Đánh giá hiệu lực ức chế nấm phytophthora sp gây bệnh sương mai trên cây cà chua của vi khuẩn bacillus velezensis

TÓM TẮT Vi khuẩn Bacillus velezensis, thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis, hiện nay đang được quan tâm nghiên cứu bởi có nhiều tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm sinh

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GÂY BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÂY CÀ CHUA CỦA

VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS

VÕ LƯƠNG Ý NHI

Đà Nẵng, năm 2020

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GÂY BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÂY CÀ CHUA CỦA

VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS

Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2016-2020

Sinh viên: Võ Lương Ý Nhi Người hướng dẫn: ThS Lê Vũ Khánh Trang

Đà Nẵng, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực Đây là kết quả nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học

Đà Nẵng, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực hiện

Võ Lương Ý Nhi

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới ThS Lê

Vũ Khánh Trang đã định hướng nghiên cứu, sửa khóa luận và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm

Đà Nẵng đã tạo điều kiện và giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp này

Đà Nẵng, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực hiện

Võ Lương Ý Nhi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

3 Ý NGHĨA ĐỀ TÀI 2

3.1 Ý nghĩa lý luận 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM PHYTOPHTHORA SP GÂY BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÂY CÀ CHUA 4

1.1.1 Tổng quan về nấm bệnh Phytophthora sp 4

1.1.2 Triệu chứng bệnh sương mai trên cây cà chua 5

1.2 VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG 6

1.3 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS 7

1.4 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 9

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 VẬT LIỆU 11

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 11

2.2.2 Phương pháp 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17

3.1 SÀNG LỌC KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP TỪ CÁC THÀNH PHẦN TRONG CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS 17 3.2 ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA SP TỪ CÁC THÀNH PHẦN TRONG CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS 18 3.2.1 Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp từ tế bào vi khuẩn B velezensis 18

3.2.2 Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp từ dịch ngoại

bào của vi khuẩn B velezensis 22

3.2.3 Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp từ các thành phần phi enzyme trong dịch ngoại bào 24

3.2.4 Đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp từ enzyme ngoại bào của vi khuẩn B velezensis 26

3.2.5 Kết luận 27

3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS 28

3.3.1 Khả năng sinh enzyme protease 28

3.3.2 Khả năng sinh enzyme chitinase 29

3.3.3 Khả năng sinh enzyme cellulase 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

1 Kết luận 31

2 Kiến nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 38

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

FAO Foods and Agriculture Organization

MMHL Minimal Medium recommended by Hsu and Lockwood

PDA Potato Dextrose Agar

PSM Môi trường chọn lọc Phytophthora

DANH MỤC BẢNG BIỂU

3.1 Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bệnh từ sinh khối tế bào

không gia nhiệt

3.6 Hiệu lực kháng nấm cao nhất của các thành phần trong canh

trường nuôi cấy vi khuẩn B velezensis sau 5 ngày

27

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1.2 Hình thái khuẩn lạc và bào tử vi khuẩn B velezensis 8

3.1 Khả năng kháng nấm Phytophthora sp của các thành phần trong

3.2 Khả năng đối kháng nấm từ tế bào không gia nhiệt của vi khuẩn B

3.3 Khả năng đối kháng nấm từ tế bào được gia nhiệt ở 55°C của vi khuẩn

3.4 Khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp từ dịch ngoại bào của vi

khuẩn B velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ 23

3.5 Khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp bằng dịch phi enzyme của

vi khuẩn B velezensis sau 7 ngày ở các nồng độ 25

3.6 Khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp từ dịch enzyme sau 7

ngày ở các nồng độ

26

3.8 Vi khuẩn B velezensis phân giải huyền phù chitin 29

TÓM TẮT

Vi khuẩn Bacillus velezensis, thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis, hiện nay đang được

quan tâm nghiên cứu bởi có nhiều tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại và giúp tăng năng suất cho cây trồng Trong nghiên cứu của Hứa Thị

Vy (2019) đã phân lập được chủng vi khuẩn B velezensis có khả năng đối kháng mạnh với nấm Phytophthora sp với hiệu lực đối kháng lên đến hơn 80% Do đó, nghiên cứu này tiếp

tục được thực hiện để sàng lọc và đánh giá các thành phần từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn

B velezensis có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai

trên cây cà chua với mục đích phát triển và đa dạng hóa các sản phẩm chế phẩm sinh học từ

vi khuẩn B velezensis Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các thành phần từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn B velezensis bao gồm tế bào vi khuẩn, dịch ngoại bào, dịch enzyme và các thành phần phi enzyme đều có khả năng đối kháng với nấm bệnh Phytophthora sp Hơn nữa, khả năng đối kháng của tế bào vi khuẩn và dịch ngoại bào với nấm bệnh Phytophthora sp là rất

mạnh thể hiện qua hiệu lực ức chế nấm lần lượt là 84,44% và 80% sau 5 ngày Ngoài ra,

nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn B velezensis còn có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào

như protease, chitinase và cellulase, đây là những enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc

phá hủy thành tế bào nấm bệnh Phytophthora sp Hiệu lực đối kháng mạnh với nấm bệnh

được chứng minh trong nghiên cứu này sẽ góp phần phát triển ứng dụng sản xuất các loại chế

phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn Bacillus velezensis phục vụ vào công cuộc phòng trừ bệnh

sương mai ở cây trồng nói chung và cây cà chua nói riêng, hướng đến một nền nông nghiệp xanh và bền vững

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) thuộc họ cà (Solanaceae) là loại cây phổ biến

trên thế giới, rất được ưa chuộng bởi giá trị dinh dưỡng và mang lại hiệu quả kinh tế cao Ở Việt Nam, cà chua được trồng từ rất lâu và nó là loại rau ăn quả được nhà nước ưu tiên phát triển Năm 2010 diện tích cà chua khoảng 17,6 nghìn ha, năng suất đạt 11,6 tấn/ha (theo FAO) Tuy nhiên việc sản xuất cà chua còn nhiều hạn chế do năng suất và chất lượng cà chua trong nước còn thấp so với thị trường nước ngoài Nguyên nhân chính là do giống có năng suất thấp cùng với khí hậu nước ta dễ dàng tạo điều kiện thuận lợi cho một số loại bệnh trên cây phát triển, chủ yếu là các bệnh do vi sinh vật gây ra như: bệnh héo xanh, bệnh đốm vi khuẩn, bệnh đốm quả, bệnh sương mai

Bệnh sương mai là loại bệnh phổ biến thứ hai trên cây cà chua, gây ra nhiều ảnh hưởng như làm giảm năng suất và chất lượng cà chua Tác nhân chính gây bệnh là do nấm

Phytophthora sp Hiện nay người ta thường sử dụng các loại thuốc hóa học để diệt nấm nhưng

biện pháp này thường để lại một số hậu quả như: diệt hết tất cả các vi sinh vật có lợi trong đất làm mất cân bằng hệ vi sinh, tạo điều kiện cho các loài gây hại phát triển, dư lượng thuốc diệt nấm làm ô nhiễm nguồn đất, nước, gây hại đối với sức khỏe của người Do đó việc sử dụng biện pháp sinh học để thay thế biện pháp hóa học đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Một trong những biện pháp sinh học được ứng dụng nhiều đó là việc sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn để đối kháng nấm bệnh

Hiện nay, có rất nhiều chủng vi khuẩn đối kháng như Pseudomonas, Bacillus… đã và

đang được nghiên cứu vì chúng có khả năng tổng hợp được một số hợp chất ngoại bào ức chế

sự phát triển của nấm bệnh gây hại cho cây trồng Trong đó chủng Bacillus sp được đánh giá

là có khả năng kiểm soát nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai cho cây trồng rất tốt

Trong nghiên cứu của Hứa Thị Vy (2019) đã phân lập và tuyển chọn được 21 chủng vi khuẩn

có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai từ các vùng đất trồng

cà chua của thành phố Đà Nẵng Trong đó có chủng vi khuẩn kí hiệu VK15 có khả năng tiêu

diệt nấm gây bệnh mạnh nhất và đã được xác định đó là loài Bacillus velezensis (B velezensis)

