Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoàng thảo vạch đỏ (dendrobium ochraceum de wild)

Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi in vitro cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau 6 tuần nuôi cấy 18 3.4.. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân chồi in vitro cây lan Hoàng thảo Vạch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG

IN VITRO LAN HOÀNG THẢO VẠCH ĐỎ (DENDROBIUM OCHRACEUM DE WILD)

TRẦN THỊ VÂN

Đà Nẵng, năm 2020

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG

IN VITRO LAN HOÀNG THẢO VẠCH ĐỎ (DENDROBIUM OCHRACEUM DE WILD)

Ngành: Công nghệ Sinh học Khóa: 2016-2020

Sinh viên: Trần Thị Vân Người hướng dẫn: TS Võ Châu Tuấn

Đà Nẵng, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực Đây là kết quả nghiên cứu của tôi và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu

vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học

Tác giả

Trần Thị Vân

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn – thầy giáo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Vũ Đức Hoàng, người đã giúp

đỡ tôi rất nhiều trong việc trau dồi kiến thức và kĩ năng thực hành thí nghiệm

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Sinh – Môi trường đã giúp

đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài khoá luận của mình

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt được kết quả tốt nhất

Đà Nẵng, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực hiện

Trần Thị Vân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về lan Hoàng thảo Vạch đỏ 3

1.1.1 Đặc điểm sinh thái 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến nhân giống in vitro thực vật 4

1.2.1 Điều kiện nuôi cấy 4

1.2.2 Môi trường nuôi cấy 4

1.3 Những nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo trên thế giới và Việt Nam 7

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới 7

1.3.2 Nghiên cứu trong nước 7

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Vật liệu 11

2.1 Phương pháp nghiên cứu 11

2.1.1 Phương pháp khử trùng mẫu vật 12

2.1.2 Phương pháp nhân nhanh protocorm 12

2.1.3 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 12

2.1.4 Phương pháp tạo rễ in vitro – tạo cây hoàn chỉnh 12

2.1.5 Phương pháp trồng cây lan in vitro trên giá thể trong buồng sinh trưởng thực vật 13 2.1.6 Phương pháp xử lý thống kê 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

3.1 Đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu vật 14

3.2 Ảnh hưởng của chất Kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ……… 16

3.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ……… 18

3.3.1 Ảnh hưởng của chất BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ……… 18

3.3.2 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân chồi in vitro cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ……… 21

3.4 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ 24

3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ in vitro 27

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

1 Kết luận………29

2.Kiến nghị ……… 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 34

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BA : 6-benzyl adenine BAP : 6-benzylaminopurine

Cs : Cộng sự

CW : Coconut water (nước dừa) ĐHST : Điều hòa sinh trưởng IAA : Indole 3-acetic acid IBA : Indole 3-butyric acid Kin : Kinetin

L : Lít

MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid NXB : Nhà xuất bản

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến

hiệu quả khử trùng quả lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau 3 tuần nuôi cấy

14

3.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả nhanh nhân nhanh

protocorm từ hạt sau 3 tuần nuôi cấy

16

3.3 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi in vitro cây

lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau 6 tuần nuôi cấy

18

3.4 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân chồi in

vitro cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau 6 tuần nuôi cấy

21

3.5 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan

Hoàng thảo Vạch đỏ sau 8 tuần nuôi cấy

24

3.6 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến khả năng sống và

sinh trưởng của cây in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ

trồng trong buồng sinh trưởng thực vật sau 3 tuần

27

DANH MỤC HÌNH ẢNH

2.1 Cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ ngoài tự nhiên 11 3.1 Sinh trưởng của protocorm trên các môi trường sau 3

tuần nuôi cấy

17

3.2 Cụm chồi in vitro cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau 6

tuần nuôi cấy

19

3.3 Chồi in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ sinh trưởng trên

các môi trường BA kế hợp với IBA sau 6 tuần nuôi cấy

22

3.4 Chồi tạo rễ in vitro của lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau 8

tuần nuôi cấy

25

3.5 Cây con in vitro lan Hàng thảo Vạch đỏ sau 3 tuần ươm

trồng trong buồng sinh trưởng thực vật trên các loại giá thể khác nhau

28

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ

(Dendrobium ochraceum de Wild)

