Xác định hàm lượng một số flavonoids trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xác định hàm lượng một số flavonoids trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao Xác định hàm lượng một số flavonoids trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao Xác định hàm lượng một số flavonoids trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- -

HOÀNG QUỲNH TRANG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ FLAVONOIDS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC- CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là kết quả nghiên cứu và làm việc của tôi, các kết quả, số liệu của luận văn là trung thực, thực tế tại nơi nghiên cứu

Hà Nội, tháng 03 năm 2014 Tác giả luận văn

Học viêc cao học khóa 2011B

L ỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Hồng Hảo và PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại Viện Công nghệ Sinh Học – Công nghệ thực phẩm, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban giám hiệu trường Đại học kỹ thuật Y tế Hải Dương, khoa Y học dự phòng – Y tế cộng cộng và labo xét nghiệm

an toàn vệ sinh thực phẩm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Th.s DS Cao Công Khánh và các anh chị tại labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện

và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, năm 2014

Học viên

M ỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID 3

1.1.1.Khái niệm về Flavonoid [4] 3

1.1.2.Phân loại Flavonoid 3

1.1.3.Tính chất của flavonoid [4] 4

1.1.4.Tác dụng sinh học của Flavonoid 5

1.2.Giới thiệu về các flavonoids trong nghiên cứu 7

1.3.Một số phản ứng định tính flavonoid 9

1.4.Các phương pháp xác định Flavonoid 10

1.4.1.Phương pháp phân miễn dịch phóng xạ(radioimmunoassay – RIA) 10

1.4.2.Phương pháp sắc ký lỏng 11

1.4.2.1 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng với dectecter UV-VIS 11

1.4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng siêu cao áp[28] 14

1.4.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS [32] 14

1.5.Phương pháp HPLC 16

1.5.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng 16

1.5.2 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [1, 7] 18

1.6 Mục tiêu và nội dung của nghiên cứu 19

1.6.1 Mục tiêu 19

1.6.2Nộidung 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1.Đối tượng nghiên cứu 20

2.2.Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 20

2.2.1.Thiết bị 20

2.2.2.Dụng cụ 20

2.2.3.Hóa chất 21

2.3.Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1.Phương pháp lấy mẫu 22

2.3.2.Phương pháp phân tích 22

2.3.3.Xây dựng quy trình xử lý mẫu 22

2.4.Thẩm định phương pháp phân tích [5] 25

2.4.1.Tính đặc hiệu và chọn lọc 26

2.4.2.Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 26

2.4.3.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 29

2.4.4.Xác định độ lặp lại (độ chính xác) 31

2.4.5 Xác định độ đúng 32

2.5.Phương pháp xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

3.1.Lựa chọn phương pháp phân tích 35

3.2.Tối ưu điều kiện xác định Flavonoid trên thiết bị HPLC 35

3.2.1.Khảo sát lựa chọn bước sóng xác định 35

3.2.2.Lựa chọn pha tĩnh để tách các chất flavonoids 35

3.2.3.Khảo sát và lựa chọn tốc độ pha động 36

3.2.4.Khảo sát lựa chọn nhiệt độ buồng cột: 36

3.2.5.Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu: 37

3.2.6.Khảo sát pha động 38

3.2.7.Khảo sát chương trình gradient 42

3.3.Khảo sát quá trình xử lý mẫu : 45

3.3.1.Phương pháp xử lý mẫu xác định các chất Flavonol Aglycon 47

3.3.2.Phương pháp xử lý mẫu xác định các chất Isoflavon 47

3.4.Đánh giá phương pháp phân tích: 48

3.4.1.Độ đặc hiệu và chọn lọc của bước sóng phân tích 48

3.4.2.Đánh giá độ lặp lại của hệ thống 49

3.4.3.Khảo sát lập đường chuẩn 51

3.4.4.Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 52

3.4.5.Độ lặp lại của phương pháp: 54

3.4.6.Độ đúng của phương pháp 57

3.5 Áp dụng phân tích một số mẫu thực tế: 59

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 73

PH Ụ LỤC 79

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IUPAC International Union of Pure and

Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học

cơ bản và ứng dụng

USFDA United States Food and Drug

Administration

Cục dược phẩm và thực phẩm

Mỹ

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid được xác định trong đề tài 7

Bảng 1.2: Các phương pháp phân tích flavonoid bằng HPLC 12

Bảng 2.1: Danh mục các chất chuẩn 21

Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc của từng chất 21

Bảng 2.3 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 32

Bảng 2.4: Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC 33

Bảng 2.5: Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu 33

Bảng 3.1: Danh mục các pha động khảo sát 39

Bảng 3.2: Mối quan hệ giữa hàm lượng các flavonoid (mg/viên) trong viên nén Ginkgo Intensiv với thể tích methanol dùng để chiết mẫu 46

Bảng 3.3 Mối quan hệ giữa hàm lượng các isoflavonoid (mg/g) trong bột đậu nành với 3 dung môi dùng để chiết 48

Bảng 3.4: Các phương trình hồi quy tuyến tính mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ các flavonoid 51

Bảng 3.5: LOD và LOQ của các flavonoid 53

Bảng 3.6: Độ lặp lại của phương pháp 54

Bảng 3.7: Kết quả phân tích độ thu hồi, độ lặp lại 55

Bảng 3.8: Kết quả phân tích độ thu hồi, độ lặp lại 55

Bảng 3.9: Độ lặp lại của Daizdein 56

Bảng 3.10: Độ lặp lại của Genistein 56

Bảng 3.11: Độ đúng của phương pháp 57

Bảng 3.12: Độ thu hồi của Daizdein 59

Bảng 3.13: Độ thu hồi của Genistein 59

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc chung của các flavonoid 3

Hình 1.2: Cấu trúc chung của các euflavonoid 3

Hình 1.3: Cấu trúc chung của các isoflavonoid 4

Hình 1.4: Cấu trúc chung của các neoflavonoid 4

Hình1.5 : Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 19

Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến 23

Hình 2.2 Đồ thị tương quan giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích 27

