Luận văn y học (hoàn chỉnh) ứng dụng kỹ thuật QF PCR trong chẩn đoán trước sinh các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp

TrẻmắcHCDown thường cóbiểu hiện lâm sàng: cơthểthấpbé,đầubé,chẩmd ẹt,lỗmũirộng,lưỡidàycóxuthếthòrangoài,vànhtaibiếndạng,ngóntayngắnbiếndạng,đườngvântaythayđổirõrệt,nhượccơ,tăngđộngkhớpvà

40%nguyênnhânlàdocácrốiloạnnhiễmsắcthể.Cácrốiloạnnhiễmsắcthểthườnggặpởtrẻsinhrasốngphầnlớncól i ê n quanđếncácnhiễmsắcthể21,18,13vànhiễmsắcthểgiớitính.Đâycũnglànguyênn h â n c ủam ộts ốh ộic h ứngb ấtt h ư ờ ngn h i ễms ắct h ểt h ư ờngg ặpn h ư h ộ ich ứngDown,hộichứngEdwards,hộichứngPatauvàmộtsốhộichứngbấtthườngc ủanhiễmsắcthểgiớitínhnhưKlinefelter,Turner.Vìvậy,chẩnđoántrướcsinhđóngvaitròquantrọngtrongviệcpháthiệnsớmcácdịtậtbẩmsinhđểcóthểcanthiệpởg i ai đoạnbàothainhằmgiảmtỉlệtrẻsơsinhmắccácrốiloạnditruyền

Vớisựtiếnbộcủay học,nhiềukỹthuậtchẩnđoántrướcsinhđãrađời.Từnăm1966,kỹthuậtnuôicấytếbàovàphântíchnhiễmsắcthểđồ(karyotype),gọitắtl à karyotyping,rađờivàđượcđánhgiálàtiêuchuẩnvàngtronglĩnhvựcchẩnđoántrướcsinh.Tuynhiên,kỹthuậtnàyvẫncòntồntạimộtsốhạnchếnhưthờigianthựchiệndài(14–

21ngày),thaotácphứctạp,tốnnhiềucônglaođộng.Dođó,nhucầuxuấthiệncáckỹthuậtkhácnhanhhơnvàgiúpgiảm

đángkểthờigianlolắngchocácbậcchamẹlàcầnthiết.Kỹthuậtlaitạichỗpháthuỳnhquang(FluorescenceInSituH y b r i d i z a t i o n –

F IS H) đ ã đ ượ cgiớithiệuvớiđộnhạycaovà thờigiantrảkếtquảngắn hơnđángkể.Ngaysau đó,mộtkỹthuậtmớikhác đã ra đời, kếthợpcác đặctínhc ủaP C R v à đ á n h dấuh u ỳnhq u a n g đ ư ợ cg ọil à kỹthuậtQ F -

P C R (QuantitativeF l u o r e s c en c e

PolymeraseChainReaction).KỹthuậtQF-PCRcónhiềuưuđiểmvượttrộihơnFISHlàcóthểtựđộnghóacùnglúcnhiềumẫu,chiphíthấphơnvàtốnítnhâncônglaođộnghơn.Từnăm1993,kỹthuậtQF-

PCRđượcchứngminhcóthểáp

HiệnnayởViệtNam,tạimộtsốbệnhviệnlớnnhưbệnhviệnT ừDũ, bệnhviệnHùngVươngvàbệnhviệnPhụsảnTrungươngđãtriểnkhaiápdụngkỹthuậtQF-

PCRvàochẩnđoántrướcsinh.KhoaXétnghiệmDitruyềnYhọccủabệnhviệnT ừDũđượcđánhgiálàđơnvịđiđầucảnướcvềditruyềnngườivàchẩnđoántrướcsinh,đãứngdụngthànhcôngcáckỹthuậtditruyềnphântửđểchẩnđoáncácdịtậtbẩmsinhtrongđóphảikểđếnkỹthuậtQF-

PCR.Dođó,tronghaithángtạikhoaXétn gh i ệmDitruyềnYhọccủabệnhviệnTừDũ,chúngtôiđãthựchiệnđềtàithựctập:“ Ứ ngdụngkỹthuậtQF-