Trong công nghiệp sản xuất các loại chế phẩm sinh học thì điều quan trọng là cần phải xác định được cơ sở khoa học của việc ứng dụng vi sinh vật đối kháng, ví dụ như xác định được các cơ chế, con đường và những thành phần có thể đối kháng mầm bệnh hại của vi sinh vật đối kháng để làm nền tảng cho việc sản xuất các loại chế phẩm sinh học đa dạng hơn Do

vậy, đề tài: “Đánh giá hiệu lực ức chế nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai trên cây

cà chua của vi khuẩn Bacillus velezensis” được thực hiện để tìm ra thành phần nào của canh

trường nuôi cấy vi khuẩn có khả năng kháng nấm bệnh Phytophthora sp ở cây cà chua mạnh nhất, làm cơ sở để sản xuất các chế phẩm Bacillus sp ứng dụng trong nông nghiệp, hướng

đến sự phát triển của một nền nông nghiệp xanh và bền vững

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc sản xuất các chế phẩm sinh học

từ vi khuẩn B velezensis trong lĩnh vực phòng ngừa dịch bệnh cho cây trồng tại địa phương,

góp phần nâng cao năng suất cây trồng, xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Sàng lọc khả năng kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai trên cây cà chua

từ các thành phần trong dịch nuôi cấy vi khuẩn B velezensis ở điều kiện phòng thí nghiệm

- Đánh giá khả năng kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai trên cây cà chua

từ các thành phần trong dịch nuôi cấy vi khuẩn B velezensis ở điều kiện phòng thí nghiệm

- Khảo sát khả năng sinh một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn B velezensis

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM PHYTOPHTHORA SP GÂY BỆNH SƯƠNG MAI

TRÊN CÂY CÀ CHUA

1.1.1 Tổng quan về nấm bệnh Phytophthora sp

a Đặc điểm sinh thái của nấm bệnh Phytophthora sp

Phytophthora sp là tác nhân gây bệnh sương mai trên cây cà chua, chúng phát tán bào

tử trong gió từ cây này sang cây khác Nấm sinh sản theo hai hình thức là vô tính và hữu tính, trong đó phương thức sinh sản vô tính là quan trọng nhất bằng cách phát tán bào tử Nếu nhiệt

độ môi trường nằm trong khoảng từ 20 – 24°C thì bào tử nấm sẽ nảy mầm trực tiếp tạo thành sợi nấm xâm nhập vào tế bào mô cây Bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác do gió hoặc

có thể do nước rửa trôi bào tử từ nơi này sang nơi khác Nếu vườn cà chua được bón đạm nhiều, mất cân đối hoặc trồng quá dày, tiêu thoát nước kém, trồng liên tục không có thời vụ

rõ ràng, xen kẽ, không phân khu vực là những điều kiện thuận lợi để bệnh phát sinh và phát triển (Phan Thúy Hiền và cs, 2009)

b Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora sp

Nấm Phytophthora sp là nấm ký sinh chuyên tính, sống trong tế bào thực vật tạo thành

những vòi hút sinh sản vô tính chủ yếu tạo bào tử phân sinh (conidi) trên các cành conidi đâm nhánh hơi phình rộng Cành conidi tương đối dài, conidi đơn độc hình trứng hay hình quả chanh Chỉ có một conidi trên đỉnh nhánh tạo cho bề mặt của bộ phận bị bệnh có màu trắng rất dễ nhận dạng (William W Kirk và cs, 2009)

Hình 1.1 Bào tử của nấm bệnh Phytophthora sp (Hứa Thị Vy, 2019)

Hình thức sinh sản của nấm Phytophthora sp quyết định đến khả năng phát dịch Theo nghiên cứu của Andre và David (2004) cho thấy chu kỳ sống của nấm Phytophthora sp có

thể bao gồm tới 3 dạng sinh sản vô tính – bào tử nang, du động bào tử, hậu bào tử và bào tử noãn với dạng sinh sản hữu tính Sợi nấm sinh dưỡng lưỡng bội sản sinh ra bào tử nang vô tính mà có thể nảy mầm trực tiếp hoặc có thể phân chia để sản sinh ra các bào tử động, mỗi bào tử động trải qua một quá trình lan truyền và bơi vào nang trước khi nảy mầm

