Khảo sát tác dụng kháng u da của cao toàn phần ethanol từ lá tía tô perilla frutescens lamiaceae trên chuột nhắt trắng

Khảo sát tác dụng dự phòng vàđiều trị của cao Tía tô 10% trên mô hình chuột gây u bằng 7,12-dimethylbenz[a]anthracene DMBA và croton oi với DMBA được bôi 1 lần duynhất, croton oil được b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VƯU THANH TÚ QUYÊN

KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TOÀN

PHẦN ETHANOL TỪ LÁ TÍA TÔ PERILLA FRUTESCENS

LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2017

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VƯU THANH TÚ QUYÊN

KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TOÀN PHẦN

ETHANOL TỪ LÁ TÍA TÔ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE

TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng

Mã số: 60720402

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn: PGS.TS Huỳnh Ngọc Trinh

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2017

Luận văn Thạc sỹ - Niên khóa: 2015 – 2017Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng

KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TOÀN PHẦN ETHANOL TỪ

LÁ TÍA TÔ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT

Phương pháp nghiên cứu

Toàn thân cây Tía tô được quan sát, phân tích đặc điểm và tiến hành vi phẫu các bộphận thân, lá và cuống lá Cao toàn phần Tía tô được chiết xuất từ bột lá với ethanol50% Flavonoid có trong cao Tía tô được định tính bằng SKLM và định lượng bởiHPLC pha đảo, đầu dò PDA tại bước sóng 300 nm Khảo sát tác dụng dự phòng vàđiều trị của cao Tía tô 10% trên mô hình chuột gây u bằng 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) và croton oi với DMBA được bôi 1 lần duynhất, croton oil được bôi cách đó 2 tuần với tần suất 2 lần/tuần trong thời gian 20tuần

Kết quả

Kết quả định tính SKLM cho thấy cao toàn phần Tía tô có chứa acid rosmarinic vàluteolin Bằng phương pháp định lượng HPLC với đầu dò PDA, tính được hàmlượng acid rosmarinic và luteolin lần lượt là 1.178 ± 0.011 % (w/w) và 0.105 ±0.001 % (w/w) Cao Tía tô 10% đã không làm thay đổi tỷ lệ chuột u, số khối u trungbình nhưng đã làm chậm sự xuất hiện khối u 2 tuần và làm giảm thể tích khối u có ýnghĩa thống kê so với lô chứng glycerin 5% Trong thử nghiệm đánh giá tác độngđiều trị, cao Tía tô 10% không làm giảm tỷ lệ chuột u, số khối u trung bình và thểtích trung bình khối u so với lô bệnh

Kết luận

Cao toàn phần ethanol từ lá Tía tô Perilla frutescens đã cho thấy hiệu quả dự phòng

nhưng không thể hiện được tác động điều trị u da trên chuột nhắt trắng

Master’s thesis – Academic course: 2015 – 2017Speciality: Pharmacology – Clinical Pharmacology

ANTI-TUMOR EFFECT OF ETHANOLIC EXTRACT FROM LEAVES OF

PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE IN MOUSE SKIN

Vuu Thanh Tu QuyenSupervisor: Assoc Prof Dr Huynh Ngoc Trinh

Background

This study aimed to investigate the antitumor effects of Perilla leaf extract (PLE) in

a two-stage chemical carcinogenesis protocol in mice We also evaluates the effect

of PLE on normal mouse skin Morevoer, we analysed perilla plant by microscopicmethod and formed pharmacopoeial standards of PLE

Methods

A whole plant of perilla was observed, analysed by microscopic method Totalextract of Perilla leaves was obtained by percolation method using 50% ethanol

The identification of PLE was performed by thin layer chromatography (TLC) with

normal phase of silica gel F254 and HPLC-PDA with reversed phase of C18 column

at UV 300 nm The cutaneous tumors were initiated by the a single application by7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) on the dorsal shaved skin, then promoted

by repeated applications of croton oil during 20 weeks

Results

The TLC chromatogram for the studied extract highlighted the presence ofrosmarinic acid and luteolin By means of HPLC-PDA analysis, the content ofrosmarinic acid and luteolin were found in amounts of 1.178 ± 0.011 % (w/w) and0.105 ± 0.001 % (w/w), respectively In the preventing effect experiment, the PLE-treated group prolonged the latency period of tumor appearance up to 2 weeks andalso significantly reduced average tumor volume in dorsal skin of mice comparedwith untreated group In the treated effect experiment, PLE did not change thetumor incidence, tumor burden and average tumor volume

Conclusion

The ethanol extract from leaves of Perilla frutescens demonstrated promising

antitumor-promotion in preventing activity but it did not show the prevented tumor effect on mouse skin

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu, kết quả trong luận văn đều trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây.

Vưu Thanh Tú Quyên

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Ung thư da 2

1.1.1 Sự hình thành và phát triển ung thư da 2

1.1.2 Tác nhân gây ung thư da 2

1.1.3 Phân loại ung thư da 3

1.2 Mô hình gây u da 2 giai đoạn bằng hóa chất trên chuột thực nghiệm 5

1.2.1 Cơ chế tác động của các tác nhân gây u qua các giai đoạn thử nghiệm 5

1.2.2 Tác nhân hóa học chính trong mô hình gây u hai giai đoạn 6

1.2.3 Các mô hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trong các nghiên cứu trên thế giới 7

1.2.4 Đặc điểm mô học khối u trên da chuột 10

1.3 Hoạt chất có tác dụng kháng u được nghiên cứu 14

1.3.1 Imiquimod 14

1.3.2 Curcumin 14

1.3.3 Tía tô 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Dược liệu Tía tô 18

2.1.2 Động vật thí nghiệm 18

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 18

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Kiểm nghiệm dược liệu Tía tô bằng phương pháp vi học 20

2.2.2 Chiết xuất cao toàn phần từ lá Tía tô 20

2.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần Tía tô 21

2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần Tía tô lên da chuột bình thường 24

2.2.5 Khảo sát tác động kháng u của cao toàn phần Tía tô lên mô hình gây u da trên chuột 24

2.3 Đánh giá thử nghiệm 25

2.3.1 Đánh giá trong quá trình thử nghiệm 25

2.3.2 Đánh giá cuối thử nghiệm 26

2.4 Xử lý số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ 27

3.1 Kiểm nghiêm dược liệu Tía tô bằng phương pháp vi học 27

3.1.1 Đặc điểm hình thái cây Tía tô 27

3.1.2 Bóc tách biểu bì lá Tía tô 29

3.1.3 Vi phẫu mô thực vật cây Tía tô 29

3.1.4 Khảo sát thành phần bột lá Tía tô 34

3.2 Chiết xuất cao toàn phần từ lá Tía tô 35

3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần Tía tô 35

3.3.1 Cảm quan 35

3.3.2 Thử tinh khiết 35

3.3.3 Định tính 36

3.3.4 Định lượng 38

3.4 Đánh giá sự ảnh hưởng của cao toàn phần Tía tô 10% lên da chuột bình

thường 39

3.5 Khảo sát tác động phòng ngừa và điều trị u da của cao toàn phần Tía tô 40

3.5.1 Đánh giá sự ảnh hưởng của aceton và glycerin 5% đối với da chuột 40

3.5.2 Đánh giá tác động phòng ngừa u da của cao toàn phần Tía tô 10% 47

3.5.3 Đánh giá tác động điều trị u da của cao TT 10% 57

Chương 4 BÀN LUẬN 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 73

FDA Food and Drug Aministration Cục quản lý thực phẩm và

dược phẩm Hoa KỳHPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

NF-κB Nuclear factor kappa B Yếu tố nhân kappa B

SCCs Squamous cell carcinomas Ung thư tế bào gai

TNF-a Tumor necrosis factor alpha Yếu tổ hoại tử khối uTPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-

acetate

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các hình thái lâm sàng của BCCs 4