PCRtrongchẩnđoántrướcsinhcácrốiloạnnhiễmsắcthểthườnggặp”vớicácmụctiêunhưsau:

1 ThựctậpquytrìnhxétnghiệmbằngkỹthuậtQF-PCR

2 HiểuvàphântíchkếtquảQF-PCRsaukhitiếnhànhđiệndimaoquản

3 ĐánhgiáđộchínhxáccủakỹthuậtQF-PCR

Lệchbội,sựmấtđihoặctăngthêmmộthoặcmộtvàiNSTlànguyênnhânphổbiếnc ủarốil o ạnN S T ở n g ư ờ i.M ộtN S T t h ê m v à o gọil à “ t a m nhiễms ắct h ể”(trisomy)lànhómchiếmnhiềunhấttrongcácbấtthườngNST(chiếmkhoảng90%)v à làmộttrongnhữngnguyênnhânquantrọngcủadịdạngbẩmsinhcũngnhưchậmp h á t triểntâmthầnvậnđộng.TrisomycủaNST13(hộichứngPatau),18(hộichứngE d w a r d s ) , và21(hộichứngDown)làmộtmốiquantâmlớntrongchẩnđoántrướcsin h bởivìchúnglàbaNSTthườngđượctìmthấyvớitầnsốcaoởcácbấtthường củac á c casinhsống[26],[27].Ngoàira,sựkhôngphântáchcủacácnhiễmsắcthểgiớití nh trongquátrìnhgiảmphânởngườigâyramộtsốnhiễmsắcthểbấtthườngnhư:X O (hộichứngTurner),XXY(hộichứngKlinefelter),…

Sựkhôngphântáchcũngcóthểxảyratrongnguyênphângâyracácthểkhảmởcáctếbàobìnhthườngvàlệchbội

1.1.1 HộichứngDown

Hộichứng(HC)DownlầnđầutiênđượcmôtảbởibácsĩIohnLangdonDownvàonăm1887.Đếnnăm1959,nguyênnhânvềmặtditruyềncủaHCDownđãđượcp h á t hiệnlàdoth

ừa mộtNSTsố21trongbộNSTnêncònđượcgọi làtrisomy21.HCDownchiếmtỷlệ1/700–1/800ởtrẻsơsinhcònsốngvàtỷlệnàytươngtựgiốngn h a u ởcácnướcvàcácchủngtộckhácnhautrênthếgiới[33]

TrẻmắcHCDown thường cóbiểu hiện lâm sàng: cơthểthấpbé,đầubé,chẩmd ẹt,lỗmũirộng,lưỡidàycóxuthếthòrangoài,vànhtaibiếndạng,ngóntayngắnbiếndạng,đườngvântaythayđổirõrệt,nhượccơ,tăngđộngkhớpvàchậmpháttriểnt r í tuệ[1].Bêncạnhđó,trẻmắcHCDownthườngkèmtheodịtậtởtim,dịtậttiêuhóa,…Khoảng15–20%trẻmắcHCDownchếtsớm dobệnhtimbẩmsinh,mộtsốítcóthểsốngđến50–60tuổinếukhôngkèmtheocácdịtậtnguyhiểm.

Hình1.1.KaryotypevàhìnhảnhcủatrẻmắcHCDown

(Nguồn:KhoaXétnghiệmDitruyềnYhọc,bệnhviệnTừDũ,[9])

Nguyênnhânchínhxácgâyratìnhtrạngrốiloạnnàyvẫnchưađượcxácđịnhc ụthểởtừngngười.Tuynhiên,thốngkêthấyrằngphụnữtừ35tuổitrởlêncónguyc ơ s i n h conbịHCDowntănglên

rõrệtthểhiệnởhình1.2.Ởphụnữ30tuổinguycơsinhconmắcHCDownlà0,2%nhưngtănglên0,8%ởtuổi40và3,6%ởtuổi45

Hình1.2.ĐồthịbiểudiễnmốiliênhệgiữatuổimẹvàHCDown[24].