Kết quả của Letter W Burgess (2008) cho rằng Phytophthora sp thuộc lớp nấm trứng,

không phải nấm thực và sinh sản ra di động bào tử Vì vậy, phòng trừ nấm này khác với phòng trừ các bệnh do nấm thực gây ra và các thuốc dùng trong phòng trừ cũng khác Theo tác giả, các bệnh do nấm này gây hại cho cây lâu năm, rau và các cây trồng khác làm tổn thất đáng kể

về kinh tế cho các nước vùng Đông Nam Á Các loài Phytophthora sp sản sinh bọc bào tử

trên môi trường chọn lọc PSM nếu được đặt trong điều kiện có chiếu sáng Một số loài cũng sản sinh bọc bào tử trên môi trường PCA hoặc môi trường potato-dextrose agar (PDA)

1.1.2 Triệu chứng bệnh sương mai trên cây cà chua

Tác giả William W Kirk và cs (2009) cho biết, bệnh sương mai có nguồn gốc từ Nam

Mỹ, nơi đây cũng chính là nguồn gốc ra đời của cây khoai tây Sau đó, bệnh đã lan ra các nước châu Âu, châu Á cùng với việc di thực của cây này Bệnh được chính thức xác định đầu tiên năm 1930 ở Đức, 15 năm sau bệnh trở thành dịch nguy hiểm ở Bắc Âu, đặc biệt ở Ai-xơ-len

Tác nhân gây bệnh do nấm thuộc loài nấm Phytophthora sp Triệu chứng của bệnh thường

biểu hiện chủ yếu trên lá và thân cây cà chua

Đối với lá cà chua: bệnh thường xuất hiện ở mép của chóp lá tạo ra vết xám xanh nhạt sau đó lan rộng vào phiến lá Ở phần giữa vết bệnh sẽ chuyển dần sang màu nâu đen và xung quanh có lớp bào tử màu trắng xốp bao phủ như sương muối làm cho lá chết lụi Ở phần dưới

lá bệnh có một lớp mốc trắng như sương

Đối với thân cành cà chua: bệnh sẽ biểu hiện từng đoạn dài, lúc đầu thân cây sẽ có màu nâu hoặc màu thâm đen, sau đó sẽ thối rửa thành màu nâu đen có lớp nấm trắng như sương muối bao phủ xung quanh Khi bị nhiễm bệnh thì phần thân hoặc cành sẽ nhỏ tóp lại dễ làm cho cây gãy gục

1.2 VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG

Vi sinh vật đối kháng là những loài có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật khác trong tự nhiên Việc lợi dụng hiện tượng đối kháng này trong việc bảo vệ thực vật được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học Đây được xem là một phương pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng một cách trực tiếp bằng cách sử dụng các thành phần trong hệ sinh thái

để giúp cho cây trồng chống lại những tác nhân gây bệnh, nó cũng chính là chìa khóa để tạo

ra một nền nông nghiệp bền vững (Azcon-Augiler và Barea, 1996)

Những loài vi khuẩn đối kháng luôn tồn tại ở trong tự nhiên, đa số chúng đều có lợi cho con người Trong nông nghiệp những loài vi khuẩn đối kháng đều thuộc hệ vi sinh vật sống ở vùng rễ cây, trong quá trình sinh trưởng chúng sẽ tiết ra các chất trao đổi thứ cấp như: chất kháng sinh, enzyme thủy phân, siderophore, chất điều hòa sinh trưởng Những chất này rất

có lợi cho sự phát triển của cây trồng, giúp cây kháng bệnh, tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, kích thích sự sinh trưởng của cây, hòa tan nguồn dinh dưỡng từ dạng khó hấp thụ thành dạng

dễ hấp thụ cho cây

Một số cơ chế đối kháng của vi sinh vật:

- Cơ chế do kháng sinh: Kháng sinh là một chất sinh ra trong quá trình sinh trưởng của

vi sinh vật nhằm tiêu diệt những mầm bệnh có trong đất trồng cây, giúp cho cây trồng phát triển Nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hoặc là kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn một cách đặc hiệu

- Cơ chế do siderophore: Vi sinh vật đối kháng có khả năng cạnh tranh một cách trực

tiếp với nguồn gây bệnh về dinh dưỡng, oxy, không gian sống, khả năng sinh kháng sinh, tạo siderophore để sinh trưởng Trong đó, siderophore là một loại protein sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe3+ trong môi trường có ái lực cao nhằm giúp phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của vi sinh vật, làm cho môi trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác không có đủ ion Fe3+ cho quá trình sinh trưởng của mình, do đó chúng sẽ không sinh trưởng được

