Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các vi khuẩn phân lập ựược từ sữa bò bị viêm vú với một số thuốc kháng sinh thông dụng..... Kiểm tra tắnh mẫn cảm của các vi khuẩn phân lập ựược từ sữa bò b
ðặt vấn ủề
Những năm gần ủõy, ngành chăn nuụi bũ sữa nước ta ủó và ủang phỏt triển mạnh ở nhiều ủịa phương ðặc biệt, từ sau quyết ủịnh 167/2001/Qð/TTg, số lượng ủàn bũ sữa khụng ngừng tăng nhanh Năm 2000 nước ta cú khoảng 35.000 con bò sữa; năm 2002 có khoảng 55.000 con tăng gần 1,6 lần so với năm 2000; năm 2004 có khoảng 95.000 con, gấp hơn 2,7 lần ðến 2006 cả nước có khoảng 113.000 con bò sữa, gấp 3,2 lần so với năm 2000 (Cục chăn nuôi, 2007) Dự kiến ủến năm 2010, ủàn bũ sữa nước ta ủạt số lượng 200.000 con, sản xuất ủược 350.000 tấn sữa, ủỏp ứng ủược 40% nhu cầu tiờu dựng trong cả nước Tuy vậy, ủàn bũ sữa nước ta mới chỉ tăng nhanh về số lượng, nhưng cũn chất lượng của ủàn bũ (kể cả giống, số lượng và chất lượng sữa, sản lượng sữa bỡnh quân/con/năm chưa cao) Hiện tại, ngành chăn nuôi bò sữa của ta còn gặp không ớt khú khăn cả về chất lượng con giống, qui trỡnh kỹ thuật, trong ủú phải kể ủến khả năng phũng chống bệnh cho ủàn bũ sữa Một trong những bệnh thường xuyờn gõy khú khăn cho ngành chăn nuụi bũ sữa ở Việt Nam ủang phải ủối mặt ủú là bệnh viờm vỳ
Nghệ An, trong ựó nổi bật là huyện Nghĩa đàn với lợi thế của vùng ựịa hỡnh bỏn sơn ủịa, diện tớch rộng, thuận tiện cho việc trồng cỏ và chăn thả ủàn bũ Nghệ An cũn cú nhiều sụng lớn chảy qua ủủ cung cấp nguồn nước nờn rất thuận lợi cho phỏt triển chăn nuụi bũ sữa Hiện cũn cú nhiều hộ nụng dõn ủó tớch lũy ủược nhiều bài học kinh nghiệm trong chăn nuụi bũ sữa của nhiều năm nay Với những lợi thế như trờn kể cả về ủiều kiện thự nhiờn, khớ hậu cũng như kinh nghiệm ủó cú, nờn gần ủõy tỉnh Nghệ An ủó mạnh dạn ủầu tư và cũn cú nhiều chớnh sỏch ủể hỗ trợ về kinh tế cho người chăn nuụi bũ sữa của tỉnh trong ủú cú huyện Nghĩa đàn như: tập trung qui hoạch lại vùng phát triển chăn nuôi; Các bộ khuyến nụng mở cỏc lớp tập huấn, hỗ trợ về cụng tỏc ủào tạo nghề, chuyển giao cỏc quy trỡnh kỹ thuật chăn nuụi bũ sữa ủến từng hộ gia ủỡnh; Cỏc hộ chăn nuụi bũ sữa cũn ủược hỗ trợ tiền vốn ủể mua giống bũ, cải tạo, nõng cấp và sửa chữa chuồng trại,…Bờn cạnh ủú, Tỉnh cũng cú chớnh sỏch mở cửa ủể thu hỳt cỏc Cụng ty sản xuất, chế biến sữa ủầu tư xõy dựng những nhà mỏy ủảm bảo việc tiờu thụ sữa cho nụng dõn, mở rộng phỏt triển vựng nguyờn liệu, ủảm bảo chăn nuụi phỏt triển bền vững và mang lại hiệu quả kinh tế cao
