Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và tích lũy carotenoid trong pha sinh trưởng vi tảo scenedesmus obliquus

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CAROTENOID TRONG PH

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CAROTENOID TRONG

PHA SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO SCENEDESMUS OBLIQUUS

PHAN THỊ DIỄM MY

Đà Nẵng, năm 2020

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CAROTENOID TRONG

PHA SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO SCENEDESMUS OBLIQUUS

Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2016 – 2020

Sinh viên: Phan Thị Diễm My Người hướng dẫn: TS Trịnh Đăng Mậu

Đà Nẵng, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực Đây là kết quả nghiên cứu của tôi và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học

Đà Nẵng, ngày 16 tháng 07 năm 2020

Tác giả khóa luận

Phan Thị Diễm My

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trịnh Đăng Mậu giảng viên khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Thứ hai, tôi xin cảm ơn thầy Trần Ngọc Sơn, giảng viên khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã không ngại thời gian chỉ bảo và truyền đạt thêm những kiến thức giúp đỡ tôi trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Thứ ba, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Và lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người

đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày 16 tháng 07 năm 2020

Phan Thị Diễm My

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

GGPP Geranylgeranyl diphosphate IPP Isopentenyl diphosphate

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về vi tảo Scenedesmus obliquus 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại 3

1.1.2 Hình thái cấu tạo và đặc điểm sinh học 3

1.1.3 Các giai đoạn trong quá trình sinh trưởng của tảo Scenedesmus obliquus 4

1.1.4 Sinh sản của tảo Scenedesmus obliquus 5

1.1.5 Cơ chế tổng hợp carotenoid trong vi tảo 6

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy carotenoid của tảo Scenedesmus obliquus 7

1.2 Một số nghiên cứu trên thế giới và trong nước về yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tích lũy carotenoid của vi tảo Scenedesmus obliquus 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phương pháp nhân giống tảo và giữ giống trên môi trường BG-11 15

2.2.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi tảo bằng buồng đếm Newbauer 16

2.2.4 Bố trí thí nghiệm 17

2.2.5 Thống kê và xử lý số liệu 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Ảnh hưởng của nitơ đến sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus obliquus 19

3.2 Ảnh hưởng của phôtpho đến sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus obliquus 21

3.3 Ảnh hưởng của NaCl đến sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus obliquus 23

3.4 Ảnh hưởng của nitơ và phôtpho đến sự tích lũy carotenoid của vi tảo Scenedesmus obliquus 25

3.4.1 Ảnh hưởng của nitơ đến sự tích lũy carotenoid của vi tảo Scenedesmus obliquus 25

3.4.2 Ảnh hưởng của phôtpho đến sự tích lũy carotenoid của vi tảo Scenedesmus obliquus 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

1 Kết luận 29

2 Kiến nghị 29

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1.1 Vi tảo Scenedesmus obliquus phân lập từ các thủy vực

nước ngọt trên địa bàn thành phố Đà Nẵng

3

1.2 Quá trình tổng hợp carotenoid trong vi tảo 7

3.1 Đường cong sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus obliquus

3.7 Hàm lượng và năng suất tổng hợp carotenoid của vi tảo

Scenedesmus obliquus ở các nồng độ nitơ khác nhau

26

3.8 Hàm lượng và năng suất tổng hợp carotenoid của vi tảo

Scenedesmus obliquus ở các nồng độ phôtpho khác nhau

27

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Vi tảo Scenedesmus obliquus được đánh giá là nguồn nguyên liệu tiềm năng để

sản xuất carotenoid – một dạng sắc tố hữu cơ trong sinh vật quang hợp có giá trị dinh dưỡng cao, được ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm và thức ăn nuôi trồng thủy hải sản Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất dinh dưỡng nitơ, phôtpho và muối NaCl đến khả năng sinh trưởng và tích lũy carotenoid

của vi tảo Scenedesmus obliquus được phân lập từ các thủy vực nước ngọt tại Đà Nẵng Kết quả chỉ ra rằng trong môi trường BG-11 với nồng độ nitơ 120 mgN.L-1

và nồng độ phôtpho 12,21 mgP.L-1, Scenedesmus obliquus sinh trưởng tốt nhất với tốc

độ trung bình lần lượt là 0,298 ± 0,03 ngày-1

và 0,23 ± 0,01 ngày-1, đồng thời sự tích lũy carotenoid cũng đạt tốt nhất với hiệu suất trung bình tương ứng đạt 0,80 ± 0,13 %

và 0,49 ± 18 % sinh khối khô Bên cạnh đó, kết quả thí nghiệm cũng chỉ ra rằng NaCl

gây ra tác động tiêu cực đến sự phát triển của Scenedesmus obliquus trong giai đoạn

sinh trưởng, nồng độ NaCl rất nhỏ (0,01 – 0,2 M) kìm hãm sự phát triển của vi tảo và nồng độ NaCl 0,6 M ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng của vi tảo

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, vi tảo ngày càng thu hút nhiều sự chú ý không chỉ nhờ những ứng dụng của sinh khối vi tảo trong việc sản xuất nhiên liệu sinh học mà còn nhờ tiềm năng trở thành nguồn nguyên liệu cung cấp các hợp chất hóa học có giá trị cao như axit béo, polysaccharide, vitamin và các sắc tố chống oxy hóa như β-carotenoid, phycocyanin, astaxanthin (Pulz và Gross, 2004; Přibyl và cs, 2016a) Carotenoid là các sắc tố liên kết với cấu trúc isoprenoid, trong các sinh vật quang hợp, carotenoid hoạt động như các sắc tố phụ trong quá trình quang hóa Các carotenoid thứ cấp có khả năng bảo vệ hệ thống quang hợp bằng cách loại bỏ các phân tử oxi phản ứng dư thừa, chống lại các tổn thương do phản ứng oxy hóa gây ra (Skibsted, 2012; Kari Skjånes, 2013)