Họ tên sinh viên Trần Thị Vân

Lan Hoàng thảo Vạch đỏ là một loài đặc hữu rất hẹp của Việt Nam, sống phụ sinh sống bám trên thân và cành cây gỗ trong rừng rậm nhiệt đới Lan Hoàng thảo Vạch đỏ là loài có dáng cây và hoa đẹp, được yêu thích trồng làm cảnh Tuy nhiên, hiện nay lan Hoàng thảo Vạch đỏ là loài hiếm, có mức độ đe dọa R trong sách đỏ

Việt Nam Nghiên cứu nhân giống lan Hoàng thảo Vạch đỏ bẳng kỹ thuật nuôi cấy in

vitro nhằm tạo được số lượng cây lớn trong thời gian ngắn là việc làm thật sự cần

thiết

Kết quả nghiên cứu chỉ ra, khử trùng quả lan Hoàng thảo Vạch đỏ bằng ethanol 70% trong 2 phút, sau đó khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất; nuôi cấy mẫu hạt trên môi trường MS đã cho tỷ lệ mẫu

vô trùng cao nhất là 93,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi là 83,33% sau 3 tuần nuôi cấy Môi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 2,0 mg/l Kin là môi trường thích hợp để nhân nhanh protocorm của lan Hoàng thảo Vạch đỏ; với hệ số nhân nhanh 16,9 lần sau 3 tuần nuôi cấy Môi trường MS có 3% saccharose, 0,8%

agar bổ sung 2 mg/l BA là môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro của lan

Hoàng thảo Vạch đỏ; với tỷ lệ phát sinh chồi là 90% hệ số nhân chồi đạt 3,63 chồi/mẫu, chiều cao đạt 2,13cm sau 6 tuần nuôi cấy Môi trường MS có 3%

saccharose, 0,8% agar bổ sung 0,75 mg/l IBA thích hợp để tạo rễ in vitro Sau 8 tuần

nuôi cấy, tỷ lệ ra rễ là 90%; đạt 3,83 rễ/chồi, chiều dài 0,90 cm/rễ Giá thể dớn

(100%) là giá thể thích hợp để ươm trồng cây lan Hoàng thảo Vạch đỏ in vitro; với tỉ

lệ sống là 100% sau 3 tuần ươm trồng trong điều kiện buồng sinh trưởng thực vật

MỞ ĐẦU

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, với địa hình đồi núi chiếm hơn ¾ diện tích đất liền, tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của các loài lan Lan ở nước ta có nhiều giống khác nhau như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium mang nhiều màu sắc, kiểu dáng khác nhau Theo Trần Hợp (1998), Việt Nam có 137 – 140 giống gồm 800 loài lan rừng Đến 2007, đã có đến

144 giống thuộc 927 loài lan được phát hiện và mỗi năm phát hiện thêm nhiều loài lan mới Phong lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả Theo các tài liệu lưu hành, hoa lan được biết đến và trồng dưới thời vua Trần Anh Tông, chúng thường được dùng làm cảnh, trang trí Ngày nay, nghề trồng lan không chỉ

là một thú vui tao nhã mà nó còn mang lại hiệu quả kinh tế và văn hóa

Lan Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong Họ Lan (Orchidaceae) Trên thế giới chi lan Hoàng thảo có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia (Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Lý Thị Anh, 2013) Ở Việt Nam, Dendrobium có khoảng 100 loài, xếp trong 14 tông, được phân biệt bằng thân (giả hành), lá và hoa (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1987) Chúng phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển (Đào Thị Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008) Lan Hoàng thảo có hoa đẹp, màu khảm, tạo nên một tổ hợp và màu sắc rất phong phú; hoa có hương thơm, lâu tàn, chùm hoa nở kéo dài từ 1 – 2 tháng mới hết hoa nên rất được khách hàng ưa chuộng Tuy nhiên với tình trạng thu hái, buôn bán lan rừng trái phép phổ biến như hiện nay làm dẫn đến nguy cơ mất nhiều nguồn gen lan rừng quý hiếm trong thời gian đến (Nguyễn Văn Kết, 2010)

