Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và hàm lƣợng hợp chất có hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm cordyceps militaris trong

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG HỢP CHẤT CÓ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HỆ SỢI NẤM

Cordyceps militaris TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LỎNG

HỒ MINH NGUYÊN

Đà Nẵng, năm 2020

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HỆ SỢI NẤM

Cordyceps militaris TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LỎNG

Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2016-2020

Sinh viên: Hồ Minh Nguyên Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Hồ Minh Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Minh Lý – giáo viên hướng dẫn đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp Và lòng biết ơn chân thành nhất đến thầy Trịnh Đăng Mậu đã đi cùng tôi từ lúc bắt đầu xây dựng đề tài đến thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu cho khóa luận Đồng thời tôi xin cảm ơn thầy Vũ Đức Hoàng và cô Lê Thị Mai đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn tất kết quả nghiên cứu này

Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Khoa Sinh – Môi trường cùng Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng đã tạo điều kiện để tôi có thể thuận lợi tiến hành và hoàn thiện đề tài nghiên cứu của mình

Chân thành cảm ơn đến các quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã trang bị cho tôi nền tảng kiến thức vững chắc để có thể phục vụ cho quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn đến anh Lê Văn Kiêm và những người bạn quý mến đã giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận Đặc biệt là gia đình vì đã cổ vũ và tạo động lực cho tôi hoàn thành khóa luận thành công nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn!

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và hàm lượng cordycepin của hệ sợi

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ C:N đến sự sinh trưởng và tích lũy cordycepin của hệ

3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA PH MÔI TRƯỜNG NUÔI ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA PH MÔI TRƯỜNG NUÔI TỚI HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDES VÀ CORDYCEPIN ĐƯỢC NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ C:N ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA HỆ SỢI NẤM

3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ C:N ĐẾN HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDES VÀ CORDYCEPIN CỦA HỆ SỢI NẤM NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ 24

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

2.1 Thành phần hóa học của môi trường với các tỷ lệ C:N khác

nhau cho quá trình nuôi cấy lắc của Cordyceps militaris 13

3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng của hệ sợi

nấm Cordyceps militaris trong môi trường dịch thể 19

3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ C:N đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm

3.5 Trọng lượng khô của hệ sợi nấm Cordyceps militaris được

nuôi trong các môi trường có tỷ lệ C:N khác nhau 22

Hàm lượng polysaccharides nội bào của hệ sợi nấm

Cordyceps militaris được nuôi trong các môi trường dinh

dưỡng có tỷ lệ C:N khác nhau

25

3.8

Hàm lượng (a) và năng suất (b) cordycepin có trong hệ sợi

nấm Cordyceps militaris được nuôi trong các môi trường

dinh dưỡng có tỷ lệ C:N khác nhau

26

TÓM TẮT

 Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps militaris chịu

ảnh hưởng rất nhiều từ cá yếu tố môi trường bên ngoài pH và tỷ lệ C:N trong môi trường

dinh dưỡng mang tính quyết định đến nhiều chỉ tiêu năng suất của hệ sợi nấm C.militaris

Nghiên cứu được thực hiện để tìm được ngưỡng pH và tỉ lệ C:N tối ưu nhất cho sự sinh

trưởng hệ sợi nấm, hàm lượng cordycepin và polysaccharides của nấm Cordyceps militaris trong điều kiện nuôi cấy lỏng Tỷ lệ dinh dưỡng C:N và pH trong môi trường

nuôi cấy lỏng là những yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến các chỉ tiêu về đường kính thể lạc, mật độ thể lạc, sinh khối hệ sợi và đặc biệt là sinh tổng hợp cordycepin và

polysaccharides nội bào của hệ sợi nấm C militaris Với điều kiện môi trường nuôi cấy

lắc có tốc độ 150 vòng/phút ở 240C, pH 7 được chứng minh là tối ưu cho sinh trưởng của

hệ sợi với sinh khối đạt trọng lượng là 10,719 ± 0,24 mg/mL Hệ sợi nấm nuôi ở môi trường pH 7 thu được thể lạc có đường kính (3,1 ± 0,86 mm) và mật độ (14,8 ± 8,44