1.1.2 HộichứngEdwards

HCEdwardsđượcbácsĩJohnHiltonEdwardsmôtảlầnđầuvàotháng4/1960t r ê n tạpchíyhọcLancet.HCEdwardsxảyrakhibệnhnhânbịthừamộtNSTsố18n ên còngọilàtrisomy18,đâylàtrisomyphổbiếnđứnghàngthứhaisauHCDownvớitỉlệkhoảng1/3.000trẻsơsinh[11]

TrẻmắcH C E d w a r d s t h ư ờ n g c ó c á c đ ặ c đ i ể mk i ểuh ì n h n h ư : đầun h ỏ,c ằmnhọn,tránhẹp,taithấp,taybấtthường,ngóntaycoquắp,chânkhoèo,…

và90%trẻc ó dịtậttimđi kèm[2] HC Edwards thườnggâychết thai hoặc tửvong sớmsausinh.Khoảng80%trẻbịHCEdwardschếttrongtuầnđầutiênsausinh.Mộtsốítcóthểsốnghơnmộttháng.Khoảng5-10%cóthểsốnghơnmộtnămtuổi[3]

Hình1.3.KaryotypevàhìnhảnhtaybấtthườngcủatrẻmắcHCEdwards

(Nguồn:KhoaXétnghiệmDitruyềnYhọc,bệnhviệnTừDũ,[9])

NguyênnhânchủyếucủaHCnàylàdotrongquátrìnhphátsinhgiaotửởbốhoặcmẹcặpNST18khôngphânlytạoracác

tinhtrùnghoặctrứngthừamộtNST18.K hitếbàosinhdụcbấtthườngthụtinhvớitếbàosinhdụcbìnhthườngsẽtạonênhợptửc ó b ộN S T b ấtt h ư ờ ng.K h o ảng9 5 % c á c t r ư ờ nghợpd ạngt

r i s o m y 18t h u ầnv à khoảng5%làthểkhảmhoặccácthểphốihợpkhácnhưchuyểnđoạn[4]

1.1.3 HộichứngPatau

SovớihaiHCDownvàEdwards,HCPatauđượcquansátsớmhơnvàonăm1657nhưngmãiđếnnăm1960,cơchếditruyềncủaHCnàymớiđượcbácsĩKlausP at au môtảđầyđủ.HCPataulàmộtdạngrốiloạnNSTnặngnênkhảnăngsốngsótcủathainhimắcHCnàylàrấtthấp,dođótầnsốxuấthiệnởtrẻsơsinhchỉkhoảng1/10.000

ĐặcđiểmkiểuhìnhcủaHCPataubaogồm:tậtdưngóntay,ngónchân,chânbịkhuyếttật,đầunhỏ,mắtnhỏ,mũidịdạng,hởvòmmiệng,…

Đasốtrẻbịtổnthươnghệthầnkinh,bịcácdịtậtnhư:dịtậttim(chiếm80%),dịtậthệbàitiết(trên60%)vàdịtậtởcơquansinhsản(75%).DocóquánhiềudịtậtnặngnềnênnhữngtrẻmắcH

CP a t a u khôngsốngđượclâukhoảng90%chếttrongvòng1tuổi[4]

Hình1.4.KaryotypevàhìnhảnhcủatrẻmắcHCPatau

(Nguồn:KhoaXétnghiệmDitruyềnYhọc,bệnhviệnTừDũ,[9])

GiốngvớiHCDownvàEdwards,hơn90%nguyênnhâncủaHCPataulàdosựthừamộtNST13,nênđượcgọilàtrisomy13,phầncònlạiởdạngthểkhảmhoặcchuyểnđoạn

HiệntượngrốiloạnNSTkhôngchỉxảyraởcáccặpNSTthườngmàcòngặpởc á c NSTgiớitính

1.1.4 Mộtsốrốiloạnnhiễmsắcthểgiớitính

1.1.4.1 HộichứngKlinefelter

ĐâylàHCrốiloạnNSTgiớitínhhay gặpnhấtởnamgiới,chiếmtỉlệkhoảng1 / 5 0 0 –1/1.000ởcácbétraimớisinhra[29].HCnàyđượcbácsĩHarryKlinefeltermôtảlầnđầutiên vàonăm1942, nguyênnhânlà do dưmột nhiễmsắcthểgiớitính

Xn ên cóbộnhiễmsắcthểlà47,XXY.Bêncạnhđó,HCKlinefeltercòncócácdạngkhácnhư:t h ểkhảm47,XXY/