Nuôi vi tảo làm nguồn cung cấp các carotenoid là một hướng nghiên cứu và ứng dụng giàu tiềm năng trong bối cảnh công nghệ sinh học tảo đang ngày càng phát triển bởi

vì tảo có tốc độ sinh trưởng và sinh sản nhanh, khả năng tích lũy cao hàm lượng các sắc

tố Sự tích lũy này thường được kích thích bằng cách tạo ra các điều kiện bất lợi như thiếu hụt nitơ, độ mặn cao hoặc cường độ ánh sáng cao bởi vì vi tảo có xu hướng tích lũy các carotenoid thứ cấp để thích nghi với các căng thẳng từ môi trường (Bhosale, 2004; Lemoine và Schoefs, 2010) Hai loài vi tảo được nuôi phổ biến nhất để sản xuất

carotenoid hiện nay là Dunaliella salina và Haematococcus pluvialis

Hàm lượng carotenoid của Haematococcus pluvialis nuôi cấy trong điều kiện thiếu

nitơ và phosphat được ghi nhận đạt đến 40 mg.g-1 sinh khối khô (Boussiba và cs, 1999), cao hơn rất nhiều so với trong điều kiện bình thường Tuy nhiên, nhược điểm của việc

nuôi cấy H pluvialis là loài vi tảo này có tốc độ tăng trưởng tương đối chậm và cho sinh khối thấp (Hagen và cs, 2001) Scenedesmus obliquus được coi là một ứng viên thay thế

tiềm năng do chúng có khả năng tích lũy carotenoid thứ cấp cao và khả năng phục hồi sinh trưởng nhanh chóng sau các căng thẳng của môi trường (Qin và cs, 2008) Tuy vậy, đến nay số lượng nghiên cứu về khả năng sinh trưởng và tích lũy sắc tố của loài vi tảo này ứng dụng trong việc sản xuất các hợp chất có giá trị khá khan hiếm ở Việt Nam Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi, cụ thể là ảnh hưởng của nồng

độ nitơ, phôtpho và muối NaCl tới khả năng sinh trưởng và tích lũy carotenoid của vi tảo

Scenedesmus obliquus, nhằm tìm ra môi trường tối ưu cho sự phát triển cũng như sự tích

lũy carotenoid của giống tảo bản địa này

2 Mục tiêu đề tài

Xác định được nồng độ nitơ, phôtpho, NaCl tối ưu cho sinh trưởng và tích lũy

carotenoid ở vi tảo Scenedesmus obliquus

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về khả năng sinh

trưởng và tích lũy carotenoid ở vi tảo Scenedesmus obliquus

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài là cơ sở xác định nồng độ nitơ, phôtpho, NaCl trong môi trường

tối ưu cho sự sinh trưởng và tích lũy carotenoid ở vi tảo Scenedesmus obliquus để áp

dụng vào mô hình nuôi trồng trong quy mô lớn

- Khảo sát ảnh hưởng của nitơ đến sự sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus obliquus

- Khảo sát ảnh hưởng của phôtpho đến sự sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus obliquus

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus obliquus

- Khảo sát ảnh hưởng của nitơ đến sự tích lũy carotenoid của vi tảo Scenedesmus obliquus ở pha sinh trưởng

- Khảo sát ảnh hưởng phôtpho đến sự tích lũy carotenoid của vi tảo Scenedesmus obliquus ở pha sinh trưởng

- Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến sự tích lũy carotenoid của vi tảo

Scenedesmus obliquus ở pha sinh trưởng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về vi tảo Scenedesmus obliquus

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Scenedesmus obliquus là chủng vi tảo nước ngọt, về phân loại khoa học của (Dương Đức Tiến và Võ Hành, 1997), vi tảo Scenedesmus obliquus thuộc:

Giới (Domain): Plantae (Thực vật)

Ngành (Phylum): Chlorophyta

Lớp (Class): Chlorophyceae

Bộ (Ordo): Sphaeropleales

Họ (Familia): Scenedesmaceae

Chi (Genus): Scenedesmus

Loài (Species): Scenedesmus obliquus

1.1.2 Hình thái cấu tạo và đặc điểm sinh học

Cộng đơn bào gồm 2 – 4 – 8 tế bào Các tế bào gắn với nhau ở phần giữa tế bào, sắp xếp trên 1 hàng Tế bào hình thoi, đầu tế bào thắt nhọn, đôi khi tế bào hơi thắt nhọn và uốn cong vào phía trong

Thành tế bào nhẵn, thể màu nằm ở ngoại vi, có 1 hạt tạo bột, kích thước tế bào (4 –30) x 2 – 9,5µ (Dương Đức Tiến và Võ Hành, 1997)

Hình 1.1 Vi tảo Scenedesmus obliquus phân lập từ các thủy vực nước ngọt trên địa bàn

thành phố Đà Nẵng

1.1.3 Các giai đoạn trong quá trình sinh trưởng của tảo Scenedesmus obliquus

Cũng như sự phát triển chung theo quy luật tăng trưởng của các sinh vật khác, sinh trưởng của tảo (được xếp cùng nhóm với vi khuẩn lam) cũng trải qua 4 giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân bằng và suy vong Với chế độ dinh dưỡng thích hợp và điều kiện sinh lí học thuận lợi, các quá trình xảy ra như sau (Nguyễn Lân Dũng và Bùi Việt Hà, 2009):

