Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học dùng trong môi trường ao nuôi giúp giảm ô nhiễm môi trường phòng bệnh xuất huyết trên cá rô phi do streptococcus agalactiae

Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học dùng trong môi trường ao nuôi giúp giảm ô nhiễm môi trường phòng bệnh xuất huyết trên cá rô phi do streptococcus agalactiae Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học dùng trong môi trường ao nuôi giúp giảm ô nhiễm môi trường phòng bệnh xuất huyết trên cá rô phi do streptococcus agalactiae luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Tiến hành thu thập mẫu nước ao nuôi được lấy từ các ao nuôi cá khỏe mạnh, không bị bệnh và ở giai đoạn cuối của quá trình nuôi (ao đã nuôi cá đƣợc 5-8 tháng) tại các vùng Nam Định, Hải Phòng, Hải Dương, Bắc Ninh, Hưng Yên Mẫu đƣợc đựng trong ống falcol đã khử trùng bảo quản lạnh trong thùng bảo ôn trong quá trình đƣa mẫu từ thực địa về phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập trong vòng 48h đối với các mẫu ở phía Bắc Một số mẫu phía Nam thì bảo quản lâu hơn 3-5 ngày

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus

Phân lập vi sinh vật và nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để mọc thành các khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt riêng Lấy 10ml mỗi mẫu đƣợc đun nóng ở 80 0 C trong 30 phút kết hợp lắc nhẹ, để nguội về nhiệt độ phòng rồi tiến hành pha loãng và trải trên đĩa môi trường thạch NA sao cho thu được các khuẩn lạc đơn Các đĩa môi trường thạch sau đó được ủ ở 37 0 C trong 24 giờ Các khuẩn lạc đơn có hình thái khác nhau đƣợc tách riêng và làm thuần bằng cách cấy ria lặp lại nhiều lần từ 1 khuẩn lạc đơn trên môi trường NA Sau đó chọn các khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyển sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa a Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc

Lấy một vòng que cấy khuẩn lạc trên ống thạch nghiêng, gạt 3-4 lần trên mặt thạch NA ở một góc Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria từ một vạch thành 3-4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa vi khuẩn dính trên que cấy Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy Đặt mẫu ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ để chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ

Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không) b Phương pháp nhuộm gram

Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau

Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị rửa trôi khi xử lý cồn Vi sinh vật có phức chất này thuộc gram dương

Loại phức chất thứ hai không giữ đƣợc màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật này thuộc gram âm c Thử phản ứng Cata ase

Nhỏ dung dịch H2O 2 3% trực tiếp lên sinh khối tế bào vi khuẩn kết hợp nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào vi khuẩn cũng nhƣ sự bắt màu gram để lựa chọn chủng và tiến hành sàng lọc

2.2.3 Tuyển chọn chủng giống a Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào

Nguyên tắc: Enzyme tác động với cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng phân giải cơ chất xung quanh khuẩn lạc Đường kính của vòng phân giải cơ chất phản ánh hoạt tính của enzyme

Phương pháp tiến hành: Dùng que cấy lấy một lượng khuẩn lạc của chủng vi khuẩn được chọn cấy chấm điểm lên đĩa môi trường NA có bổ sung từng loại cơ chất: 1% tinh bột tan, 1% CMC, 1% casein, 1% xylan tương ứng cho khả năng sinh các enzyme amylase, cellulase, protease và xylanase Ủ các đĩa khảo sát ở 37 0 C trong vòng 24h và quan sát vòng phân giải trên đĩa b Thử nghiệm khả năng khử NO 2 -

Dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn đƣợc kiểm tra khả năng khử NO2

- sử dụng phương pháp Griess

Nguyên lý: phương pháp này được áp dụng để xác định nồng độ khối lƣợng của NO2

- có mặt trong môi trường Màu hồng của dung dịch có độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 520 nm, hình thành bởi dung dịch NO2

- tác dụng với thuốc thử axit sulfanilic và α-naphtylamin trong môi trường axit c Thử nghiệm khả năng khử NH 4

Dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn đƣợc kiểm tra khả năng khử NH4 + sử dụng phương pháp Nesstle

- Nguyên lý: Trong môi trường bazơ mạnh NH4

NH 3 mới hình thành và sẵn có trong nước tác dụng với Nesstle tạo phức màu vàng hoặc nâu