Hình 1.2 Ung thư tế bào gai – SCCs 5

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của 7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA) 6

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 7

Hinh 1.5 Cấu trúc da người (a) và da chuột (b) 10

Hình 1.6 Cấu trúc lớp biểu bì của da 11

Hình 1.7 Quá trình hình thành SCCs ở da chuột 11

Hình 1.8 Hyperplasia ở da chuột 12

Hình 1.9 Papilloma ở da chuột 13

Hình 1.10 SCCs ở da chuột 13

Hình 1.11 Cấu trúc hóa học của imiquimod 14

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học các hợp chất curcuminoid 15

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái thân và lá Tía tô 27

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái hoa Tía tô 28

Hình 3.3 Đặc điểm biểu bì dưới lá Tía tô 29

Hình 3.4 Cấu tạo vi phẫu thân Tía tô 30

Hình 3.5 Đặc điểm lỗ khí và lông che chở ở thân Tía tô 30

Hình 3.6 Các kiểu lông tiết ở thân Tía tô 31

Hình 3.7 Cấu tạo vi phẫu gân lá 31

Hình 3.8 Đặc điểm lỗ khí và lông tiết ở lá Tía tô 32

Hình 3.9 Cấu tạo vi phẫu phiến lá Tía tô 32

Hình 3.10 Cấu tạo vi phẫu cuống lá Tía tô 33

Hình 3.11 Cấu tạo vi phẫu cánh lồi ở cuống lá Tía tô 33

Hình 3.12 Đặc điểm lông tiết và lông che chở cuống lá Tía tô 34

Hình 3.13 Đặc điểm lông che chở có trong bột lá Tía tô 34

Hình 3.14 Lông tiết và mảnh tế bào có trong bột lá Tía tô 34

Hình 3.15 Các loại mô dẫn có trong bột lá Tía tô 35

Hình 3.16 Định tính flavonoid trong cao toàn phần Tía tô bằng các phản ứng hóa học 37

Hình 3.17 Sắc ký đồ của dịch cao toàn phần Tía tô, chuẩn luteolin và chuẩn acid rosmarinic dưới UV 254 nm, UV 365 nm và thuốc thử VS 37

Hình 3.18 Vùng da chuột lô cao chứng ở tuần 1 (A) và tuần 20 (B) 39

Hình 3.19 Vi phẫu da chuột bình thường (A) và da chuột lô cao chứng (B) 40

Hình 3.20 Vùng da chuột lô aceton ở tuần 1 (A) và tuần 18 (B) 41

Hình 3.21 Vi phẫu da chuột bình thường (A) và da chuột lô aceton (B) 41

Hình 3.22 Trọng lượng trung bình (g) của lô glycerin 5% và lô bệnh 42

Hình 3.23 Tỷ lệ chuột bị u (%) ở lô glycerin 5% và lô bệnh 43

Hình 3.24 Số khối u trung bình ở lô glycerin 5% và lô bệnh 44

Hình 3.25 Thể tích trung bình khối u lô glycerin 5% và lô bệnh 45

Hình 3.26 Khối u tuần 20 lô glycerin 5% (A) và lô bệnh (B) 46

Hình 3.27 Vi phẫu da chuột lô glycerin 5% (A) và lô bệnh (B) 47

Hình 3.28 Hiện tượng viêm loét sau khi bôi DMBA 48

Hình 3.29 Trọng lượng chuột – Đánh giá tác động dự phòng của cao TT 10% 49

Hình 3.30 Tỷ lệ chuột u – Đánh giá tác động dự phòng của cao TT 10% 50

Hình 3.31 Số khối u trung bình – Đánh giá tác động dự phòng của cao TT 10% 51

Hình 3.32 Thể tích u trung bình – Đánh giá tác động dự phòng của cao TT 10% 52

Hình 3.33 Khối u vào tuần 20 của lô cao TT dự phòng 10% (A), lô glycerin 5% (B) và lô curcumin 4% (C) 53

Hình 3.34 Quan sát vi phẫu papilloma da chuột của lô curcumin 4% (A), cao TT 10% dự phòng (B), bệnh (C) và glycerin 5% (D) 54

Hình 3.35 SCCs ở lô curcumin 4% 55

Hình 3.36 SCCs ở lô cao TT 10% dự phòng 55

Hình 3.37 SCCs ở lô glycerin 4% 56

Hình 3.38 SCCs ở lô bệnh 57

Hình 3.39 Trọng lượng chuột trung bình – Đánh giá tác động điều trị của cao TT 10% 58

Hình 3.40 Tỷ lệ chuột bị u – Đánh giá tác động điều trị của cao TT 10% 59

Hình 3.41 Số khối u trung bình – Đánh giá tác động điều trị của cao TT 10% 60

Hình 3.42 Thể tích u trung bình – Đánh giá tác động điều trị của cao TT 10% 61

Hình 3.43 Khối u tuần 20 ở lô bệnh (A), lô imiquimod (B) và lô cao TT điều trị (C) 62

Hình 3.44 Papilloma ở lô imiquimod 63

Hình 3.45 SCCs ở lô cao TT 10% điều trị 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các mô hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trên chuột 8

Bảng 3.1 Độ ẩm của cao toàn phần Tía tô (%) 35

Bảng 3.2 Độ tro toàn phần của cao toàn phần Tía tô (%) 36

Bảng 3.3 Định tính flavonoid trong cao toàn phần Tía tô bằng phản ứng hóa học 36 Bảng 3.4 Định lượng HPLC acid rosmarinic và luteolin (%) có trong cao toàn phần Tía tô 38

Bảng 3.5 Đánh giá sự ảnh hưởng của cao TT 10% lên da chuột bình thường 39

Bảng 3.6 Kết quả vi phẫu mô học da lưng chuột ở lô cao chứng TT 10% 39

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của aceton lên da chuột bình thường 40

Bảng 3.8 Kết quả vi phẫu mô học da lưng chuột ở lô aceton 41

Bảng 3.9 Đánh giá sự ảnh hưởng của glycerin 5% lên sự tiến triển khối u 42

Bảng 3.10 Đánh giá mức độ tiến triển khối u lô bệnh và lô glycerin 5% 46

Bảng 3.11 Đánh giá tác động dự phòng u da của cao TT 10% 47

Bảng 3.12 Đánh giá tác động của cao TT 10% lên mức độ tiến triển khối u 53

Bảng 3.13 Đánh giá tác động điều trị u da của cao TT 10% 58

Bảng 3.14 Đánh giá mức độ tiến triển khối u của kem bôi imiquimod 5% và cao TT 10% điều trị 62

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư ngày càng trở thành vấn nạn của xã hội với tỉ lệ bệnh nhân tăng mạnh ngay

cả ở những nước đang phát triển Tại Hoa Kỳ, ung thư da là loại ung thư phổ biếnnhất với gần 5 triệu người mắc mỗi năm và tổng chi phí điều trị lên đến 8,1 triệu đô[51] Ung thư da gồm hai dạng phổ biến là ung thư tế bào hắc sắc tố và ung thưkhông do hắc sắc tố Tuy ung thư da dễ điều trị nhưng nếu không phát hiện sớm và

có những biện pháp ngăn chặn, khả năng gây tử vong cho bệnh nhân rất cao Việcđiều trị cho những bệnh nhân bị ung thư da phụ thuộc vào tình trạng bệnh mà lựachọn giữa phẫu thuật hay điều trị dùng thuốc Ngoài 35 thuốc đã được FDA chấpthuận trong điều trị ung thư da [36], hiện nay việc sử dụng các thuốc từ dược liệuđem lại tiềm năng to lớn khi đạt hiệu quả trị liệu tốt, giảm tác dụng phụ và hạ thấpchi phí Có rất nhiều dược liệu chứa các hoạt chất kháng ung thư đã được nghiêncứu, trong đó dược liệu Tía tô đang gây được sự chú ý vì chứa nhiều hoạt chất vớinhiều công dụng khác nhau như kháng ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa,…Tác