Hình 2.3 Đường chuẩn trên nền mẫu thực 28

Hình 2.4: Xác định LOD bằng cách tính S/N 30

Hình 3.1: Sắc đồ phân tích các chất flavonoid trên cột ODS Inersil 36

Hình 3.2: Sắc đồ phân tích các chất flavonoid với tốc độ 0,9ml/min 36

Hình 3.3: Sắc đồ phân tích các chất flavonoid với nhiệt độ buồng cột 450C 37

Hình 3.4 Sắc đồ phân tích các flavonoid với thể tích tiêm mẫu 50µl 38

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): ACN và (B) acid acetic 0,1%; 40

Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm 40

(A): ACN và (B): acid acetic 0,1%; 1%TCA 40

Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): methanol và (B): acid acetic 0,1%; 1%THF 41

Hình 3.8: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): methanol và (B): acid formic 0,1%; 1%THF 41

Hình3.9: Sắc đồ tách hỗn hợp 9 flavonoid trên cột C18 tốc độ dòng 1ml/phút theo chương trình Gradient 1 43

Hình 3.10 Sắc đồ tách hỗn hợp 9 flavonoid trên cột C18 tốc độ dòng 1ml/phút theo chương trình Gradient 2 43

Hình 3.11 Sắc đồ tách hỗn hợp 9 flavonoid trên cột C18 tốc độ dòng 1ml/phút theo chương trình Gradient 3 44

Hình 3.12: Đường chuẩn EGCG 51

Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn LOD của các flavonoid ở bước sóng 360nm 52 Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn LOD của các flavonoid ở bước sóng 260nm 53 Hình 3.15 Quy trình phân tích mẫu thực 60

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cuộc sống ngày càng hiện đại hơn, mọi người bắt đầu quan tâm hơn đến sức khỏe của mình Tuy nhiên cuộc sống hội nhập khiến con người ngày càng bận rộn hơn, thời gian luôn hạn hẹp, nhiều khi không thể chăm sóc chu đáo cho bản thân Nhu cầu về các loại thực phẩm “sạch”, đảm bảo chất lượng và đặc biệt là các loại thực phẩm chức năng có nhiều tác dụng tốt ngày càng tăng Tuy nhiên, hiểu biết về thực phẩm chức năng thì không phải ai cũng tường tận Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh Một số nhà kinh doanh đã lợi dụng lòng tin của người tiêu dùng nên đã quảng cáo quá đáng chức năng của thực phẩm chức năng khiến không

ít người coi thực phẩm chức năng là “thần dược” chữa bách bệnh

Flavonoid là một nhóm hợp chất hữu cơ gặp nhiều trong thảo dược và một số loại thực phẩm Do nhiều công dụng của các flavonoid mà các dược liệu này được đưa vào làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng Trên thị trường đã xuất hiện rất nhiều các loại thực phẩm chức năng và một số sản phẩm thực phẩm chứa các chất nhóm flavonoid Khi niềm tin của con người vào thực phẩm chức năng ngày càng cao thì có một vấn đề đặt ra, đó là chất lượng của các sản phẩm này trên thị trường Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào hiện nay xác định xem liệu chất lượng của các sản phẩm ra sao Đó vẫn là vấn đề mà người dân và các cơ quan chức năng quan tâm

Đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm là một vấn đề nhận được sự quan tâm của toàn xã hội Hiện nay công tác quản lý an toàn thực phẩm đang chuyển biến mạnh mẽ, đòi hỏi các cơ quan quản lý nhà nước phải chủ động phát hiện, phòng ngừa ngộ độc thực phẩm và bệnh truyền qua thực phẩm, kiểm soát thực phẩm nhập khẩu, bảo đảm an toàn thực phẩm đối với thực phẩm trong nước và xuất khẩu, đáp ứng những yêu cầu khắt khe của hội nhập kinh tế quốc tế Việc này đòi hỏi phải có một hệ thống kiểm nghiệm đủ mạnh không chỉ đáp ứng các yêu cầu

trong nước mà phải thoả mãn các điều kiện khắt khe của khu vực và trên thế giới, được thế giới công nhận

Với những thực tế như vậy, để góp phần bảo vệ sức khỏe và quyền lợi của người tiêu dùng, đồng thời góp phần kiểm soát chất lượng thực phẩm, thực phẩm chức năng, giúp các nhà sản xuất đảm bảo chất lượng sản phẩm cũng như góp phần tăng cường công tác quản lý của các cơ quan chức năng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định hàm lượng các flavonoids trong thực phẩm bằng kỹ thuật

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời một số flavonoid trong thực phẩm và thực phẩm chức năng

Ứng dụng quy trình đã xây dựng cho phân tích một số sản phẩm thực phẩm, thực phẩm chức năng trên thị trường Hà Nội

CH ƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn gặp nhiều trong thực vật Các flavonoid

thường có màu vàng, một số có màu tím, xanh hoặc thậm chí không màu Flavonoid

được xếp vào nhóm hợp chất phenol có khung cấu trúc theo kiểu C6-C3-C6

Hình 1.1: Cấu trúc chung của các flavonoid

Thông thường mạch 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng C có oxy

1.1.2 Phân loại Flavonoid

Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của vòng B và các mức độ oxy hóa của

mạch 3C:

∗ Euflavonoid: vòng B ở vị trí C-2

Hình 1.2: Cấu trúc chung của các euflavonoid

Gồm có các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan-3-ol, flavan-4-ol,

flavan-3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon uron

∗ Isoflavonoid: vòng B ở vị trí C-3

Commented [L1]: Title ko có dấu hai chấm

Commented [L2]: Format chưa chuẩn: chưa căn 2 bên

Hình 1.3: Cấu trúc chung của các isoflavonoid

Gồm có các nhóm: isoflavan, isoflav-3-en, isoflavan-4-ol, isoflavanon,

isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen,

coumaronochromon, dihyroisochalcon, homoisoflavon

∗ Neoflavonoid: vòng B ở vị trí C-4

Hình 1.4: Cấu trúc chung của các neoflavonoid

Gồm các nhóm: 4-arylchroman, 4-aryl coumarin, dalbergion

∗ Ngoài ra còn có Biflavonoid là những flavonoid dimer, Triflavonoid có cấu tạo

bởi 3 monomer flavonoid

1.1.3 Tính chất của flavonoid [4]

- Màu sắc: Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu,

flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam Các chất

thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, flavan-3-ol không có nối