- Phương pháp chỉ được áp dụng với lượng amoni rất nhỏ 0,1mg/l

2 K2HgI4 + NH3 + 3 KOH  Hg(HgIONH2) + 7KI + 2H2O

K 2 HgI 4 + NH 3 + KOH  Hg(HgI 3 NH 2 ) + 5KI + H 2 O

- Dùng muối xenhet cho vào nước phân tích để các muối này kết hợp với các ion gây nhiễu hình thành các hợp chất tan, không màu trong dung dịch d Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với sinh sinh v t kiểm định bằng phương pháp đục lỗ thạch

Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường thạch, những nơi nào có chất ức chế khuếch tán thì vi sinh vật kiểm định không sinh trưởng được và tạo thành vòng vô khuẩn xung quang lỗ thạch

- Cấy chủng vào môi trường nutient broth, nuôi cấy lắc

- Sau 24h, lọc dịch nuụi cấy qua màng lọc 0.22 àm thu lấy dịch trong

- Lấy dịch nuôi vi khuẩn kiểm định có nồng độ tế bào 10 6 CFU/ml, trải lên bề mặt môi trường đĩa thạch blood agar Để khô và đục lỗ

- Nhỏ dịch trong sau lọc vào lỗ thạch sao cho dịch không trà ra ngoài miệng lỗ

- Cất tủ lạnh từ 2-4h cho dihcj trong khuếch tán vào môi trường thạch

- Cất tủ ấm 37 0 /24h, đọc kết quả Và đo kích thước vòng vô khuẩn

2.2.4 Định danh chủng giống a Định danh bằng kít sinh hóa

- Chọn khuẩn lạc thuần, nuôi cấy 18-24h đối với nhóm Bacillus

- Trải đều sinh lý lên khay đựng strip, bóc strip đặt vào khay

- Mở ống môi trường 50 CHB/E, thu khuẩn lạc đã chọn vào môi trường phù hợp tương ứng độ độ 2 McFarlank Sử dụng ngay

- Lần lượt nhỏ ống môi trường có chứa khuẩn lạc đã thu vào các giếng đầy đến vạch quy định (~150àl), trỏnh tạo bọt trong cỏc giếng

- Đậy khay đặt vào tủ nuôi 37 o C, đọc kết quả sau 24h, 48h bằng phần mềm Web API do nhà sả xuất cung cấp b Định danh bằng sinh học phân tử

- Ly tâm 1.5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào

- Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE (TE buffer: 15 mM Tris-HCl +1 mM EDTA (pH 7,5)

- Thêm 0,4 mg lysozym Trộn đều, ủ 37 0 C/1 giờ Trộn đều 3 phút

- Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 37 0 C/30 phút

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều Ly tâm 15000v/p, 15phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 8 l ARNaza 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37 0 C trong 30 phút

- Thêm 12 l proteinaza K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 56 0 C

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều Ly tâm 15000v/p, 15phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 1 thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15000v/p, 15phút Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác

- Thêm 1/10 V Natri axetat 3M và 1ml Etanol 100%, đảo trộn Đặt trong đá 30 phút Ly tâm 15000v/p trong 15 phút Bỏ lớp dịch trên

- Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không

- Hoà tan ADN trong 50-100l nước hoặc TE

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml)

20 phút vớt ra Quan sát trên máy soi gel

- Phản ứng khuếch đại ADN

950C - 30giây 560C - 15 giây 30 chu kỳ 720C - 1 phút

- Sản phẩm PCR đƣợc gửi đi tinh sạch và giải trình tự Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh đƣợc so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST c Phương pháp thử khả năng đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vuông góc

Phương pháp đối kháng trực tiếp được sử dụng để đánh giá đặc tính đối kháng của các chủng vi khuẩn dự kiến lựa chọn trong đề tài

Cấy ria 2 chủng trên cùng 1 đĩa petri Đường ria thứ nhất là chủng 1 Đường ria thứ 2 làm chủng cần thử đối kháng Đường ria thứ 3 cắt cả đường ria

33 số 1 và số 2 Hai chủng đối kháng nhau khi tạo thành vùng không có vi sinh vật phát triển tại những điểm giao nhau, khuẩn lạc cạnh nhau khó phát triển đƣợc bình thường.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trường của B subtilis SHV27

