Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED lên sự sinh trưởng và hàm lượng một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả thể nấm cordyceps militaris

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐÈN LED LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT C

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐÈN LED LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG QUẢ THỂ NẤM Cordyceps

militaris

LÊ THỊ HỒNG ÁI

Đà Nẵng, năm 2020

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐÈN LED LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG QUẢ THỂ NẤM Cordyceps

militaris

Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2016-2020

Sinh viên: Lê Thị Hồng Ái Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Lê Thị Hồng Ái

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trịnh Đăng Mậu và TS Nguyễn Minh

Lý, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt cũng như giúp tôi trau dồi kiến thức và kĩ năng thực hành thí nghiệm trong suốt những năm tôi học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn

Tác giả luận văn

Lê Thị Hồng Ái

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

TÓM TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 Ý NGHĨA ĐỀ TÀI 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NẤM Cordyceps militaris 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố 3

1.1.2 Một số hợp chất sinh học trong nấm Cordyceps militaris 3

1.1.3 Giá trị dược liệu 5

1.2 GIỚI THIỆU VỀ ÁNH SÁNG ĐÈN LED 7

1.2.1 Cấu tạo, lịch sử phát triển của đèn LED 7

1.2.2 Ứng dụng của đèn LED trong sản xuất các loại nấm có giá trị dược liệu 8

1.2.3 Vai trò của nguồn chiếu sáng đến sự phát triển của quá trình nuôi cấy nấm Cordyceps militaris 9

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 10

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 10

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 12

2.3.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của phổ ánh sáng đơn sắc đến khả năng sinh trưởng của quả thể nấm Cordyceps militaris 13

2.3.3 Phương pháp định lượng polysaccharide 13

2.3.4 Phương pháp định lượng cordycepin 14

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 14

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng lên khả năng sinh trưởng của nấm C militaris 15

3.2 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng lên khả năng tích lũy hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Cordyceps militaris 22

3.3 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng lên khả năng tích lũy hàm lượng cordycepin trong quả thể nấm Cordyceps militaris 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 27

PHỤ LỤC 34

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

HPLC : High - performance liquid chromatography

LED : Light - Emitting diode

75Đ:25X: 75% ánh sáng LED đỏ và 25% ánh sáng LED xanh dương 75X:25Đ: 75% ánh sáng LED xanh dương và 25% ánh sáng LED đỏ 50Đ:50X: 50% ánh sáng LED đỏ và 50% ánh sáng LED xanh dương

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1

Thời gian nảy mầm và số lượng mầm quả thể nấm

DANH MỤC HÌNH

3.1 Cảm ứng mầm quả thể ban đầu của nấm C militaris dưới

3.2 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến số lượng quả thể nấm C

3.5 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến khối lượng sinh khối tươi

3.6 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến khối lượng sinh khối khô

3.7 Hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Cordyceps

3.8 Hàm lượng cordycepin dưới các điều kiện ánh sáng khác

TÓM TẮT

Nghiên cứu này nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của màu sắc khác nhau trong ánh sáng đèn LED đến thời gian nảy mầm, số lượng mầm quả thể, sự hình thành cơ thể quả về số lượng, chiều cao và sinh khối Bên cạnh đó, nghiên cứu ảnh hưởng của phổ ánh sáng khác nhau lên sự tích lũy các thành phần hợp chất có hoạt tính sinh học như

polysaccharide và cordycepin được tạo ra trong nuôi cấy quả thể nấm C militaris Kết

quả cho thấy sự kết hợp màu sắc và cường độ ánh sáng thích hợp của đèn LED có thể làm tăng đáng kể số lượng mầm, thúc đẩy thời gian nảy mầm, sự phát triển quả thể và tăng giá trị tích lũy của các hợp chất có hoạt tính sinh học (cordycepin và polysaccharide) Kết quả trong nghiên cứu cho thấy rằng ánh sáng trắng rút ngắn thời gian xuất hiện mầm quả thể (2,83 ± 0,4 ngày) và số lượng mầm đạt giá trị cao nhất (63 ± 16,38 mầm) Tương tự như vậy, ánh sáng LED trắng cũng cho số lượng quả thể nhiều nhất (56,5 ± 13,9 cây) và làm tăng khối lượng sinh khối tươi của quả thể (13,07 ± 1,37 g) Mặc dù khối lượng sinh khối khô ở sự kết hợp ánh sáng màu 50Đ:50X cho giá trị tốt nhất (3,04 ± 0,6 g) và chiều cao cây có sự phát triển tốt ở ánh sáng xanh (4,07 ± 1,24 cm)

nhưng dựa trên những chỉ tiêu đánh giá sinh trưởng của quả thể nấm C militaris dưới

ánh sáng trắng là phù hợp nhất Trong các phổ ánh sáng đèn LED khác nhau, hàm lượng

polysaccharide trong quả thể của C militaris là 7,1 ± 1,67 mg/g ở ánh sáng trắng Hàm

lượng cordycepin cao nhất ở ánh sáng xanh đạt giá trị 1,93 mg/g và giảm dần từ ánh sáng 75X:25Đ, trắng, đỏ, 50Đ:50X và 75Đ:25X Phổ ánh sáng đèn LED thích hợp có thể rút ngắn thời gian nảy mầm, tăng đáng kể số lượng mầm, thúc đẩy sự hình thành quả thể và tăng năng suất tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học được tạo ra trong nuôi cấy quả

thể nấm C militaris

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Nấm Cordyceps militaris được gọi là nấm trùng thảo đã sử dụng rộng rãi trong

thực phẩm hoặc làm dược liệu ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước

của Châu Á (Xie và cs, 2009) Cordyceps militaris là một loại nấm ký sinh trên nhộng

hoặc ấu trùng của một loài côn trùng thuộc bộ Lepidoptera và một số ấu trùng của

bộ cánh cứng Coleoptera (Kobayashi, 1993)

Trong nấm Cordyceps militaris có chứa nhiều hợp chất quý có hoạt tính sinh học

như cordycepin, mannitol, adenosine, polysaccharide (Das SK và cs, 2010); (Dong và

cs, 2012) Cordycepin đã được chứng minh là có tác dụng chống khối u, chống bệnh bạch cầu, chống di căn, chống vi khuẩn, chống vi rút, chống trypanosomia, chống phục hồi, điều hòa miễn dịch và chống viêm (Paterson, 2008 ) Adenosine có thể điều chỉnh sự tăng sinh tế bào, biệt hóa và apoptosis (Szentmiklosi et al., 2015 ; Yang và cs, 2010 ) Được xem là loại nấm có giá trị dược liệu cao nên và giá trị kinh tế lớn đã thúc đẩy việc khai thác quá mức ngoài tự nhiên và dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng của loài nấm này (Nguyễn

Thị Minh Hằng, 2017) Vì vậy, nấm Cordyceps militaris đã được rất nhiều nước trên thế

giới như Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản sản xuất với quy mô công nghiệp để tạo ra dược liệu với số lượng lớn

Trong quy trình nuôi trồng Cordyceps militaris, ngoài những yếu tố thiết yếu như

giống nấm, môi trường, ánh sáng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh

trưởng, phát triển và khả năng tổng hợp các hợp chất sinh học ở nấm C militaris (Chiang

và cs, 2017; Lian và cs, 2014) Hiện nay, việc nuôi trồng Cordyceps militaris chủ yếu sử

dụng ánh sáng đèn huỳnh quang (Wu và cs, 2016) Ánh sáng này tiêu tốn nhiều năng lượng sinh học, sử dụng nguồn điện lớn và thời gian ra quả thể lâu Để khắc phục bất cập trong việc ứng dụng ánh sáng huỳnh quang trong nuôi trồng, nhiều nghiên cứu ứng dụng ánh sáng LED trong nuôi trồng tảo, thực vật và nấm (Hernandez và cs, 2012); (Hogewoning và cs, 2010) Trong đó một số nghiên cứu đã đề cập đến việc ứng dụng ánh

sáng LED trong nuôi trồng nấm C militaris Các nghiên cứu cho thấy LED tạo ra ánh

sáng cực mạnh với mức giải phóng nhiệt và tiêu thụ năng lượng tối thiểu so với các loại khác đèn được áp dụng trong phòng nuôi cấy mô và nhà kính Nó có tuổi thọ bóng đèn

dự kiến lên tới 50.000 h so với 200 h cho một bóng đèn thủy ngân thông thường và nó có nhiều lợi thế chiếu sáng như nhiệt độ phát ra mát hơn, bước sóng và chuyển đổi năng lượng cao hơn (Bourget, 2008; Massa và cs, 2008; Shimizu và cs, 2011) Kết quả của Yi

và cộng sự cũng đã chứng minh các chức năng của đèn bước sóng khác nhau đối với sự tăng trưởng và sinh tổng hợp các chất hoạt tính sinh học và sử dụng đèn LED giải phóng nhiệt và tiêu thụ năng lượng thấp để thay thế đèn huỳnh quang truyền thống có thể cải thiện chất lượng sản phẩm và tăng hàm lượng các hoạt chất sinh học

Xuất phát từ những cơ sở lý luận trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng sinh trưởng và hàm lượng một số hợp chất có hoạt

tính sinh học trong quả thể nấm Cordyceps militaris”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định được điều kiện ánh sáng tối ưu nhất cho quá trình sinh trưởng và một số

hợp chất có hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps militaris

3 Ý NGHĨA ĐỀ TÀI

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp dẫn liệu khoa học về điều kiện nuôi trồng nấm Cordyceps militaris

- Tài liệu cho học tập, nghiên cứu về lĩnh vực sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh học nấm

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của nghiên cứu sẽ được dùng để hỗ trợ vào quy trình xây dựng nuôi trồng

tối ưu nấm Cordyceps militaris

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NẤM Cordyceps militaris

1.1.1 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố

Nấm Cordyceps militaris (còn gọi là Đông trùng hạ thảo) là các loài nấm dược liệu

sống ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành của một số loài nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức

ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh

ở dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Vì mùa đông nấm ký sinh trên sâu, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là Đông trùng hạ thảo, người

ta thường đào lấy cả xác sâu và nấm để làm thuốc

Loài nấm C militaris tìm thấy ở vùng núi có độ cao 2000-3000m, thường tìm thấy

Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nước trong khu vực Đông Nam Á

Nấm Cordyceps militaris là loài được nghiên cứu kĩ nhất trong tất cả các loài của giống Cordyceps (Kobayasi Y, 1941) Sự đa dạng về hình thái và khả năng thích nghi của

loài này ở nhiều sinh cảnh khác nhau có thể là nguyên do khiến chúng có mặt ở nhiều vùng địa lý và sinh thái trên trái đất (Kobayasi Y, 1941); (Mains E.B, 1958) Ký chủ phổ

biến của loài C militaris trong tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng của các loài bướm Trong tự nhiên có nhiều loài Cordyceps có hình thái tương tự hoặc gần giống loài

C.militaris, bao gồm C cardinalis và một số loài khác (Sung J.M, 2007)

1.1.2 Một số hợp chất sinh học trong nấm Cordyceps militaris

Các thành phần hóa học chứa trong nấm C militaris, quan trọng nhất là nhóm chất

cordycepic acid, cordycepin, polysaccharide và adenosine có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh ung thư và các bệnh do virus Ngoài ba thành phần trên khi phân tích nấm người

ta còn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị acetylgalactosamine, ergosterol, hypoxanthine, chitinase, mannitol,

Cordycepin lần đầu tiên được tách ra từ C militaris năm 1950 do Cunningham và

cộng sự thực hiện Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong tự nhiên, nồng độ

cordycepin trong quả thể C militaris cao hơn C sinensis với hàm lượng lần lượt là 2,65

và 1,64 mg/g, trong khi trong nuôi cấy lỏng hàm lượng các chất thu được là 1,59 mg/g

tương tự C sinensis trong tự nhiên (Lo và cs, 2013) Cordycepin có khả năng kháng nấm,

kháng ung thư và kháng virus Gần đây hơn, cordycepin cũng cho thấy khả năng điều hòa sản phẩm của interleukins trong tế bào lympho T (Masuda và cs, 2006) Cordycepin phát huy tác dụng gây độc tế bào thông qua methyl hóa acid nucleic, ức chế sự phát triển của

Clostridium paraputrificum và Clostridium perfringens, nhưng không có tác động nào tới Bifidobacterium spp và Lactobacillus spp so Ahn và cộng sự đã chứng minh năm 2000

(Kwon và cs, 2009; Qinqin và cs, 2012)

Các polysaccharide chính trong nấm C militaris là một dạng glucans với các mối

liên kết glycosidic Vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharides đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide thu nhận từ thực vật lại không

có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các polysaccharide Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động của các

tế bào ung thư bao gồm homopolyme có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và acid glucuronic Trong một số loài nấm, polysaccharide liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide - protein hoặc polysaccharide - peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn Cấu trúc glucan đặc biệt có khả năng kháng khối u được biết đến nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho biết những glucan có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên kết với các đơn vị như acid glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose hoặc ribose (Tuli và cs, 2014; Holliday và cs, 2008; Qinqin và cs, 2012) Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể và được cho là phong phú ở hầu hết

các loài Cordyceps Khi thu nấm Cordyceps ngoài tự nhiên, nồng độ adenosine là 2,45 ± 0,03 mg/g trong quả thể nấm C militaris cao hơn C sinensis, ở C sinensis hàm lượng chỉ có 1,643 ± 0,03 mg/g, trong khi đó, hàm lượng trong sợi nấm C militaris nuôi cấy lỏng là 1,592 ± 0,03 mg/g gần tương tự C sinensis trong tự nhiên (Lo và cs, 2013)

Adenosine được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch (Shashidhar và

cs, 2013)

1.1.3 Giá trị dược liệu

Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong điều trị

bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá trị kinh tế cao Nấm

Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên Vì vậy, việc sản xuất ở quy mô lớn các

chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là

một vấn đề cấp thiết

Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3’- deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch (Shonkor Kumar và cs, 2010) Cho đến nay, các nhà khoa học vấn chưa thể biết chính

xác cơ chế ức chế sự phát triển của tế bào ung thư của Cordyceps, cơ chế này có thể là

tăng cường chức năng của hệ thống miễn dịch và miễn dịch tự nhiên; ức chế có chọn lọc tổng hợp RNA, từ đó ảnh hưởng tới tổng hợp protein; hoạt động chống oxy hóa và chống các gốc tự do; chống đột biến; làm nhiễu quá trình sao chép của virus cảm ứng khối u; cảm ứng methy hóa acid nucleic (Zhou và cs, 2009)

Hoạt tính chống oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2 chứa

trong dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo phức ở nồng

độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85% (Fengyao và cs, 2011)

Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên cho thấy khi dùng chế phẩm từ

Cordyceps militaris, số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hình

dạng bình thường tăng Hiệu quả này được duy trì thậm chí sau 2 tuần ngưng sử dụng chế phẩm Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn (Lin và cs, 2007)

Hạn chế virus cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps

militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A Chất

này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào (Yuko và cs, 2007)

Kháng khuẩn kháng nấm và kháng ung thư: C militaris protein (CMP) tách chiết từ

nấm có kích thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7-9 Protein này ức chế

nấm Fusarium oxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quan (Park và cs, 2009) Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium Các hợp

chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh

tiểu đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch (Seulmee và cs, 2009)

Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có

hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzyme fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy

mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzyme fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người (Jae - Sung và cs, 2006)

Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris được thử nghiệm về tác dụng kiểm soát lipopolysaccharide

(LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7 Các đại thực bào

được xử lý với nồng độ khác nhau của dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris làm

giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết Những

kết quả này cho thấy rằng dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris có tác dụng ức

chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol và cs, 2010)

Ngoài ra, C militaris còn có nhiều chức năng khác như chống lão hóa (Khan và cs,

2010), hạ huyết áp (Kodama và cs, 2000), cải thiện bài tiết insulin và chống tiểu đường

(Choi và cs, 2004) So với C sinensis, quả thể C militaris cho thấy hàm lượng hoạt chất

cao hơn nhiều như polysaccharide, axit amin tổng số, adenosine, cordycepin, cordycepic

acid, kẽm và sắt (Dong và cs, 2012) Trong những năm gần đây, quả thể C militaris có

sẵn trên thị trường đã trở thành nguồn nguyên liệu rất quan trọng cho y tế và thực phẩm

chức năng ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Đông Nam Á (Li và cs, 2006) Mặc dù nấm C

sinensis được sử dụng rộng rãi hơn C militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng của

chúng cũng khá tương tự nhau Các chiết xuất từ nấm C militaris có thể được sử dụng

trong các trường hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Das và cs, 2010)

1.2 GIỚI THIỆU VỀ ÁNH SÁNG ĐÈN LED

1.2.1 Cấu tạo, lịch sử phát triển của đèn LED

Đèn LED (Light - Emitting diode) được cấu tạo từ hai khối bán dẫn Một khối

chứa các điện tử điện tích âm (n-type) và khối còn lại mang điện tích dương (p-type) Henry Josef Round là người báo cáo đầu tiên về đèn LED vào năm 1907 (Round và cs, 1907) Tuy nhiên, nghiên cứu của Round đã bị lãng quên trong nhiều thập kỷ cho đến khi chúng được cải tiến và ứng dụng lần đầu tiên bởi Nick Holonyak vào năm 1962 Loại đèn LED này đã được thương mại hóa trong những năm thập niên 60 của thế kỷ XX Công nghệ chế tạo đèn LED thật sự bùng nổ trong những năm thập niên 70 của thế kỷ XX Các

xu thế hướng tới nhiều ứng dụng thực tế (như máy tính, đồng hồ kỹ thuật số và các máy kiểm tra thiết bị) cũng bắt đầu phát triển Các kỹ thuật chế tạo vật liệu ngày càng được cải tiến, cường độ ánh sáng phát ra ngày càng tăng và đèn LED được sử dụng cho mục đích thắp sáng Trong những năm 1980, một loại vật liệu mới ra đời, GaAlAs (gallium aluminum arsenide) đã được phát triển Công nghệ GaAlAs tạo đèn LED cung cấp hiệu suất cao hơn trước đây, điện năng yêu cầu rất thấp vì vậy có thể tiết kiệm được lượng điện năng tiêu thụ Đèn LED có thể dùng cho các bảng hiệu hay thông báo vì dễ dàng thiết kế được mạch điện và ghép lại với các hình dạng bất kỳ từ chúng Ngoài ra, đèn LED đã được ứng dụng trong thiết kế mã vạch, máy quét, hệ thống cáp quang truyền dữ liệu và trang thiết bị trong y tế Trong giai đoạn này, sự cải thiện chất liệu tinh thể bao bên ngoài cho phép đèn LED phát ra ánh sáng màu vàng, xanh lá cây, màu đỏ, và thay đổi các thông số khung dẫn để nâng cao độ sáng hiệu quả nhưng các cấu trúc cơ bản của vật liệu bán dẫn vẫn không thay đổi Diode laser phát ra ánh sáng trong vùng quang phổ nhìn thấy đã được thương mại hóa ở những năm cuối của thế kỷ 80 Các nhà thiết kế đã

sử dụng kỹ thuật tương tự sản xuất đèn LED có độ bền và cường độ ánh sáng cao Tuy nhiên, trong thời gian này, đèn LED phát ra ánh sáng xanh dương vẫn chưa được tạo ra Mãi đến năm 1993, Shuji Nakamura thuộc công ty hóa chất Nichia Nhật Bản lần đầu tiên giới thiệu đèn LED phát ra ánh sáng xanh Với phát minh trên, ông cùng hai nhà khoa học khác là Isamu Akasaki và Hiroshi Amano đã đoạt giải Nobel vật lý năm 2014 Công nghệ chế tạo đèn LED xanh dương gặp rất nhiều khó khăn trong nâng cao dòng photon phát ra và chúng tương đối nhạy cảm với mắt người

Khi so sánh tuổi thọ đèn sợi đốt (1.000 giờ), đèn huỳnh quang (8.000 giờ), đèn LED

có tuổi thọ dài rất đáng kể lên đến 100.000 giờ Ngoài tuổi thọ dài, đèn LED còn có nhiều

ưu điểm hơn các nguồn chiếu sáng thông thường như kích thước nhỏ, phát ra bước sóng

cụ thể, phát nhiệt thấp, điều chỉnh được cường độ ánh sáng và chất lượng chiếu sáng, tiêu thụ điện năng thấp… Với những lợi thế trên, đèn LED ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn trong nông nghiệp, hỗ trợ tăng trưởng thực vật trong môi trường có kiểm soát như phòng nuôi cấy mô và buồng sinh trưởng (Growth chamber), phòng nuôi tảo và kể cả phòng nuôi nấm dược liệu Sử dụng cấu trúc bán dẫn phát quang có thể tiết kiệm điện năng đến 11% và giảm lượng khí thải CO2 từ 261 - 348 triệu tấn vào năm 2020 (Tsao và

cs, 2004)

Đèn LED có thể kiểm soát được bức xạ phát ra và khắc phục được hầu hết những nhược điểm của một số nguồn sáng thông thường nên là nguồn sáng đầy hứa hẹn để thay thế những thiết bị chiếu sáng truyền thống hiện nay trong nuôi cấy nấm dược liệu Ngoài đặc tính phát ra vùng quang phổ hẹp, ưu điểm chính của việc sử dụng đèn LED là có thể chọn lựa bước sóng phát ra phù hợp với sự hấp thụ của nấm Đã có một số bài viết về việc ánh sáng xanh ảnh hưởng quá trình sinh lý, hình thành quả thể và biểu hiện gen của nấm (Idnurm và cs, 2006; Velayos và cs, 2000) Trong những năm gần đây, có một vài báo cáo về bước sóng ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa của nấm như sinh khối, exopolysaccharide và endopolysaccharide, thành phần của polysaccharide và độ nhạy của sợi nấm (Smirnov và cs, 2009; Poyedinok và cs, 2008; Puchkova và cs, 2010)

Từ đó, có thể nghiên cứu đáp ứng của từng loại nấm với từng vùng quang phổ Shrestha

và cộng sự (2006) đã phát hiện ra rằng ánh sáng là yếu tố quan trọng nhất trong việc xác định mật độ, kết cấu và sắc tố của nuôi cấy hệ sợi nấm trong điều kiện tối Dong và cộng

sự (2012) chỉ ra rằng ánh sáng đỏ có lợi cho sự tăng trưởng sợi nấm và hàm lượng adenosine, trong khi ánh sáng xanh thuận lợi cho quá trình sinh tổng hợp cordycepin

trong hệ sợi nấm Cordyceps militaris

1.2.2 Ứng dụng của đèn LED trong sản xuất các loại nấm có giá trị dược liệu

Đèn LED có nhiều ưu điểm so với các nguồn chiếu sáng khác bao gồm nhỏ gọn, trọng lượng rất thấp, sản xuất đơn giản và rẻ tiền, không bị các vấn đề cháy, chống rung cao và khả năng chịu đựng các hoạt động lặp đi lặp lại thường xuyên (Yan, Xiantao, 2014) Ngoài việc có các ứng dụng rộng rãi cho các sản phẩm điện tử như đèn chỉ thị,

v.v., đèn LED còn trở thành nguồn sáng thay thế quan trọng cho các ứng dụng khác nhau, những nơi thường sử dụng đèn sợi đốt và đèn huỳnh quang

Trong quá trình trồng nấm, các điều kiện bao gồm: nhiệt độ, pH, môi trường và điều kiện sục khí luôn được coi là yếu tố quan trọng Ngược lại, ảnh hưởng của ánh sáng trong việc quang hợp ở vi khuẩn thì ít được nhấn mạnh và nghiên cứu Trong những năm gần đây, một số tế bào cảm quang (photoreceptors) trong nấm đã được phát hiện (Atoui A và

cs, 2010) Nó đã được báo cáo rằng thời gian nuôi trồng của nấm Linh chi (Ganoderma

lucidum) có thể giảm bằng cách chiếu sáng với ánh sáng đỏ và ánh sáng xanh (Poyedinok

và cs, 2008) Hơn nữa, nấm sò trắng (Pleurotus Ostreatus) phát triển tốt hơn dưới ánh

sáng đỏ (Arjona D và cs, 2009) Tuy nhiên, chỉ có báo cáo về các điều kiện bước sóng ánh sáng hạn chế việc sản xuất exopolysaccharides trong quá trình nuôi trồng nấm bào

ngư (Pleurotus eryngii)

1.2.3 Vai trò của nguồn chiếu sáng đến sự phát triển của quá trình nuôi cấy

nấm Cordyceps militaris

Chất lượng ánh sáng (chất lượng quang phổ), số lượng (photon) và thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng sâu sắc đến sự phát triển và phát sinh hình thái của quả thể nấm Giai

đoạn phát triển quả thể của nấm Cordyceps militaris gồm quá trình nuôi hệ sợi ban đầu

trong 14 ngày và giai đoạn sinh trưởng quả thể 40 đến 50 ngày dưới điều kiện nuôi sáng

liên tục Vì nhiệt độ trong phòng nuôi nấm Cordyceps militaris luôn cao hơn 220C ở hầu hết các ngày nên cần một hệ thống làm mát để duy trì nhiệt độ cho sự phát triển bình thường của quả thể Chi phí năng lượng cho cả điều kiện nuôi ánh sáng và hệ thống làm

mát đang trở thành chi phí chính cho việc sản xuất thường xuyên các thân cây ăn quả C

militaris (Yi và cs, 2014) Ngoài vai trò điều tiết đối với sự tăng trưởng, phát triển và sinh

sản, ánh sáng cũng có thể ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (Idnum

và Heitman, 2005), tức là làm tăng hàm lượng của các hoạt chất sinh học và cải thiện chất lượng dinh dưỡng hoặc màu sắc của nấm và cây Cordycepin (Ni và cs, 2009; Cai và

cs, 2013; Yao và cs, 2013), carotenoids (Dong, 2013) và polysaccharide (Lee và cs,

2010) là các hoạt chất sinh học chính trong Cordyceps militaris Carotenoids cũng góp phần tạo ra màu vàng sẫm của các quả thể nấm C militaris Những chất này đại diện cho

việc đánh giá chất lượng của các sản phẩm Cordyceps thương mại được bán ra trên thị trường Shrestha và cộng sự (2006) đã phát hiện ra rằng ánh sáng là yếu tố quan trọng

nhất trong việc xác định mật độ, kết cấu và sắc tố của văn hóa sợi nấm của C militaris và

không có sắc tố của sợi nấm trong điều kiện tối Dong và cộng sự (2012) chỉ ra rằng sự phát triển của sợi nấm đỏ và hàm lượng adenosine, trong khi ánh sáng màu xanh thuận

lợi cho quá trình sinh tổng hợp cordycepin trong sợi nấm C militaris Dong và cộng sự

(2012) đã báo cáo rằng ánh sáng hồng (1/3 xanh + 2/3 đỏ) tăng hàm lượng chất khô và sự tích lũy của carotenoids và cordycepin, trong khi ánh sáng đỏ tăng hàm lượng adenosine

trong quả thể C militaris Những kết quả cho thấy tiềm năng tăng cả năng suất và chất lượng của sản phẩm C militaris thông qua điều chỉnh ánh sáng trong môi trường nuôi

cấy Việc nắm vững tác động của ánh sáng đến quá trình sinh lý nấm có thể điều khiển được sự sinh trưởng và phát triển của nấm trong điều kiện nhân tạo

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 2014, Zhi-Li Yi và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đèn

LED trong quy trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris thay thế ánh sáng đèn huỳnh

quang để tăng năng suất sinh học và làm giảm chi phí năng suất tiêu thụ điện Với những ảnh hưởng của các sự kết hợp ánh sáng khác nhau kết quả cho thấy ánh sáng xanh là điều cần thiết đối với sự nảy mầm của mầm quả thể, ánh sáng đỏ làm tăng hàm lượng adenosine, ánh sáng xanh làm tăng hàm lượng cordycepin và carotenoids trong quả thể Kết quả của bài báo này phù hợp với một nghiên cứu trước đó, hàm lượng cordycepin giảm dần từ ánh sáng xanh, ánh sáng hồng, ban ngày, ánh sáng đỏ, hàm lượng adenosine giảm dần từ ánh sáng đỏ, ánh sáng hồng, ban ngày, ánh sáng xanh và hệ sợi nấm phát triển thích hợp trên ánh sáng đỏ (Yu và cs, 2009)

Trong nghiên cứu của Kho và cộng sự (2016), khi khảo sát các nguồn ánh sáng là xanh nước biển (460-475nm), xanh lá cây (515-545nm), vàng (587-595nm), đỏ (620-645nm) và trắng (380-760nm) kết quả cho thấy ánh sáng xanh và đỏ cho sự sinh trưởng quả thể tốt nhất Ở phổ ánh sáng đỏ cho sinh khối quả thể cao nhất, tuy nhiên hàm lượng exopolysaccharide thu được nhiều nhất ở phổ ánh sáng xanh (Kho và cs, 2016)

Qua các công trình nghiên cứu về điều kiện ánh sáng được đề cập trên, chúng ta có

thể thấy được tính cấp thiết và quan trọng đối với quy trình nuôi nấm Cordyceps militaris

đã và đang được tiếp tục chú trọng nghiên cứu trên thế giới

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu được tiến hành để khảo sát điều kiện ánh sáng đến quá trình sinh trưởng, tích lũy hàm lượng cordycepin và adenosine trong quả thể

nấm Cordyceps militaris Như ở nghiên cứu của Phạm Thị Lan và cộng sự (2016) nhiệt

độ và ánh sáng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris Nghiên

cứu này chỉ ra ở ánh sáng xanh dương cho hàm lượng Cordycepin cao nhất Theo nghiên cứu của Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2017), ở cường độ 500-700 của ánh sáng trắng

thích hợp cho khả năng sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris Nhưng các công trình

nghiên cứu này chỉ nghiên cứu về phổ ánh sáng hoặc cường độ của ánh sáng trắng vì vậy cần có một nghiên cứu đầy đủ về điều kiện ánh sáng ảnh hưởng quá trình sinh trưởng và

tích lũy hợp chất trong quả thể nấm Cordyceps militaris

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguồn mẫu sử dụng trong nghiên cứu này là nấm Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris được nhân giống và nuôi trồng tại phòng thí nghiệm Công

nghệ sinh học nấm thuộc Khoa Sinh- Môi trường, Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng

Hình 2.1 Quả thể nấm Cordyceps militaris

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến khả năng sinh trưởng của quả thể nấm

Cordyceps militaris

Khảo sát ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến khả năng tích lũy polysaccharide và

cordycepin trong quả thể nấm Cordyceps militaris

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

Môi trường rắn dùng để nuôi cấy quả thể bao gồm các thành phần sau gạo lức: nhộng + nước cất = 15: 34 và bổ sung các loại khoáng KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3, KCl

Các mẫu được nuôi cấy trong hũ nhựa loại 700ml Mỗi nghiệm thức được cấy với

36 hũ môi trường

Sau khi cấy, hệ sợi nấm C militaris, được nuôi trong bóng tối trong 14 ngày đến

khi sợi nấm bao phủ toàn bộ bề mặt, các hũ được nuôi cấy dưới sự kết hợp ánh sáng khác nhau của đèn LED

2.3.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của phổ ánh sáng đơn sắc đến khả năng

sinh trưởng của quả thể nấm Cordyceps militaris

Điều kiện nuôi cấy: các mẫu được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ 220C ± 2C, độ ẩm trung bình khoảng 60-80% và cường

độ ánh sáng 800 lux

Các thí nghiệm về ánh sáng được thiết lập thành 6 công thức như sau:

100% ánh sáng LED trắng

100% ánh sáng LED đỏ

100% ánh sáng LED xanh dương

50% ánh sáng LED đỏ và 50% ánh sáng LED xanh dương

75% ánh sáng LED đỏ và 25% ánh sáng LED xanh dương

75% ánh sáng LED xanh dương và 25% ánh sáng LED đỏ

Sau khi hệ sợi phun kín môi trường, các mẫu được nuôi cấy dưới 6 điều kiện chiếu sáng khác nhau trong 50 ngày Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra loại ánh sáng thích

hợp cho sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris

Các chỉ tiêu cần theo dõi: thời gian bắt đầu sinh quả thể, thời gian hình thành quả thể, kích thước, số lượng và hình thái quá thể, khả năng tích lũy cordycepin và polysaccharide

2.3.3 Phương pháp định lượng polysaccharide

Cân 1g quả thể nấm đã sấy khô, nghiền, bổ sung 5ml nước cất để ở nhiệt độ phòng Sau đó đem siêu âm 1 tiếng, thu nhận được dịch chiết và đem đi ly tâm 15000 vòng trong 10 phút Sau đó thu dịch chiết bên trên và kết tủa bằng cồn 960 Thu phần cặn

và tái hòa tan trong 1ml nước cất Hỗn hợp được bổ sung thêm 1 ml phenol 5% và 5ml