- Pha thích nghi (Lag phase): là giai đoạn tảo thích nghi với môi trường mới Ở giai đoạn này trong tế bào tảo diễn ra sự vô hiệu hóa các enzyme, sự giảm tốc độ trao đổi chất của các tảo giống Tế bào tảo sẽ gia tăng kích thước nhưng không có sự phân chia Giai đoạn này kéo dài hay ngắn liên quan đến tính chất của môi trường Nếu tính chất của môi trường mới sai khác nhiều so với môi trường giống cũ thì giai đoạn thích nghi sẽ kéo dài Nếu cấy giống tảo vào môi trường mới lúc tảo giống đang ở giai đoạn thích nghi hay

từ giai đoạn suy vong thì giai đoạn thích nghi này sẽ kéo dài

- Pha tăng trưởng (Log phase): là giai đoạn tế bào phân chia rất nhanh và liên tục Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào được tổng hợp với tốc độ tương đối ổn định Tốc độ tăng trưởng trong giai đoạn này tùy thuộc vào kích thước tế bào, cường độ ánh sáng, nhiệt độ môi trường và môi trường dinh dưỡng Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự tăng trưởng không đồng đều Phản ứng này rất dễ quan sát khi chuyển tế bào từ môi trường nghèo dinh dưỡng sang môi trường giàu dinh dưỡng hơn hoặc ngược lại thì cũng có kết quả về

sự sinh trưởng không đồng đều như vậy

- Pha cân bằng (Stationary phase): khi có một vài nhân tố xuất hiện như sự giảm sút của các yếu tố dinh dưỡng nào đó, tỉ lệ cung cấp oxi và cacbonic, sự thay đổi pH, sự hạn chế ánh sáng hay sự xuất hiện các yếu tố ngăn cản sự phân chia tế bào thì quá trình sinh trưởng của tảo sẽ bị ức chế, đây là giai đoạn đầu của pha tăng trưởng chậm Tuy nhiên, pha này diễn ra rất nhanh với sự cân bằng được tạo ra giữa tốc độ tăng trưởng và các nhân tố giới hạn

- Pha suy vong (Death phase): khi các chất dinh dưỡng trở nên cạn kiệt không đủ cung cấp cho sự sinh trưởng và trao đổi chất đến mức trở nên độc hại, tảo sẽ bị suy tàn gọi là pha chết Giống như giai đoạn logarit, sự suy vong của quần thể vi sinh vật cũng có

tính logarit Tổng số tế bào sống và chết không thay đổi vì các tế bào chết chưa bị phân hủy

1.1.4 Sinh sản của tảo Scenedesmus obliquus

Theo nghiên cứu của Trainor và Burg (1965), vi tảo Scenedesmus, đặc biệt là Scenedsmus obliquus, một loại tảo nước ngọt phân bố rộng rãi, được cho là sinh sản bằng

bào tử Bào tử không có khả năng di chuyển, chúng được gắn với tế bào mẹ tại một vị trí

xác định trước khi tách rời để tạo khuẩn lạc S.obliquus và S.dimorphus đã được quan sát

trên các môi trường và điều kiện tăng trưởng khác nhau nhưng vẫn chưa tìm thấy được khả năng di chuyển của chúng Vì khó khăn này, cũng như thực tế là các tế bào chuyển động được tạo ra trong điều kiện kích thích sinh sản, nên có thể các tế bào chuyển động là giao tử

Trong các nghiên cứu sự đa hình của Scenedesmus, giống như Dactylococcus, Chlorella, Oocystis và Ankistrodesmus thường được quan sát Trong số các loài có gai,

một số loài đa hình có thể tạo ra sự đa dạng về hình thái giống với các loài ổn định khác,

do đó chúng có thể tạo ra một loài lai sinh thái trong nuôi cấy Mặc dù sự thay đổi hình

thái có thể là dấu hiệu từ sự thiếu hụt dinh dưỡng, sự sinh sản của Scenedesmus sẽ cung

cấp một dẫn liệu khoa học cho sự thay đổi này

Để tạo ra sự chuyển động, S.obliquus được chuyển sang một môi trường thiếu

hụt nitơ 3ml mẫu tảo được nuôi cấy trong bình vô trùng, dưới điều kiện ánh sáng liên tục

ở 15ᵒC trong 48 giờ Khi các tế bào trên được trộn lẫn với chủng S.obliquus WH – 50, đã

có sự hình thành khuẩn lạc từ các giao tử Thông thường, có năm đến mười tế bào hoặc rất nhiều khuẩn lạc trên một tế bào Khi các giao tử tách ra khỏi các khuẩn lạc, các roi đã được hình thành Sự hoạt động của roi bơi đã được quan sát trong vài phút, nhưng sau đó

đã có sự hợp nhất chất nguyên sinh Trong vòng 30 giây, các giao tử đã hợp nhất và kết quả tạo thành hợp tử tứ bội Các hợp tử còn lại hoạt động trong nhiều giờ, nhưng không

có phản ứng quang hóa cũng không có xu hướng đứng yên

Trước đây, nhiều nghiên cứu không thể theo dõi sự chuyển động của tế bào sau phân chia, có lẽ nguyên nhân là vì chúng đã chết Trong các thí nghiệm hiện tại, nhiều loại giao tử chưa kết hợp cũng bị tan rã Các tế bào được liên hợp gần đây có thể sống sau khi chuyển sang môi trường chứa nguồn nitơ Hoặc, nếu sự phát sinh giao tử xảy ra trong một môi trường cung cấp đầy đủ nitơ, chu trình có thể được hoàn thành

1.1.5 Cơ chế tổng hợp carotenoid trong vi tảo

Carotenoid được tổng hợp trong lục lạp nhờ hoạt động của một loạt các protein trên màng nhân (Varela và cs, 2015) Quá trình tổng hợp này diễn ra rất phức tạp, liên quan đến hàng chục gen và enzyme (Novoveská và cs, 2019)