2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của B subtilis SHV27

Chủng đƣợc khảo sát trên quy mô bình tam giác 1 lít

Môi trường NB pha 8g/ lít hấp khử trùng 121 0 C/15 phút

Nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ (30 0 C, 35 0 C, 37 0 C, 40 0 C), lắc 150 vòng/phút

Lấy mẫu xác định mật độ tế bào trong canh trùng nuôi cấy ở các giờ khác nhau (8h; 12h; 16h; 20h; 24; 28h; 32h; 36h) để xác định mật độ tế bào

Lặp lại thí nghiệm 3 lần

2.3.2 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của B subtilis SHV27

Môi trường NB pha 8g/ lít ở các điều kiện pH khác nhau (pH= 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0) hấp khử trùng 121 0 C/15 phút

Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 37 0 C, lắc 150 vòng/ phút

Lấy mẫu xác định mật độ tế bào trong canh trùng nuôi cấy ở các giờ khác nhau (8h; 12h; 16h; 20h; 24; 28h; 32h; 36h ) để xác định mật độ tế bào

2.3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khác nhau đến sinh trưởng của B subtilis SHV27

Môi trường dinh dưỡng khảo sát là NB pha 8g/ lít ở điều kiện pH = 7,5 và môi trường MT1 ở điều kiện pH= 7,5 hấp khử trùng 116 0 C

Nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ 37 0 C, lắc 150 vòng/ phút

Lấy mẫu xác định mật độ tế bào trong canh trùng nuôi cấy ở các giờ khác nhau (8h; 12h; 16h; 20h; 24; 28h; 32h; 36h; 42h) để xác định mật độ tế bào

2.3.4 Ảnh hưởng của lưu lượng khí vào đến sinh trưởng của B subtilis SHV27

Sau khi tối ƣu trên bình tam giác, tiến hành nuôi cấy trên thiết bị 5 lít và khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng khí đến sinh trưởng của vi sih vật

Môi trường MT1, pH= 7,5 hấp khử trùng 116 0 C

Nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ 37 0 C, lắc 150 vòng/ phút

Lấy mẫu xác định mật độ tế bào trong canh trùng nuôi cấy ở các giờ khác nhau ( 8h; 12h; 16h; 20h; 24; 28h; 32h; 36h) để xác định mật độ tế bào

2.3 Khảo sát sinh trưởng của B licheniformis SHV43 và B pumilus SHV52

Do điều kiện thời gian, nên sau khi xác định đƣợc điều kiện lên men của

B.subtilis SHV27, áp dụng các điều kiện lên men của B subtilis SHV27 để khảo sát thời gian nuôi 2 chủng còn lại là B licheniformis SHV43 và B pumilus

SHV52 trên hệ thống lên men 5 lít.

Tạo chế phẩm

Sau khi lên men, tiến hành ly tâm với tốc độ 4000v/ 30 phút ở nhiệt độ 4 -

10 0 C để thu sinh khối vi khuẩn

2.4.2 Chọn chất mang và tạo chế phẩm

Sau khi lên men, tiến hành ly tâm với tốc độ 4000v/ phút và thu sinh khối Sinh khối thu được phối trộn với tá dược là tinh bột sắn, đường maltodextrin và sấy khô ở 45-50 0 C đến khi độ ẩm đạt dưới 8%

Dựa vào đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và mục tiêu nghiên cứu chế phẩm, tiến hành xây dựng công thức chế phẩm Để xác định nồng độ tế bào từng loại có trong chế phẩm dựa vào khả năng ức chế S.agalactiae của các chủng ở các nồng độ khau

- Bể 1: Bể dung tích chứa 500 lít bổ sung 400 lít nước sạch + bổ sung nồng độ S.agalactiae trong bể là 10 3 CFU/ml + nồng độ nguyên liệu bổ sung

- Bể 4: Bể dung tích chứa 500 lít bổ sung 400 lít nước sạch + bổ sung nồng độ S agalactiae trong bể là 10 3 CFU/ml, khôn

- g bổ sung nguyên liệu vi sinh làm đối chứng

Lấy mẫu kiểm tra nồng độ tế bào S.agalactiae sau 24h bổ sung

Tương tự, thiết kế thí nghiệm với 2 nguyên liệu còn lại B.licheniformis SHV43 và B pumilus SHV52