Lan Hoàng thảo Vạch đỏ (Dendrobium ochraceum de Wild) là một loài đặc hữu của

Việt Nam Đây là loài có dáng cây và hoa đẹp, được yêu thích trồng làm cảnh (Võ Văn Chi và Trần Hợp, 2002) Trong tự nhiên, lan Hoàng thảo Vạch đỏ có sự phân bố hẹp, cùng với sự khai thác quá mức hiện nay nên loài lan này đang suy giảm nhanh chóng trong tự nhiên, chúng cần phải được bảo tồn và phát triển Năm 2007, lan Hoàng thảo Vạch đỏ được đưa vào Sách đỏ Việt Nam ở mức độ hiếm, còn trong Sách đỏ của IUCN

thì loài này được xếp ở mức độ nguy cấp (Sách đỏ Việt Nam, 2007)

Nhân giống lan bằng phương pháp truyền thống (giâm chiết cành, tách bụi ) sẽ mất nhiều thời gian và không hiệu quả (Martin và Madassery, 2006) Theo Lê Văn Hoàng

(2008), nhân giống in vitro được xem là phương pháp thích hợp nhất có thể nhân giống

lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và giá thành hợp lý Ở nước ta, việc ứng

dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nhân giống đã thành công trên nhiều loài lan, không

những góp phần bảo tồn nguồn gen mà còn phát triển sản xuất nhiều loài lan có giá trị kinh tế cao

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống

in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ (Dendrobium ochraceum de Wild)”

Xây dựng được quy trình nhân giống lan Hoàng thảo Vạch đỏ bằng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro, với hệ số nhân giống cao

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp những dẫn liệu khoa học về nhân giống in vitro cây lan Hoàng thảo Vạch

đỏ, góp phần làm phong phú hơn dữ liệu về kỹ thuật nhân giống in vitro cây lan Hoàng

thảo Vạch đỏ

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu làm cơ sở sản xuất nhanh, liên tục cây giống lan Hoàng thảo Vạch đỏ, đáp ứng nhu cầu sản xuất thương phẩm hoa lan trên quy mô lớn

- Nghiên cứu các điều kiện để vô trùng mẫu vật

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh protocorm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo rễ in vitro

- Khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể đển khả năng sống sót và sinh trưởng của cây

lan in vitro nuôi trong buồng sinh trưởng thực vật

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Đặc điểm sinh thái

Lan Hoàng thảo Vạch đỏ là thực vật đặc hữu ở Việt Nam, được mệnh danh là nữ hoàng sắc đẹp của các loài hoa lan thuộc chi lan Hoàng thảo Năm 2007, lan Hoàng thảo Vạch đỏ được đưa vào Sách đỏ Việt Nam ở mức độ hiếm R, còn trong Sách Đỏ của IUCN thì loài này được xếp ở mức độ EN – mức độ nguy cấp

Lan Hoàng thảo Vạch đỏ là cây thân thảo, sống phụ sinh ở cây gỗ thuộc vùng nguyên sinh và thứ cấp thường xanh lá rộng và rừng hỗn hợp trên đá granit, sa thạch, đá thạch anh và đá phiến, thường là trên các sườn đá dốc đứng và trên đỉnh núi với độ cao từ

400 đến 800 m Ở nước ta, lan Hoàng thảo Vạch đỏ đã được phát hiện ở các tỉnh, Hà Tĩnh (Hương Sơn, Sơn Kim), Thừa Thiên – Huế (A Lưới, Hương Thủy, núi Bạch Mã), Quảng Nam (Nam Trà My, Đại Lộc, Đại Hồng) và Gia Lai (Kon Ha Nung, Kbang) (Leonid và cs, 2016) Cây cho hoa vào tháng 5 – 6 Cây tái sinh bằng chồi và hạt

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Thân cây mập mạp, dựng đứng, dài khoảng 15 – 60 (70) cm, đường kính 0,8 – 1,5

cm Lá hình bầu dục hẹp, thuôn dài, dài khoảng 5 – 8 (10) cm, rộng 1,2 – 2,4 cm, phủ lông ngắn màu đen Loài lan này rất khác biệt so với các loại lan khác, dễ dàng nhận ra vì

nó có cánh màu vàng nhạt với nhiều đường gân tương phản màu đỏ tươi (Leonid và cs, 2016) Cụm hoa 1 – 5 hoa, mỗi hoa có 1 – 4 (5) cánh hoa; hoa hình bầu dục, nhọn, dài 1,2cm Hoa có hương thơm rất nhẹ chỉ có khi hoa mới nở, màu vàng nhạt đến gần trắng