động kháng ung thư của Tía tô tuy đã được chứng minh trên in vitro ở các dòng tế

bào HepG2 (ung thư gan), dòng HL-60 (ung thư bạch cầu), dòng HTC116 (ung thư

đại tràng),…[25], [26], [40] nhưng vẫn còn ít thử nghiệm in vivo Việc nghiên cứu tác dụng Tía tô trên in vivo đóng vai trò quan trọng trong việc khẳng định tiềm năng

kháng ung thư của dược liệu này, qua đó tạo tiền đề để thực hiện các nghiên cứulâm sàng và sử dụng Tía tô trong ngăn ngừa sớm hay điều trị trên những bệnh nhânung thư da Vì những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Khảo sát tác dụngkháng u da của cao toàn phần ethanol từ lá Tía tô trên chuột nhắt trắng” với các mụctiêu như sau:

- Kiểm nghiệm dược liệu Tía tô bằng phương pháp vi học

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao toàn phần ethanol từ lá Tía tô

- Khảo sát tác dụng của cao toàn phần Tía tô trên da chuột bình thường

- Khảo sát tác dụng phòng ngừa và điều trị u da của cao toàn phần Tía tô

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ung thư da

1.1.1 Sự hình thành và phát triển ung thư da

Ung thư da là biểu hiện của sự tăng trưởng không kiểm soát của tế bào da bìnhthường, được gây ra bởi các bất thường về DNA, làm tế bào da bị đột biến, tăngsinh nhanh chóng và hình thành các khối u lành tính hay ác tính Các gene tác độnglên sự phát triển của khối u gồm 2 loại: gene gây u (oncogene) và gene ức chế u(tumor suppressor gene) Gene gây u là các gene mã hóa protein liên quan đến sựtăng sinh và phân chia tế bào Khi bị biến đổi, chúng sẽ hoạt hóa tín hiệu thúc đẩy

sự tăng trưởng làm tế bào tăng sinh quá mức và tạo thành các khối u Ngược lại,gene ức chế u mã hóa protein đóng vai trò kìm hãm sự tăng trưởng quá mức của tếbào Khi bị biến đổi, các gene này bị mất chức năng kiểm soát đối với sự tăng sinh

tế bào và dẫn đến ung thư da

Ras là một trong những gene gây u đầu tiên được nhận diện trong bộ gene người.Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự biến đổi gene ras, đặc biệt là gene Harvey ras vàKristen ras, là nguyên nhân phổ biến trong bệnh lý ung thư không do hắc sắc tố.Protein ras liên quan đến phần trong của màng tế bào và được cho là đóng một vaitrò quan trọng trong con đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến sự tăng trưởng vàbiệt hóa [22] P53 là gene ức chế u, mã hóa cho phosphoprotein 53-kDa, đảmnhiệm vai trò kiểm soát sự phiên mã và chu kỳ tế bào Gene p53 góp phần trongviệc bảo vệ DNA của tế bào khỏi những tổn thương từ tia UVB Sự biến đổi genep53 được phát hiện trong hầu nhiều trường hợp mắc ung thư da tế bào đáy và ungthư da tế bào gai [13]

1.1.2 Tác nhân gây ung thư da

Tia tử ngoại mặt trời: cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, trực thuộc WHO, phân

loại tia tử ngoại mặt trời vào nhóm 1- nhóm các tác nhân gây ung thư trên người[8] Tia UV từ ánh nắng mặt trời có khả năng gây ra 90% trường hợp ung thư dakhông do hắc sắc tố [9] Các tác động của tia cực tím gây ra các đột biến gen, ung

thư hóa, cản trở hoặc ức chế sinh tổng hợp DNA, RNA, protein và ảnh hưởng tớichức năng miễn dịch của cơ thể [3]

Các chất hóa học: đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát nguy cơ ung thư.

Các tác nhân này có thể là: hắc ín, bồ hóng, anthracene, arsenic,…[11]

Yếu tố nhân kappa B (NF-κB): NF-κB là yếu tố có khả năng gắn với một đoạn

intron của gene mã hóa cho chuỗi nhẹ kappa của immonoglobulin Trong nhân,

NF-κB khởi động hay điều hòa quá trình sao mã đáp ứng sớm bằng cách gắn vào vùngkhởi động hay vùng tăng cường của các gene đặc hiệu Trong hầu hết các loại tếbào, NF-κB có vai trò điều hòa các tín hiệu sống sót cho tế bào Tuy nhiên, ở một sốtrường hợp, yếu tố này lại gây nên chết tế bào theo chu trình Quá trình điều hòa bấthợp lý NF-κB là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh lý trong đó có ung thư NF-κBđược hoạt hóa bởi nhiều tác nhân khác nhau như bức xạ cực tím, các cytokine, bụicông nghiệp, các thành phần của vi khuẩn và virus [24]

Ngoài ra còn nhiều yếu tố khác như: yếu tố gen, yếu tố nội tiết, yếu tố màu da,…

1.1.3 Phân loại ung thư da

Ung thư da được chia làm hai nhóm chính: Ung thư da không do hắc sắc tố và ungthư da hắc sắc tố 90% các trường hợp ung thư da là loại ung thư không hắc sắc tố,trong đó chủ yếu là ung thư tế bào đáy và ung thư tế bào gai Ngoài ra còn có dàysừng quang hóa, bệnh Bowen, verrucas và acanthomas nhưng chiếm tỷ lệ rất nhỏ[10]

1.1.3.1 Ung thư tế bào đáy – BCCs (Basel cell carcinomas)

Là loại chiếm phổ biến nhất trong hầu hết các trường hợp ung thư da, BCCs tiếntriển chậm, hiếm khi gây di căn Bệnh gặp ở bất kì chỗ nào trên cơ thể, nhưngthường thấy nhất ở vùng đầu, mặt, đôi khi ở cổ, thân mình; hiếm khi khu trú ở lòngbàn tay, bàn chân; không bao giờ xuất hiện ở niêm mạc BCCs có nhiều hình tháilâm sàng khác nhau (Hình 1.1) [1]

Hình 1.1 Các hình thái lâm sàng của BCCs

(a) BCCs thể xơ cứng ; (b) BCCs thể nang ; (c) BCCs thể nhiễm sắc ;(d) BCCs thể nốt ; (e) BCCs thể nông ; (f) BCCs thể loét

1.1.3.2 Ung thư tế bào gai – SCCs (Squamous cell carcinomas)

Ở người, đây là loại ung thư da phổ biến thứ hai sau ung thư tế bào đáy (BCCs).Khác với BCCs, SCCs được hình thành ở phần phía trên của biểu bì, trong lớp tếbào gai SCCs luôn luôn xuất hiện trên những thương tổn đã có từ trước, nhất là trênnhóm bệnh da tiền ung thư (Bowen, Paget), hiếm hơn là trên những vùng da có sẹo,viêm mạn hoặc dày sừng ở người già Bệnh xuất hiện tự nhiên, sau sang chấn nhiềulần lập đi lập lại hoặc sau khi điều trị không thích hợp Thương tổn lớn lên, lan rộng

ra, lớp sừng dày lên, trên bề mặt bị loét, thâm nhiễm sâu xuống dưới, bờ nổi cao lên(những nụ thịt), có quầng đỏ bao bọc xung quanh, có khi xuất hiện dạng như nhúsừng Tế bào SCCs điển hình là tế bào hình đa giác giới hạn rõ, nhiều nguyên sinhchất, nhiều ty lạp thể, nhiều tổ chức sợi Có một, hai nhân bắt màu rõ và có mảngnhiễm sắc Các tế bào u xếp chồng chất lên nhau tạo thành dạng tế bào lát nối với

nhau bằng một cầu nối liên bào SCCs có khuynh hướng lan rộng và xâm lấn hệ

thống bạch huyết, xâm lấn vào tổ chức lân cận, loét phá hủy phần mềm, sụn xương,mạch máu lớn và các dây thần kinh, nhiễm khuẩn phụ [1]