đôi liên hợp giữa vòng B và nhóm carbonyl nên không màu Các dẫn chất

anthocyanidin màu thay đổi theo pH môi trường

- Độ tan: Thường các hợp chất flavonoid glycoside và flavonoid sulfat phân cực

nên tan được trong nước, không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ Ngược lại,

các flavonoid aglycon thì tan trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước Các

Commented [L3]: Format chưa chuẩn: chưa căn 2 bên

flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng

1.1.4 Tác dụng sinh học của Flavonoid

Flavonoid có rất nhiều các tác dụng sinh học đã và đang được nghiên cứu để đưa vào ứng dụng trong thực tiễn:

HO•, ROO•, tạo phức với các ion kim loại là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa Các flavonoid được chứng minh là có tác dụng làm bền vững màng tế bào nơi dễ bị peroxyd hóa gây ra các rối loạn làm hủy hoại tế bào [4, 17]

hyalruronidase là enzyme là tăng tính thấm của mao mạch Do đó, flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc [4] Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng aglycon có tác dụng tốt hơn glycoside trên hyalruronidase, do đó quercetin có tác dụng tốt hơn rutin, quercetrin và naringenin tốt hơn naringin [12]

- Tác dụng chống độc: Tiến hành trên các động vật thí nghiệm được gây độc

bằng benzen carbon tetraclorua, chloroform…nhận thấy flavonoid làm giảm tổn thương gan, bảo vệ gan [6] Flavonoid làm tăng lượng glycogen trong gan giúp nâng cao chức năng giải độc gan Một số dược liệu đã được sử dụng để điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan như cây Actiso, cây Bụt dấm…[4]

- Tác dụng chống viêm: Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng một số flavonoid ức

chế các enzyme tham gia vào quá trình viêm như kaempferol, artemetin, apigenin, quercetin [17, 15] Rutin, quercetin, catechin được dùng để điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da, và màng nhầy trong trường hợp xạ trị [4]

- Tác dụng trên tim mạch: Một số chất như quercetin, rutin, myricetin,

pelargonin, hỗn hợp catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích phút của tim, làm hồi phục tim khi bị gây ngộ độc bởi chloroform, quinin, metanol [4] Ngoài ra, một số flavonoid như luteolin, quercetin, kaempferol… đã được nghiên cứu trên thỏ và chuột về tác dụng chống kết tập tiểu cầu [17, 6, 27]

- Tác d ụng estrogen: Các dẫn chất thuộc nhóm isoflavonoid có tác dụng

estrogen Tác dụng này được giải thích là do sự gần nhau về mặt cấu trúc với diethylstilbestrol [4]

- Các tác dụng khác của flavonoid: Flavonoid có tác dụng chống co thắt các tổ

chức cơ nhẵn như túi mật, ống dẫn mật, phế quản…(apigenin có tác dụng làm giảm

co thắt phế quản gây ra bởi histamin, seretonin, acetylcholin) Scoparosid trong

Sarothamus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capitata, quercitrin trong cây

diếp cá, flavonoid trong cây râu mèo có tác dụng thông tiểu rõ rệt Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycoside trong rễ cam thảo đã được dùng để chữa đau

dạ dày [4] Quercetin đóng vai trò quan trọng trong ngăn ngừa và điều trị loét đường tiêu hóa do nó kích thích bài tiết chất nhầy và ức chế sự phát triển của Helicobacter

pylori trong các nghiên cứu in-vitro [16] Các nghiên cứu còn chỉ ra tác dụng chống ung thư, ức chế sự phát triển tế bào ung thư của genistein, các catechin [17] Dịch chiết từ lá của Ginkgo biloba được dùng có tác dụng tăng tuần hoàn não Một số isoflavon như puerarin, daidzin, daidzein được dùng để tăng cường tuần hoàn [30] Ngoài ra, các flavonoid còn được chứng minh các tác dụng chống nấm, kháng khuẩn, chống virus Quercetin đã được nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trên chuột thí nghiệm và đang mở ra hướng mới để điều trị đái tháo đường tuýp 2 [6]

1.2 Gi ới thiệu về các flavonoids trong nghiên cứu

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid được xác định trong đề tài

Tinh thể màu vàng, không tan trong nước, tan được trong dung dịch kiểm, nhiệt độ nóng chảy 3160C

Tinh thể màu vàng, ít tan trong nước, tan trong ethanol nóng Nhiệt độ nóng chảy 2780C

3

Luteolin

C15H10O6 286,24

Dạng tinh thể hoặc bột mịn màu vàng, tan trong các dung môi hữu cơ

Dạng bột kết tinh màu vàng, nóng chảy ở

235oC Ít tan trong nước, tan

trong các dung môi hữu cơ

Dạng bột kết tinh màu trắng, tan trong các dung môi hữu

cơ, điểm nóng chảy 264oC

Dạng tinh thể, bột màu trắng, tan trong dung môi hữu cơ

Nhiệt độ nóng chảy 3230C

Dạng tinh thể, bột màu vàng, tan trong dung môi hữu cơ

Nhiệt độ nóng chảy 2420C

2470C

Trong thực phẩm ECG và EGCG có trong hoa lơ xanh, rau chân vịt, dâu tây nhưng nhiều nhất là trong trà xanh Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của EGCG cao gấp 100 lần so với vitaminC và gấp 25 so với vitamin

E Mặt khác EGCG có khả năng diệt trừ các virus, vi khuẩn, ngăn chặn sự phát triển của tế bảo ung thư, ngăn ngừa các bệnh tim mạch như: đau tim, đột quỵ, tai biến mạch máu não và angina pectoris (đau ở lồng ngực có khi sự đau lan ra ở cánh tay trái, nguyên nhân do co thắt động mạch của cơ tâm) và làm giảm lượng đường trong máu của những bệnh nhân đái tháo đường