46XY;4 8 X X X Y ; 48,XXYY và 4 9 , X X X X Y Hầuh ếtcácbấtthườngNSTnàydohiệntượngkhôngphânlyNSTxảyraởbốhoặcmẹ

NgườimắcHCKlinefelterthườngvôsinh,chỉsốIQhơithấphơnbìnhthường,pháttriểncácđặcđiểmthiênvềnữgiớinhưvúpháttriển,lôngmumọctheokiểunữ,ítrâu,…

HCTurnerdomấthoàntoànmộtNSTXvàbộNSTchỉcònduynhấtmộtNSTgiớitínhXlànguyênnhânthườnggặpnhấtchiếmkhoảng50%.Trườnghợpnàycòng ọilàmonosomyXvàkíhiệulà45,Xhoặc45,XO.Khoảng1/3cáctrườnghợpnữbịH C TurnerdomấtđoạnxảyratrênmộtNSTX.Ngoàira,HCTurnercònxuấthiệnởthểkhảmvànhữngtrườnghợpnàythườnggâyrốiloạnnhẹhơnmonosomyX[34]

Hình1.6.KaryotypevàhìnhảnhcủangườimắcHCTurner[9]

chếnhữnghậuquảnặngnềdodịtậtbẩmsinhgâyra,giảmthiểusốngườitàntật,thiểunăngtrítuệtrongcộngđồng,ch ư ơ n g trìnhsànglọc

vàchẩnđoántrướcsinhngàycàngđượcquantâmởnướcta

1.2 MỘTSỐPHƯƠNGPHÁPSÀNGLỌCTRƯỚCSINH

Sànglọctrướcsinhlàchươngtrìnhthựchiệnxétnghiệmthườngquychophụn ữmangthai3thángđầu(quý1),3thánggiữa(quý2)đểpháthiệnsớmcácthaikỳcónguycơvềbệnhlý ditruyềnnhưthiếumenG6PD,bệnhvềNSTnhưHCDownvà

cácdịtậtbẩmsinhkhác.Sànglọctrướcsinhlàmộtbướcquantrọngcầnphảithựchiệnđểcóthểpháthiệnsớmcáchiệntượngbấtthườngcủathainhinhằmđưaracácbiệnphápchămsóchayđiềutrịphùhợpvàkịpthời.Cácbướcsànglọctrướcsinhnênt h ựchiệngồmsiêuâmthai,xétnghiệmDoubletestvàTripletest

1.2.1 Siêuâmthai

Siêuâmlàphươngphápsànglọckhôngxâmlấnđếnthainhinêncóthểđượcxemlàcôngcụantoànđểpháthiệncácdịtậtcủathainhi

pháthiệncácthainhic ó nguycơbịdịtậtnhưthaivôsọ,n ứtđốts ống,mộtsốrốilo ạnNST,

…Có2xétnghiệmtầmsoát phổbiến làDouble test được thực hiệnởquý 1vàTripletestởquý2c ủathaikỳ.Giống nhưsiêuâm,cảhai xét nghiệmDouble testvà Tripletest là các xétn g h i ệmkhôngxâmlấnvàkhôngcóảnhhưởngđếnmẹvàthainhi

1.2.2.1 XétnghiệmDoubletest

10XétnghiệmDoubletestlàxétnghiệmsinhhóalấymáumẹđểthựchiện2xétnghiệm:địnhl ư ợ ngP A P P - A ( p r e g n a n c y a s s o c i a t e d plasmap r o t e i n A ) v à -hCG

g i a i đ o ạ n sớm của thaikỳ.-hCG là hormone cũng được tạo rabởinhauthaiởgiaiđ o ạnsớmcủathaikỳ[7].Cảhaichấttrênđềudothainhisảnxuấtvàxuấthiệnởmáumẹ.Dođó,nếuthainhicóhiệntượnglệchbộiNSTthìnồngđộcủacácchấtnàysẽthayđổitrongmáumẹvàviệcđịnhlượngchúngkếthợpvớikếtquảsiêuâmcóthểgiúpđánhgiánguycơdịtậtbẩm