- Nhóm tác động trực tiếp có khả năng tạo u, không cần thông qua các biến đổi hóahọc: β-propiolacton, N-methyl-N-nitroso guanin,…

- Nhóm tác động gián tiếp (còn gọi là các chất tiền ung thư) cần có các biến đổichuyển hóa để tạo thành các yếu tố mang khả năng tạo u thực sự: benzo[a]pyren;7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA)…

Giai đoạn khởi phát mang tính chất không thể hồi phục và cộng dồn Vì vậy , ở giaiđoạn này, chất gây ung thư được bôi nhiều lần hay một lần duy nhất đều cho hiệuquả như nhau [28], [46]

1.2.1.2 Giai đoạn tăng hoạt (promotion)

Các tế bào ở giai đoạn khởi phát cần được tác động gây tăng sinh và xáo trộn hơnnữa để có thể hình thành khối u Vì vậy, các chất tăng hoạt ở giai đoạn này sẽ kíchthích vào tế bào nhiều hơn với tần suất lặp đi lặp lại và kéo dài, giúp các khối u pháttriển hơn hoặc làm tăng số lượng khối u [38] Các chất tăng hoạt hầu hết chỉ làmthay đổi biểu hiện gen mà không làm biến đổi cấu trúc DNA, dẫn đến việc kích

Các biến đổi được gây ra ở giai đoạn tăng hoạt mang tính hồi phục, vì thế việc bôilặp lại hóa chất trên da là cần thiết Nếu giảm tần suất bôi, hiệu quả gây u sẽ giảmhoặc mất Một nghiên cứu cho thấy hiệu quả gây papiloma và carcinoma tối đa khicroton oil được bôi 1 hay 2 lần/tuần nhưng kết quả sẽ đạt sớm hơn nếu bôi 2lần/tuần Nếu giảm tuần suất bôi còn một lần một tuần trong 4 tuần với tổng liềunhư trên thì không có khối u nào phát triển [46].

1.2.1.3 Giai đoạn tiến triển (progression)

Đây là quá trình không hồi phục, dẫn đến sự di căn của các khối u: papilomachuyển thành carcinoma Ở giai đoạn này, các gene tiếp tục bị đột biến nhiều hơnnữa, bao gồm: hoạt hóa các gene gây ung thư và bất hoạt các gene ức chế tế bào u,dẫn đến sự biệt hóa tế bào và gây rối loạn thông tin di truyền [44]

1.2.2 Tác nhân hóa học chính trong mô hình gây u hai giai đoạn

1.2.2.1 DMBA (7,12-dimethylbenzen[a]anthracen)

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của 7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA)

DMBA là một tác nhân gây ung thư được sử dụng nhiều trong các mô hình gây utrên chuột thực nghiệm DMBA tác động lên nhiều cơ quan, bao gồm da, tuyến vú,khoang miệng, gan,…Trên da chuột, DMBA hoạt hóa gene gây u bằng cách gắnnhóm 12-methyl của nó lên N-7 của adenine, gây ra sự chuyển đảo adenine thành

thymine trên codon 61 của gene c-H-ras và cuối cùng dẫn đến sự hình thành cácpapillomas [16]

DMBA thường đóng vai trò như một chất khởi phát – initiator, đặc biệt trong các

mô hình gây u da 2 giai đoạn với chất tăng hoạt – promoter là croton oil hoặc TPA[46]

1.2.2.2 Croton oil

Croton oil được chiết xuất từ hạt cây Ba Đậu, tên khoa học là Croton Tiglium, thuộc

họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Thành phần chính của croton oil là các ester phorbol,trong đó chiếm chủ yếu là TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) (Hình1.10)

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)

Croton oil là một chất gây phỏng rất mạnh: khi bôi lên da, da bị nóng bỏng vàphồng lên, tạo mụn nước sau đó thành mụn tróc da Croton oil có tác dụng chậm, vàchỉ tác dụng lên trên bề mặt da, sau khi khỏi mụn thì không để lại sẹo, trừ khi tạicùng một chỗ bôi nhiều lần [2]

Trong mô hình u da trên chuột, croton oil đóng vai trò là chất tăng hoạt nhờ khảnăng gây viêm, làm thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào và sự hình thành khối u

1.2.3 Các mô hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trong các nghiên cứu trên thế giới

Đây là mô hình được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về đánh giá tác độngcủa các thuốc kháng u cũng như tìm hiểu bản chất các giai đoạn của ung thư biểu

mô Khác với mô hình sử dụng đơn chất, mô hình này sử dụng hai hóa chất gây u

với mục đích và thời gian tác động khác nhau Hai chất được sử dụng chính trong

mô hình này gồm DMBA và croton oil (hoặc TPA) DMBA được sử dụng một lầnduy nhất, dùng để gây đột biến gene ở giai đoạn khởi phát Croton oil sau đó sẽđược bôi lặp lại trong một khoảng thời gian thử nghiệm nhất định, đóng vai trò tănghoạt quá trình viêm và kích thích sự tiến triển và hình thành khối u

Mô hình gây u này giúp quan sát được hai giai đoạn u riêng biệt, có lợi lớn trongviệc theo dõi sự ảnh hưởng của yếu tố môi trường hoặc tác dụng của thuốc thửnghiệm lên các giai đoạn khác nhau của sự hình thành khối u Thời gian quan sát sựtiến triển của khối u có thể diễn ra trong suốt vòng đời của chuột Trong quá trìnhquan sát, có thể sử dụng các phương pháp không xâm lấn để đánh giá mức độ tiếntriển u và cuối thử nghiệm có thể tiến hành giải phẫu vùng da giúp đánh giá mộtcách toàn diện, khách quan và cho kết quả tin cậy Các khối u gây ra bởi mô hình 2giai đoạn có thể là papiloma lành tính hoặc có khả năng tiến triển đến SCCs Vì vậy,

mô hình này tạo cơ hội có thể theo dõi sự tiến triển sớm và muộn trong quá trìnhphát triển của khối u [34]

Các mô hình gây u 2 giai đoạn khác nhau về giống chuột thử nghiệm, liều lượnghoạt chất, tần suất, khoảng cách bôi giữa DMBA và croton oil (Bảng 1.1) Nghiêncứu của Lê Thị Ngọc Thúy năm 2016, tác giả đã chỉ ra mô hình gây u 2 giai đoạnbôi DMBA 0,2% một lần duy nhất, sau 2 tuần bôi croton oil 2% 2 lần/tuần là tối ưu

và ổn định khi cho tỷ lệ sống sót và tỷ lệ papiloma cao, đồng thời làm giảm gánhnặng khối u trên chuột, phù hợp để áp dụng mô hình trong các thử nghiệm khảo sáttác động điều trị và dự phòng u da của hoạt chất kháng u

Bảng 1.1 Các mô hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trên chuột

Prashar R

và cs., 1994

[43]

Chuột Swissalbino 7-8 tuầntuổi

Bôi DMBA 1 lần duy nhất(195 nmol) Sau 2 tuần, bôi

100 µl croton oil 1% 2lần/tuần trong 12 tuần

100% số chuột bịpapiloma vào tuầnthứ 12

Das R K Chuột Swiss Bôi DMBA 1 lần duy nhất 100% số chuột bị

và cs., 2004

[42]

albino 5-6 tuầntuổi

(50 mg/kg) Sau 1 tuần, bôi

100 µl croton oil 1% 2lần/tuần trong 12 tuần

papiloma vào tuầnthứ 12

Kim DJ và

cs., 2006

[15]