Lá đài và cánh hoa hình mác, quăn, dài 2,5 – 2,7cm, rộng 0, 6 – 0,8cm Với chiếc cằm hình cựa dài 2,2 – 2,4cm, cánh môi dài 2,5 – 2,7cm, rộng 2 – 2,4cm, màu vàng chia 3 thùy, ở giữa có 3 đường ống dọc, thùy bên hình bán nguyệt, có nhiều gân màu đỏ, thùy giữa hình nêm, đầu lõm, mép gấp nếp kiểu lượn sóng Trụ dài 0,5cm, màu trắng, ở gốc có gân dọc màu đỏ, răng trụ hình tam giác, đầu tù Hiện nay chúng là một trong những loài lan bị săn tìm ráo riết bởi các nhà vườn nuôi trồng và những nhà sưu tầm lan không chỉ ở Việt Nam

1.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến nhân giống in vitro thực

vật

1.2.1 Điều kiện nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó là ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm

+ Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8 – 12h/ngày Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1990) Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ

2000 – 4000 lux Trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 – 3000 lux

+ Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp nuôi cấy mô 20 – 27°C Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc

đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay

hình thành tế bào và cơ quan

+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô (Lê Văn Hoàng, 2008)

1.2.2 Môi trường nuôi cấy

Chất dinh dưỡng được cung cấp cho tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro lấy từ

môi trường nuôi cấy Thành phần cấu tạo nên môi trường nuôi cấy được chia thành 4 nhóm: nước cất (95%), môi trường cơ bản bao gồm nguồn cacbon và chất khoáng, chất điều hoà sinh trưởng và các chất khác như agar, agarose Vì vậy, vấn đề việc lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng

Sự sinh trưởng và phân chia của tế bào thực vật bị tác động mạnh mẽ bởi sự điều chỉnh của nguồn Cacbon, Photphat, Nitơ và các chất điều hoà sinh trưởng (Eibl và cs, 2009)

+ Nguồn Cacbon: các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu

cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất cacbon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Lê Văn Hoàng, 2008) Thông thường, saccharose (2 –5%) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô thực vật Saccharose

sẽ được enzyme ngoại bào thuỷ phần tạo ra các đường đơn là glucose và fructose trong quá trình nuôi cấy (Eibl và cs, 2009)

+ Nguồn Nitơ: nhu cầu nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4+ và NO3- Trong

đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4+ Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp

cả hai nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất

+ Nguồn Photphat: Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng Trong môi trường nuôi cấy, photpho được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium

Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi

cấy in vitro Đây là môi trường giàu dinh dưỡng, gồm các khoáng đa lượng, vi lượng cần

thiết cho sự phát triển của cây

+ Các nguyên tố đa lượng: bao gồm sáu nguyên tố: nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S), tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn) Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/l nitrate và kali Các nguyên

tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1 – 3 mmol/l (Lê Văn Hoàng, 2008)

+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, Bo, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất quan trọng cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây Nói chung, nồng độ thường được sử dụng đối với Cu và Co là 0,1 µmol/l, Fe và Mo là 1 µmol/l, I là 5 µmol/l,

Zn là 5 – 30 µmol/l, Mn là 20 – 90 µmol/l được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm (Lê Văn Hoàng, 2008)

+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được vitamin, nhưng không đủ cho nhu cầu của cây Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy Các vitamin inositol, B1 (thiamin) và B6 (pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1 – 10 mg/l Murashige và Skoog (1962) đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào và rất quan trọng đối với nuôi cấy mô sau khi nghiên cứu kĩ lưỡng

sự có mặt của nó trong môi trường MS

+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1994 Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính auxine, các gluxid của cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

+ Chất làm thay đổi trang thái môi trường: Agar (thạch) là một loại polysacharid của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6 – 12g/l Độ thoáng khí của môi trường thạch

có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy Nồng độ thạch dao động trong khoảng

6 – 10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng ở thực vật Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: auxin, cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid Sự phối hợp hay lựa chọn nồng độ các chất kích thích sinh trưởng sẽ là yếu tố quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào… Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, long (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ Gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt

và sự ra hoa, đóng khí khổng ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của

tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi (Lê Văn Hoàng, 2008)

Việt Nam

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, như cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng nên việc nghiên cứu nhân giống lan Hoàng thảo rất được quan tâm và phát triển mạnh mẽ

Chang và cs (2004) đã nghiên cứu giống in vitro ở lan Hoàng thảo kèn – D

lituiflorum thu được kết quả: Môi trường ½ MS bổ sung 0,5 mg/l NAA là tối ưu cho việc

nhân nhanh protocorm với hệ số nhân là 4,37 lần, môi trường N6 bổ sung 0,5 mg/l NAA,

10% dịch ép chuối là thích hợp cho tạo rễ in vitro với chiều dài rễ từ 2 – 4 cm và số rễ từ

6 – 8 rễ

Năm 2010, M Maridass và cs đã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan

D nanum thông qua nuôi cấy đoạn thân Kết quả cho thấy, tỷ lệ cảm ứng callus tối đa thu

được trên môi trường 2,0 µM/l NAA và 1,2 µM /l Kin Hiệu quả tối đa của cảm ứng chồi (15,78 ± 0,37 mm) được quan sát thấy trên môi trường cơ bản được bổ sung 0,5 µM/l

BAP Cây lan in vitro khi đưa ra đất trong tự nhiên có tỉ lệ sống sót đạt 85%

Asghar và cs (2011) đã nghiên cứu nuôi cấy chồi nách của lan D nobile var Emma

trắng Số lượng chồi tối đa (4,33), khi nuôi cấy trên môi trường có 2 mg/l BAP, trong khi

đó trên môi trường với 1,5 mg/l của Kin; chiều dài chồi cao nhất (4,18 cm) Nồng độ BAP, Kin cao hơn (3,0 mg/l) và CW (300 ml) dẫn đến vàng, chồi hoại tử và tăng trưởng kém Cảm ứng rễ được thực hiện bằng cách sử dụng hai chất là IBA và NAA ở các nồng

độ khác nhau trên môi trường MS IBA ở mức 2 mg/l đã tăng tỷ lệ ra rễ là 97,5% với 4,70 rễ/cây và chiều dài rễ 3,47 cm hiệu quả hơn NAA Nồng độ IBA và NAA cao hơn

3,0 mg/l; khả năng ra rễ in vitro kém hơn

1.3.2 Nghiên cứu trong nước

Nguyễn Văn Song và cs (2011), đã nghiên cứu thành công nhân nhanh in vitro lan Kim điệp (D chrysotoxum) Trong nghiên cứu, tác giả đã kết luận rằng môi trường thích

hợp cho nảy mầm và và phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản có 20g/l sucrose, 8g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS

cơ bản có 20g/l sucrose, 8g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP với số protocorm trung bình đạt được cao nhất là 4,33 Môi trường MS cơ bản có 30 g/l sucrose, 8g/l, 1g/l than hoạt tính, 15% nước dừa, 2 mg/l BAP và 1 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh

chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro với số chồi/protocorm là 3,18 và chiều

cao là 3,28 cm/chồi Môi trường MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8g/l agar; 15% nước dừa

và 1g/l NAA là thích hợp tạo rễ của chồi in vitro với số rễ/chồi đạt 5,93

Năm 2013, Nguyễn Quỳnh Trang và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro lan Phi điệp tím (D anosmum) Quả lan được khử trùng bề mặt bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút và khử trùng bằng NaOCl 5% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt và mẫu tái sinh cao nhất

là 56,56% và 60% Môi trường Knuds có bổ sung 0,3 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kin + 0,3mg/l BAP, cho hệ số nhân nhanh chồi đạt 5,8 lần/3 tuần, chất lượng thể chồi tốt Sau 4 tuần, công thức bổ sung 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l GA3 + 0,1 mg/l Kin chồi tăng trưởng tốt nhất (đạt 2,45 cm), chất lượng chồi tốt Trên môi trường nuôi cấy có 0,5 mg/l IBA và 0,3 mg/l IBA + 0,1 mg/l NAA cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt 98%, đạt trên 3 rễ/chồi, chất lượng

rễ tốt Khi cây có chiều cao > 4 cm, có 3 – 4 rễ đem bình cây ra huấn luyện ở điều kiện tự nhiên, rửa sạch thạch, đưa cây ra trồng trên giá thể dương xỉ Thời gian huấn luyện 10 ngày, tỷ lệ sống của cây khi trồng ra giá thể đạt 100%, rễ bám và sinh trưởng trên giá thể tốt

Năm 2016, Vũ Kim Dung và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo

Ý thảo ba màu (D gratiosissimum Reichenb.f.) Khi khử trùng bề mặt quả lan bằng

ethanol 70% trong 2 phút, dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l, cho tỷ lệ mẫu sạch là 96,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh protocorm 90% với thời gian phát sinh chồi 20 ngày Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường BAP 0,5 mg/l, NAA 0,3 mg/l, Kinetin 0,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100 ml/l, nước dừa 100 ml/l, sucrose 30 g/l, cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất (9,53 và 96,67%) sau 4 tuần nuôi cấy Chồi ra rễ 93,33% và chiều dài rễ là 3,22 cm khi nuôi trên môi trường MS bổ sung IBA 0,2 mg/l, NAA 0,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100 ml/l, sucrose 20 g/l sau 5 tuần nuôi cấy

Năm 2017, Nguyễn Văn Việt nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong nhân giống cây lan Hoàng thảo vôi (D cretaceum Lindley) Kết quả cho thấy, khử trùng bề

mặt quả lan bằng ethanol 70% trong 2 phút, HgCl2 0,1% trong 10 phút và nuôi cấy trên môi trường MS, cho tỷ lệ mẫu sạch là 94,7%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi là 90% với thời

gian phát sinh chồi 20 ngày Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l NAA, 0,3 mg/l Kinetin, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa, 30 g/l sucrose, 5 g/l agar cho hệ số nhân chồi cao nhất 12,3 sau 5 tuần nuôi cấy Chồi ra rễ đạt 93,3%, số rễ đạt 4,1 rễ/cây và chiều dài rễ 3,6 cm khi nuôi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l IBA, 0,3 mg/l NAA, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 20 g/l sucrose sau 5 tuần nuôi cấy

Vi nhân giống lan Hoàng thảo kèn (D lituiflorum Lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy

in vitro đã được nghiên cứu thành công bởi Nguyễn Văn Việt (2017) Kết quả nghiên cứu

cho thấy, khử trùng bề mặt quả lan bằng ethanol 70% trong 1 phút, dung dịch HgCl20,1% trong 12 phút và nuôi cấy trên môi trường Knops, cho tỷ lệ mẫu sạch là 86,7%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi (protocorm) là 76,7% với thời gian phát sinh chồi 5 tuần Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường BAP 0,8 mg/l, Kin 0,3 mg/l, NAA 0,1 mg/l, dịch chiết khoai tây 100 ml/l, nước dừa 100 ml/l, sucrose 30 g/l, agar 5 g/l cho hệ số nhân chồi cao nhất 10,3 sau 5 tuần nuôi cấy Chồi ra rễ 100%, số rễ đạt 4,8 rễ/cây và chiều dài rễ 3,6 cm khi nuôi trên môi trường Knops bổ sung IBA 0,2 mg/l, NAA 0,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100 ml/l, sucrose 20 g/l sau 5 tuần nuôi cấy Cây con được huấn luyện và chuyển ra trồng trên giá thể dớn trắng với tỉ lệ cây sống đạt 89%

Đỗ Quỳnh Liên và cs (2019) đã thành công trong kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nhân giống lan Phi điệp tím Hoà Bình (D anosmum Lindley) Khử trùng bề mặt quả lan bằng

ethanol 70% trong 2 phút, HgCl2 0,1% trong 10 phút và nuôi cấy mẫu hạt trên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS, đã cho tỷ lệ mẫu sạch là 94,6%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi là 93,3% với thời gian phát sinh chồi là 23 ngày Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường bổ sung 0,8 mg/l BAP, 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l Kinetin, 100 g/l khoai tây nghiền, 100 ml/l nước dừa, 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar cho tỷ lệ tạo cụm chồi là 96,8%, hệ số nhân chồi là 13,7 lần Chồi ra rễ 94,3%, số rễ đạt 3,5 rễ/cây và chiều dài rễ là 3,0 cm khi nuôi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l IBA, 0,3 mg/l NAA, 100 g/l khoai tây nghiền, 20 g/l sucrose sau 5 tuần Khi cây có chiều cao > 4 cm, khoảng 3 – 4 rễ đem bình cây ra huấn luyện ở điều kiện ánh sáng tán xạ trong 10 ngày, sau đó đưa cây ra trồng trên giá thể, tỷ lệ sống đạt 98,03% sau 6 tuần nuôi

Vũ Thị Phan và cs (2019) đã nghiên cứu thành công nhân giống cây lan Trầm tím

(D nestor) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro Kết quả cho thấy, khử trùng quả lan bằng

phương pháp đốt 3 lần bằng ethanol 96% cho tỷ lệ nảy mầm 90,8% sau 8 tuần nuôi cấy

Nhân nhanh thể chồi trên môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l BAP; 0,2 mg/l NAA; 0,2 mg/l Kin; 30g/l sucrose; 5,5 g/l agar, hệ số nhân đạt 6,33 lần sau 6 tuần nuôi cấy Kích thích tăng trưởng chồi bằng môi trường nhân nhanh thể chồi bổ sung 100 mg/l khoai tây cho hệ

số nhân chồi là 4,12 lần, chiều cao chồi đạt 4,23 cm, thân mập lá dài và xanh Ra rễ trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA; 0,1 mg/l NAA; 20 g/l sucrose 6,5 g/l agar với tỷ lệ

ra rễ 100%; số rễ đạt 5,45 rễ/cây và chiều dài rễ là 3,85 cm Cây con hoàn chỉnh được huấn luyện 2 tuần trước khi ra ngoài, sau đó trồng cây trên giá thể dớn trắng cho tỉ lệ sống 93,33%, cây khỏe, thân cứng, rễ bám tốt vào giá thể và xuất hiện lá mới sau 8 tuần

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Phương pháp khử trùng mẫu vật

Quả được rửa sạch dưới vòi nước chảy trong vòng 15 phút, lắc trong bình xà phòng

15 phút và rửa sạch lại dưới vòi nước chảy trong 15 phút Khử trùng bề mặt quả bằng ethanol 70% trong 2 phút Sau đó tiến hành khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% ở các khoảng thời gian khác nhau từ 5 – 15 phút Rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 3 lần Quả lan sau khi khử trùng, tách lấy hạt, hạt được cấy lên môi trường MS cơ bản + 3% saccharose + 0,8% agar Đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu và tỷ lệ tái sinh chồi thông qua các chỉ tiêu: tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu chết, tỉ lệ nảy chồi sau 3 – 6 tuần nuôi cấy

2.1.2 Phương pháp nhân nhanh protocorm

Protocorm được cấy chuyển sang môi trường MS cơ bản và môi trường MS có bổ sung 3% saccharose; 0,8% agar; Kinetin (0,5 – 4 mg/l) Đánh giá hiệu quả phát sinh protocorm sau 4 tuần nuôi cấy thông qua các thông số: tỉ lệ phát sinh protocorm, khối lượng của protocorm (g)

2.1.3 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro

Thể chồi protocorm (4 tuần tuổi) được nuôi cấy trên các môi trường MS có 3% saccharose; 0,8% agar; bổ sung BA (1 – 4 mg/l), IBA (0,25 – 1 mg/l) riêng lẻ và phối

hợp Đánh giá khả năng hình thành và sinh trưởng chồi in vitro sau 4 – 6 tuần nuôi cấy

thông qua: tỉ lệ phát sinh chồi, số chồi/mẫu, chiều cao chồi

2.1.4 Phương pháp tạo rễ in vitro – tạo cây hoàn chỉnh

Chồi in vitro (cao 1,5cm) nuôi cấy trên các môi trường: MS có 3% saccharose; 0,8% agar; bổ sung IBA (0,25 – 1 mg/l) Đánh giá khả năng ra rễ của chồi in vitro sau 4 –

8 tuần nuôi cấy thông qua: số rễ/chồi, chiều dài rễ, tỉ lệ phát sinh rễ

Các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi khử trùng ở 121°C

trong nồi áp suất 1 atm Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được duy trì ở nhiệt độ 25 ±

2°C, điều kiện chiếu sáng 2000 lux và thời gian chiếu sáng 12 h/ngày