sinhcủathainhi.TheonghiêncứucủaWaldvàcộngsự,tỷlệpháthiệndịtậtbẩmsinhcủaxétnghiệmDoubletestlà75%[30].Tuyn h i ê n , xétnghiệmnàykhôngcókhảnăngpháthiệntấtcảdịtậtcủathainhimàchỉcảnhbáothaicónguycơcaovớimộtsốdịtậtnhưHCDown,HCEdwardsvàHCP at au Nếukếtquảchỉranguycơdịtậtbẩmsinhcao, cầnphảitiếnhànhcác xétn g h iệmchẩnđoán.Nếuthaicónguycơdịtậtởmứcranhgiới,cầnthửtiếpTripletestởquý2củathaikỳđểđánhgiámứcđộnguycơrõrànghơn

ếthợpvớinồngđộ-hCGvàEstriolgiảmthìthaicónguycơcaobịHCDown,HCE d w a r d s hoặcbấtthườngNSTkhác.ĐểướctínhchínhxácmứcđộnguycơbịdịtậtcủathainhicầnkếthợpkếtquảcủaTripletestvớinhiềuyếutốkhácnhưtuổimẹ,chủngtộc,t iềns ửn g ư ờ imẹ,s ốthai, t uổithaivà ti ềns ửsảnk hoa [3].Xétn gh i ệmTr ip l e testgiúpkhẳngđịnhlạikếtquảcủaxétnghiệmDoubletest

NếuxétnghiệmDoubletestvàTripletestcókếtquảchothấythaicónguycơc ao bịmộthoặcnhiềurốiloạnNSTthìcầntiếnhànhchẩnđoántrướcsinhbằngcácthủthuậtxâmlấnnhưchọcốihoặcsinhthiếtgainhau

1.3 CÁCKỸTHUẬTCHẨNĐOÁNTRƯỚCSINHRỐILOẠNNHIỄMSẮCT

HỂ

Mộtlĩnhvự c đ ặ cb iệtq u a n t r ọngđ ố ivớiy họcc ộngđ ồ nglà c ô n g t ác chẩnđoántrướcsinhđối vớicác bấtthườngNST,nhất là khi việckiểm soátdânsốvàpháttriểnkinhtếcũngnhưdântríkhiếnnhữngngườilàmbốmẹngàycàngquantâmhơnđ ế n đứaconmàhọsẽsinhra.Tuynhiên,cáckỹthuậtchẩnđoántrướcsinhlànhữngthủtụcchẩnđoánchuyênsâucónguycơgâysẩythaivàtốnkémvềmặtkinhtếnênc h ỉđượckhuyếncáoápdụngchonhữngthaiphụcónguycơcaomangthaibịrốiloạnNST.Dođó,cáccặpvợchồngnênđượctưvấnvàthảoluậnkỹtrướckhiquyếtđịnhthựchiệncácthủthuậtchẩnđoán

Các tếbào trong dịchốicó nguồngốc từnhiềumôkhác nhau củathainhinhư:màngối,da,đườngtiếtniệu,đườnghôhấp,đườngtiêuhóavàtếbàotạomáuthai.Lượngtếbàotrongdịchốithayđổitùytheothaikỳ

Chẩnđoántrướcsinhdựatrêntếbàoốicóđộchínhxáccaovìnguycơngoạin h i ễmtếbàomẹthấp.Tuynhiên,chọcốilàmộttrongnhữngthủthuậtxâmlấntrướcsi n h n ê n c ó t h ể

d ẫnđếnmộts ốt a i b i ếnk h ô n g mongm u ốnn h ư : sẩythai(khoảng1 / 2 0 0 ) , khuyếttậtthai,nhiễmtrùngmẹ,rỉối[8]

1.3.1.2 Sinhthiếtgainhau

Sinht h i ếtg a i n h a u hiệnl à kỹthuậtđ ư ợ csửd ụngp h ổbiếnn h ấtt r o n g c h ẩnđoán3thángđầucủathaikỳ.D ư ớ isựchỉdẫncủasiêuâm,kỹthuậtnàythunhậnmẫubánhnhautừtửcung.Mẫubánhnhausẽđượclấybằngcatheter(mộtốngdài)h o ặcsửdụngkimchọcquađườngbụnghayđườngâmđạo.Kỹthuậtnàychophépch ẩnđoándịtậtthainhisớmhơnchọcốinhưngkèmtheorủirocaohơn(tỷlệsẩythaikhoảng1,9–2,1%)[8],[17]