Các carotenoid và các terpen được tổng hợp từ tiền chất isopentenyl diphosphate (IPP) chứa năm nguyên tử carbon (C5) (Takaichi, 2011) Geranylgeranyl diphosphate (GGPP) chứa 20 nguyên tử cacbon (C20) được tổng hợp từ bốn phân tử của IPP

Trong quá trình ngưng tụ hai hợp chất C20 (GGPP), tiền chất carotenoid đầu tiên là phytoene (C40) được hình thành bởi phytoene Phân tử phytoene bị khử liên tiếp qua bốn phản ứng khử bão hòa với sự xúc tác của phytoene desaturase (PDS) và ζ-carotenoid desaturase (ZDS) tạo thành phytofluene, ζ-carotenoid, neurosporene và lycopene (Solovchenko, 2013) Lycopene sau đó đóng vòng ở cả hai đầu để tạo thành β-carotenoid Hydroxyl cả hai vòng của β-carotenoid tạo ra zeaxanthin hoặc có thể được epoxit hóa một lần để tạo thành antheraxanthin hoặc hai lần để tạo thành violaxanthin (Novoveská

và cs, 2019) Neoxanthin và các sắc tố khác được tạo ra từ violaxanthin, zeaxanthin hay β-carotenoid

Với astaxanthin, có hai con đường chính để tổng hợp hợp chất này trong vi tảo Astaxanthin có thể được tạo ra bởi hoạt động của enzyme carotenoid hydroxylase chuyển đổi canthaxanthin thành astaxanthin hoặc enzyme-arotenoid ketolase tạo thành astaxanthin từ nhánh zeaxanthin, trong đó có nhiều phân tử trung gian tham gia (Han và

cs, 2013)

Tương tự β-carotenoid, α-carotenoid và các dẫn xuất của chúng đều được tạo thành

từ lycopene Sự hydroxyl hóa các vòng β, દ và α-carotenoid tạo thành lutein – tiền chất của các carotenoid khác như crocoxanthin, prasinoxathin hay loroxanthin (Takaichi, 2011)

Quá trình tổng hợp zeaxanthin-antheraxanthin-violaxanthin (VAZ) cũng như diadinoxanthin-diatoxanthin ( DD-DT) là các quá trình tổng hợp thuận nghịch Các quá trình này được kích hoạt khi tế bào gặp điều kiện cường độ ánh sáng cao nhằm phân tán năng lượng dư thừa trong tế bào, tránh những tổn thương do ánh sáng gây nên (Jahns và

cs, 2009) Cơ chế quang vệ (photoprotection) này còn gọi là chu trình xanthophyll

Hình 1.2 Quá trình tổng hợp carotenoid trong vi tảo (Novoveská và cs, 2019)

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy carotenoid của tảo Scenedesmus obliquus

Sinh trưởng của tảo đạt cao nhất với cường độ và thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo đó là một chế độ chăm sóc, theo dõi kỹ lưỡng để đảm bảo các chỉ tiêu ánh sáng, nhiệt độ, pH, tốc độ sục khí, dinh dưỡng giúp cho tảo phát triển tốt nhất

- Yếu tố ánh sáng: cũng như các loài thực vật khác, tảo cũng cần ánh sáng cho quá trình quang tổng hợp vật chất hữu cơ từ CO2 Không chỉ vậy, nó còn là nguồn năng lượng chính trong giai đoạn tăng trưởng quang tự dưỡng Các sinh vật sử dụng năng lượng ánh sáng để chuyển đổi CO2 và các hợp chất hữu cơ trong tế bào (Amrita Difus, 2015) Các tế bào vi tảo có giới hạn bão hòa ánh sáng nhất định, được sử dụng làm nguồn năng lượng

để tổng hợp nguyên sinh chất của tế bào và hạn chế việc sử dụng ánh sáng khi tiếp xúc vượt quá giới hạn bão hòa của nó Ánh sáng đóng một vai trò quan trọng đối với vi tảo và cường độ ánh sáng thay đổi tùy theo độ sâu bể nuôi và mật độ nuôi cấy vi tảo (Wahidin

và cs, 2013) Ngoài ra, cường độ ánh sáng cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự tích lũy β-carotenoid trong các tế bào tảo (Pisal và cs, 2005)

- Yếu tố pH: khoảng pH cho hầu hết các loài tảo khi nuôi cấy là từ 7 – 9, với khoảng tối ưu là 8,2 – 8,7 (Barsanti và Gualtieri, 2014) Sự kết tủa của môi trường nuôi cấy hoàn toàn do sự gián đoạn của nhiều quá trình tế bào dẫn đến việc không duy trì được

độ pH chấp nhận được Hoặc việc sục khí cũng ảnh hưởng đến giá trị pH, khi tảo hấp thụ cacbon vô cơ khiến cho pH tăng lên đáng kể trong suốt quá trình nuôi Trong trường hợp nuôi cấy tảo mật độ cao, việc bổ sung cacbon dioxide cho phép điều chỉnh độ pH tăng, có thể đạt đến giá trị giới hạn lên đến pH = 9 trong quá trình phát triển của tảo (Baert và cs,

1996) Mức pH thuận lợi cho tảo Scenedesmus phát triển là 7 – 8 và pH = 8 là tốt nhất để sản xuất carotenoid trong vi tảo Scenedesmus almeriensis (Sánchez và cs, 2008; Přibyl và

cs, 2015)