Tuy nhiên trong chăn nuôi bò sữa hiện nay, việc chăm sóc nuôi dưỡng chỳng theo ủỳng quy trỡnh kỹ thuật, ủặc biệt cỏc quy trỡnh vệ sinh phũng bệnh cũn ủang bị hạn chế nhiều nhất là cỏc gia trại mới ủầu tư thờm ủể mở rộng sản xuất Hiện trờn ủịa bản, cỏc bệnh về nội khoa, ngoại - sản khoa, ký sinh trựng cũng cũn xảy ra khỏ phổ biến làm ảnh hưởng khụng nhỏ ủến hiệu quả chăn nuụi Một trong những bệnh gõy thiệt hại lớn ủến ngành chăn nuụi bũ sữa Việt Nam nói chung, ở huyện Nghĩa đàn nói riêng là bệnh viêm vú Bệnh xảy ra gây thiệt hại lớn về kinh tế, làm giảm sản lượng, chất lượng sữa Nếu không phát hiện kịp thời, việc ủiều trị khỏ tốn kộm, nhiều khi cũn phải loại thải Bờn cạnh ủú, khi bũ bị viêm vú dạng tiềm ẩn còn có khả năng gây kế phát các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hay cỏc bệnh sản khoa làm ảnh hưởng ủến hiệu quả kinh tế, gõy tõm lý lo lắng bất ổn trong ủầu tư sản xuất mở rộng ðể giúp người chăn nuôi hiểu rõ hơn về bệnh viêm vú của bò sữa tại huyện, chỳng tụi ủó tiến hành thu thấp số liệu, ủiều tra thực trạng bệnh của ủịa phương, thụng qua ủú ta cú thể tỡm hiểu thờm về nguồn gốc và cỏc nguyờn nhõn gõy bệnh, ủõu là nguyờn nhõn chớnh, trờn cơ sở ủú ủề ra qui trỡnh phũng trị bệnh cú hiệu quả kinh tế cao ðược sự phân công của khoa và hướng dẫn trực tiếp của PGS.TS Bùi Thị Tho, Bộ môn Nội – Chẩn - Dược, Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội, Chỳng tụi tiến hành thực hiện ủề tài: ỘNghiên cứu thực trạng bệnh viêm vú bò sữa ở huyện Nghĩa đàn, tỉnh Nghệ An và biện pháp phòng trị”.
Mục tiờu nghiờn cứu của ủề tài
Từ cỏc kết quả ủiều tra, chỳng tụi ủó xỏc ủịnh ủược thực trạng bệnh viờm vú bò sữa trên ựàn bò sữa tại các hộ chăn nuôi bò sữa thuộc huyện Nghĩa đàn tỉnh Nghệ An
Từ những thớ nghiệm tại phũng thớ nghiệm trọng của Bộ Nụng Nghiệp ủặt tại khoa thỳ y: phõn lập, giỏm ủịnh vi khuẩn hiều khớ cú trong sữa viờm, trờn cơ sở ủú sẽ xỏc ủịnh ủược cỏc vi khuẩn gõy bệnh chớnh
Từ kết quả làm khỏng sinh ủồ với 3 loại vi khuẩn hiếu khớ cú trong sữa viờm sẽ chọn những thuốc cũn ủộ mẫn cảm cao với vi khuẩn bố trớ cỏc thử nghiệm ủiều trị bệnh trờn lõm sàng.
í nghĩa khoa học và thực tiễn của ủề tài
Từ cỏc kết quả chớnh của ủề tài như: ủiều tra thực trạng bệnh, phõn lập, giỏm ủịnh vi khuẩn, làm khỏng sinh ủồ ủể chọng thuốc ủiều trị bệnh, Kết quả của ủề tài sẽ giỳp nhà chăn nuụi chọn thuốc và cỏc phỏc ủồ ủiều trị cụ thể vừa mang lại hiệu quả kinh tế cao vừa khắc phục ủượng hiện tượng khỏng thuốc của vi khuẩn
Kết quả của ủề tài giỳp người chăn nuụi thực hiện ủỳng cỏc qui trỡnh chăn nuụi bũ sữa, trỏnh lạm dụng khỏng sinh, khống chế ủược hiện tượng khỏng thuốc của vi khuẩn gõy bệnh ðặc biệt cũn chống ủược tồn lưu khỏng sinh trong sữa, chống ụ nhiễm mụi trường do vi khuẩn khỏng thuốc và cũn ủảm bảo ủược vệ sinh an toàn sữa cho người tiêu dùng.
ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ðối tượng, ủịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu
2.1.1 ðối tượng nghiên cứu đàn bò sữa ựược nuôi tại các gia trại (từ 15-20 bò/gia trại) và một số hộ gia ựình thuộc huyện Nghĩa đàn -tỉnh Nghệ An
Từ thỏng 4 năm 2012 ủến thỏng 6 năm 2013
- Thu gom mẫu sữa bệnh lý và bỡnh thường của ủàn bũ sữa ủược nuụi tại các gia trại (từ 15-20 bò/gia trại) và một số hộ gia ựình thuộc Huyện Nghĩa đàn - Tỉnh Nghệ An
- Bộ môn Nội – Chẩn – Dược – ðộc chất khoa Thú y
- Phũng thớ nghiệm Trọng ủiểm Cụng Nghệ Sinh học khoa Thỳ y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 ðiều tra tình hình chăn nuôi bò sữa và khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm vú lâm sàng tại các hộ chăn nuôi bò sữa thuộc huyện Nghĩa đàn tỉnh Nghệ An
2.2.2 Áp dụng phương pháp CMT – Califorlia Mastitis Test trong chẩn đốn sớm bị bị viêm vú cận lâm sàng
2.2.3 Phõn lập, giỏm ủịnh cỏc vi khuẩn hiếu khớ cú trong sữa bũ thường gặp cú trong sữa bò mắc bệnh viêm vú và sữa bò ở trạng thái sinh lý bình thường
2.2.4 Kiểm tra khả năng mẫn cảm của cỏc vi khuẩn phõn lập ủược từ sữa bũ bị viờm vú với một số thuốc kháng sinh thông dụng
2.2.5 Thử nghiệm một số phỏc ủồ ủiều trị bệnh viờm vỳ bũ
2.2.6 Xây dựng quy trình phòng bệnh viêm vú bò sữa.
Nguyên liệu, vật liệu nghiên cứu
Mẫu sữa ủược lấy từ cỏc bầu vỳ của ủàn bũ sữa ủược nuụi tại cỏc gia trại (khoảng 15-20 bò/gia trại) và một số hộ gia ựình thuộc huyện Nghĩa đàn -tỉnh Nghệ An
- Thuốc thử CMT, khay thử CMT
- Các trang thiết bị và dụng cụ trong phòng nghiên cứu: phiến kính sạch, pipet, kớnh hiển vi quang học, tủ ấm, que cấy, cồn, ủốn cồn,… Giấy tẩm khỏng sinh của cụng ty TNHH Nam Khoa thành phố Hồ Chớ Minh sản xuất ủạt tiờu chuẩn quốc tế khi kiểm ủịnh
2.3.3 Cỏc loại mụi trường nuụi cấy, phõn lập, giỏm ủịnh vi khuẩn thụng thường và chuyên dụng.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp lấy mẫu sữa
2.4.2 Phương phỏp xỏc ủịnh bũ mắc bệnh viờm vỳ lõm sàng
Thụng qua bỏo cỏo về cụng tỏc phũng và ủiều trị bệnh hàng thỏng của cỏc bộ thỳ y thỳ y cỏc xó Tới cỏc gia ủỡnh nuụi nhiều bũ sữa ủể hỏi thờm về tiền sử bệnh Trực tiếp tham gia ủiều trị những ca bệnh cụ thể, thụng qua ủú ủể năm thờm về trạng thỏi chung và cỏc ủặc ủiểm bệnh lý ủiển hỡnh của tuyến vỳ khi bị viờm: hỡnh dỏng, kớch thước, tớnh nguyờn vẹn của da vỳ và ủặc ủiểm của
2.4.3 Phương phỏp xỏc ủịnh bũ sữa bị viờm vỳ cận lõm sàng
- Bệnh viêm vú cận lâm sàng được chẩn đốn bằng phương pháp CMT (California Mastitis Test) (Anri và cs., 2002)
Phát hiện sữa viêm bằng thuốc thử CMT (California Mastitis Test)
Nguyên tắc của phướng pháp
Phương pháp này là nhằm phát hiện bệnh viêm vú qua số lượng tế bào bạch cầu trong 1 ml sữa Tỷ lệ xét nghiệm: 1-1 (giữa dung dịch CMT và sữa)
- Thao tác: sau khi vắt sữa rửa sạch núm vú, lấy sữa trên từng lá vú cho vào ủĩa Pộtri hay cốc ủựng, lấy 2ml lượng vừa ủủ ủể xột nghiệm Bơm 2ml thuốc thử CMT vào ủĩa Pộtri cú chứa 2ml sữa Xoay trũn ủĩa, ủặt ủĩa Pộtri trờn nơi hơi tối ủể quan sỏt, ủọc kết quả ngay dựa trờn sự ủúng vún và thay ủổi màu sắc của hỗn hợp