1.3.1.3 Chọchútmáucuốngrốn

Đâylàkỹthuậtlấymáuthainhiquađườngdâyrốndướisựchỉdẫncủasiêuâm,đượcthựchiệnvàotuầnthai18.Kỹthuậtnàyítđượcápdụnghơnsovớihaikỹthuậtchọcốivàsinhthiếtgainhauvìkhảnăngtaibiếncaonhư:sẩythai,chảymáukéodài,chảymáutừthaisangmẹ,bấtthườngcấutrúcthai,thaichậmpháttriển,nangnư ớ c[2]

CáctếbàocủathainhisaukhithunhậnbằngnhữngkỹthuậttrênsẽđượcsửdụngchocáckỹthuậtditruyềnđểphântíchcácbấtthườngcủaNST

1.3.2 Kỹthuậtlậpnhiễmsắcthểđồ(karyotype)

Năm1952,kỹthuậtkaryotypeđãđượcsửdụngtrongnghiêncứuditruyềntếbàovàđếnnayquanhiềuđợtcảitiến,kỹthuậtnàytrởthànhmộtcôngcụkhôngthểthiếut r o n g v iệcp h â n t í c h cá c r ốil o ạndit r u y ềnở n g ư ờ i K a r y o t y p e đ ư ợ cc á c n h à n g h i ê n cứuđánhgiálàtiêuchuẩnvàngtrongchẩnđoántrướcsinhnhữngbấtthườngcủaNST

KaryotypedựatrênnguyêntắckhảosátbộNSTcủatếbàoởkỳgiữa(metaphase)hoặckỳgiữasớm(pro-

metaphase).Karyotypeđượcthựchiệnbằngcáchn u ô i cấytếbàotrongmôitrườngdinhdưỡngđặcbiệt.Sauthờigianthíchhợp,tếbàođ ư ợ ct h u h o ạch,t r ảil ênl a m s a u đ ó t i ế nh à

n h n h u ộmG T G ( G i e m s a T r y p s i n G - b a n d i n g ) đểphântíchbộNST

KaryotypecóthểxácđịnhbấtthườngvềsốlượnglẫncấutrúccácNSTvớiđộc h í n h xá

c l ê n đ ế n99,4– 9 9, 8 % và r ấtđ á n g t i n cậy[4],

[ 1 0 ] Tuynhiên,b ê n cạnhn h ữnglợiíchđángkểmàkaryotypemanglạithìkỹthuậtnàyvẫncòntồntạimộtsốhạnchếnhưthờigiantrảkếtquảdàitừ14–

21ngàydothờigiannuôicấyítnhấtphảimất10ngày[19].Điềunàydẫnđếnmộttâmlýbấtankéodàiđốivớithaiphụvàkhiếnchoviệcchấmdứtthaikỳnếucótrởnênphứctạpvànguyhiểmhơn.Ngoàira,karyotypeđòihỏikỹthuậtviêncótrìnhđộvàchuyênmôntrongviệcnuôicấy,nhuộmv à phântíchbộNST.MộtnhượcđiểmkháccủakaryotypelàkhôngthểpháthiệncácbấtthườngcấutrúcNSTnhỏhơn5Mb[4]

1.3.3 Kỹthuậtlaitạichỗpháthuỳnhquang(FISH)

KỹthuậtFISH(FluorescenceInSituHybridization)rađờitừnăm1989,làkỹthuậttrunggiangiữaditruyềntếbàovàsinhhọcphântử.NguyêntắccủakỹthuậtlàsửdụngcácđầudòđặchiệuđượcđánhdấuchấtpháthuỳnhquanglaivớiNSTởkỳgiữa(metaphase),và/hoặcnhântếbàoởgiankỳ(interphase).Dướikínhhiểnviquangh ọc,cácvịtrílaisẽđượcpháthiện,sốlượngtínhiệuhuỳnhquangtrongmỗinhântếb ào đạidiện cho sốlượngbảnsaoNST.Nếucó2tínhiệulà bìnhthường,1tínhiệulàmonosomyvà3tínhiệulàtrisomy[5],[21]