- Nhiệt độ: nhiệt độ là một trong những yếu tố chính kiểm soát tỷ lệ trao đổi chất và quá trình quang hợp (Raven và Geider, 1988) Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo và sự hình thành các thành phần phụ thuộc nhiệt độ trong các tế bào Sự thích nghi của vi tảo với nhiệt độ được điều chỉnh bởi các đặc tính sinh hóa khác nhau, chẳng hạn như phản ứng enzyme, tính thấm của tế bào và thành phần cấu trúc tế bào (Berges và cs, 2002) Nhiệt độ căng thẳng là một trong những yếu tố quan trọng nhất có thể tương tác với sự hạn chế chất dinh dưỡng trong tự nhiên, ảnh hưởng đến sự chuyển pha của lipid,

sự hình thành các đại phân tử và động học của các phản ứng hóa lý (Rhee và Gotham, 1981) Nhiệt độ cao cũng là điều kiện thuận lợi cho sự tích lũy carotenoid trong vi tảo lam (García-González và cs, 2005)

Theo nghiên cứu của Đặng Thị Thanh Hòa và Trần Thị Mỹ Xuyên (2007),

Scenedesmus có thể chịu được khoảng nhiệt độ rộng cho tăng trưởng là 15 – 42ᵒC với

nhiệt độ tối ưu là 30 – 35ᵒC Nhiệt độ thấp hơn 15ᵒC có thể làm chậm tốc độ tăng trưởng và nhiệt độ cao hơn 42ᵒC sẽ gây chết tế bào vi tảo

- Tốc độ sục khí: sục khí để ngăn chặn sự lắng đọng của tảo, để đảm bảo rằng tất

cả các tế bào của quần thể đều được tiếp xúc với ánh sáng và chất dinh dưỡng như nhau,

để tránh sự phân tầng do nhiệt (ví dụ trong môi trường nuôi cấy ngoài trời) và cải thiện trao đổi khí giữa môi trường nuôi cấy và không khí Ngoài ra, CO2 còn là đệm chống lại

sự thay đổi pH do cân bằng CO2/HCO3- Tùy thuộc vào quy mô của hệ thống nuôi cấy, việc trộn được thực hiện bằng cách khuấy, thủ công, sục khí hoặc sử dụng bánh xe chèo

và phản lực Tuy nhiên, cần lưu ý rằng không phải tất cả các loài tảo có thể chịu đựng được tốc độ sục khí cao (Baert và cs, 1996)

- NaCl: theo nghiên cứu của Blumwald và cs (1984) khi nuôi cấy vi tảo trong môi trường có nồng độ NaCl cao, vi tảo có thể tạo ra một số chất chuyển hóa để bảo vệ tế

bào khỏi các điều kiện bất lợi và cân bằng áp suất thẩm thấu với môi trường xung quanh

Độ mặn trong khoảng 20 – 24 g.L-1 đã được nghiên cứu là khoảng tối ưu cho hầu hết các loài vi tảo (FAO, 1991) Điều kiện độ mặn cũng có thể kích thích sản xuất các thành phần

cụ thể trong vi tảo (Yen và cs, 2019) Ngoài ra, NaCl có tác động lớn đến việc sản xuất sắc tố trong vi tảo (Begum và cs, 2016) Quá trình này xảy ra do sự tách rời của các phycobilisome từ màng thylakoid gây ra sự xâm nhập nhanh chóng của các ion bazơ dẫn đến giảm quá trình quang hợp, đồng thời ảnh hưởng đến quá trình sản sinh sắc tố (Blumwald và cs, 1984)

Ngoài các yếu tố về điều kiện nuôi cấy thì hàm lượng dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cần chú ý trong quá trình nuôi cấy Nhất là đối với quá trình sinh trưởng cũng như

tích lũy carotenoid của tảo Scenedesmus obliquus

- Cacbon: cacbon là một trong những chất dinh dưỡng quan trọng cần phải được cung cấp trong quá trình sinh trưởng của tảo Đây là yếu tố cần thiết cho quang hợp và sinh sản của tảo (chiếm 50% trọng lượng khô của tế bào) (Chisti, 2007; Milne và cs, 2012) Vi tảo dị dưỡng sử dụng cacbon hữu cơ làm nguồn cacbon trong điều kiện không

có ánh sáng Một số loài vi tảo chuyển hóa theo cơ chế kết hợp các đặc tính tự dưỡng và

dị dưỡng, sử dụng cả cacbon hữu cơ và vô cơ, sử dụng năng lượng được sản xuất từ một hợp chất hữu cơ cho tổng hợp tế bào và lưu trữ năng lượng hóa học chuyển đổi từ năng lượng ánh sáng (Chojnacka, 2004) Vi tảo tự dưỡng sử dụng cacbon vô cơ và sản xuất hydroxyl như một chất chuyển hóa dẫn đến tăng pH, trong khi vi tảo dị dưỡng sử dụng cacbon hữu cơ và tạo ra CO2, dẫn đến giảm pH (Kim và cs, 2013)

Tỉ lệ cố định cacbon thấp sẽ làm giảm tốc độ tăng trưởng của tảo Cacbon có thể được sử dụng dưới hình thức cacbonat hoặc bicacbonat Khi hàm lượng CO2 quá cao có thể làm giảm nồng độ tương đối của protein và các sắc tố trong tế bào (Liu và cs, 2005) Việc bổ sung nguồn cacbon hữu cơ thường xuyên tạo ra sự tích lũy các carotenoid bởi vi tảo có khả năng phát triển dị dưỡng hoặc quang hóa (Solovchenko, 2013)

- Nitơ: nitơ là một yếu tố dinh dưỡng góp phần quan trọng trong việc sản xuất sinh khối tảo và tham gia vào thành phần của tế bào như acid amin, protein, diệp lục, phân tử truyền năng lượng (ATP, ADP), vật liệu di truyền (RNA, DNA) và thành phần tế bào khác…chiếm 7 – 20% trọng lượng khô tế bào (Barsanti và Gualtieri, 2005; Pires, 2015) Hầu hết các loài vi tảo có khả năng sử dụng nhiều nguồn nitơ gồm có nitơ hữu cơ (urê,

glutamin, glysin…) và nitơ vô cơ (amoni, nitrat và nitrit) Nitơ được tảo hấp thụ và đồng hóa thành các hợp chất sinh hóa trong cơ thể, được tế bào sử dụng để đáp ứng các thay đổi của nhu cầu sinh lí (Li và cs, 2008; Rodolfi và cs, 2009; Cakmak và cs, 2012)