- Cơ chế do enzyme thủy phân: enzyme ngoại bào là những enzyme được vi sinh vật sinh

tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

1.3 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS VELEZENSIS

Hiện nay, theo hệ thống phân loại thì chi Bacillus có khoảng gần 300 loài và các loài phụ dưới loài (Parte, 2014) B velezensis là một trong số tám loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis (Rooney và cs, 2009) Chi Bacillus là một nhóm các loài vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình

que, phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái, phát triển tốt ở nhiệt độ từ 25-37°C và thích nghi

nhanh ở pH trung tính Hầu hết các chi Bacillus có khả năng sinh nội bào tử là một dạng nghỉ

của tế bào để giúp vi khuẩn có thể chống chịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi của môi trường

Vi khuẩn B velezensis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2005 tại bờ sông Velez ở Malaga – miền Nam Tây Ban Nha (Ruiz-Garcia và cs, 2005) B velezensis là vi khuẩn Gram

dương, hình que, kích thước tế bào vi khuẩn khoảng 0,7 – 0,9 x 1,6 – 3 μm, có khả năng sinh acid từ aesculin, amygdalin, arbutin, (Wang và cs, 2008) Loài này còn được biết đến như là một tác nhân phòng trừ sinh học bệnh cây hiệu quả với khả năng sản sinh tốt kháng sinh, các enzyme phân giải vách tế bào nấm bệnh và các hợp chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng (Mc Spadden, 2004)

Hình 1.2 Hình thái khuẩn lạc và bào tử vi khuẩn B velezensis (Hứa Thị Vy, 2019)

Đây là loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh hormone kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh (Chowdhury và cs,

2015; Shao và cs, 2015; Li và cs, 2015) Do sở hữu các đặc tính quý, vi khuẩn B velezensis

được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ giải mã hệ gen (genome) đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng trong nhà kính và

ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B velezensis đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có

lợi và ứng dụng trong đấu tranh sinh học để phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây trồng phục

vụ nông nghiệp

Theo phần lớn các nghiên cứu trước đây đã sử dụng B velezensis để ứng dụng trong

nông nghiệp, thay thế cho phân bón tổng hợp hiện nay và thuốc trừ sâu hóa học Các tác giả

đã chỉ ra tiềm năng kiểm soát sinh học của B velezensis có khả năng thông qua bốn cơ chế

chính: kháng sinh qua trung gian chất chuyển hóa kháng khuẩn, sản xuất các hormone tăng trưởng để hấp thu chất dinh dưỡng, cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật khác và sản sinh các hợp chất dễ bay hơi cùng với các hợp chất lipopeptide bề mặt (Adetomiwa Ayodele Adeniji và cs, 2019)

B velezensis sản sinh ra nhiều loại chất trao đổi bậc hai có hoạt tính kháng nấm và kháng

vi khuẩn gây bệnh cây Các chất trao đổi đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore và protein kháng khuẩn (Arguelles-Arias và cs, 2009; Huang và cs, 2014)

1.4 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Vi sinh vật đối kháng với một số loài gây bệnh trên cây trồng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX Một số tiến bộ đã đạt được trong việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng như:

Nghiên cứu của Galindo (1992) đã thí nghiệm kiểm tra thành công khả năng phòng trừ

sinh học đối với nấm Phytophthora palmivora ở cây ca cao bằng cách sử dụng các vi sinh vật đối kháng như Bacillus spp và Pseudomonas fluorescens

Theo nghiên cứu của tác giả Jensen và cs (2002) thì chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

GBO3 được sử dụng để xử lý hạt làm giảm bệnh thối rễ cây đậu và tăng năng suất 31% so với

đối chứng Bên cạnh đó, một số vi khuẩn như Bacillus spp., xạ khuẩn Streptomyces spp cũng

được sử dụng nhiều để phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại do các nhóm vi khuẩn này có nhiều tiềm năng như phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có tính đối kháng cao với các loài

vi sinh vật gây hại và an toàn với các vi sinh vật khác cũng như môi trường

Tại Hàn Quốc, theo nghiên cứu của Dong và cs (2006) đã sử dụng sản phẩm vi khuẩn có chứa enzyme chitinase và β-1,3-glucanase đã hạn chế được 64% tỷ lệ bệnh sương mai so với đối chứng trên cây ớt ở nhà lưới Tác giả cũng sử dụng các giống chống chịu, vệ sinh đồng ruộng, luân canh với các cây khác… kết quả đã hạn chế được 54-70% bệnh trên ớt ngoài đồng