Rutin, Quercetin và Kaempferol đại diện cho nhóm Flavonol Quercetin và Kaempferol là những flavonold gặp nhiều trong tự nhiên thực vật Theo báo cáo của viện nghiên cứu Institute of Human tại Đức thì những thực phẩm gồm hành tây, táo, berry, kale có nhiều Quercetin Khi sử dụng những thực phẩm này thường xuyên sẽ làm giảm khả năng mắc ung thư tụy tới 23% so với những người không sử dụng Hành tây có chứa lượng lớn chất quercetin rất tốt cho việc làm giảm huyết áp và ngăn ngừa mảng bám động mạch [28]

Daidzein và Genistein đại diện cho nhóm isoflavon Cả hai chất Daidzein và Genistein có tính chất như estrogen trong chế độ ăn uống và có thể sử dụng cho liệu pháp thay thế hormone thời kỳ mãn kinh [22] Nồng độ của chất isoflavone trong đậu tương là khoảng 0,2-0,4% khối lượng, và nồng độ này bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: nơi xuất xứ, môi trường tăng trưởng và mùa thu hoạch Theo các nghiên cứu người dân Nhật bản thường xuyên tiêu thụ những sản phẩm giàu đậu nành, có tỷ lệ

tử vong vì ung thư vú thấp hơn các nước khác

Luteolin và Myricetin là những Flavonol hay gặp trong thực vật và dược liệu Các nghiên cứu đã chỉ ra myricetin cũng như kaempferol và quercetin, có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tụy Không chỉ có vậy, myricetin còn được đề nghị trong hỗ trợ điều trị ung thư tuyến tiền liệt và có tác dụng chống oxy hóa [26]

Tác dụng của FeCl3: Tuỳ theo số lượng và vị trí của nhóm OH-phenol mà cho màu lục, xanh hoặc nâu

Tác dụng của kiềm: nếu hơ một tổ chức thực vật (cánh hoa, lát cắt của gỗ), hoặc một tờ giấy thấm có dịch chiết trên miệng lọ amoniac thì sẽ thấy có màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ và nhóm flavonoid

Tác dụng của H2SO4 đặc: với dẫn chất flavon, flavonol cho màu vàng đậm Với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm, đỏ tươi

Tác dụng của antimoin pentachlorid: antimoin pentachlorid (SbCl5) trong carbon tetraclorua (CCl4) cho màu đỏ đến tím với chalcon, vàng đến vàng cam với flavon Với dihydrochalcon thì không cho màu

Phản ứng cyanidin: dung dịch flavonoid trong ethanol, thêm bột Mg rồi nhỏ

từ từ HCl đậm đặc Sau 1-2 phút sẽ thấy màu đỏ cam, đỏ thẫm, đỏ tươi tùy theo nhóm flavonoid

Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm: nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc kiềm, màu tùy thuộc vào các dẫn chất

Phản ứng ghép đôi với muối diazoni: các flavonoid có nhóm OH ở vị trí số 7

có thể phản ứng với muối diazoni tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ

Xác định hàm lượng flavonoid trong thực phẩm nói chung và trong thực phẩm chức năng nói riêng là một vấn đề rất được quan tâm Rất nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu xác định nhóm hợp chất này bằng nhiều phương pháp khác nhau trên các đối tượng như đậu nành, nước tiểu, huyết thanh Dưới đây là một số phương pháp phổ biến được tiến hành thực nghiệm

Hiện nay, RIA (phương pháp phân tích miễn dịch phóng xạ) được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học

Lap tìm ra một phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) để xác định daidzein từ dịch cơ thể, dựa trên kháng thể đa giá chống lại daidzein -4' -O- ( carboxymethyl ) - ether - BSA Độ nhạy của xét nghiệm này là 0,4 pg /ống cũng đã

sử dụng một phương pháp RIA để xác định chất isoflavone trong bia và đo genistein đơn lẻ trong huyết thanh người Isoflavone trong bia đã được định lượng bằng hai xét nghiệm miễn dịch, kháng thể đầu tiên chống lại daidzein/frmononetin

và kháng thể thứ hai chống lại genistein/biochanin A Tổng cộng có 26 mẫu bia được phân tích về nồng độ isoflavone, với daidzein trong bia trong khoảng 0,08-2,5 nmol / L và genistein là 0,169-6,74 nmol/L Đối với genistein đơn lẻ trong huyết thanh người, hai hệ thống RIA cho genistein đã được sử dụng , dựa trên kháng thể

đa giá chống lại genistein -4' –O - (carboxymethyl) - ete albumin và genistein -7 -O- (carboxymethyl) - ete huyết thanh albumin tiếp hợp , với độ nhạy đối với genistein

là 1,2 và 2,8 pg/ống Nghiên cứu này cho thấy xét nghiệm miễn dịch dựa trên kháng huyết thanh chống lại các dẫn xuất khác nhau ở vị trí để xây dựng các immunogen ,

có thể phân biệt giữa isoflavone đơn lẻ và các chất chuyển hóa khác nhau của chúng Tuy nhiên, bộ enzyme xét nghiệm miễn dịch (EIA) trên thị trường hiện nay

có thể cung cấp độ nhạy tốt hơn so với phương pháp RIA và EIA thông thường Mặc dù tất cả những ưu điểm trên, điểm bất lợi lớn nhất trong xét nghiệm miễn dịch

là thiếu đánh giá đồng thời cho nhiều hợp chất, độ chính xác rất thấp và nó không thể phân biệt các isoflavone với nhau

Sắc ký lỏng là phương pháp tách được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực phân tích hiện nay vì phạm vi ứng dụng rộng rãi

1.4.2.1 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng với dectecter UV-VIS

Các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC [9, 11, 14, 21, 24, 29, 31]

Bảng 1.2: Các phương pháp phân tích flavonoid bằng HPLC

Các thông số Phương

Cột C18 Phenomexex (150 x 2mm; 3µm)

Chiết với 3ml methanol/lần x 2 lần, gộp dịch chiết lại, định mức đến 10ml bằng methanol

Các thông s ố Phương

5µm)

Cột C18 Pack, ODS-AM-

YMC-303 (250 x 4,6mm; 5µm)