Thành phần hoỏ chất thuốc thử gồm: chất màu ủỏ xẩm bromocrộsol 1/10.000 và dung dịch teepol10% Sự ủụng vún phụ thuộc vào mật ủộ cỏc tế bào bạch cầu trong sữa với cỏc mức ủộ ủo lường tỡnh trạng viờm nhiễm
- Bò mạnh khoẻ: dưới 300.000 tế bào/ ml
- Bò bị nhiễm: trên 800.000 tế bào/ ml
Dự theo cỏc tỏc giả nào ủể thử, khi ủọc kết quả cần cỏc chỳ ý như sau:
- Kết quả âm tính hay nghi ngờ khi thử CMT thì phải xem xét và cân nhắc cẩn thận Kết quả âm tính cũng không có nghĩa hoàn toàn là không có bệnh
- ðõy là phương phỏp ủọc kết quả cú tớnh chủ quan người ủọc và bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác
- Khi ủể kết quả khỏ lõu cú thể sẽ thấy õm tớnh giả vỡ gen trong ủĩa bị biến mất
- Sử dụng sữa mới vắt cho kết quả chính xác hơn sữa bảo quản hơn 24 giờ
- Chỳ ý dụng cụ chứa sữa ủể thử và yếu tố nhiễm khuẩn bờn ngoài gõy acid hóa sẽ làm kết quả âm tính
- Hàm lượng chất bộo trong sữa cao ảnh hưởng ủến sự chuyển màu ủỏ bromocresol Theo Daniel và cs chứng minh kết quả CMT cũn tựy thuộc vào ủàn gia sỳc ủang cú hàm lượng chất bộo cao hay thấp, từ ủú sẽ gõy phản ứng dương tớnh hay âm tính
- Số lượng tế bào cú thay ủổi và dao ủộng nhiều trong chu kỳ cho sữa, thời gian vắt sữa, trạng thái sức khỏe bầu vú và tùy loại vi khuẩn gây bệnh
Sử dụng pipet hỳt 1ml sữa cho vào khay thử theo vị trớ từng lỏ vỳ, sau ủú hỳt tương ủương 1 lượng thuốc thử CMT cho vào khay, lắc nhẹ trong vài giõy rồi ủọc kết quả đánh giá mức ựộ ngưng kết (+), (++), (+++), (++++) dựa vào mức ựộ dắnh nhớt và màu sắc của hỗn hợp sữa và thuốc thử theo hướng dẫn của nhà sản xuất thuốc thử CMT
2.4.4 Phõn lập và giỏm ủịnh vi khuẩn hiếm khớ cú trong sữa
Chỳng tụi tiến hành phõn lập và giỏm ủịnh cỏc vi khuẩn hiếu khớ cú trong sữa theo phương pháp thường qui (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997) trong các loại môi trường thông thường và môi trường chuyên dụng
Phương pháp thu mẫu sữa
Cỏc mẫu sữa ủược lấy từ cỏc vỳ riờng biệt hoặc lấy từ mẫu chung của bốn bầu vỳ của một cỏ thể bũ Trong khi thu mẫu cần ủặc biệt chỳ ý khõu khử trựng cỏc dụng cụ lấy mẫu: dụng cụ ủảm bảo sạch sẽ, vụ khuẩn, trỏnh nhiễm tạp khuẩn Quỏ trỡnh lấy mẫu phải tuõn thủ ủỳng cỏc thao tỏc kĩ thuật Mẫu sữa thu gom về phũng thớ nghiệm cần ủược nuụi cấy sử lý ngay Nếu chưa lịp sử lý, cần bảo quản trong tủ lạnh dương Mấu sữa thu gom ủược dựng trong cỏc thớ nghiệm: phõn lập và giỏm ủịnh vi khuẩn hiếu khớ cú trong cỏc mẫu sữa bỡnh thường và bệnh lý, tỡm vi khuẩn bội nhiễu trong mẫu sữa viờm, từ ủú kiểm tra tính mẫn cảm của các vi khuẩn bội nhiễm với những kháng sinh thông dụng Phương pháp kiểm tra khỏng sinh ủồ trờn cơ sở ủú chọn thuốc ủiều trị theo sơ ủồ
Trước tiờn chỳng tụi tiến hành phõn lập và giỏm ủịnh cỏc vi khuẩn hiếu khớ: Streptococcus sp, Staphylococcus sp, E.coli và Salmonella sp theo cỏc sơ ủồ sau:
Mụi trường thạch thường: Quan sỏt hỡnh thỏi, màu sắc, kớch thước, ủếm tổng số các loài khuẩn lạc ðếm số khuẩn lạc Giữ trên thạch máu
Nuôi cấy trên nước thịt
Kiểm tra ủộ mẫn cảm của vi khuẩn với các kháng sinh thông dụng
Tỡm phỏc ủồ ủiều trị
Môi trường chuyên dụng cho Gram (+)
Môi trường chuyên dụng cho Gram (-)
Nuôi cấy trên nước thịt
Nuôi cấy trên nước thịt
Sơ ủồ phõn lập Streptococcus và Staphylococcus (theo Carter G.R, 1995)
Sơ ủồ phõn lập, giỏm ủịnh E.coli và Salmonellas (theo Carter G.R, 1995)
Catalase (-), khuẩn lạc nhỏ, trong suốt
Streptococcus (khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong, dạng S)
Kiểm tra ủặc tớnh nuụi cấy
(Thạch thường, nước thịt, thạc máu)
Kiểm tra ủặc tớnh sinh húa
Catalase (+), khuẩn lạc to, ủục trắng hoặc vàng có thể có
Staphylococcus (Môi trường có màu vàng)
Kiểm tra ủặc tớnh nuụi cấy (Thạch thường, nước thịt, gelatin)
Kiểm tra ủặc tớnh sinh húa
Glucose Lactose Saccharose Salixin Trehalose H2S Glucose Lactose Saccharose Manitol H2
* Phương phỏp giỏm ủịnh một số vi khuẩn:
Sau khi nhận biết khuẩn lạc của vi khuẩn trờn thạch mỏu và cỏc ủặc ủiểm hỡnh thỏi của chỳng, tiến hành kiểm tra cỏc ủặc tớnh sinh húa cơ bản, sử dụng một số biện phỏp ủể phõn biệt một số loài vi khuẩn gõy bệnh chớnh
Phương phỏp CAMP dựng ủịnh danh Streptoccus gõy viờm vỳ bũ sữa:
Phương phỏp CAMP: phản ứng CAMP ủược Chritstie, Atkins và Munch- Peterson (1994) phỏt minh và sử dụng ủể phõn biệt cỏc Streptococcus nhúm B (cỏc Streptococcus gây bệnh viêm vú bò thuộc nhám B) Phản ứng dựa trên nguyên lý:
Bò bình thường Mẫu sữa Bò viêm vú
Istrati (Khuẩn lạc thuần khiến dạng S – màu vàng) ðếm số khuẩn lạc
Khuẩn lạc thuần khiết Endo
Brillian green Khuẩn lạc vàng chanh
Tính chất sinh học Giữ trên thạch máu
Hình thái nuôi cấy ðặc tính sinh hóa
Saccaroza Galactoza Glucoza Lactoza Kligler VP
Streptococcus nhúm B sản sinh một chất cú thành phần giống Protein ủược gọi là CAMP factor, nú cú thể cộng hoạt với tốc ủộ β Hemolysin của Staphylococcus aureus tạo ra một vòng dung huyết hoàn toàn, hình mũi tên trên vùng dung huyết không hoàn toàn (β) của Staphylococcus aureus
Ngày nay, phản ứng CAMP ủược cải tiến bằng cỏch cho thờm vào mụi trường làm phản ứng 0,1% Esculinvà 0,01% Ferric Citrat ủể xỏc ủịnh cỏc Steptococcus cú khả năng phõn giải Esculin và phản ứng ủược gọi là CAMP- Esculin test
Tiến hành: Cấy một ủường thẳng Staphylococcus aureus chủng chuẩn ( dung huyết 2 vũng α và β) chia ủụi ủĩa thạch (0,1% Esculin và 0,01% Ferric Citrat) Sau ủú cấy cỏc Streptococcus cần phõn biệt theo hướng vuụng gúc và cỏch ủường cấy Staphylococcus trên từ 2-3mm Bồi dưỡng ở 37 0 C/24h
Kết quả CAMP (+): Xuất hiện vùng dung huyết hoàn toàn hình mũi tên nơi tiếp giỏp giữa ủường cấy Streptococcus với vựng dung huyết β của Staphylococus aureus
CAMP- Esculin test cho phép phân biệt các loại Streptococcus theo bảng sau:
Vi khuẩn CAMP Esculin Dung huyết
Phương phỏp ủịnh danh một số loại Staphylococcus