Hai dòng vi khuẩn Bacillus là BB1 và FH17 với bã nho đã phân hủy theo nghiên cứu của Zhi-Qiang Jiang và cs (2006) có thể tiêu diệt tới 81% nấm Phytophthora capcisi gây bệnh

sương mai trên cây ớt

Nghiên cứu của Lee K J và cs (2008) cho thấy Bacillus spp dòng R33 và R13 có khả năng hạn chế sự phát triển của nấm Phytophthora capcisi tới 86,8%

Tại trường Đại học Florida của Mỹ đã ứng dụng được một số chủng vi sinh vật đối kháng

để hạn chế bệnh trên cây cà chua như các chủng PGPR Bacillus pumilus SE 34, EQTY và

Pseudomonas putida 89B61 với tỷ lệ bệnh giảm từ 10-25% so với đối chứng Ngoài ra thì tác

giả cũng có sử dụng 2 chủng vi khuẩn Bacillus là Bacillus amyloliquefaciens IN937a và

Bacillus subtilis GB03 để hạn chế khả năng bị bệnh héo xanh và bệnh sương mai trên cây cà

chua

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam hiện nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng để làm cơ sở khoa học sản xuất các loại chế phẩm sinh học phòng trừ một số bệnh hại trên cây trồng Đặc biệt, trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu về việc sử dụng

vi khuẩn Bacillus sp để tạo chế phẩm sinh học đối kháng phòng trừ một số bệnh trên cây

trồng:

- Chế phẩm BC (Bacillus subtilis) của Viện Bảo vệ Thực vật (1999) ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do nấm Phytophthora capsici

- Nguyễn Quang Huy và cs (2012), Trường đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà

Nội, đã phân lập hai chủng vi khuẩn ký hiệu U1.3 và U3.7 đều thuộc chi Bacillus trong đó U1.3 gần với loài Bacillus subtilis còn chủng U3.7 gần với loài Bacillus velezensis Hai chủng

vi khuẩn phân lập đều có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp

- Trịnh Thành Trung và cs (2016), Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(3): 563-571, đã tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định đặc tính sinh học của chất kháng nấm và chất kháng

khuẩn từ chủng vi khuẩn Bacillus velezensis CP1604

- Trịnh Thành Trung và cs (2017), Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(1): 169-179, đã nghiên cứu tiềm năng ứng dụng tạo chế phẩm làm phân bón hữu cơ sinh học từ các chủng

Bacillus velezensis phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam

- Tác giả Trần Ngọc Khánh và cs (2015) đã tuyển chọn và định danh được 2 chủng vi

sinh vật là Bacillus amyloliquefaciens và xạ khuẩn Streptomyces toxytricini có khả năng kháng nấm Phytophthora infestans

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

- Chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh sương mai trên cây cà chua đã được phân lập

tại một số vùng trồng cà chua ở Đà Nẵng và được bảo quản tại khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng

- Vi khuẩn B velezensis đã được phân lập tại một số vùng đất trồng cà chua ở Đà Nẵng

và được bảo quản tại khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bố trí thí nghiệm

Tiến trình thực hiện nghiên cứu được bố trí theo Hình 2.1

Đánh giá hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn

Gia nhiệt Không gia

nhiệt Enzyme Phi enzyme

2.2.2 Phương pháp

a Phương pháp giữ giống vi sinh vật

Vi khuẩn B velezensis được giữ giống trên môi trường thạch LB, nấm Phytophthora sp

được giữ giống trên môi trường thạch PDA Tất cả các giống vi sinh vật được bảo quản ở 4°C

và thực hiện cấy chuyền hàng tháng

b Phương pháp hoạt hóa vi sinh vật

- Đối với vi khuẩn: Từ ống thạch nghiêng lấy sinh khối vi khuẩn để tiến hành hoạt hóa trong bình tam giác 250 ml chứa 50ml môi trường LB đã được khử trùng ở điều kiện 121°C,

1 atm trong thời gian 20 phút, tiến hành nuôi cấy lắc 150 vòng/ phút trong 18 giờ ở nhiệt độ phòng

- Đối với nấm: Chủng nấm gây bệnh sương mai Phytophthora sp từ ống thạch nghiêng

được hoạt hóa lại trong môi trường thạch PDA đĩa bằng cách cắt một khoanh thạch trong ống thạch nghiêng rồi úp sang môi trường PDA mới trong khoảng 5 – 7 ngày ở 30°C để thực hiện các phương pháp đối kháng

c Phương pháp thu sinh khối tế bào, enzyme ngoại bào và các thành phần phi enzyme từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus velezensis

Vi khuẩn B velezensis được tăng sinh trong bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi

trường LB và 1% thể tích chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa Sau 12 giờ nuôi cấy lắc ở nhiệt

độ phòng, tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/ 10 phút để thu dịch ngoại bào và sinh khối tế bào

vi khuẩn Sinh khối tế bào vi khuẩn được tái huyền phù trong nước cất vô trùng

Để thu enzyme ngoại bào và các thành phần phi enzyme, tiến hành nuôi cấy lắc vi khuẩn đã hoạt hóa trong môi trường LB lỏng trong vòng 48 giờ, sau đó thực hiện như trên để thu dịch ngoại bào Lấy 50ml dịch ngoại bào cho vào bình 250ml Tiến hành tủa phân đoạn dịch ngoại bào bằng cách cho từ từ muối amoni sunfat (NH4)2SO4 bão hòa và khuấy đều để lắng Sau 12 giờ tiến hành ly tâm 10000 vòng/10 phút ở 4°C thu được phần dịch nổi là các thành phần phi enzyme, phần kết tủa được hòa tan trong đệm acetate pH=3,8

d Sàng lọc khả năng kháng nấm Phytophthora sp từ các thành phần trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn B velezensis ở điều kiện phòng thí nghiệm

Phương pháp sàng lọc khả năng kháng nấm được thực hiện theo phương pháp cấy kép

và theo dõi sự phát triển của sợi nấm sau 48 giờ Trong đó, đĩa petri chứa môi trường thạch PDA được chia làm hai phần đối xứng, nấm được cấy vào một bên đĩa và một bên là mẫu thí nghiệm Đĩa petri được ủ ở nhiệt độ 30°C, tiến hành quan sát sự phát triển của sợi nấm và kết luận khả năng ức chế sự phát triển của nấm bởi các mẫu

Các mẫu thí nghiệm được sử dụng để sàng lọc khả năng kháng nấm Phytophthora sp

bao gồm:

+ 0,1ml dịch sinh khối tế bào vi khuẩn B velezensis không gia nhiệt

+ 0,1ml dịch sinh khối tế bào vi khuẩn B velezensis được gia nhiệt ở 55ºC trong vòng

Phương pháp thực hiện

Đĩa petri chứa môi trường PDA được chia làm hai phần đối xứng, nấm được cấy vào một bên đĩa và một bên là 0,1ml dịch mẫu được pha loãng với nước cất vô trùng đến các nồng

độ thích hợp sau đó nhỏ vào lỗ thạch ở bên đĩa còn lại Ủ ở nhiệt độ 30°C, tiến hành quan sát

sự phát triển của sợi nấm và tính hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn Các mẫu

thí nghiệm đánh giá khả năng kháng nấm Phytophthora sp bao gồm:

+ Dịch sinh khối tế bào vi khuẩn B velezensis không gia nhiệt

+ Dịch sinh khối tế bào vi khuẩn B velezensis được gia nhiệt ở 55ºC trong vòng 15 phút + Dịch ngoại bào

+ Dịch enzyme ngoại bào

Phương pháp thực hiện

Phương pháp đục lỗ trên thạch trên môi trường có chứa cơ chất tương ứng với từng loại enzyme được hấp khử trùng, đổ vào đĩa petri Chờ môi trường nguội, dùng ống đục lỗ (đường kính 6mm) Nhỏ dịch nuôi cấy của vi khuẩn vào lỗ thạch Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 24 - 72 giờ Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng để xem hoạt tính sinh enzyme + Xác định khả năng sinh enzyme chitinase: Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường MMHL bổ sung 1% dịch huyền phù chitin, ủ ở 30°C trong 3 ngày (Jami và cs, 2008) Khả năng phân giải chitin được xác định bằng cách nhuộm với dung dịch Lugol 1%