Cột C18 Phenomexex (150 x 2mm; 3µm)

và tiêm vào hệ

thống HPLC

Chiết với 40ml methanol 80%, định mức đến 50ml, lọc và tiêm vào hệ thống HPLC

Mẫu nghiền thành bột, thêm ethanol 70% có acid acetic 0,1%, rung siêu

âm, ly tâm, lọc, tiêm vào hệ thống HPLC

Chiết bằng dung môi methanol trong bình siêu

âm sau 15 phút, lọc và tiêm vào

hệ thống HPLC

Nhận xét: Các phương pháp 1, 2, 4, 6, 7 đều có thời gian phân tích mẫu rất dài,

trong khoảng 40-70 phút và do đó, tốn dung môi pha động nên không có hiệu quả kinh tế cao Phương pháp 5 có thời gian phân tích mẫu ngắn, chỉ 15 phút, song

nhược điểm của phương pháp là sử dụng acid phosphoric làm pha động nên có thể dẫn tới giảm tuổi thọ cột Phương pháp 3 có thời gian lưu ngắn, phương pháp xử lý mẫu đơn giản, tuy nhiên mới chỉ áp dụng trên các mẫu dạng lỏng Các phương pháp trên đều có ưu điểm là hệ số tương quan cho các flavonoid đều đạt yêu cầu, độ thu hồi cao, trong khoảng 85%-102%

1.4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng siêu cao áp[28]

Trong một nghiên cứu sau đó, một phương pháp sắc ký lỏng siêu cao áp (UPLC ) được phát triển bởi Klejdus để phân tích các isoflavone đậu nành và các axit phenolic Tổng cộng có 6 isoflavone đậu nành đã được tách ra bằng cách sử dụng một cột Waters BEH C18( 50 mm × 2,1 mm ×1,7 nm) với pha động (A) 0,3 % axit axetic trong nước và (B) methanol chạy ở điều kiện gradient như sau: ban đầu

là 78% A và 22% B, nâng lên 50% B trong 1,0 phút, 100 % B trong 1,4 phút và trở lại 22% B trong 1,8 phút Tốc độ dòng là 0,8 ml phút , với bước sóng phát hiện

270 nm và cột nhiệt độ 60 ° C Phương pháp này diễn ra nhanh chóng, nhưng nó chỉ phân tích được 6 isoflavone đậu nành là daidzin, glycitin, genistin, daidzein, genistein và glycitein

1.4.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS [32]

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện nay Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các chất hữu cơ trung hòa bị ion hóa thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc

tự do Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Để xác định isoflavone đậu nành trong mẫu nước tiểu , Cimino đã phát triển một phương pháp HPLC / MS sử dụng một cột Supelco Discovery RPamide - C16 (25 mm × 4.6 mm × 5 mm) với pha động kênh A là 25% methanol có chứa 10 mM amoni axetat và 71 mM trietylamine (TEA) và kênh B là 95% methanol có chứa 10

mM amoni axetat và 71 mM TEA điều chỉnh ở pH 4,5 Chế độ gradient được sử

dụng là 35% A và 65 % B vào ban đầu , tăng lên đến 95% B sau 10 phút, duy trì trong 1 phút ở tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút, với tổng thời gian chạy trong vòng 11 phút Phương pháp này nhanh chóng và chỉ cần một lượng nhỏ mẫu nước tiểu, nhưng chỉ có một số isoflavone đậu nành được phân tích Khả năng phát hiện ở chất isoflavone có thể đạt được bằng cách sử dụng một phương pháp HPLC - ESIMS phát triển bởi Satterfieldet Pha tĩnh là cột C18 Waters (50 mm × 2.1 mm × 3,5nm) với pha động isocratic: metanol tỷ lệ (55 : 45) tốc độ dòng chảy ở mức 0,1 ml / phút , tổng thời gian tách dưới 10 phút Các giới hạn phát hiện của daidzein và genistein là 25,4 và 2,7 pg/ml, và mức độ của hai chất trong nước tiểu của các tình nguyện viên được cho ăn 35g protein đậu nành/ngày đều ở mức 6 ng / ml Phương pháp này có độ nhạy cao , nhưng chỉ các isoflavone aglycone (daidzein và genistein) mới được tách ra

Thomas phát triển hai phương pháp khác nhau để xác định isoflavone đậu nành trong huyết tương và nước tiểu người Để phân tích huyết tương, cột Luna Phenyl – hexyl (150 mm × 4.6 mm × 4.6 nm) và một pha động (A) 0,05 M amoni formate (pH 4.0) và (B) methanol - acetonitril ( 50 : 50 , v / v) chạy theo chế đọ gradient sau: 100% A và B 0% ban đầu , tăng lên đến 40 % B sau 0,5 phút và duy trì cho đến 11,5 phút, 80 % B sau 12,5 phút và duy trì cho đến 15,5 phút Tốc độ dòng chảy là 2 ml /phút với phát hiện ở 259 nm Để phân tích nước tiểu, một cột Zorbax Eclipse XDBPhenyl HPLC (75 mm × 4.6 mm ×3,5 mm) và một pha động (A) 0,05 M amoni formate (pH 4.0) và (B) methanol đã được sử dụng với điều kiện

độ dốc: 90% A và 10 % B ban đầu trong 0,5 phút, tăng lên đến 45 % B sau 1 phút

và duy trì cho đến 10,5 phút, 80 % B sau 11,5 phút và duy trì cho đến 14,5 phút Tốc độ dòng chảy là 2 ml/phút với phát hiện ở 259 nm Các giới hạn định lượng của daidzein , genistein và glycitein là khoảng 2 ng/ml Độ nhạy của phương pháp này

là cao , tuy nhiên, chỉ aglycones (daidzein, genistein và glycitein ) được phân tích

1.5 Phương pháp HPLC

1.5.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [8]

Pha tĩnh trong sắc ký lỏng [8, 9]

Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3-7µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

- Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN…)

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất

đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực Hơn nữa, trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế

Pha động trong sắc ký lỏng [8, 9]

Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh

- Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

- Hoà tan được mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp

+ Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha ngược

+ Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực như cyclopentan, pentan, heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…

n-Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi

để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích

Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là gradient pha động

- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các cation, anion, các hợp chất có tính dẫn điện…

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến, như detector PDA,

MS, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích nhờ vào phổ hấp thụ hoặc mảnh phổ đặc trưng với từng chất phân tích

Hình1.5 : Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

1.6 Mục tiêu và nội dung của nghiên cứu

1.6.1 Mục tiêu

- Xây dựng quy trình phân tích đồng loạt 9 flavonoid nói trên

- Thẩm định quy trình đã xây dựng theo các quy định của Việt Nam và thế giới

- Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu đã xây dựng vào các mẫu thực

tế

1.6.2 Nội dung

- Khảo sát và lựa chọn các điều kiện phân tích

- Khảo sát và lựa chọn quy trình chiết mẫu phù hợp với từng đối tượng mẫu

- Thẩm định phương pháp theo tiêu chí của ISO 17025

- Phân tích một số mẫu thực tế để đưa ra các nhận xét đánh giá về hàm lượng các mẫu có trên thị trường

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định hàm

lượng 9 flavonoid: ECG, EGCG (đại diện cho nhóm Catechin), rutin, quercetin,

kaempferol (đại diện cho nhóm Flavonol), daidzein, genistein (đại diện cho nhóm

Isoflavon), luteolin, myricetin

- Đối tượng mẫu phân tích là các loại thực phẩm chức năng chứa các chất

nhóm flavonoid như trên và một số thực phẩm có nguồn gốc đậu nành

- Các mẫu phân tích được lấy ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội

- Địa điểm tiến hành thí nghiệm tại labo hóa – viện kiểm nghiệm quốc gia

2.2.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu

- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm)

- Tiền cột C18 Symmetry Waters (20mm x 3,9mm; 5µm)

- Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01g (XT1200c, Swiss); cân phân tích có

độ chính xác 0,0001g và 0,00001g (Mettler Toledo)

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy rung siêu âm (Elma, Germany),máy ly tâm

- Hệ thống chiết pha rắn SPE (Supelco), Cột chiết pha rắn C18-E (500mg,

- Vial 1,8ml (Agilent) đựng dịch chiết mẫu

Commented [L4]: Thay mục này bằng mục tiêu dung NC ở trên

Commented [L5]: Nếu có hình hệ HPLC thì đưa vào đây và bình

luận 1 chút về ưu điểm /đặc điểm của nó, nếu có thể

Các dung môi: Methanol, n-hexan, acetonitril và nước cất 2 lần

Các hóa chất: acid formic, natri format, natri hydroxyd, acid acetic, THF

Các loại hóa chất, thuốc thử phải đạt yêu cầu dùng cho HPLC

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 0,01mg từng lượng chất chuẩn trên cân

phân tích vào cốc có mỏ 50ml, hòa tan bằng methanol và chuyển vào bình định mức

50ml, định mức bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ Bảo quản trong điều kiện

lạnh

Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: Hút 2ml dung dịch chuẩn gốc rutin,

ECG, EGCG Hút 1ml các dung dịch chuẩn gốc khác cho vào bình định mức 20ml,

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Đối tượng mẫu: Các sản phẩm có nguồn gốc đậu tương như (sữa đậu nành,

mầm đậu nành, bột đậu nành) và thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ trong việc

giảm cân, làm đẹp, tăng cường sinh lực

- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

- Địa điểm: trên địa bàn nội thành Hà nội

- Khối lượng mẫu lấy: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/mẫu

- Bảo quản và lưu trữ mẫu: Điều kiện thường

Nhóm Flavonoid là hợp chất trong phân tử có khung Cacbon cồng kềnh,

không phân cực, khối lượng phân tử lớn do đó nếu sử dụng phương pháp sắc ký khí

thường khó bay hơi, chất phân tích cần phải được dẫn xuất hóa chuyển về dạng hợp

chất dễ bay hơi và bền nhiệt Nếu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp

detector khối phổ thì trang thiết bị đắt tiền, chi phí khấu hao lớn, yêu cầu kỹ thuật

phân tích cao Mặt khác trong thực phẩm chức năng nếu có mặt sẽ ở nồng độ lớn do

đó phù hợp với tách bằng sắc ký lỏng sử dụng dectecter PDA Do vậy, chúng tôi

tiến hành xác định hàm lượng một số Flavonoid trong thực phẩm và thực phẩm

chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- PDA) Đây là

phương pháp hiện đại, có độ tin cậy cao, có tính ứng dụng rộng rãi

Nguyên lý: Các Flavonoid được tách ra khỏi nền mẫu bằng methanol, thủy

phân ở nhiệt độ cao Sau đó ly tâm tách lấy dịch chiết, định lượng bằng kỹ thuật sắc

ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector PDA

2.3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Các mẫu trước khi đi phân tích sẽ được đồng nhất, chúng tôi chia thành hai

nhóm mẫu: mẫu thực phẩm và mẫu thực phẩm chức năng Quy trình xử lý mẫu sơ

bộ

Commented [L8]: Dẫn xuất ở bước nào?

Commented [L9]: Trước khi vào các mục nhỏ, nên giới thiệu

mẫu sẽ được xử lý qua các giai đoạn nào, bước nào cần cho mẫu gì, sau đó mới chi tiết các bước ra Để thế này cứ thấy rối và ko theo dõi được đối với 1 loại mẫu cụ thể nào đó

Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến

a Đồng nhất mẫu:

- Đối với mẫu thực phẩm:

+ Với các mẫu thực phẩm dạng lỏng: lắc đều trước khi lấy

+ Với các mẫu thực phẩm dạng rắn: được xay nghiền mịn và đồng nhất

- Đối với các mẫu thực phẩm chức năng:

+ Với các mẫu dạng rắn: nghiền nhỏ, trộn đồng nhất

+ Với viên nén: lấy 20 viên nén, cân trên cân phân tích có độ chính xác đến

0,0001g để tính khối lượng trung bình viên Đồng nhất mẫu bằng cách nghiền mẫu

thành bột, trộn đều

+ Với viên nang cứng: lấy 20 viên nang cứng, cân trên cân phân tích có độ

chính xác đến 0,0001g, tháo bỏ vỏ nang, phần bột trộn đều để đồng nhất Phần vỏ

nang lau sạch, cân vỏ nang để tính khối lượng trung bình viên

+ Với viên nang mềm: Lấy 20 viên nang mềm, cân trên cân phân tích có độ

Đồng nhất - Cân mẫu

HPLC

Ly tâm

Bình định mức 50ml

Commented [L10]: Có phải quy trình chung ko, nếu đúng thì nên

đưa lên đầu tiên của phần xử lý mẫu rồi bình luận 1 chút như đã comments

chính xác đến 0,0001g, tháo vỏ nang, phần dịch trong nang được trộn đều đồng

nhất Phần vỏ nang dùng ether để rửa, để khô tự nhiên cho đến khi hết mùi ether,

cân khối lượng của vỏ nang để tính khối lượng trung bình viên

b Phương pháp chiết trực tiếp:

- Áp dụng với các đối tượng mẫu là các sản phẩm thực phẩm chức năng dạng

bổ sung trực tiếp các chất nhóm flavonoid đã được tinh chế

- Dựa trên khả năng tan của các chất phân tích và tham khảo nhiều bài báo,

nghiên cứu, chúng tôi khảo sát các loại dung môi để chiết mẫu là các dung dịch

methanol/ nước với các tỷ lệ 90/10,80/10,70/10,60/10

- Cân chính xác khoảng 0,5-1g mẫu trên cân phân tích vào ống ly tâm 50ml

Thêm khoảng 30ml dung môi chiết, lắc đều, rung siêu âm 15 phút, ly tâm với tốc độ

6000vòng/5phút Gạn lấy phần dịch trên vào bình định mức 50ml, phần cặn đem

rung siêu âm lần 2 với 15ml dung môi chiết và tiến hành ly tâm như lần một Gộp

dịch chiết và định mức bằng dung môi chiết đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc

0,45µm, phân tích trên HPLC

- Với sản phầm dạng lỏng: Hút chính xác 10-15ml cho vào ống ly tâm 50ml

Thêm khoảng 30ml dung môi chiết, lắc đều, rung siêu âm 15 phút, ly tâm với tốc độ

6000vòng/5phút Gạn lấy phần dịch trên vào bình định mức 50ml, định mức bằng

dung môi chiết đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm, phân tích trên HPLC

c Phương pháp xử lý mẫu xác định các chất Flavonol Aglycon:

- Áp dụng với các đối tượng mẫu là các sản phẩm thực phẩm chức năng có

nguồn gốc thảo dược

- Sử dụng quá trình xử lý mẫu của phương pháp AOAC 2008.07: Cân chính

xác khoảng 1-2g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml có nắp kín, thêm 35 ml

dung dịch Ethanol : H2O : HCl đặc (50 :20 :8), đậy kín nắp, lắc đều Thủy phân

trong 60 phút tại nhiệt độ 900C, sau đó để nguội và ly tâm 6000 vòng/phút trong 5

phút, gạn lấy phần dịch trong phía trên Thêm 10 ml methanol vào phần cặn, lắc đều

trong 1 phút rồi đem ly tâm, gộp phần dịch trong cho vào bình định mức 50ml, định

mức bằng methanol Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm, phân tích trên HPLC

d Phương pháp xử lý mẫu xác định các chất Isoflavon:

Commented [L11]: Các tiêu đề, dù nhỏ cũng nên có format khác

để chú ý vói người đọc, và thống nhất giữa các phần khác nhau

- Áp dụng với các đối tượng mẫu là các sản phẩm thực phẩm (thường là các

loài thuộc họ Đậu) chứa các chất thuộc nhóm Isoflavon

- Dựa trên khả năng tan của các chất phân tích, cấu tạo, thành phần của nền

mẫu nghiên cứu và tham khảo nhiều bài báo, chúng tôi tiến hành thử nghiệm chiết

mẫu là bột đậu nành với các dung dịch methanol, ethanol và acetonitrile nồng độ

80% và sử dụng 2 phương pháp chiết mẫu có thêm acid clohydric vào quá trình

thủy phân và không thêm acid clohydric vào quá trình thủy phân mẫu

- Cân chính xác khoảng 1-2g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml có

nắp kín, thêm 35 ml dung dịch chiết mẫu, đậy kín nắp, lắc đều Thủy phân trong 2

giờ tại nhiệt độ 800C, sau đó để nguội và ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, gạn

lấy phần dịch trong phía trên Thêm 10 ml dịch chiết vào phần cặn, lắc đều trong 1

phút rồi đem ly tâm, gộp phần dịch trong cho vào bình định mức 50ml, định mức

bằng acetonitril Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm, phân tích trên HPLC

- Với sản phầm dạng lỏng: Hút chính xác 10ml cho vào ống ly tâm 50ml

Thêm khoảng 25ml dung dịch chiết và tiến hành như trên

Theo quy định của USFDA, AOAC, USP các thông số cần thẩm định bao gồm

các yếu tố chính sau:

1 Tính đặc hiệu, tính chọn lọc; (Specifility/Selectivity)

2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn; (Linearity and Calibration)

3 Giới hạn phát hiện; (Limit of Detection – LOD)

4 Giới hạn định lượng; (Limit of Quatification – LOQ)

5 Độ đúng; (Trueness)

6 Độ chụm; (Precision)

Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào: Kỹ thuật áp dụng, yêu

cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thí nghiệm, trong phạm vi

và thời gian nghiên cứu, chúng tôi thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương

pháp thông qua việc đánh giá các thông số: Tính chọn lọc, khoảng tuyến tính và

đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng (thông qua hiệu

(trueness)+ độ chụm (precision)