tl/mL) thích hợp cho việc cấy chuyền nuôi trồng quả thể nấm Cordyceps militaris Môi

trường pH 6 là tối ưu cho hệ sợi nấm sản sinh polysaccharides nội bào (9,1 ± 1,14 mg/g) Năng suất cordycepin của hệ sợi nấm ở môi trường nuôi cấy có pH 7 đạt cao nhất với 15,866 ± 0,351 mg/L Tỷ lệ C:N càng giảm thu được trọng lượng khô hệ sợi càng cao (Tỷ

lệ 12:1 đạt 10,776 ± 0,64 mg/mL) cùng với hàm lượng và năng suất cordycepin đạt tối

đa (tỷ lệ 18:1 đạt hàm lượng 0,185 mg/g và năng suất 14,997 ± 4,047 mg/L) Ngược lại, nồng độ polysaccharides nội bào được sản sinh mạnh mẽ ở môi trường có tỷ lệ C:N cao (tỷ lệ 36:1 đạt 7,49 ± 0,23 mg/g)

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Loài Cordyceps là nấm kí sinh thuộc họ Clavicipitaceae và ngành Ascomycota (nấm

túi) Các sợi nấm ký sinh phát triển trong cơ thể ấu trùng vào mùa thu, và hình thành bào

tử hữu tính trưởng thành, gọi là stroma, nhô ra khỏi cơ thể côn trùng vào mùa hè (Won và

cs, 2005) Các stroma có hoặc không có ấu trùng được sử dụng như dược liệu điều trị ở

các nước châu Á trong nhiều thế kỷ qua (Buenz và cs, 2005) Vì thế, Cordyceps được sử

dụng rộng rãi như một loại thực phẩm bổ dưỡng, được chứng nhận như một loại thuốc bổ hay thực phẩm chức năng cho sức khỏe ở châu Á Trong số các loại nấm ký sinh ở sâu

bướm, C sinensis đã nhận được nhiều sự chú ý do hoạt tính sinh học của nó Có rất nhiều tài liệu nghiên cứu về những hoạt tính sinh học của C sinensis bao gồm tráng dương,

giảm đau, chống ung thư, hạ huyết áp và các hoạt động giãn mạch, giảm gốc tự do, và

điều chế miễn dịch (Yu và cs, 2006) Tuy nhiên, C sinensis tự nhiên rất khan hiếm và

cực kỳ tốn kém Do đó, nhiều nhà nghiên cứu đã tập trung nỗ lực vào việc tìm loài thay thế có giá trị kinh tế hơn (Li và cs, 2006)

Cordyceps militaris là một nấm ký sinh đã nhận được sự chú ý đáng kể trong những

năm gần đây do được thừa nhận rằng nó có tác dụng sinh học có đặc tính tăng cường sức

khỏe (Nan và cs, 2001) Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối của Cordyceps militaris có 17 axit amin khác nhau, lipit và nhiều nguyên tố vi lượng thiết yếu Quan

trọng hơn là trong sinh khối có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao, đặc biệt phải kể đến là hợp chất cordycepin có trong quả thể nấm (Tang và cs, 2018) Bên cạnh đó, nhiều hoạt chất thiết yếu cũng đã được phát hiện như adenosine, polysaccharides, nucleotides, Các hợp chất này được nghiên cứu chứng minh có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, điều tiết đường huyết, kiểm soát bệnh tiểu đường và tác động tích cực đến

hệ miễn dịch (Kim và cs, 2003)

Ngoài ra, polysaccharides nội bào và ngoại bào đã được chứng minh là có tác dụng

ức chế sự phát triển của một số tế bào ung thư (Sone và cs, 1985) Các polysaccharides

có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào ung thư chúng bao gồm homopolymer có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose,

fructose, ribose và acid glucuronic Nó là chất kích thích miễn dịch mạnh nhất từng được biết đến, là một chất phòng chống khối u lành tính và ác tính rất mạnh mẽ, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lượng đường trong máu