KỹthuậtFISHlàmộtkỹthuậtmớicógiátrịsànglọccao,đượcsửdụngtrongchẩnđoántrướcsinhnhằmpháthiệncáclệchbộiNSTthườnggặp.KỹthuậtFISHđược thựchiện trên nhân tếbàoởgiankỳkhông cần trảiquathờigiannuôicấytếbàonên cóưuđiểmhơnkỹthuậtkaryotype làchokếtquảxétnghiệmnhanhchỉtrong vò ng2–

3ngày.Đâylàbướctiếnlớntrongviệcgiảmthờigianchờđợichothaiphục ũ n g nhưgiảmbớtkhókhăntrongcáctrườnghợpthaibấtthườngcầnđìnhchỉ[5].Mặcdùnhanhvàđángtincậynhưngchiphíchohóachấtxétnghiệmcònkhácaovàtốnnhiềucônglaođộngnênkỹthuậtnàyvẫnchưađượcápdụngrộngrãiởnướcta

(Nguồn:KhoaXétnghiệmDitruyềnYhọc,bệnhviệnTừDũ)

1.3.4 KỹthuậtQF-PCR

Khắcphụcnhượcđiểmthờigianthựchiệndàicủakaryotype,chíphícaovàtốnnhiềucôngthaotáccủaFISH,kỹthuậtQF-

PCRđãrađờivàlầnđầutiênđượcápdụngđểpháthiệncácrốiloạnNSTvàonăm1993[18].Đếnnay,kỹthuậtnàyđãtrởt h à n h phươngphápchẩnđoánnhanhchóng,hiệuquảvàđượcứngdụngởnhiềunơitrênthếgiới

1.3.4.1 Kháiniệm

Kỹt h u ậtQ F

-P C R ( Q u a n t i t a t i v e F l u o r e s c e n c e -PolymeraseC h a i n Reaction)đ ư ợ cgọilàphảnứngchuỗipolymerhuỳnhquangđịnhlượng,dùngđểkhuếchđạicácđoạnDNAngắnđặchiệu(STR),đánhdấubằngtínhiệuhuỳnhquangvàđịnhlượngbằngđiệndimaoquản[23]

STR(shorttandemrepeat)haymicrosatellitelàcáctrìnhtựlặplạisongsongn g ắncótínhđahìnhrấtcaodosốlầnlặplạikhácnhaugiữacáccáthể.STRchứat rì nh tựlặplạigồm2–

6nucleotide.STRcũngđặctrưngchotừngNSTnêncácNSTk h ác nhauchứacáctrìnhtựSTRkhácnhau.TrongkỹthuậtQF-

PCR,STRđóngvait r ò làcácmarkerđểkhuếchđạimộtsốlocusnhấtđịnhtrêncácNST13,1

8,21,XvàY, quađóxácđịnhđược sốlượngcác alen thông quahìnhảnhđiệndi Ngoàira,STRđ ư ợ clựachọnlàmmarkerp h ảicómứcđộdịhợptửcaovìkếtquảvớinhiềualen

[25].NguyêntắccủaQF-PCRcủamộtSTRđặctrưngNSTsẽhiểnthị2đỉnhhuỳnhquangvớitỷlệ1:1.Ởtrườnghợptrisomysẽxuấthiện3đỉnhhuỳnhquangvớitỷlệ1:1:1(trisomy3alen)hoặc2đỉnhvớitỷlệ2:1(trisomy2alen).T r ư ờ nghợpđồnghợptửsẽhiểnthị1đỉnhhuỳnhquangduynhất[12].

c ầnkaryotype.T r o n g k h i đ ó , ở MỹvàC a n a d a , c á c k ếtq u ảQ F

-P C R p h ảiđ ư ợ ck i ểmt r a l ạib ằng

karyotype.ỞHàLan,ThụyĐiểnvàPhầnLan,nhữngthaicónguycơdotuổimẹ,xétn g h i ệmsànglọchuyếtthanhdươngtínhvàkếtquảsiêuâmcó

dấuhiệugợiýthìđượcđ ề

nghịápdụngkỹthuậtQF-PCRcònnhữngthaicóbấtthườnghìnhtháikhisiêuâmthìnênthựchiệnkaryotype[4]