- Dinh dưỡng phôtpho: phôtpho là một yếu tố quan trọng, là thành phần thiết yếu cấu tạo phân tử, chẳng hạn như adenosinetriphosphate, DNA, RNA và là một thành phần chính của phospholipid, chiếm khoảng 1% trọng lượng khô tế bào (Sydney và cs, 2014) Nitơ và phôtpho là hai nguồn dinh dưỡng chính quan trọng trong quá trình sinh

trưởng cũng như tích lũy carotenoid trong tảo Scenedesmus obliquus và có thể bổ sung

hai chất dinh dưỡng này từ nhiều nguồn khác nhau Ngoài ra, sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo còn chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố (Pires, 2015)

- Lưu huỳnh là thành phần cấu trúc của một số axit amin và vitamin và rất quan trọng trong sản xuất lục lạp (Barsanti và Gualtieri, 2005)

- Kali là thành phần cấu tạo của một số enzyme, tham gia vào quá trình tổng hợp protein và điều hòa thẩm thấu (Sydney và cs, 2014)

- Magie là một yếu tố quan trọng có trong diệp lục, một sắc tố quan trọng cho phản ứng quang hợp Các vi chất dinh dưỡng như sắt, mangan, coban, kẽm, đồng và molypden được sử dụng trong quá trình nuôi cấy với một lượng nhỏ Sắt là một các nguyên tố vi lượng quan trọng nhất cho sự tăng trưởng của vi tảo tham gia vào quá trình quang hợp và

hô hấp Nó hoạt động như một chất xúc tác oxi hóa khử trong quang hợp và đồng hóa nitơ (Pires, 2015)

1.2 Một số nghiên cứu trên thế giới và trong nước về yếu tố ảnh hưởng đến khả

năng sinh trưởng, tích lũy carotenoid của vi tảo Scenedesmus obliquus

Sự sinh trưởng cũng như khả năng tổng hợp carotenoid trên vi tảo Scenedesmus đã được nghiên cứu khá nhiều trên thế giới Cụ thể, các yếu tố về điều kiện nuôi như nitơ,

phôtpho, NaCl đã được nghiên cứu có nhiều tác động đến các đặc điểm sinh học của vi

tảo Scenedesmus

Nitơ là nguồn dinh dưỡng chính có ảnh hưởng trực tiếp đến vi tảo Scenedesmus

Pancha và cs (2014) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nitơ đến sự thay đổi về hình thái

cũng như về sinh hóa của vi tảo Scenedesmus sp CCNM 1077 Kết quả chỉ ra rằng trong

điều kiện môi trường có nồng độ nitơ thấp thì hoạt động quang hợp cũng như hàm lượng

protein thô trong sinh vật giảm, trong khi trọng lượng tế bào khô và năng suất sinh khối phần lớn không bị ảnh hưởng Stress nitrat đã được tìm thấy có ảnh hưởng đáng kể đến

hình thái tế bào của Scenedesmus sp CCNM 1077 Loại bỏ hoàn toàn nitrat khỏi môi

trường nuôi cho kết quả hàm lượng lipid (27,93 %) và carbohydrate (45,74%) cao nhất

Điều này làm cho Scenedesmus trở một trong những nguồn dự trữ tiềm năng cho sản xuất

nhiên liệu sinh học Ngoài ra, Arumugam và cs (2013) cũng nghiên cứu sự ảnh hưởng

của các nguồn nitơ khác nhau đến sự sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus Kết quả cho

thấy có sự khác biệt giữa các nguồn nitơ trong việc thúc đẩy tăng trưởng sinh khối tảo ở nồng độ thấp hơn 5 và 10 mM Trong nghiên cứu,nitrat được sử dụng dưới dạng KNO3

và NaNO3 với một lượng lần lượt là 0,32 g.L-1 và 0,28 g.L-1 được cho rằng phù hợp với

sự tăng trưởng nhằm thu sinh khối của Scenedesmus Trong số các dạng nitơ tồn tại trong

môi trường thì urê (0,25 g.L-1) cho sinh khối gần như bằng nitrat, vì vậy urê trở thành một nguồn thay thế cho nguồn nitơ trong nuôi cấy tảo quy mô lớn trên thị trường hiện nay do có giá thành rẻ hơn

Sự tăng trưởng Scenedesmus sp nuôi trồng ở các hồ ở Lithuanian đã được nghiên

cứu với mục đích khảo sát điều kiện tối ưu để thu sinh khối làm nhiên liệu sinh học Các mẫu được lấy từ các nguồn nitơ khác nhau với các nồng độ khác nhau, có sự bổ sung nồng độ CO2 khác nhau và có bổ sung các nồng độ muối Năng suất sinh khối tốt nhất đã thu được khi sử dụng urê làm nguồn nitơ hoặc môi trường BG-11 với nồng độ NaNO3giảm Sự tăng lên của sinh khối ghi nhận được khi điều kiện nuôi cấy có bổ sung sục khí bằng CO2 (đặc biệt là với nồng độ 24%) (Makareviciene và cs, 2011)