Chuột C57BL/68-10 tuần tuổi

Bôi DMBA 1 lần duy nhất(50 µg) Sau 1 tuần, bôi 200

µl croton oil 2,5% 3 lần/tuầntrong 22 tuần

83% số chuột bị usau 22 tuần

Sharma K

và cs., 2009

[39]

Chuột Swissalbino 7-9 tuầntuổi

Bôi DMBA 1 lần duy nhất(100 µg) Sau 2 tuần, bôi 100

µl croton oil 1% 3 lần/tuầntrong 16 tuần

Khối u đầu tiên ởtuần 7 100% chuột

Bôi DMBA 1 lần duy nhất(100 µg) Sau 1 tuần, bôi 100

µl croton oil 1% 2 lần/tuầntrong 10 tuần

Khối u đầu tiên ởtuần 6 66,7%chuột bị u ở tuần11

Chaudhary

G và cs.,

2011 [17]

Chuột Swissalbino 7-8 tuầntuổi

Bôi DMBA 1 lần duy nhất(100 µg) Sau 2 tuần, bôi 100

µl croton oil 1% 3 lần/tuầntrong 16 tuần

100% chuột bị u ởtuần 16

Trần Thị

Ngọc Vân,

2014 [6]

Chuột Swissalbino 6-8 tuầntuổi

Bôi DMBA 0,2% 1 lần duynhất (50 µl) Sau 1 tuần, bôicroton oil 2% 2 lần/tuầntrong 18 tuần

Bôi 50 µl DMBA 0,2% 1 lầnduy nhất Sau 2 tuần, bôi 50

µl croton oil 1% 2 lần/tuầntrong 20-22 tuần

68,75% số chuột bị

u sau 20-22 tuần

Hinh 1.5 Cấu trúc da người (a) và da chuột (b)

Nằm trong cùng của lớp biểu bì là lớp đáy, gồm các tế bào hình trụ, nằm vuông gócvới đường phân cách giữa biểu bì và chân bì Lớp đáy có chức năng tăng sinh và lànơi duy nhất diễn ra quá trình phân bào [14] Lớp tế bào gai nằm trên tế bào đáy, lànhững tế bào đa diện, xếp sát nhau, trên bề mặt có những nhú bào tương giốngnhững cái gai Các tế bào hạt nằm trên lớp gai có chứa các hạt sừng keratohyalintrong bào tương, có dạng hình dẹt và độ dày mỏng phụ thuộc vào quá trình sừnghóa Ngoài cùng là lớp sừng, các tế bào dẹt hoàn toàn, màng bào tương dày và nhânbiến mất Các tế bào sừng chồng chất thành lớp lên nhau và tế bào ngoài cùng nhấtluôn bị bong ra

Hình 1.7 Quá trình hình thành SCCs ở da chuột

Hyperplasisa: là hiện tượng tăng sinh các lớp tế bào không keratin của biểu bì, có

các đặc điểm nhận biết điển hình sau: [27], [50]

- Độ dày của lớp tế bào gai và lớp tế bào hạt tăng

- Tăng số lượng tế bào của lớp biểu bì, đặc biệt ở lớp tế bào gai

- Thường kèm theo sự hình thành rete ridge và dày sừng

- Có thể bao gồm lớp mô đệm của nang lông

- Lớp màng đáy còn nguyên vẹn

Với hyperplasia không điển hình:

- Độ dày lớp tế bào gai và lớp tế bào hạt tăng bất thường

- Không phân biệt được ranh giới giữa lớp tế bào đáy, lớp tế bào gai và lớp tế bàohạt

Hyperplasia

Papilloma

SCCs

Papilloma: trong mô hình gây u da trên chuột, papilloma không được đánh giá tương đương như papilloma ở người [18] Nó là các khối u nhú có hình dạng rõ

hoặc khối mô sống không bao gồm tế bào mỡ với các đặc điểm biệt hóa rõ như sau:[27], [50]

- Khối u nhú cấu tạo bởi các tế bào gai keratin hóa bao phủ lên mô đệm

- Màng đáy còn nguyên vẹn, các tế bào đáy xếp khít nhau, vuông góc với màng đáy

- Tế bào gai và tế bào hạt bị biệt hóa và keratin hóa thành các lớp tế bào dày kèm sựgia tăng bất thường các hạt keratohyalin

- Thường xuất hiện sự phân bào

- Các lớp tế bào trên màng đáy có thể có hiện tượng keratin hóa sớm (dyskeratosis)

- Tăng sinh lớp sừng

- Có thể bị loét và viêm

Hình 1.9 Papilloma ở da chuột [27]

Squamous cell carcinomas (SCCs): sự tiến triển thành SCCs trên chuột ở mô hình

gây u da rất giống với SCCs của người về mặt mô học với các đặc điểm: [27], [50]

- Các tế bào biểu bì phá vỡ màng tế bào đáy và xâm lấn xuống lớp bì; các tế bào u

có thể xâm lấn đến lớp cơ dưới da

- Có sự biệt hóa tế bào gai ở các mức độ khác nhau

- Các tế bào của khối u có hình dạng đa giác có màng tế bào rõ và bị keratin hóa ởnhiều mức độ; kích thước nhân to và số lượng phân bào nhiều

- Thường có viêm và loét

Hình 1.10 SCCs ở da chuột

1.3 Hoạt chất có tác dụng kháng u được nghiên cứu

1.3.1 Imiquimod

Hình 1.11 Cấu trúc hóa học của imiquimod

Kem bôi Imiquimod 5% được FDA chấp thuận trong điều trị BCCs, dày sừngquang hóa và mụn cóc sinh dục Imiquimod kích thích hệ thống miễn dịch của cơthể tiết ra alpha-interferon và các chất cytokin khác để chống lại tế bào ung thư.Imiquimod được dùng như một lựa chọn điều trị thay thế trường hợp phẫu thuậthoặc các phương pháp trị liệu khác không phù hợp hay chống chỉ định Bôi kemimiquimod 5% để điều trị BCCs dạng nông 5 lần một tuần trong 6 tuần đạt tỉ lệ 82%trường hợp giảm tế bào ung thư [21] Một số nghiên cứu về hiệu quả của imiquimodtrong điều trị SCCs cho thấy thuốc làm giảm 80% trường hợp SCCs tại chỗ khi bôi

5 lần 1 tuần trong 11 tháng và 71% trường hợp SCCs xâm lấn khi bôi 5 lần 1 tuầntrong 12 tháng [52]

1.3.2 Curcumin

Curcumin, demethoxycurcumin và bis-demethoxycurcumin, gọi chung là cáccurcuminoid, đóng vai trò là thành phần hóa học chính và tạo nên sắc tố vàng cho

Nghệ (Curcuma longa, họ Zingiberaceae) Hàm lượng curcumin trong hợp chất

curcuminoid chiếm từ 2 – 8% [23] và là hoạt chất có tác động dược lý quan trọngnhất

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học các hợp chất curcuminoid

(a) Curcumin ; (b) Demethoxycurcumin ; (c) Bis-demethoxycurcumin

Hoạt tính chống ung thư

Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra curcumin có tác dụng ngăn ngừa ung thư ởnhiều cơ quan như ruột, tá tràng, dạ dày, thực quản và ung thư miệng Curcumincũng được chứng minh là làm giảm các khối u trên da chuột được gây ra bởibenz(a)pyrene, DMBA và TPA [41] Cơ chế kháng ung thư của curcumin theonhiều cách khác nhau, hướng mục tiêu đến nhiều cấp độ tăng sinh của tế bào Bêncạnh tác động theo chiều dọc vào các yếu tố phiên mã, yếu tố gây ung thư và các tínhiệu protein, curcumin cũng tác động vào các giai đoạn khác nhau của ung thư – từlúc khởi phát ung thư do đột biến DNA, đến quá trình tăng trưởng và di căn của tếbào ung thư [53]

Hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm

Curcumin bảo vệ tế bào chống lại sự oxy hóa bằng cách ức chế quá trình peroxidhóa lipid, được biết đến như một chuỗi phản ứng gốc tự do trung gian, và thu nhặtcác gốc tự do còn sót lại từ phản ứng peroxid Quá trình viêm diễn ra với sự tập hợpcủa nhiều enzyme và cytokine như cyclooxygenase 2 (COX2), 5-lipoxygenase (5-LOX), phospholipase A2 (PLA2), cảm ứng nitric oxide synthase (iNOS), NF-κB và

TNF-a Curcumin ức chế quá trình viêm bằng cách làm giảm nồng độ iNOS vàCOX-2, bất hoạt enzyme 5-LOX và PLA2 do đó arachidonic acid không thể chuyểnhóa thành các chất trung gian gây viêm như leucotrien, prostaglandin, Curcumincũng ngăn chặn sự phóng thích NF-κB vào tế bào chất, vì vậy biểu hiện của geneliên quan đến quá trình viêm, tăng sinh tế bào và sự sống tế bào không thể diễn ra[32], [53]

1.3.3 Tía tô

Tía tô (hay Tử tô) tên khoa học Perilla frutescens (L.) Britton, thuộc họ Hoa môi

Lamiaceae, là một loài thực vật được dùng làm gia vị phổ biến ở các nước châu Ánhư Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản,…[2] Ở Việt Nam, theo Vũ Xuân Phương(2000), chi Perilla L hiện có 3 taxon: P frutescens (L.) Britt.,là cây mọc hoang dại

ở các tỉnh miền núi phía Bác (Lào Cai, Lạng Sơn, Hòa Bình…) và hai dưới loài [7]

1.3.3.1 Thành phần hóa học

Lá Tía tô có mùi thơm, chứa tinh dầu mà thành phần chính là các dẫn chấtmonoterpen, tiêu biểu gồm có perillaldehyde, perillene, β-caryophyllene,thujopsene, β-farnesene, limonene, elsholtziaketone, perillaketone, furylketone,linalool, và trans-citral [47] Các thành phần hóa học có hoạt tính như acid ursolic(một triterpen glycosid) và acid rosmarinic cũng hiện diện trong lá Tía tô [37].Ngoài ra, 16 loại flavonoid bào gồm 5 anthocyanidin, 2 flavone và 9 flavoneglycoside đã được tìm thấy trong lá và hạt Tía tô Trong số những flavonoid này, 3-

p-coumarylglucoside-5-glucoside của cyanidin và 7-caffeylglucosides của apigenin

kể lượng histamin phóng thích từ tế bào dưỡng bào ở chuột cống thử nghiệm [19]

Tác dụng kháng ung thư

Cao chiết Tía tô đã được chứng minh trên in vitro là có tác dụng ức chế sự phát

triển và làm chết tế bào trên dòng tế bào HepG2 (ung thư gan), dòng HL-60 (ungthư bạch cầu), dòng HTC116 (ung thư đại tràng) Acid rosmarinic từ Tía tô ức chếtăng sinh tế bào Jurkat (ung thư máu) bằng cách thay đổi biểu hiện cyclin, các chất

ức chế cyclin phụ thuộc kinase và chết tế bào [26], [25], [40] Trên các mô hình gây

u da bằng DMBA và croton oil (hay TPA), acid rosmarinic, luteolin, acid triterpencũng đã được chứng minh có tác động ức chế sự hình thành và tiến triển khối u[12], [37], [49]

Ngoài ra, Tía tô cũng thể hiện nhiều tác dụng dược lý khác như tác động lên thịgiác, khả năng học hỏi và ghi nhớ ở chuột; tác dụng hạ huyết áp và tác dụng làm hạlipid máu [29]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Dược liệu Tía tô

Tía tô được thu hái ở Hà Nội vào tháng 12 năm 2016, sau đó được nhặt lấy lá, rửasạch rồi phơi âm can đến khô Xay thô dược liệu đến kích thước khoảng 4 mm đểtiến hành chiết xuất, điều chế thành cao Ngoài ra, 1 cây Tía tô có đầy đủ các bộphận (rễ, thân, lá, hoa) được sử dụng làm vi phẫu thực vật

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng giống đực, chủng Swiss albino, hoàn toàn khỏe mạnh, không bị dị

tật, không có biểu hiện bất thường, được cung cấp bởi viện Vaccin và sinh phẩm Y

tế Nha Trang Trọng lượng khi bắt đầu thí nghiệm là từ 25 – 30 gram

Chuột được nuôi ổn định 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm Một ngày trước khithí nghiệm, chuột được cạo lông trên phần diện tích 2 x 2 cm da lưng và cách đuôi1,5 cm Sau đó, chuột được phân ngẫu nhiên vào các lô khác nhau Mỗi chuột đượcnuôi riêng trong các ô có kích thước 12 x 12 x 15 cm, 1 lồng 6 ô

Trong suốt quá trình thử nghiệm, chuột được cung cấp nước và thức ăn dạng viên

do Viện vaccin và sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử

DMBA ≥ 95% (Sigma – Aldrich, Đức)

Croton oil (Sigma – Aldrich, Đức)

Curcumin ≥ 97% (Domesco, Việt Nam)

Kem Imiquimod 5% (Imiquad® - Glenmark, Ấn Độ)

Chất chuẩn luteolin ≥ 95% (Bộ môn Dược liệu – Khoa Dược, Đại học Y dược TPHCM)

Chất chuẩn acid rosmarinic ≥ 98% (Sigma – Aldrich, Đức)

Ethanol 96% (Việt Nam)

Ethyl acetat (Chemsol Việt Nam)

Diethyl ether (Trung Quốc)

Aceton (Chemsol, Việt Nam)

Glycerin (Trung quốc)

Formalin (Việt Nam)

Acetonitril PA (Merck, Đức)

Acid phosphoric PA (Sigma – Aldrich, Đức)

NaCl 0,9% dược dụng

Các thuốc thử : vanillin – sulfuric (VS), sắt (III) cloric 10%

Bộ hóa chất phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Bộ thuốc nhuộm vi phẫu mô thực vật

Máy siêu âm Sonorex RK – 1028H

Tủ sấy ULM-500 (Memmert)

Máy HPLC Shimadzu SPD – M20A, cột Agilent Zorbax C18, đầu dò PDA

Mặt kính đồng hồ, đĩa petry, kim mũi mác, phiến kính, lá kính

Kính hiển vi quang học Olympus, kính hiển vi soi nổi

Micropipet 20 – 200 µl, 100 – 1000 µl

Thước kẹp điện tử Digitronic Caliper 110-WR Series

Bocal nhựa, bocal thủy tinh, nắp lưới tròn, lồng sắt 6 ô

Lọ đựng mẫu da chuột

Một số dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm: bộ dao kéo mổ chuột,dao lam, becher,

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Kiểm nghiệm dược liệu Tía tô bằng phương pháp vi học

2.2.1.1 Phân tích đặc điểm hình thái cây Tía tô

Quan sát, phân tích các đặc điểm, hình dạng, kích thước các bộ phận sau của câyTía tô tươi: thân, phiến lá, hoa, bộ nhị, nhụy, hạt phấn; cách sắp xếp của lá Xácđịnh hoa thức và vẽ hoa đồ