2.4.3 Khảo sát độ ổn định của chế phẩm

Thử nghiệm dài hạn: là thử nghiệm bảo quản chế phẩm trong điều kiện thực, toàn bộ các chỉ tiêu chất lƣợng theo tiêu chuẩn đều đƣợc đánh giá kéo dài theo thời gian đến khi chế phẩm không còn đáp ứng chất lƣợng đề ra Thử nghiệm chế phẩm có nghĩa xác định tuổi thọ chính xác của chế phẩm Thử nghiệm dài hạn: tối thiểu 3 lô Thử nghiệm dài hạn: 3 tháng/lần Điều kiện bảo quản: Nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Thời gian khảo sát tối thiểu: 30 tháng

Thời gian bắt đầu thử nghiệm là thời gian cho chế phẩm vào thiết bị thử nghiệm Thời gian kết thúc thử nghiệm là thời gian một trong các chỉ tiêu không đạt hoặc đến thời điểm hết hạn sử dụng của chế phẩm

Dựa vào kết quả nghiên cứu của các lô, xác định tuổi thọ của sản phẩm theo kết quả nào có tuổi thọ ngắn hơn

Nếu chế phẩm sản xuất trước ngày đặt mẫu một tháng trở lên thì khi tính kết quả phải cộng thêm thời gian này vào tuổi thọ của sản phẩm

Xác đinh mật độ tế bào bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc

Đánh giá hiệu quả sản phẩm

2.5.1 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến nồng độ

NO 2 - , NH 4 + và tăng trọng của cá Để đánh giá hiệu quả của chế phẩm khi bổ sung ở các nồng độ khác nhau, trong điều kiện phòng thí nghiệm, đƣợc thiết kế gồm 5 bể, mỗi bể có dung tích chứa 500 lít

Bể 1: 400 lít nước + 50 con cá, không bổ sung chế phẩm làm đối chứng

Bể 2: 400 lít nước + 50 con cá + bổ sung chế phẩm liều 500 gram/ 1000m 3

Theo dõi chỉ tiêu vi sinh, chỉ số NO2

+, hàm lƣợng Streptococcus sp trong bể các ngày 0 ngày (trước khi bổ sung chế phẩm) Định kì lấy mẫu kiểm tra

7 ngày/ lần và theo dõi trong thời gian 2 tháng

Cân tổng trọng lƣợng cá đầu vào, chia trung bình đến khi kết thúc thí nghiệm định kì 7 ngày/ lần Lặp lại thí nghiệm 3 lần

2.5.2 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến khả năng ức chế Streptococcus agalactiae HV-Strep O2 Để đánh giá hiệu quả của chế phẩm khi bổ sung ở các nồng độ khác nhau trong việc ức chế vi khuẩn gây bệnh, trong điều kiện phòng thí nghiệm, đƣợc thiết kế gồm 4 bể; Mỗi bể có dung tích chứa 500 lít được lấy 400 lít nước + 50 cá rô phi đơn tính trọng lƣợng trung bình 40 - 42 gram

Hàm lƣợng vi khuẩn kiểm định HV-Strep O2 bổ sung vào bể là

Theo dõi hàm lượng Streptococcus sp trong bể các ngày 0 ngày (trước khi bổ sung sản phẩm), 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày

+ Bể 1: Đối chứng nước có cá + HV-Strep O2, không bổ sung chế phẩm + Bể 2: Nước có cá + HV-Strep O2, bổ sung chế phẩm nồng độ 500 gram/ 1000m3

+ Bể 3 Nước có cá + HV-Strep O2, bổ sung chế phẩm nồng độ 1000 gram/ 1000m3

+ Bể 4 Nước có cá + HV-Strep O2, bổ sung chế phẩm nồng độ 2000 gram/ 1000m3.