Hiện nay giống nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam đã được nuôi trồng khá phổ biến Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, nuôi trồng nấm C militaris sử dụng công nghệ

nhân giống dạng dịch thể mang lại hiệu quả cao, rút ngắn được thời gian, giảm tỷ lệ nhiễm và thích hợp cho nuôi trồng với quy mô lớn (Kwon và cs, 2009) Tuy nhiên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm trong môi trường dịch thể bị chi phối rất nhiều bởi thành phần dinh dưỡng, các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ, pH, tỷ lệ C:N…(Dong và

cs, 2005) Trong đó pH môi trường đóng vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến

sự hình thành tơ nấm trong môi trường dịch thể, ảnh hưởng đến chức năng của màng tế bào, hình thái và cấu trúc tế bào, độ hòa tan của các muối, các ion, sự hấp thụ các chất dinh dưỡng và quá trình sinh tổng hợp các chất khác nhau

Tỷ lệ C:N trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến tốc độ sinh tổng hợp của nhiều chất chuyển hóa, đặc biệt là sự tăng trưởng sợi nấm và sản xuất Exo-biopolymer Trong một số nghiên cứu, tỷ lệ C:N thấp sẽ thuận lợi cho quá trình sản xuất adenosine và cordycepin, nhưng nếu nồng độ nguồn nitơ quá cao sẽ ức chế sản phẩm Vì thế, sự sinh tổng hợp cordycepin được kiểm soát bởi sự cân bằng giữa các điều kiện nuôi cấy và nồng

độ dinh dưỡng trong môi trường

Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá được mức độ ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy này đến sự sinh trưởng sợi nấm và sự sinh tổng hợp cordycepin Để xác định được điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho sản xuất

và lưu trữ bảo quản giống, tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng và hàm lượng hợp chất có

hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong điều kiện nuôi cấy lỏng”

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Tìm được ngưỡng pH, tỉ lệ C:N tối ưu nhất cho sự sinh trưởng hệ sợi nấm, hàm

lượng cordycepin và polysaccharides của nấm Cordyceps militaris trong điều kiện nuôi

cấy lỏng

3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài sẽ là dẫn liệu khoa học cho các nghiên cứu sau này về chủng nấm

Cordyceps militaris

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm dữ liệu về quy trình nhân giống cũng như sản

xuất chủng nấm Cordyceps militaris trên địa bàn thành phố Đà Nẵng

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng và hàm lượng hợp chất có

hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong môi trường dịch thể

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ C:N đến sinh trưởng và hàm lượng hợp chất có hoạt

tính sinh học của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong môi trường dịch thể

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps là một giống nấm túi, được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện

lần đầu tiên ở vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu quý này thực chất là ấu

trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes hoặc Hepialus bị nấm Cordyceps ký sinh Chi nấm Cordyceps có tới 350 loài khác nhau, chỉ riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài như C liangshanensis, C taishanensis, C shanxiensis, C gansuensis, C grasspara, C guizhouensis… Ngoài ra còn có các chủng C militaris, C nutans, C gunnuii Tuy nhiên cho đến nay người ta chỉ mới nghiên cứu nhiều nhất được về 2 loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris thuộc

Loài nấm C militaris tìm thấy ở vùng núi có độ cao 2000 - 3000 m, thường tìm thấy

Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nước trong khu vực Đông Nam Á

Nấm Cordyceps militaris là loài được nghiên cứu kỹ nhất trong tất cả các loài của giống Cordyceps (Kobayashi và cs, 1941) Sự đa dạng về hình thái và khả năng thích

nghi của loài này ở nhiều sinh cảnh khác nhau có thể là nguyên do khiến chúng có mặt ở nhiều vùng địa lý và sinh thái trên trái đất (Kobayashi và cs, 1941; Mains và cs, 1958)

Ký chủ phổ biến của loài C militaris trong tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng của các loài bướm Trong tự nhiên có nhiều loài Cordyceps có hình thái tương tự hoặc gần giống loài C militaris, bao gồm C cardinalis và một số loài khác (Sung và cs, 2006)