2.2.1.2 Bóc tách biểu bì lá Tía tô

Bóc nhẹ lớp ngoài cùng của mặt sau phiến lá, lấy một mẩu nhỏ cho lên phiến kính

và quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi soi nổi Các đặc điểm của

tế bào biểu bì lá cần được quan sát bao gồm: tế bào biểu bì, cấu tạo lỗ khí, lôngche chở, lông tiết

2.2.1.3 Vi phẫu mô thực vật cây Tía tô

Thực hiện vi phẫu thân, lá, cuống lá của cây Tía tô tươi

Cắt vi phẫu: dùng dao lam cắt thật mỏng mẫu dược liệu đã chọn, lát cắt nằm trongmặt phẳng vuông góc với trục cắt Ở mẫu thân thì cắt phần lóng, mẫu lá thì lấy đoạn1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống, và một phần phiến lá ở hai bên

Nhuộm vi phẫu: sử dụng phương pháp nhuộm kép carmin-lục iod Vi phẫu nhuộmxong được soi với nước cất và quan sát dưới kính hiển vi quang học

2.2.1.4 Khảo sát bột dược liệu lá Tía tô

Lấy khoảng 10 gram bột thô lá Tía tô xây nhỏ và rây qua rây số 32 (rây mịn) Phầnbột mịn này được dùng làm mẫu bột để soi

Lên tiêu bản bột soi: cho một giọt nước cất vào giữa phiến kính, dùng que sạch trộnđều bột, lấy một ít bột cho vào giữa giọt chất lỏng, dùng một góc của lá kính khuấynhẹ để phân tán bột và đậy lá kính lại Quan sát các cấu tử có trong tiêu bản bằngkính hiển vi quang học

2.2.2 Chiết xuất cao toàn phần từ lá Tía tô

Quy trình chiết xuất: làm ẩm bột lá Tía tô với ethanol 50% trong 20 phút Sau đócho dược liệu lên bình ngấm kiệt, thêm dung môi ngặp mặt dược liệu 5 cm, ngâmlạnh 24 giờ Tiến hành rút dịch chiết với tốc độ dòng khoảng 100 giọt/phút Khi

dịch chiết không còn phản ứng với thuốc thử FeCl3 trên giấy lọc thìdừng rút, ép bã

và thu dịch chiết Dịch thu được đem cô quay loại dung môi rồi cô trên bếp cáchthủy ở 950C đến thể chất cao đặc Phần cao này sau đó được để trong bình hút ẩmđến khi khối lượng không đổi

2.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần Tía tô

để máy tiến hành đo và sau đó ghi nhận kết quả độ ẩm Thực hiện tương tự với 3 lần

đo và lấy kết quả trung bình

Độ tro toàn phần

Tiến hành theo phụ lục 9.8, Dược điển Việt Nam IV, phương pháp 2: Lấy một cốc

sứ nung trong lò nung ở nhiệt độ khoảng 600 oC trong 30 phút Để nguội trong bìnhhút ẩm rồi cân bì Cho vào cốc sứ này 1 g cao chiết, thêm 0,5 ml nước cất rồi đemđun trên bếp điện đến khi phần cắn trong cốc không còn bốc khói Phần cắn này sau

đó được đem nung trong lò nung ở nhiệt độ 600 ± 25 oC trong 1,5 giờ Cốc nungcùng cắn tro sau khi nung tiếp tục được làm nguội trong bình hút ẩm đến khối lượngkhông đổi và cân để tính độ tro toàn phần Thực hiện tương tự với 3 lần đo và lấykết quả trung bình

2.2.3.3 Định tính

Định tính bằng phản ứng hóa học

Xác định thành phần flavonoid có trong cao toàn phần Tía tô

Tiến hành: Hòa 1 g cao toàn phần với khoảng 10 ml ethanol 50% và đem lắc phân

bố với diethyl ether, thực hiện nhiều lần cho đến khi dịch ether trở nên trong suốt.Gạn bỏ lớp ether, phần dịch còn lại được lắc phân bố với khoảng 10 ml ethyl acetat,

lặp lại ba lần Thu dịch ethyl acetat đem cô thành cắn Hòa tan cắn với khoảng 10

ml ethanol 96% Dịch này dùng để tiến hành các phản ứng hóa học sau:

- Phản ứng với thuốc thử FeCl3 10%: Cho khoảng 5 ml dịch chiết vào ống nghiệm,thêm khoảng 1 ml thuốc thử FeCl3 10%, lắc đều và quan sát màu của dung dịch

- Phản ứng với dung dịch kiềm loãng: Cho khoảng 5 ml dịch chiết vào ống nghiệm,thêm khoảng 1 ml thuốc thử NaOH 10%, lắc đều và quan sát màu của dung dịch

- Phản ứng cyanidin (Mg/HCl đậm đặc): Cho dịch chiết vào ống nghiệm Thêmkhoảng 10 mg bột magnesi kim loại, đặt nghiêng rồi nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 -

5 giọt) theo thành ống nghiệm Để yên một vài phút, quan sát sự thay đổi màu củadung dịch

- Xác định luteolin và acid rosmarinic có trong mẫu thử nếu vết ở mẫu thử có Rf

tương đương với Rf ở 2 mẫu chuẩn, và vết mẫu thử bắt màu thuốc nhuộm VS giốngvới các vết của mẫu chuẩn

2.2.3.4 Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tiến hành định lượng luteolin và acid rosmarinic có trong cao toàn phần Tía tô bằngphương pháp HPLC

Dung môi hòa tan mẫu : acetonitril : nước (75 : 25)

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 100 mg cao cho vào bình định mức 20 ml,thêm 5 ml nước, lắc đều, thêm 10 ml acetonitril, lắc siêu âm 60 phút, để nguội đếnnhiệt độ phòng rồi bổ sung acetonitril cho đủ thể tích

Dung dịch chuẩn acid rosmarinic: Cân chính xác khoảng 5 mg acid rosmarinic chovào bình định mức 20 ml, thêm 5 ml nước, lắc đều, thêm 10 ml dung môi hòa tanmẫu, lắc siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi bổ sung hỗn hợp dungmôi hòa tan mẫu chủ đủ thể tích

Dung dịch chuẩn luteolin: Cân chính xác khoảng 2,5 mg luteolin cho vào bình địnhmức 20 ml, thêm 5 ml nước, lắc đều, thêm 10 ml dung môi hòa tan mẫu, lắc siêu âm

15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi bổ sung dung môi hòa tan mẫu đến thểtích

Hút chính xác 4 ml dung dịch chuẩn acid rosmarinic và 1 ml dung dịch chuẩnluteolin cho vào bình định mức 20 ml Bổ sung dung môi hòa tan mẫu đến thể tíchthu được dung dịch chuẩn

2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần Tía tô lên da chuột bình thường

Cao toàn phần Tía tô sau khi điều chế được pha trong glycerin 5% ở nồng độ 10%

Sử dụng micropipet hút chính xác 50 µl cao TT 10%, nhỏ và dàn đều lên lưng chuộtsao cho phủ kín hết vùng da đã cạo lông Sau khi bôi cao, chuột được đeo vòngnhựa quanh cổ trong 30 phút để tránh hiện tượng chuột quay lại liếm Thực hiện thínghiệm đối với lô cao chứng (n = 17) với tần suất bôi 1 lần/ngày và lặp lại hằngngày trong suốt 20 tuần thử nghiệm

2.2.5 Khảo sát tác động kháng u của cao toàn phần Tía tô lên mô hình gây u

da trên chuột

2.2.5.1 Mô hình gây u da 2 giai đoạn với DMBA và croton oil

Áp dụng mô hình gây u da 2 giai đoạn đã được khảo sát trong đề tài của Lê ThịNgọc Thúy [4] với chất khởi phát DMBA và croton oil là chất tăng hoạt Tiến hànhnhư sau: Trên vùng da lưng chuột đã được cạo lông trước đó, bôi 50 µl DMBA0,2% (tương ứng liều 100 µg) 1 lần duy nhất ở tuần đầu tiên Sau 2 tuần, bôi 50 µlcroton oil 2% 2 lần/tuần đến cuối thử nghiệm Quá trình thử nghiệm kéo dài trongthời gian 20 tuần