Vậtliệu–Phươngpháp Thựctập Tốtnghiệp

2.1 VẬTLIỆU

2.1.1 Mẫuphântích

DịchốicủacácthaiphụcónguycơcaovềrốiloạnsốlượngNSTdựatrênkếtq uảsànglọctrướcsinh(siêuâm,xétnghiệmDoubletest,Tripletest,kếthợpvớitiềnsửbảnthânthaiphụvàgiađìnhbịrốiloạnNST),đượcchỉđịnhchọcốitạibệnhviệnT ừDũ

Micropipette Tip Tube

Máy khuấy từ Máy vortex Máy ly tâm

Máy ủ lắc Máy PCR Hệ thống điện di

mao quản

InstaGene Matrix Hi-DiTM Formamide Kit DevyserHình 2.1 Một số hình ảnh minh họa dụng cụ, thiết bị, hoá chất cho kỹ thuậtQF-PCR

Ly trích DNA tổng số

Thực hiện phản ứng luân nhiệt – PCR

Điện di mao quản

- Chuẩnbịcáctube1,5mlđánhsốtươngứngvớimãsốbệnhnhân

- Đổbớtd ịchố i đ ế nt h ểt í c h 2 mlt h ì n g ừng.S ửd ụngm i c r o p i p e t t e h ú t200lcặndịchốisangtubeđãchuẩnbịsẵn

- Lytâm14.000rpmtrong1phútloạibỏdịchnổi

- Bổsung200ldungdịchPBS.Vortex.Lytâm14.000rpmtrong1phútthucặn,loạibỏdịchnổi

- Tùytheolượngcặnốitiếnhànhbổsung100–200lInstaGeneMatrix

- Vortexsauđótiếnhànhspin

- Ủtrong8phútở99-100OC

Hút cặn dịch ối và rửa với dung dịch PBS

Ly tâmVortex

- Vortexởtốcđộcao.Lytâm12.000rpmtrong2phút

NhữngbướcchínhtronglytríchDNAbằngkitInstaGeneMatrixđượctómtắttheosơđồ2.2

BổsungdungdịchInstaGeneMatrixVo r

tex

Spin

Sơđồ2.2.QuytrìnhlytríchDNAbằngkitInstaGeneMatrix

20 l

20 l

2.2.2 Quytrìnhphảnứngluânnhiệt–PCR

ỨngvớimỗimẫuDNAsaukhiđượclytríchsẽđượcchạy2phảnứngPCRđamồiriêngbiệttrongbộkitDevyserComplete

ThànhphầnphảnứngPCR1gồmcó:

PCRActivatorDevyserCompleteMix1

ThànhphầnphảnứngPCR2gồmcó:

PCRActivatorDevyserCompleteMix2

DevyserCompleteMix1gồmcáccặpmồiđượcđánhdấuhuỳnhquang đặchiệucho14markerđặctrưngtrêncácNST13,18,21.Tươngtự,DevyserCompleteMix2g ồmcáccặpm ồiđượcđá nh dấ uhuỳnhqua ng đặ chiệucho 19markerđặ ct r ư n g trêncácNST13,18,21,X,Yvàđặcbiệttrongđócó2markerlàT1,T3đượcsửdụngđểđếmsốlượngNSTX.Cácmarkerđượctrìnhbàytrongbảng2.1.và2.2

Thựctập Tốtnghiệp Vậtliệu–Phươngpháp

18-D1 D18q22.1 18q22.1 336–430 Xanhlá18M GATA178F11 18p11.32 350–410 Vàng18P D18S391 18p11.31 130–205 Xanhdương21A D21S1435 21q21.3 150–208 Xanhdương

21D D21S1444 21q22.13 440–495 XanhdươngBảng2.2.CácmarkerđượcsửdụngtrongphảnứngPCR2[13]

Kíhiệu TênMarker VịtrítrênNST Độdài(bp) Màuhuỳnhquang

XY

AMELX,AMELY Xp22.2,Yp11.2

X=104Y=1 1 0 Xanhdương

Xq13

7=181X=201 Xanhlá

Xq21.1

3=133X=137 Xanhdương

X9 DXS2390 Xq27.1-q27.2 312–357 Vàng