Hoạt chất sinh học

Các phân tích hóa học cho thấy trong sinh khối của Cordyceps có 17 đến 19 loại

acid amin khác nhau: D - manitol, lipid, một số yếu tố vi lượng (Na, K, Ca, Mg, Al, Mn,

Cu, Zn, Bo, Fe… trong đó cao nhất là P) Ngoài ra những hoạt chất làm nên giá trị dược

liệu của Cordyceps đáng kể đến là cordyceptid acid, cordycepin, adenosine,

hydroxyethyl-adenosine, polysaccharide…và một số loại vitamin thiết yếu như vitamin B12, vitamin A, vitamin E, vitamin K…

Cordycepin

Cordycepin lần đầu tiên được tách ra từ C militaris vào năm 1950 do Cunningham

và cộng sự thực hiện, sau đó chúng cũng được tìm thấy ở C sinensis và C kyushuensis

Mặc dù cordycepin có thể được tổng hợp hóa học nhưng chỉ cho sản lượng thấp

Cordyceps tự nhiên chứa lượng cordycepin vào khoảng 0,006 - 6,36 mg/g Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong tự nhiên, nồng độ cordycepin trong quả thể C militaris cao hơn C.sinensis với hàm lượng lần lượt là 2,65 và 1,64 mg/g (Lo và cs, 2013)

Cordycepin là một dẫn xuất của nucleotide adenosine mà tại vị trí 3’ không có O khác với thực thể ribose Trọng lượng phân tử của cordycepin C10H13N5O3 là 251, có nhiệt độ nóng chảy là 230 - 231oC, độ hấp thụ cao nhất ở 259 nm (Das và cs, 2009) Cordycepin có thể tan trong saline, cồn hoặc methanol, nhưng không tan trong benzen, ether hoặc chloroform, các nhà khoa học thường sử dụng saline khử trùng và đệm phosphate để hòa tan cordycepin (Zhou và cs, 2009) Cordycepin có khả năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng virus Ngoài ra, khả năng điều hòa sản phẩm của interleukins trong tế bào lympho T của cordycepin đã được chứng minh (Masuda và cs, 2006)

Adenosine

Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể và được cho là phong phú ở hầu hết

các loài Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 tới 14,15 mg/g Khi thu nhận nấm Cordyceps trong tự nhiên, hàm lượng adenosine ở C militaris cao hơn C sinensis (Lo và

cs, 2013) Adenosine được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch (Shashidhar và cs, 2013)

Hình 1.1 Sự khác biệt về cấu trúc phân tử giữa cordycepin và adenosine

Nucleotides

Nucleotides (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần khá đa

dạng trong nấm Cordyceps Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, guanosine có hàm lượng cao

nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo hàm lượng của

nucleotide thường cao hơn Cordyceps spp tự nhiên Nucleotides trong Cordyceps tự

nhiên bắt nguồn từ sự phân rã của nucleotide trong suốt quy trình bảo quản tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng tìm ra rằng độ ẩm có thể làm tăng đáng kể hàm lượng nucleotide

trong Cordyceps khi nuôi trên môi trường rắn (Zhou và cs, 2009)

Polysaccharide

Nấm Cordyceps spp được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản xuất thực

phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh Chứng chứa rất nhiều loại đường, bao gồm mono-, di- và các oligosaccharide, và nhiều polysaccharides phức tạp

Các polysaccharides chính trong nấm Cordyceps là một dạng glucans với các mối

liên kết: (⅓) - (⅙) β glucans và (⅓) - 1 - glucans Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharides đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharides thu nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích được thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các polysaccharides Các

polysaccharides có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào ung thư chúng bao gồm homopolymer có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fructose, ribose và acid glucuronic Trong một số loài nấm, polysaccharides liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide - protein hoặc polysaccharide - peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn Cấu trúc

⅓ - β - glucans có khả năng kháng khối u được biết đến nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho biết những glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên kết với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi bên bao gồm các đơn vị như acid glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose hoặc ribose Heteroglycans là một nhóm polysaccharides lớn có hoạt tính sinh học đa dạng được phân loại là galatians, fucans, xylene và mannans

Giá trị dược liệu

Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong điều trị

bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá trị kinh tế cao Nấm

Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên Vì vậy, việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là

một vấn đề cấp thiết

Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3’- deoxyadenosine) từ nấm

cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch (Shonkor Kumar và cs, 2010)

Hoạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM - hs - CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo phức ở nồng

Hạn chế virus cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps

militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A Chất

này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào (Ohta và cs, 2007)

Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng ung thư: C militaris: protein (CMP) tách chiết

từ nấm có kích thước 12 kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7 - 9 Protein này

ức chế nấm Fusarium oxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quan (Park và

cs, 2009) Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium Các

hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm

khuẩn đường ruột Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa

bệnh tiểu đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF - κB,

do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều

trị các bệnh về miễn dịch (Shin và cs, 2009)

Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có

hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin Enzyme này có khả năng sử

dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác

như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy

mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzyme fibrinolytic giá thành cao

hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người

Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ quả

thể nấm Cordyceps militaris được thử nghiệm về tác dụng kiểm soát lipopolysaccharide

(LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố

hoại tử khối u α (TNF - α) và interleukin - 6 (IL - 6) của tế bào RAW264,7 Các đại thực

bào được xử lý với nồng độ khác nhau của dịch chiết làm giảm đáng kể LPS, TNF - α và

IL - 6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết Những kết quả này cho thấy rằng

dịch chiết có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế

bào

Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm Cordyceps

sinensis được sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng

của chung cũng khá tương tự nhau Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có thể

được sử dụng trong các trường hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

1.2.1 Trên thế giới

Jeong Seok Kwon và cs (2009) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Cacbon-nitơ (tỷ lệ C:N) đến sự tăng trưởng của hệ sợi nấm và sản xuất EPS của

Cordyceps militaris Để thực hiện khảo sát này, nồng độ glucose và cao nấm men trong

môi trường được thay đổi tương ứng từ 10 đến 100 g/L và 1 đến 40 g/L Tỷ lệ C:N dao động từ 4 đến 10 để xác định mức độ thích hợp cho sự tăng trưởng sợi nấm và sản xuất EPS Kết quả thu được, tỷ lệ C:N tương ứng là 4 (C:N = 80:20) và 8 (C:N = 80:10) dẫn đến sự tăng trưởng hệ sợi nấm và sản xuất EPS đạt cao nhất Những kết quả này hợp lý đối với một nghiên cứu trước đó, sự sản xuất EPS đạt tối đa trong điều kiện sử dụng hạn chế của nguồn nitơ (Kim và cs, 1999) Trong nghiên cứu này, tỷ lệ C:N tối ưu được xác định là 8, tại đây sự sản xuất EPS là tốt nhất mặc dù năng suất sinh khối sợi nấm đạt thấp hơn (Kwon và cs, 2009)

Vào năm 2007, Ing - Lung Shih và các cộng sự của mình đã thực hiện nghiên cứu

về sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp các hoạt

chất sinh học của nấm Cordyceps militaris trong môi trường dịch thể Kết quả cho thấy,

cao nấm men thích hợp được chọn làm nguồn nitơ cung cấp dinh dưỡng cho môi trường Khi tăng nồng độ nitơ với pH ban đầu được giữ ở mức 6 thì trọng lượng sinh khối hệ sợi nấm có sự giảm rõ rệt lần lượt là 22,3 mg/L, 16,5 mg/L và 7,8 mg/L tương ứng với với nồng độ cao nấm là 10 g/L, 15 g/Lvà 30 g/L Trong khi đó, hàm lượng cordycepin thu được tương ứng lần lượt là 154,8 mg/L, 650,2 mg/L và 590 mg/L và hàm lượng adenosine là 50 mg/l, 70 mg/l và 55,3 mg/l Điều này chứng tỏ rằng tỷ lệ C:N thấp thích hợp cho sự tích lũy cordycepin và adenosine; ngoài ra, nồng độ nitơ cao dẫn đến tỷ lệ C/N quá thấp sẽ làm giảm sinh khối hệ sợi thu được Sản lượng Cordycepin đạt cao nhất từng được báo cáo đạt 1041.5 mg/l khi trong môi trường chứa 10 g/l Glucose và 30g/l cao nấm men ở pH 5