2.2.5.2 Các lô chuột thử nghiệm

Lô aceton (n = 6): bôi 50 µl dung môi aceton 2 lần/tuần trong suốt 20 tuần

Lô bệnh (n = 9): chỉ bôi DMBA/croton oil

Lô glycerin 5% (n = 14): bôi dd glycerin 5% sau khi bôi DMBA/croton oil Bôi 1lần/ngày, lặp lại hằng ngày trong suốt 20 tuần thử nghiệm

Lô curcumin 4% (n = 9): bôi curcumin sau khi bôi DMBA/croton oil Bôi 1lần/ngày, lặp lại hằng ngày trong suốt 20 tuần thử nghiệm Curcumin nguyên chấtđược pha trong dung môi aceton ở nồng độ 4%

Lô Imiquimod (n = 14): bôi kem Imiquimod 5% lên khối u có kích thước từ 1 x 1

mm trở lên và tồn tại ít nhất 1 tuần Imiquimod được bôi sau croton oil và bôi 1lần/ngày trong 5 ngày/tuần đến cuối thử nghiệm

Lô cao dự phòng (n = 16): bôi cao Tía Tô 10% ngay sau khi bôi DMBA/croton oil.Bôi 1 lần/ngày, lặp lại hằng ngày trong suốt 20 tuần thử nghiệm

Lô cao điều trị (n = 17): bôi cao Tía tô 10% lên khối u có kích thước từ 1 x 1 mmtrở lên và tồn tại ít nhất 1 tuần Cao được bôi sau croton oil và bôi 1 lần/ngày, lặplại hằng ngày đến cuối thử nghiệm

2.2.5.3 Cách bôi các hóa chất gây u và các tác nhân điều trị

Cách bôi aceton: dùng micropipet lấy một lượng chính xác 50 µl dd aceton, nhỏ lênlưng chuột sao cho đảm bảo phủ kín hết vùng da đã cạo lông

Cách bôi DMBA và croton oil: dùng micropipet hút chính xác 50 µl ddDMBA/croton oil, nhỏ từng giọt lên phần trung tâm trên vùng da lưng chuột đã cạolông Sau khi nhỏ mỗi giọt, đợi vài giây để dd khô hẳn rồi mới nhỏ giọt tiếp theo.Cách bôi curcumin 4%: dùng micropipet hút 50 - 70 µl dd curcumin 4%, nhỏ lênlưng chuột sao cho đảm bảo phủ kín hết vùng da đã cạo lông,

Cách bôi imiquimod: dùng tay lấy một lượng kem imiquimod 5% bôi bao phủ đềulên các khối u có trên lưng chuột Bôi lan ra vùng xung quanh khối u khoảng 2 mm.Cách bôi cao dự phòng: sử dụng micropipet hút 50 – 150 µl cao TT 10%, nhỏ vàdàn đều lên lưng chuột sao cho phủ kín hết vùng da đã cạo lông Sau khi bôi cao,chuột được đeo vòng chống liếm trong 30 phút

Cách bôi cao điều trị: dùng micropipet hút 50 – 100 µl cao TT 10%, nhỏ bao phủđều lên các khối u có trên lưng chuột Bôi lan ra vùng xung quanh khối u khoảng 2

mm Sau khi bôi cao, chuột được đeo vòng chống liếm trong 30 phút

2.3 Đánh giá thử nghiệm

2.3.1 Đánh giá trong quá trình thử nghiệm

Chuột được theo dõi mỗi ngày Những thông số cần quan sát và ghi nhận vào cuốimỗi tuần như sau:

- Trọng lượng chuột sau mỗi tuần

- Tỷ lệ chuột sống sót sau mỗi tuần

- Thời điểm xuất hiện khối u đầu tiên ở mỗi lô chuột

- Tỉ lệ chuột bị u trong mỗi lô

- Số lượng khối u trung bình trên mỗi chuột bị u

Số khối u trung bình =

- Đo kích thước khối u (chiều dài và chiều rộng) vào cuối mỗi tuần Chỉ những khối

u có số đo chiều dài và chiều rộng từ 1 mm trở lên và tồn tại ít nhất 1 tuần mới đượcghi nhận Thể tích khối u được tính theo công thức như sau:

V =Trong đó: V là thể tích khối u (mm3)

W là chiều rộng khối u (mm)

L là chiều dài khối u (mm)

- Thể tích khối u trung bình:

Vtb =

2.3.2 Đánh giá cuối thử nghiệm

Bóc tách vùng da lưng của chuột vào cuối thử nghiệm và ngâm vào dd formalin10% Mẫu da sau đó được gửi đến khoa giải phẫu bệnh – Bệnh viện Nhi đồng 1 đểtiến hành phân tích mô học

2.4 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20 và Microsoft Excel 2016

Các giá trị được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SEM (Standard Error of Means).Các phép kiểm thống kê được sử dụng:

- Shapiro-Wilk (cỡ mẫu <50): kiểm tra xem phân phối có phải là phân phối chuẩnhay không

- Mann-Whitney: so sánh 2 số trung bình trong phân phối không chuẩn

- T-test: so sánh 2 số trung bình trong phân phối chuẩn

- Chi bình phương (χ2) : so sánh 2 tỷ lệ

- Fisher (F): so sánh 2 tỷ lệ khi có hơn 20% số ô có expected count <5

- Các giá trị được xem là khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05, độ tin cậy95%

Chương 3 KẾT QUẢ

3.1 Kiểm nghiêm dược liệu Tía tô bằng phương pháp vi học

3.1.1 Đặc điểm hình thái cây Tía tô

Thân: cỏ mọc đứng, có mùi thơm, cao 30 – 50 cm, phân nhánh nhiều Thân và cành

màu tím, mang ít lông, có tiết diện vuông và lõm ở cạnh (Hình 3.1A)

Lá: đơn, mọc đối chéo chữ thập, phiến mỏng, hình trứng rộng, kích thước 11 x 6

cm, đỉnh lá nhọn, gốc tròn Lá xẻ răng cưa sâu, rúm, mặt trên của lá có màu xanh,

mặt dưới lá màu tím; gân giữa màu tím, gân bên 5-8 đôi Cuống lá dạng sợi, dài 3-4

cm, đường kính 1,5-2 mm, màu tím xanh (Hình 3.1B và C)

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái thân và lá Tía tô

(A) Hình dạng toàn cây ; (B) Mặt trên của lá ; (C) Mặt dưới của lá

Hoa: Cụm hoa dạng chùm ở ngọn cành hoặc nách lá, dài 5-15 cm, mỗi đốt mang 2

hoa mọc đối hình chữ thập (Hình 3.2A) Lá bắc hình trứng rộng, đầu nhọn, kíchthước 2-2,5 x 3 cm, màu xanh (Hình 3.2B) Cuống hoa dài 1-3 mm Hoa không đều,lưỡng tính, mẫu 5 Đài hình chuông, màu xanh kích thước 2-3 x 1-2 mm, 2 môi:môi trên 3 thùy ngắn; môi dưới 2 thùy nhọn xẻ sâu và dài hơn môi trên Tràng hợpthành ống màu trắng, dài 2-3 mm ở phía dưới, 2 môi 2/3: môi trên chia 2 thùy cạn;môi dưới có thùy giữa lớn hơn 2 thùy bên Nhị 4 không bằng nhau, 2 nhị dài, 2 nhịngắn, đính ở 1/3 phía trên ống tràng, xen kẽ với cánh hoa, không nhô hẳn ra ngoài

C