Ở một nghiên cứu khác, Hakalin và cs (2014) đã đánh giá sự kết hợp ba yếu tố dinh dưỡng chính là nitơ, phôtpho và vitamin đối với sự tăng trưởng cũng như hàm hàm lượng

lipid của vi tảo Scenedesmus sp., đồng thời xây dựng công thức môi trường tối ưu với ba

nguồn dinh dưỡng này Kết quả chỉ ra nitơ, phốt pho và vitamin có tác tác động đáng kể đến hàm lượng lipid, hàm lượng lipid tối đa đạt 29,3%, tăng 90% khi so sánh với môi trường dinh dưỡng ban đầu Mặt khác, môi trường chỉ có nitơ và phôtpho cũng có tác động đáng kể đối với sự phát triển của tế bào với hàm lượng sinh khối khô, mật độ tảo và tốc độ tăng trưởng cụ thể lần lượt là là 1,3g.L-1; 1,5 x 107 tế bào.mL-1 và 0,62 ngày-1 Nghiên cứu của Hamouda (2018) cho rằng nồng độ phôtpho trong môi trường có thể ảnh

hưởng đến các thành phần hóa học và sinh khối của vi tảo Scenedesmus obliquus Kết

quả cho thấy ở nồng độ phôtpho 0,007 g.L-1, hàm lượng carbohydrate tối đa đạt 18,13%, hàm lượng protein cao nhất là 34,68% Mặc khác, hàm lượng lipid bằng 16% khi nồng độ phôtpho trong môi trường là 0,014 g.L-1.Tuy nhiên, ở nồng độ phôtpho 0,014 g.L-1

thì nồng độ tennin ở mức tối đa là 0,7 mg.g-1 sinh khối khô và hàm lượng flavonoid ở mức

có nồng độ NaCl là 25 mM Cũng tìm hiểu về ảnh hưởng của NaCl, nghiên cứu của Kirrolia và cs (2011) được thực hiện để đánh giá tác động của độ mặn (NaCl) đến đặc

điểm sinh lý và sinh hóa của tảo Để xác định tác động của NaCl, vi tảo Scenedesmus quadricauda đã được nuôi cấy với các nồng độ NaCl khác nhau, dao động từ 0,2-1,0

mM, thí nghiệm theo dõi trong khoảng thời gian 15 ngày Người ta nhận thấy rằng năng suất sinh khối tảo cao nhất ở nồng độ NaCl 0,2 mM so với đối chứng và sau đó nó giảm khi tăng nồng độ NaCl Tăng nồng độ NaCl ban đầu từ 0 – 0,2 mM làm giảm tích lũy lipid từ 6,75 xuống 6,12% sinh khối khô Tổng hàm lượng chất diệp lục của các loài tảo giảm khi nồng độ muối tăng lên khi so sánh với đối chứng Đáng chú ý, hàm lượng carbohydrate tăng ở tất cả các nồng độ NaCl, tuy nhiên lại có sự giảm về tổng hàm lượng protein ở nồng độ NaCl là 0,2 và 0,4mM và sau đó ở nồng độ NaCl ≥ 0,6mM, tổng lượng protein tăng so với đối chứng Kết quả chỉ ra rằng các loài tảo phản ứng đa dạng đối với stress NaCl

Các yếu tố dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự tích lũy các sắt tố và hợp chất chống oxi hóa Theo nghiên cứu của Guedes và cs (2011) về ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự tăng trưởng và hàm lượng chất chống oxy hóa của vi

tảo Scenedesmus obliquus, nhiệt độ đóng vai trò quan trọng hơn so với pH trong quá trình

tăng trưởng cũng như hàm lượng chất chống oxy hóa tổng hợp được Tốc độ tăng trưởng cao nhất đạt 0,294 ± 0,013 ngày-1 và năng suất sinh khối đạt 0,837 ± 0,054 mg.L-1.ngày-1khi điều kiện môi trường có pH tương đối thấp và nhiệt độ tương đối cao (30ᵒC) Ngược lại, tỷ lệ tổng hợp chất chống oxy hóa tăng theo pH với năng suất cao nhất đạt được ở

pH=8 và 30ᵒC với giá trị 0,638 mg.L-1.ngày-1 Ở điều kiện tối ưu nhất để tổng hợp chất chống oxy hóa thì hàm lượng lutein và β-carotenoid lần lượt là 203,57 ± 1,41 và 18,20 ± 0,33 mg.mL-1 García-Cañedo và cs (2016) tiến hành nuôi cấy mẻ Scenedesmus với ba

nồng độ nitơ khác nhau (N) Trong tất cả các nghiệm thức, nồng độ carotenoid đạt mức tối đa khi nồng độ N trong môi trường gần như hoàn toàn cạn kiệt Nồng độ carotenoid trong thí nghiệm tăng lên 3 lần so với nuôi cấy thông thường Ngoài ra, thành phần dinh dưỡng có thể gây ra stress trong hoạt động sinh lí của tảo, có thể kích hoạt tổng hợp carotenoid (Pirastru và cs, 2012) Ở nghiên cứu này, sự thay đổi chức năng quang hợp và sản xuất carotenoid trong tảo lục đã được nghiên cứu khi nuôi cấy tảo trong điều kiện hàm lượng nitơ thấp kết hợp bổ sung natri axetat Bằng cách sử dụng phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy rằng các carotenoid thứ cấp là astaxanthin và canthaxanthin được tích lũy cao hơn so với đối chứng Những thay đổi như vậy có thể liên quan đến việc sắp xếp lại cấu trúc của bộ máy quang hợp và có thể là một yếu tố tác động đến sự tích lũy carotenoid Přibyl và cs (2016) nghiên cứu về sinh tổng hợp và tích

lũy carotenoid trong vi tảo Scenedesmus sp so với Haematococcus pluvialis và Dunaliella salina Kết quả cho thấy Scenedesmus sp CCALA 1074 có thể tạo ra lượng

carotenoid cao, chủ yếu là lutein trong tất cả các giai đoạn tăng trưởng Trong môi trường

có nguồn dinh cao thì hàm lượng carotenoid tổng số và lutein tích lũy lần lượt đạt 1 và 0,75% trọng lượng khô

Sự tổng hợp carotenoid cũng còn được khảo sát dưới điều kiện ánh sáng khác nhau Ánh sáng là một yếu tố quan trọng trong việc tích lũy carotenoid và lượng nitơ có sẵn chỉ đóng một vai trò nhỏ trong quá trình tích lũy carotenoid (Pirastru và cs, 2012) Sự ảnh hưởng của nitrat và mức độ ánh sáng khác nhau đã được nghiên cứu để xác định ảnh

hưởng của stress lên quá trình tạo carotenoid của vi tảo Scenedesmus sp Astaxanthin và

adonixanthin là các xanthophyl chính trong các tế bào tảo Các xanthophyl này tồn tại dưới dạng este của axit béo trong các tế bào tảo trong môi trường nuôi cấy Việc bổ sung NaCl thúc đẩy quá trình tổng hợp các xanthophyl tự do Ánh sáng và nồng độ muối cao đẩy mạnh sự hình thành carotenogenogen hoạt hóa trong các tế bào tảo (Aburai và cs, 2015)

Tại Việt Nam, nghiên cứu về yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy

carotenoid của vi tảo Scenedesmus obliquus còn khá khan hiếm Nghiên cứu của Đặng

Thị Thanh Hòa và Trần Thị Mỹ Xuyên (2007) đã khảo sát sơ bộ các yếu tố vật lí như pH,

ánh sáng, nhiệt độ đến sinh trưởng và khảo sát tốc độ sinh trưởng của vi tảo Scenedesmus

ở ba môi trường BBM, Walsby, Jaworski Kết quả nghiên cứu chỉ ra vi tảo sinh trưởng tốt trong hai môi trường Jaworski và BBM trong khoảng nhiệt độ từ 28 – 30ᵒC với pH dao động 7,5 – 8 và cường độ ánh sáng 1000 – 2000 lux là phù hợp với sự sinh trưởng

của vi tảo Scenedesmus

Từ những nghiên cứu trên cho thấy vi tảo Scenedesmus obliquus là nguồn nguyên

liệu tiềm năng để sản xuất carotenoid – một dạng sắc tố hữu cơ trong sinh vật quang hợp

có giá trị dinh dưỡng cao, được ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm và thức

ăn nuôi trồng thủy hải sản Bên cạnh đó, việc tối ưu hóa môi trường nuôi vẫn đang được quan tâm để tạo ra sự phát triển ổn định cũng như nâng cao hiệu suất tích lũy sắc tố như carotenoid

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Giống Scenedesmus obliquus được phân lập từ các thủy vực nước ngọt trên địa bàn

thành phố Đà Nẵng và lưu giữ tại phòng thí nghiệm Công nghệ Tảo, Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nhân giống tảo và giữ giống trên môi trường BG-11

Scenedesmus obliquus được nuôi cấy trong môi trường BG-11 (Rippka và cs, 1979)

có sục khí, cường độ ánh sáng 100 μmol.m-2.s-1 với chu kỳ sáng: tối là 16: 8, nhiệt độ duy

Định lượng sử dụng

2.2.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi tảo bằng buồng đếm Newbauer

Buồng đếm Newbauer có độ sâu buồng là 0,1 mm và gồm 9 hình vuông lớn 1mm x

1mm Mỗi hình vuông được chia thành các hình vuông nhỏ hơn Tiến hành pha loãng

mẫu để đảm bảo lượng tế bào trong mỗi ô vuông không lớn hơn 10 tế bào và không nhỏ

hơn 2 tế bào Nếu các tế bào dính lại với nhau cần lắc đều để tách rời Nhỏ 1 giọt dung

dịch mẫu vào giữa buồng đếm và đậy lại bằng lamen, chú ý không để tạo bọt khí Tiến

hành đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau (chọn 4 ô ở 4 góc và một ô ở chính

giữa) Cách đếm số tế bào trong mỗi ô lớn như sau: mỗi ô nhỏ có 4 cạnh giới hạn, đếm số

lượng tế bào nằm trọn trong ô và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều (đếm

cạnh bên trái và cạnh bên phải) Đếm các ô từ trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng

dưới rồi đổi chiều, đếm cho đến ô cuối cùng của 16 ô nhỏ (Moheimani và cs, 2013)

2.2.3 Xác định tốc độ sinh trưởng và hàm lượng sắc tố tích lũy

Tốc độ sinh trưởng µ (ngày-1) của vi tảo được tính theo công thức:

µ = ( ) ( )

Trong đó:

t và t0 là thời điểm bắt đầu và kết thúc của giai đoạn tăng trưởng (ngày),

n 0 và nt là mật độ tế bào ở thời điểm bắt đầu và kết thúc của giai đoạn tăng trưởng

(tế bào.mL-1

)

Để xác định trọng lượng khô, sinh khối tảo được lọc qua giấy lọc Whatman GF/B

và sấy ở 400C đến khối lượng không đổi Lượng sinh khối khô (μg.mL-1) được tính dựa

trên sự thay đổi trọng lượng theo công thức:

Trong đó:

W 1 là trọng lượng giấy lọc sau khi sấy đến khối lượng không đổi (μg),

W 2 là trong lượng tảo và giấy lọc sau khi sấy đến khối lượng không đổi (μg),

V là thể tích của mẫu tảo đem lọc (mL)

Hàm lượng chlorophyll-a, chlorophyll-b và carotenoid (μg.mL-1) được xác định

theo phương pháp của (Sartory và Grobbelaar, 1984; Dharma, 2017) 2 mL sinh khối tảo

được ly tâm với tốc độ 12 500 vòng.phút-1

trong 5 phút, sau đó thêm 2 mL methanol 90%