Người ta thấy rằng trọng lượng khô sợi nấm với pH 4, 5, 6 và 7 lần lượt là 15,2 g/l, 14,1 g/l, 13,9 g/l và 13,6 g/l thu được tương tự vào ngày 36, 30, 30 và 30 Điều đáng lưu

ý là độ pH của môi trường thấp hơn so với pH ban đầu trong khi sự tăng trưởng của hệ sợi tăng lên khi tiêu thụ Glucose Những điều này cho thấy sự tăng trưởng của hệ sợi có

độ pH trong môi trường Sản lượng EPS tối đa là 1,1 g/l, 1,1 g/l, 0,9 g/l và 1,0 g/l, tương ứng với năng suất sản xuất EPS lần lượt là 0,19, 0,19, 0,23 và 0,06 g/(l d) cho pH 4, 5, 6

và 7 Điều này trái ngược với thực tế là sản lượng EPS tối đa (0,29 g/l) ở mức pH ban đầu 6,0 và sản lượng EPS tối đa (1,25 g/l) ở mức pH ban đầu 8,0 Sản xuất Adenosine tối đa trong môi trường nuôi cấy lần lượt là 50,1, 40,5, 80,6 và 109,7 mg/l, tương ứng với năng suất sản xuất 10,0, 8,1, 13,4 và 21,8 mg/(l d) cho pH 4, 5, 6 và 7 (Shih và cs, 2007) Bên cạnh đó, không phát hiện được sự có mặt của adenosine trong môi trường nuôi

cấy C militaris (Masuda và cs, 2006) Sự sinh tổng hợp cordycepin ngoại bào của C.militaris bắt đầu sau khi tăng trưởng tế bào đạt mức tối đa là 315,2, 190,1, 185,2 và

138,3 mg/l, tương ứng với năng suất 12,6, 7,6, 7,41, 5,5 mg/ngày, lần lượt ở các ngưỡng

pH 4, 5, 6 và 7 (Shih và cs, 2007)

Trong nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy dịch thể thích hợp cho sự sinh

trưởng hệ sợi nấm và sản xuất Exo-biopolymer của Cordyceps militaris, Park và cộng sự

(2001) đã khẳng định rằng tỷ lệ C:N gây ảnh hưởng đến tốc độ sinh tổng hợp của nhiều hoạt chất sinh học, sự tăng trưởng của hệ sợi nấm và sản xuất Exo-biopolymer Ảnh hưởng của tỷ lệ C:N (tỉ lệ khối lượng) đối với sản xuất Exo-biopolymer đã được tiến hành nghiên cứu bằng cách sử dụng saccharose và bột ngô Theo như báo cáo, tỷ lệ C:N cao hơn thuận lợi cho cả tăng trưởng sợi nấm và sản xuất Exo-biopolymer Kết quả thu được phù hợp với một quá trình lên men khác để sản xuất polysaccharide; tức là sinh tổng hợp Xanthan được tối ưu bởi tỷ lệ C:N cao (Schweickart và cs, 1989) Bên cạnh đó, ông cũng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự sinh trưởng hệ sợi và sản xuất Exo-biopolymer Ngưỡng pH 6 được khẳng định là ngưỡng pH thích hợp nhất trong môi trường nuôi cấy dịch thể Có nhiều báo cáo cho rằng, đa số các loại nấm phát triển tối ưu nhất ở môi trường lỏng có pH acid (Yang và cs, 2000; Yang và cs, 1998) Nhiệt độ thích hợp được cố định trong nghiên cứu này là 20o