2.4.1 Tính đặc hiệu và chọn lọc

- Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp

chất khác như tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự tạp chất… Cụ thể,

trong phép phân tích định tính đó phải chứng minh được kết quả là dương tính khi

có mặt chất phân tích và âm tính khi không có mặt chất phân tích mà có mặt các tạp

chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là

khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả

các yếu tố khác nhằm hướng tới kết quả chính xác nhất.Tính đặc hiệu thường liên

quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích

- Tính chọn lọc là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến phân tích

một số hoặc nhiều chất trong chung một quy trình Nếu chất cần phân tích xác định

rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc Như vậy, tính chọn

lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu do các phương pháp phân tích thường có nhiều

chất cùng xuất hiện nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn

- Cách thực hiện: Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp cần bố

trí tiến hành thí nghiệm như sau:

+ Phân tích mẫu trắng, lặp lại tối thiểu 6 lần với từng loại nền mẫu Mẫu trắng phải

không được cho tín hiệu chất phân tích

+ Phân tích mẫu thử hoặc mẫu thêm chuẩn, lặp lại tối thiểu 6 lần Mẫu thêm chuẩn

hoặc mẫu thử phải có tín hiệu chất phân tích

2.4.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới

hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tương ứng với nồng độ chất phân tích

có mặt trong nền mẫu

• Cách xác định khoảng tuyến tính:

Để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (thường là 6) nồng độ

khác nhau, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát

sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng

Commented [L13]: Có cần mục này ở đây ko, đây hoàn toàn là

lý thuyết, mà ở đây chương 2 là thực nghiệm, nếu ko nêu ngắn gọn sự cần thiết để dẫn vào cách làm thôi

độ và quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Khoảng tuyến tính

dài hay ngắn phụ thuộc và nhiều yếu tố trong đó quan trọng nhất là bản chất của

chất phân tích và kỹ thuật sử dụng Các chất khác nhau có khoảng tuyến tính khác

nhau do sự khác nhau về tính chất lý hóa

• Xây dựng đường chuẩn:

Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ

số hồi quy tương quan Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn

ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn

bộ khoảng tuyến tính Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao

nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn

Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ

thuật khác nhau, sau đây là các loại đường chuẩn chủ yếu:

Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết:

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn, xác định các giá trị tín hiệu y đo được tương

ứng với nồng độ x Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có khảo sát đường biểu diễn

là một phương trình đường thẳng: y = ax + b

Trong đó: a là giá trị độ dốc slope

b là giá trị hệ số chặn intercept

Hình 2.2 Đồ thị tương quan giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích

Đường chuẩn trên nền mẫu trắng

Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ khác nhau, trong khoảng

Commented [L14]: Đóng mở ngoặc với tiếng Anh

tuyến tính ước lượng ở trên Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu đo nồng độ Đường

chuẩn xây dựng trên nền mẫu trắng thường cho độ tin cậy cao hơn so với xây dựng

trên chuẩn tinh khiết vì có thể loại trừ phần nào các ảnh hưởng của nền mẫu Tuy

nhiên nhiều trường hợp khó tìm được nền mẫu trắng phù hợp và không có chất phân

tích Do đó, có thể sử dụng phương pháp lập đường chuẩn trên nền mẫu thực

Đường chuẩn trên mẫu thực:

Phân tích mẫu thực có cho thêm các nồng độ chuẩn khác nhau tương tự

như trong phần làm với mẫu trắng Vẽ đường cong tín hiệu đo (trục tung y) phụ

thuộc vào nồng độ chuẩn thêm, dạng đường chuẩn trên nền mẫu thực thường có

dạng như hình dưới:

Hình 2.3 Đường chuẩn trên nền mẫu thực

Khi sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực có thể loại trừ được các

ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Sau khi lập được phương trình

đường chuẩn y = ax + b, có thể dễ dàng tính được nồng độ X = b/a

• Các lưu ý khi xây dựng đường chuẩn:

- Cần đảm bảo nồng độ chính xác: Đường chuẩn là yếu tố quyết định sự đúng đắn

của kết quả phân tích, do đó nếu trong quá trình xây dựng đường chuẩn mắc những

sai số lớn sẽ dẫn đến sự mất chính xác của kết quả Để kiểm soát được nồng độ

chuẩn, điều đầu tiên là kiểm soát được chất chuẩn (chất chuẩn mua từ nhà sản xuất)

về hàm lượng, độ tinh khiết, hạn sử dụng Trong quá trình chuẩn bị chuẩn để xây

Commented [L15]: Có các kiểu đường chuẩn rồi, có cần mục

này nữa ko?

dựng đường chuẩn, cần tiến hành cẩn thận, chính xác

- Tín hiệu đo của nồng độ phải có độ lặp đạt yêu cầu, nghĩa là phương pháp có độ

chọn lọc, không bị lẫn tạp, đồng thời độ ổn định của thiết bị cao

- Loại trừ sai số thô nếu cần thiết: Một số trường hợp, có thể gặp các sai số thô

(ngẫu nhiên) xuất hiện trong phân tích dẫn đến việc đường chuẩn xây dựng không

đáp ứng yêu cầu Trong trường hợp này, có thể cân nhắc loại trừ những điểm này để

đảm bảo sự chính xác

• Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

- Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ tiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu

là hệ số tương quan hồi quy, R phải đạt theo yêu cầu sau:

0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1

- Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi xây dựng đường

chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm

chuẩn sử dụng xây dựng đường chuẩn, tính giá trị độ chệch theo công thức sau:

C C C c c

i−

Trong đó: Δi: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng để xây dựng đường chuẩn

Ci: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

Theo quy định của các tổ chức của Mỹ, Canada, châu Âu, giá trị độ chệch

không được vượt quá ±15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOD có thể

chấp nhận giới hạn ±20%

2.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

• Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác

định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm

cụ thể Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu mà hệ thống có thể

phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại

Commented [L16]: Thường là R2

đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3)

Cách xác định: Phân tích mẫu (có thể thực hiện trên mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại 4 lần Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3

Hình 2.4: Xác định LOD bằng cách tính S/N

• Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà tại đó ta có thể định lượng được bằng phương pháp phân tích và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng

Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ phụ thuộc vào từng phương pháp, kỹ thuật và điều kiện trang thiết bị cụ thể mà lựa chọn phương pháp xác định, tính toán cho phù hợp

Cách xác định: Trong sắc ký, có thể xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu chất phân tích và nhiễu đường nền LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích

mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10)

Do đó, có thế tính LOQ từ LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD