểu phân nano tải thuốc kháng lao phân phối đường hô hấp đến phổi đã đượcchứng minh trong một số nghiên cứu về dược động học và hiệu quả kháng khuẩn thửtrên chuột lang Một liều xông hít của RMP, INH và PZA được nang hóa trong tiểuphân nano poly(lactide-co-glycolide), viết tắt là PLGA, đã cho kết quả nồng độ thuốcđược duy trì trong huyết tương 6 đến 8 ngày và trong phổi đến 10 ngày Tương tự,xông hít các tiểu phân nano đến chuột lang bị nhiễm trực khuẩn lao mỗi 10 ngày, sau

5 liều điều trị không có trực khuẩn lao nào được tìm thấy ở phổi trong khi dùng 46liều thuốc đường uống hàng ngày mới đạt được hiệu quả điều trị tương đương Ngoài

ra, biện pháp sử dụng lecithin và chitosan để bao lấy nhân dược chất cũng là một biệnpháp đang tập trung nghiên cứu [33] Ngoài ra, các tiểu phân nano dạng xông hít cònđạt nồng độ tải thuốc cao, bám dính vào tế bào niêm mạc tốt hơn, tăng cường phânphối thuốc đến phổi Hơn nữa, tiểu phân nano được hấp thu hiệu quả bởi các đại thựcbào nơi trực khuẩn lao cư trú, khi được điều chế bằng các nguyên vật liệu tương thíchsinh học và phân hủy sinh học như alginate, PLGA, gelatin hay những lipid rắn Bảng1.2 liệt kê một số tiểu phân nano tải thuốc kháng lao đã được nghiên cứu

Bảng 1.2 Tiểu phân nano tải thuốc kháng lao đã được nghiên cứu

cation

[40]

cation

[40]

Trong phạm vi đề tài này, các tiểu phân nano tải INH sẽ được nghiên cứu điều chếbằng phương pháp nhũ tương kép kết hợp bay hơi dung môi Phương pháp này tạo

hệ nhũ tương N/D/N bền vững và bắt giữ hoạt chất tốt hơn nano nhũ tương N/D đơnthuần PLGA được hòa tan trong dung môi hữu cơ, dễ dàng bay hơi Ethyl acetat (EA)hay dichloromethan (DCM) là các dung môi thường được sử dụng Hoạt chất đượchòa tan trong môi trường nước Pha nước và pha dầu sẽ được phối trộn kèm khuấymạnh nhằm tạo ra nhũ tương N/D Nhũ tương này được thêm vào dung dịch PVAtrong nước và khuấy trộn tạo nhũ tương kép N/D/N Nhũ tương kép được bay hơi đểloại bỏ các dung môi hữu cơ Hình 1.3 cho thấy cấu trúc của 1 tiểu phân nano PLGAđiển hình

Hình 1.3 Ví dụ dạng cấu trúc của tiểu phân nano PLGA [19]

1.3.2 Tiểu phân micro tích hợp các tiểu phân nano tải thuốc kháng lao.

Tiểu phân xốp lớn (LPPs: Large porous particles) đặc trưng bởi kích thước hình họctrên 5 μm và tỉ trọng khoảng 0,1 g/cm3 hoặc ít hơn Tiểu phân xốp lớn có ưu điểm làđạt đường kính khí động học lý tưởng để lắng đọng ở phế nang, đạt được nồng độcao trong phổi Tuy nhiên, do kích thước lớn nên chúng không được sự thực bào củađại thực bào phế nang [2], nên không hiệu quả với vi khuẩn lao cư trú bên trong đạithực bào [21], [ 28]

Nhược điểm của tiểu phân xốp lớn lại là ưu điểm của tiểu phân nano Các hạt có kíchthước nano có ưu điểm khi lắng đọng các hạt nano hay các hạt “siêu mịn” thường vẫn

ở trong dịch màng phổi cho đến khi bị hòa tan, thoát khỏi cơ chế làm sạch đường dẫnkhí, do đó sự lắng đọng của các tiểu phân nano mang thuốc trong phổi giúp phóngthích và duy trì thuốc trong phổi, ngoài ra, tiểu phân nano còn có thể đi sâu vào trongphế nang nơi xảy ra sự tiêu trừ của đại thực bào Tuy nhiên sự lắng đọng trong phổicủa các tiểu phân nano bị hạn chế nhiều bởi chúng bị thở ra khỏi phổi sau khi đượchít vào Hơn nữa do kích thước nhỏ, các tiểu phân nano có thể sát nhập vào nhau,không bền trong thời gian bảo quản khi ở dạng bột khô [28].

Để kết hợp ưu điểm và loại bỏ các nhược điểm của hệ tiểu phân nano và tiểu phânxốp lớn, Tsapis và công sự (2002) đã đề xuất điều chế thuốc dưới dạng hạt micro tíchhợp các tiểu phân nano bên trong nó, còn gọi là tiểu phân Trojan (Trojan particles)[28] Những hạt micro tích hợp từ các tiểu phân nano được điều chế bằng phươngpháp phun sấy gồm các tiểu phân nano kết hợp lại với nhau bằng lực Van der Waalshoặc trong khung xốp có thêm vào các thành phần như polyme sinh học hoặcphospholipid Những hạt này có tính chất vật lý và phân phối giống như tiểu phânxốp lớn, phân phối trực tiếp vào đại thực bào phế nang, sau đó những hạt nano đượctách ra và có thể được thực bào, và phóng thích thuốc có kiểm soát đạt được hiệu quảtrị liệu cao [26]

Ohashi và cộng sự (2009) đã điều chế tiểu phân nano PLGA tải RIF tích hợp trongtiểu phân micro mannitol (MAN) ((RIF/PLGA)/MAN) có đường kính trung bình lầnlượt là 213 nm và 3,2 μm Xấp xỉ 7% tiểu phân micro này lắng ở tầng 6 – 7 của dụng

cụ phân tích đặc tính khí động học (Andersen Cascade Impactor), tương ứng với việc

có thể lắng đọng ở tiểu phế quản và phế nang phổi Trong nghiên cứu in vivo ở chuột

về sự bắt giữ của đại thực bào phế nang đối với (RIF/PLGA)/MAN được đánh giá làcao hơn tiểu phân micro MAN tải RIF hay PLGA tải RIF [12] Kết quả này cho thấycác tiểu phân Trojan đã đạt được sự phóng thích thuốc kéo dài trong dịch phổi vàtrong đại thực bào bị nhiễm và có nồng độ cao hơn nồng độ tối thiểu có hiệu quả đốivới vi khuẩn Từ đó, dạng thuốc này có thể được xem như là một liệu pháp điều trịhiệu quả để giảm tần số dùng thuốc và thời gian điều trị lao [11]

Tiểu phân xốp lớn Tiểu phân nano Tiểu phân Trojan là các tiểu phân

xốp lớn mang tiểu phân nano

Hình 1.4 Cấu tạo của tiểu phân Trojan

Hình 1.5 Các giai đoạn phóng thích hoạt chất của tiểu phân Trojan

Carolina Gómez-Gaete và cộng sự đã điều chế tiểu phân Trojan chứa dexamethasonacetat để cải thiện sự khu trú trong mắt trong điều trị viêm Đầu tiên dexamethasonđược bao bằng PLGA tạo ra tiểu phân nano, sau đó tiểu phân Trojan được tạo ra bằngphương pháp sấy phun với các tá dược DPPC và HA [16]

Mitchison và cộng sự (2010) cũng đã đề xuất điều chế hạt Trojan chứa rifampicin vàpyrazinamid để cải thiện sự khu trú trong phế nang Với những ưu điểm nêu trên,,

dạng thuốc này có thể được xem như là một liệu pháp điều trị hiệu quả để giảm tần

số dùng thuốc và thời gian điều trị lao [11]

1.3.3 Hệ thống phân phối thuốc đến phổi trong điều trị lao

Để cải thiện hiệu quả điều trị lao và giảm độc tính, hệ thống phân phối thuốc đến phổitrực tiếp bằng dường hít được nghiên cứu áp dụng Vị trí của những chất trị liệu bằngđường hít thường phụ thuộc vào một vài thông số như: kích thước tiểu phân, hìnhdạng, tỉ trọng, sự hấp thu tĩnh điện, phân bố kích thước khí động học của tiểu phân.Kích thước tiểu phân quan trọng trong việc đạt được vị trí sâu trong phổi Những tiểuphân có đường kính khí động học (MMAD) trên 5 µm có xu hướng lắng đọng ởmiệng và đường hô hấp trên Những tiểu phân có đường kính từ 1 đến 5 µm có xuhướng lắng đọng sâu tại phổi, dưới 1 µm lắng đọng sâu tại phế nang phổi, kích thước

hạt từ 50 – 500 nm là kích thước mong muốn trong điều trị nhắm đến mục tiêu là đạithực bào [9], [ 14], [ 36] Có thể thấy rõ qua hình 1.6 Thuốc dùng bằng đường phổiphải dùng dụng cụ thích hợp, có 3 loại dụng cụ được dùng là thiết bị phun khí dung(Nebulizers), thiết bị hít dùng cho thuốc ở dạng bột khô (Dry Powder Inhalers), thiết

bị hít định liều (Metered Dose Inhaler), dạng hít dùng cho thuốc ở dạng bột khô phổbiến hơn do những ưu điểm có thể cầm tay, dễ sử dụng, giá thành thấp, không chứakhí đẩy [9], [ 10]

Hình 1.6 Mối liên quan giữa kích thước tiểu phân và sự lắng đọng tại phổi

1.3.4 Giới thiệu về dụng cụ phân tích đặc tính khí động học Andersen Cascade Impactor – Hình 1.7

Hình 1.7 Mô hình dụng cụ Andersen Cascade Impactor (a) và ống hít (b) Bảng 2.3.Bảng thông số kích thước tiểu phân Trojan tại từng đĩa

Mô tả: Bộ dụng cụ bao gồm 8 rây nhôm có kích thước lỗ rây khác nhau được giữ với

nhau bằng 3 kẹp lò xo và được bịt kín bởi các vòng silicon

Khi không khí được hút qua bộ lấy mẫu, nhiều luồng khí trong mỗi giai đoạn sẽ hướngbất kỳ hạt nào trong không khí về phía bề mặt của tấm thu cho giai đoạn đó Luồngkhí phản lực đi qua các lỗ rây là không đổi cho từng giai đoạn, nhưng kích thước hạt

thu được nhỏ hơn trong mỗi giai đoạn Việc một hạt có bị thu thập trên 1 giai đoạnnhất định hay không phụ thuộc vào kích thước khí động học của nó Phạm vi kíchthước hạt được thu thập trên mỗi giai đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ rây của giaiđoạn và mức cắt của giai đoạn trước Lỗ rây nhỏ sẽ làm tăng tốc độ luồng không khí,kéo theo khả năng bắt giữ hạt nhỏ hơn tại các đĩa Bất kỳ hạt nào không được thuthập ở giai đoạn đầu tiên sẽ đi theo luồng không khí xung quanh mép của tấm tới giaiđoạn tiếp theo, khi nó bị tác động hoặc chuyển sang giai đoạn tiếp theo, và cứ thế chođến khi vận tốc phản lực đủ để tạo ra lực đẩy.

Khi sử dụng bơm hút tốc độ 60 lít/phút, sử dụng các rây đánh số từ -1 đến 6 Ba râytrên cùng, tiểu phân được giữ lại bằng các đĩa nhôm có lỗ với kích thước lỗ 0,53 inch.Đĩa nhôm không lỗ được đặt ở các rây còn lại

Cơ chế bộ dụng cụ Andersen Cascade Impactor được mô tả cụ thể trong hình 1.8:

Hình 1.8 Cơ chế hoạt động của dụng cụ Andersen Cascade Impactor

1.3.5 Giới thiệu về 1 số thành phân được dùng trong công thức

Poly(lactide-co-glycolide) – viết tắt là PLGA – là một nhóm các polyme được FDAchấp thuận, có tính tương thích sinh học cao, được nghiên cứu rộng rãi lâu đời như làmột phương tiện vận chuyển thuốc Có thể điều chỉnh các tính chất vật lý cụ thể của

hệ tiểu phân polyme – thuốc bằng cách kiểm soát các thông số liên quan như khối

để đạt hiệu quả như mong muốn [17] Ngoài ra, việc thử độc tính in vivo của hệ tiểu

phân nano PLGA cho thấy độc tính thấp và an toàn đối với phổi, không thấy sự thayđổi nào đối với sự giải phóng lactate dehydrogenase, biểu hiện protein gây viêm tếbào [8] Trong công thức điều chế tiểu phân nano, PLGA được hòa tan trong pha dầu,

từ đó tạo nhũ tương N/D, từ đó góp phần điều chế tiểu phân nano

Poly vinyl alcolhol, viết tắt PVA, là poly tạo nhũ tương kép N/D/N đồng thời là chấtnhũ hóa cho hệ nhũ tương Trong tiểu phân nano PLGA, PVA tạo lớp màng bao phủlên tiểu phân nano, góp phần chủ yếu trong điều khiển khả năng phóng thích của tiểuphân nano [27]

Trong quá trình phun sấy tạo tiểu phân Trojan DL-leucine và amoni bicarbonate được

sử dụng Trong đó, DL-leucine là chất liên kết các tiểu phân nano lại với nhau thànhcác tiểu phân micro, amoni bicarbonate bay hơi trong quá trình phun sấy, từ đó tạo

độ xốp cho công thức

1.3.6 Một số ví dụ về các thuốc kháng lao phân phối trực tiếp đến phổi

Năm 2015, Phạm Đình Duy và cộng sự đã nghiên cứu tiểu phân PLGA mang hoạtchất pyrazinamyd, phương pháp nhũ tương kép kết hợp bay hơi dung môi ở nhiệt độthường, nồng độ Pyrazinamid sử dụng là 1%, tạo ra tiểu phân nano có kích thước hạt

173 nm, hiệu suất bắt giữ 7 – 8%, khả năng tải thuốc 1% Đồng thời tiểu phân xốplớn mang tiểu phân nano cũng được điều chế hiệu quả bằng phương pháp sấy phun,tạo ra LPPs có kích thước 4,1 µm, FPF đạt 40,1% và AF đạt 29,6% [13]

Pejman Sadegh và cộng sự (2011) đã chuẩn bị và phun sấy tạo bột hít chứa tiểu phânnano với chitosan mang INH phân phối đến phổi Hệ tiểu phân nano tạo thành có kíchthước hạt 250 nm, hiệu suất bắt giữ 10 – 15% [29]

Akansha Tripathi và cộng sự (2010) đã tối ưu hóa tiểu phân nano PLGA mang RIFbằng phương pháp nhũ tương đơn với các tỉ lệ thuốc / polyme, nồng độ PVA khácnhau, cho hiệu suất bắt giữ tốt nhất lên đến 75%, khả năng tải thuốc 19% [6]

Mani Gajendiran và cộng sự (2013), đã điều chế hệ tiểu phân PLGA mang INH theophương pháp nhũ tương kép, tạo tiểu phân có kích thước nano là 200-300 nm, hiệusuất bắt giữ 18,6%, khả năng tải thuốc 8,9% [22]

1.3.7 Giới thiệu về tối ưu hóa và thiết kế mô hình thực nghiệm

Thiết kế mô hình thực nghiệm cho phép khảo sát sự ảnh hưởng của công thức và quátrình điều chế đến tính chất của sản phẩm Trong đó, mô hình Taguchi được sử dụngtrong thiết kế thực nghiệm nhằm giảm thiểu số thí nghiệm cần thực hiện bằng mảngtrực giao (orthogonal arrays), từ đó xác định được công thức tối ưu để đạt kết quảnhư mong muốn [24]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Bảng 2.4.Danh mục nguyên vật liệu cần sử dụng

Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn Nhà sản xuất Xuất xứ

Gelatin 150 Bloom 30 Mesh Nhà sản xuất Cartino gelatin Thái LanGelatin 180 Bloom 20 Mesh Nhà sản xuất Cartino gelatin Thái Lan

DL-Leucin Nhà sản xuất Sigma Pháp

VT KHKT

ViệtNam

Nam

Ethyl acetate (EA)

Hiệp hội hoá chất Mỹ(ACS)

Dược điển châu Âu

Phosphat buffer saline (PBS)

Bảng 2.5 Danh mục thiết bị sử dụng

1 Máy khuấy siêu âm Toption instrument Trung Quốc

5 Máy xác định kích thước

hạt và thế zeta

Brookhaven InstrumentsCorporation

Mỹ

8 Hệ thống bay hơi chân

không

9 Máy sấy phun Pilotech Model YC-500 Trung Quốc

10 Kính hiển vi điện tử quét

(SEM)

11 Thiết bị phân tích nhiệt

(DSC)

DSC Q20 V24.9 Build121

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Điều chế tiểu phân nano và khảo sát các tính chất của tiểu phân nano

2.2.1.1 Quy trình cơ bản điều chế tiểu phân nano PLGA mang INH

Các tiểu phân PLGA tải INH được điều chế theo phương pháp nhũ tương kép kết hợpbay hơi dung môi [23] Quy trình cụ thể như sau:

Đầu tiên, 1 ml dung dịch nước chứa INH được nhũ hóa bằng 10 ml PLGA trong dungmôi hữu cơ Các dung môi hữu cơ được chọn là ethyl acetat (EA) hoặcdichloromethane (DCM) hoặc hỗn hợp EA:DCM (tỉ lệ 1:1 theo thể tích) Điều kiệnnhũ hóa: siêu âm 1 phút cường độ 100W tạo nhũ tương N/D

Sau đó, thêm vào nhũ tương N/D trên 10 ml dung dịch polyvinyl alcohol (PVA) trongnước Hỗn hợp này tiếp tục được siêu âm 3 phút, cường độ siêu âm 150 W, tạo nhũtương kép N/D/N

Nhũ tương kép trên được loại bỏ dung môi hữu cơ bằng hệ thống bay hơi chân khôngtrong thời gian 40 phút Các tiểu phân nano tạo thành được thu hồi bằng cách li tâm(4000 vòng/phút, 30 phút) với ống siêu lọc vivaspin 50 kDa MWCO, thêm 2 ml nướccất và li tâm, tiến hành 2 lần để loại bỏ PVA dư, dịch li tâm dưới được dùng để thửhiệu suất bắt giữ

Các thông số nồng độ INH, tỉ lệ INH:PLGA, nồng độ PVA được thay đổi để tìm racông thức phù hợp, từ đó xây dựng các công thức tối ưu hóa

Quy trình điều chế hệ tiểu phân nano được mô tả cụ thể tại hình 2.9:

Hình 2.9 Quy trình điều chế tiểu phân nano mang INH

2.2.1.2 Khảo sát các tính chất của hệ tiểu phân nano mang INH

Cảm quan

Quan sát bằng mắt thường màu sắc, sự biến đổi màu sắc và sự bền vững của hệ tiểuphân trong quá trình bảo quản Yêu cầu: hệ tiểu phân có màu trắng đục, phân tán đồngnhất, không xuất hiện sự biến đổi màu sắc hoặc hiện tượng kết bông, nổi kem, lắngcặn, hợp nhất trong quá trình bảo quản

Phân tích kích thước và thế zeta

Các tiểu phân nano tải INH cần có kích thước nhỏ hơn 500 nm để có khi đi tới các

đại thực bào phế nang (mục 1.3.3) Kích thước các tiểu phân được phân bố đồng đều,với phân bố kích thước hạt nhỏ hơn 0,3 là hợp lý Tiểu phân nano tải INH được phântích kích thước và phân bố kích thước hạt (polydispersity – PDI) bằng máyZetasizer.Việc đo kích thước được thực hiện ba lần sau khi pha loãng 1/100 (tt/tt) tiểuphân nano trong nước tinh khiết ở nhiệt độ phòng với góc đo cố định 1730 Việc đothế zeta cũng được tiến hành trên cùng máy với độ pha loãng 1/50 (tt/tt) trong dungdịch KCl 1 nM.

Hình thể học

Khảo sát hình thể học bằng TEM để đánh giá cấu trúc bên trong của tiểu phân nano.Mẫu hỗn dịch nano được pha loãng 2 lần với nước cất, sau đó được trải trên lưới đồngđược tráng một lớp carbon bằng máy phủ carbon Đặt lưới đồng vào đĩa petri và chovào bình hút ẩm làm khô mẫu trong 24 giờ.Quan sát mẫu dưới TEM Yêu cầu: tiểuphân đồng nhất và đồng đều giữa các tiểu phân

Hiệu suất bắt giữ và khả năng tải INH trong tiểu phân nano

Hiệu suất bắt giữ (EE) là tỉ lệ % thuốc bị giữ lại trong tiểu phân nano so với lượngthuốc ban đầu và khả năng tải thuốc (DL) là tỉ lệ thuốc trong tiểu phân nano so vớitổng lượng polymer và thuốc bị bắt giữ trong tiểu phân nano

lượng thuốc ban đầu (mg) - lượng thuốc tự do (mg)EE% = x 100

lượng thuốc ban đầu (mg)

lượng thuốc ban đầu (mg) - lượng thuốc tự do (mg)DL% = x 100

Tổng lượng polymer (mg) + thuốc được bắt giữCách xác định INH tự do và INH toàn phần:

- 2 ml hỗn dịch nano được li tâm qua vivaspin 50 kDa MWCO lấy dịch li tâm dưới,0,5 ml dịch li tâm dưới được pha loãng vào vừa đủ 50 ml nước, sau đó đo độ hấp thuqua máy quang phổ UV - Vis bước sóng 263 nm, từ đó tính được nồng độ INH tự do.INH toàn phần được xác định bằng cách li tâm 5 phút hỗn hợp gồm 0,5 ml hỗn dịchnano và 0,2 ml NaOH 1M, sau đó thêm nước vừa đủ 50 ml, đo độ hấp thu bằng máy

- Tiến hành điều chế mẫu trắng (không chứa INH), li tâm 5 phút hỗn hợp gồm 0,5

ml hỗn dịch nano và 0,2 ml NaOH 1M, sau đó thêm nước vừa đủ 50 ml, đo độ hấpthu bằng máy quang phổ UV-Vis bước sóng 263 nm, từ đó xác định mẫu trắng khônghấp thu ở UV 263 nm

Khảo sát hiệu suất phóng thích.

Phương pháp thẩm tách được dùng để đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất củatiểu phân nano

Thiết bị: Ống thủy tinh ổn nhiệt hình trụ 2 lớp thể tích 100 ml

Túi thẩm tách (MWCO: 12-14 kDa) có đường kính 10 mm và chiều dài 200 mm đượcngâm trong nước cất 24 giờ

Môi trường: 100 ml dung đệm Phosphat Buffer Saline (PBS) pH 7,4

150 vòng/phút với nhiệt độ duy trì 37 ± 0,5 oC bằng bể ổn nhiệt Rút 4 ml dung dịchtrong ống và thay thế bằng 4 ml PBS tại các thời điểm 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8, 12, 18,

24, 48, 72, 96 giờ Lượng INH phóng thích tại mỗi thời điểm được định lượng bằngcách đo độ hấp thu ở bước sóng 263 nm

Dữ liệu phóng thích INH được khảo sát động học với các phương trình bậc 0 (%thuốc tích lũy so với thời gian), bậc 1 (log % thuốc tích lũy còn lại so với thời gian),phương trình Higuchi (% thuốc tích lũy so với căn bậc hai của thời gian), Korsmeyer-Peppas (log % thuốc tích lũy so với thời gian), và Hixon Crowell (căn bậc 3 của lượngthuốc phóng thích so với thời gian) Hệ số K và giá trị R2 được tính từ đường congtuyến tính thu được qua phân tích hồi quy

2.2.1.3 Tối ưu hóa công thức điều chế tiểu phân nano mang INH

Việc tối ưu hóa được thực hiện bằng phần mềm Design-Expert, áp dụng mô hình thực

nghiệm Taguchi L9, với 4 biến số độc lập và 3 biến số phụ thuộc Mỗi biến số độclập bao gồm 3 mức giá trị.

Từ kết quả khảo sát sơ bộ về công thức điều chế tiểu phân nano, 4 biến số độc lậpđược lựa chọn để tối ưu hóa bao gồm:

X1: nồng độ INH hòa tan trong dung môi nước (1%, 1,75%, 2,5%)

X2: loại dung môi hòa tan PLGA (EA, DCM, hỗn hợp EA:DCM tỉ lệ 1:1)

Y3: thế zeta bằng máy zetasizer

9 công thức thiết kế thực hiện được mô tả cụ thể trong bảng 2.6 dưới đây:

Bảng 2.6 Thiết kế thực nghiệm theo mô hình Taguchi L9

Tiến hành điều chế 9 công thức thực nghiệm theo như thiết kế mô hình Taguchi L9

Sử dụng phần mềm Design-Expert để tối ưu hóa các biến độc lập và các biến phụthuộc Đánh giá ý nghĩa thống kê của các biến độc lập bằng phân tích phương saithông qua các giá trị p, R2 dự đoán, R2 hiệu chỉnh và độ chính xác thích hợp (adequate

các đồ thị thể hiện sự tương quan giữa các biến X1, X2, X3, X4, R1, R2 và R3 Tối ưuhóa mô hình thiết kế thực nghiệm để lựa chọn công thức tối ưu mong muốn.

Công thức tối ưu được điều chế 3 lần, so sánh kết quả thực nghiệm với dự đoán củaphần mềm với độ tin cậy 95%

2.2.1.4 Cải thiện hiệu suất bắt giữ INH của tiểu phân nano

Các tá dược được khảo sát để làm tăng hiệu suất bắt giữ và khả năng tải thuốc baogồm HP-β- cyclodextrin, gelatin và chitosan HP-β- cyclodextrin có khả năng tạophức với thuốc theo nguyên tắc host-guest vì vậy được ứng dụng trong nghiên cứunày bằng cách thêm vào trong dung dịch INH trong nước theo tỉ lệ 1:1 (mol:mol).Phức này sau khi hình thành sẽ giúp bắt giữ thuốc bên trong tiểu phân nano PLGAmới hình thành nhiều hơn sau khi dung môi được bay hơi [35] Chitosan là một chấtthường được sử dụng trong điều chế tiểu phân nano Trong tiểu phân nano PLGA,chitosan có thể được bổ sung thêm vào công thức làm tăng khả năng hấp thu thuốc

và tạo lớp màng tích điện bên ngoài lớp PLGA, từ đó có thể làm tăng hiệu suất bắtgiữ [39] Tương tự chitosan, gelatin cũng tạo 1 lớp màng bao phủ lên tiểu phân nano,cùng đặc tính nhớt của nó, ngăn cản hoạt chất thoát khỏi tiểu phân nano [38] 13 côngthức được thử nghiệm hiệu suất bắt giữ được xây dựng dựa trên các công thức đã xácđịnh tối ưu, được thể hiện trong bảng 2.7 Các công thức được thực hiện trong cùngđiều kiện và quy trình Các chất cải tiến hiệu suất bắt giữ được thêm trực tiếp vào phanước đầu tiên, sau khi hòa tan INH, và trước khi siêu âm tạo dung môi N/D Quytrình điều chế tiểu phân nano nhằm cải tiến hiệu suất bắt giữ thể hiện ở hình 2.10.Công thức có hiệu suất bắt giữ tốt được chọn để khảo sát hình thể học qua kính hiển

vi điện tử truyền qua – TEM và nghiên cứu phun sấy tạo tiểu phân Trojan