C Vì các loại nấm thường đòi hỏi thời gian dài trong quá trình nuôi cấy lỏng, điều đó khiến chúng dễ bị nhiễm bẩn

và nhiễm khuẩn, thế nên tối ưu hóa ở nhiệt độ thấp tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt động sinh lý của chúng diễn ra ổn định (Park và cs, 2001)

1.2.2 Trong nước

Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu được tiến hành để khảo sát điều kiện môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng và tích lũy các hợp chất sinh học quý hiếm của

Cordyceps militaris Như ở đề tài nghiên của Trần Thu Hà (2016), các điều kiện nuôi cấy

như pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ, tốc độ lắc trong môi trường dịch thể đều được khảo sát và đánh giá thông qua sinh khối hệ sợi, mật độ, đường kính thể lạc cầu Kết quả cho

thấy, trong môi trường dịch thể, pH tốt nhất cho sinh trưởng của giống nấm Cordyceps militaris là 6 Đường saccharose và glucose là nguồn carbon tối ưu cho sự phát triển của nấm Cordyceps militaris Nguồn dinh dưỡng nitrogen từ nhộng tằm được đánh giá là tốt

nhất, tốc độ lắc 160 rpm (vòng/phút) phù hợp cho sự phát triển hệ sợi và tích lũy hoạt

chất của nấm Cordyceps militaris (Trần Thu Hà và cs, 2016)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Giống nấm Cordyceps militaris được nuôi cấy và nhân giống tại phòng Công nghệ

sinh học nấm, thuộc Khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng

Hình 2.1 Nấm Cordyceps militaris

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và hàm lượng

cordycepin của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong nuôi cấy dịch thể

Để tìm tiến hành pha môi trường lỏng có sinh trưởng của hệ sợi cao nhất với pH khác nhau (pH 5, 6, 7 và 8) vào bình tam giác 250ml với thể tích môi trường 100ml/bình Môi trường PDA được hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 20 phút, để nguội rồi tiến hành cấy giống và nuôi cấy ở điều kiện lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở phòng lạnh 24oC Tiến hành đánh giá cảm quan và thu nhận sinh khối sau 7 ngày Sinh khối được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 50oC và tiến hành thu dữ liệu trọng lượng khô

Bố trí thí nghiệm với 4 nghiệm thức (pH = 5, 6, 7 và 8), mỗi nghiệm thức 3 bình tam giác Thí nghiệm lặp lại 5 lần

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ C:N đến sự sinh trưởng và tích lũy

cordycepin của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong nuôi cấy dịch thể

Tiến hành pha môi trường lỏng có sinh trưởng của hệ sợi cao nhất với các tỷ lệ C/N khác nhau (12:1, 18:1, 24:1, 36:1 và 48:1) vào bình tam giác 250 ml với thể tích môi trường 100ml/bình Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 20 phút, để nguội rồi tiến hành cấy giống và nuôi cấy ở điều kiện lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở phòng lạnh 24oC Tiến hành đánh giá cảm quan và thu nhận sinh khối sau 7 ngày Sinh khối được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 50o C và tiến hành cân trọng lượng khô

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của môi trường với các tỷ lệ C:N khác nhau cho quá

trình nuôi cấy lắc của Cordyceps militaris (Wu và cs, 2004)

STT Tỷ lệ C:N Glucose (g/l) C% Cao nấm men (g/l) N% Tổng (g/l)

2.3.3 Phương pháp đánh giá cảm quan thể lạc

Tiến hành lấy 5ml dịch thể hệ sợi nấm cho vào đĩa peptri, thu nhận hình ảnh và tiến hành xử lý bằng phần mềm ImageJ Đánh giá cảm quan thể lạc qua kích thước, mật độ khuẩn lạc

Thể lạc có chất lượng tốt: hạt đồng đều có đường kính từ 1 - 2 mm

Thể lạc không đạt yêu cầu: hạt không đồng đều, kích thước cầu lớn hơn 3 mm Hút lấy 1 thể lạc cầu trong mỗi bình và tiến hành đo đường kính (mm)