Phương pháp phân tích

2.6.2 Phương pháp xử lý số liệu

- Phương pháp thống kê, tổng hợp, phân tích;

- Phương pháp so sánh, đối chiếu

- Các số liệu thu đƣợc từ quá trình nghiên cứu đƣợc ghi chép lại và xử lý trên phần mềm excel 2016

NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học mạnh

Để xử lý được ô nhiễm môi trường ao nuôi, các chủng vi khuẩn được lựa chọn phải có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ dƣ thừa, thức ăn, phân của động vật thủy sản thải ra, đồng thời ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh trong ao nuôi Do đó, sau quá trình phân lập, các chủng sẽ đƣợc tiến hành các phép thử để khảo sát và sàng lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào nhƣ amylase, protease, cellulase, xylanase cũng nhƣ khả năng khử các độc tố gây hại cho vật nuôi nhƣ NH4

+, NO 2 - và khả năng sinh chất kháng khuẩn kháng S.agalactiae

Bảng 3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học của chủng giống

Vòng phân giải cơ chất enzyme (mm)

TB Casein Xylan CMC NH4

Ghi chú: (+ ) có vòng vô khuẩn nhưng nhỏ, không đo được

Kết quả bảng 3.2 cho thấy, đa phần các chủng Bacillus khảo sát đều có hoạt tính sinh enzyme, đặc biệt là amylase, protease và cellulase Có thể đây là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus để chúng thích nghi và tồn tại với điều kiện môi trường sống phức tạp Đồng thời mẫu phân lập từ môi trường ao nuôi cá ở các giai đoạn cuối khỏe mạnh do đó trong ao đã tồn tại 1 hệ vi sinh có lợi cho môi trường nuôi Đã có rất nhiều nghiên cứu công bố về khả năng sinh enzyme ngoại bào của các vi khuẩn Bacillus và enzyme xylanase ít đƣợc phát hiện hơn các enzyme còn lại Khả năng khử NH4

- thường được biết đến qua vai trò của nhóm vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter, tuy nhiên quá trình kiểm tra cũng phát hiện thấy rất nhiều chủng Bacillus có khả năng khử NH 4 + , NO 2 - [46]

[47] Hoạt tính sinh chất kháng khuẩn là 1 đặc tính sinh học cũng thường thấy trong nhóm vi khuẩn Bacillus Ở đây cũng phát hiện thấy một số chủng sinh chất kháng khuẩn kháng vơi vi khuẩn kiểm định S.agalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi

3.2.1 Tuyển chọn khả năng sinh enzyme ngoại bào

Nhƣ chúng ta đã biết, thành phần chủ yếu trong thức ăn chăn nuôi là protein (bột cá, bột xương, bột đậu nành), xơ thô và tinh bột … Trong quá trình cho ăn, 1 lượng cám nhất định sẽ bị thất thoát trong nước Hơn nữa, khả năng hấp thu thức ăn của cá chỉ đạt 70%, phần còn lại sẽ được thải ra ngoài môi trường qua phân Đó chính là 2 nguyên nhân chính dẫn đến việc ô nhiễm môi trường nước ao nuôi Chính vì thế khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, xylanase) của các chủng probiotic có vai trò rất quan trọng, nhằm chuyển hóa thức ăn dƣ thừa, phân của động vật thủy sản trong ao nuôi thành các nguồn dinh dƣỡng dễ tiêu hóa hơn cho động vật phù du để hạn chế sự ô nhiễm của môi trường nước Đây là một trong những tiêu chí quan trọng để chọn được chủng vi sinh vật làm chế phẩm

Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme đã chọn ra đƣợc 6 chủng vi khuẩn có khả năng sinh đầy đủ các hoạt tính enzyme quan tâm để đƣa vào các sàng lọc tiếp theo là SHV27, SHV31, SHV43, SHV52, SHV54 và SHV58

3.2.2 Tuyển chọn khả năng sinh chất kháng khuẩn kháng S.agalactiae Để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, thì khả năng sinh chất kháng khuẩn, ức chế với vi khuẩn gây bệnh là một đặc tính rất quan trọng của các chủng vi sinh vật đƣợc chọn làm probiotic dùng trong thủy sản

Từ bảng 3.2, 13 chủng đƣợc lựa chọn có khả năng sinh chất kháng khuẩn, kháng mạnh với chủng vi khuẩn kiểm định HVStrep-O2 gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi với kích thước vòng 12 mm trở lên là các chủng SHV18; SHV21; SHV24; SHV27; SHV28; SHV31; SHV32; SHV33; SHV38; SHV43; SHV44; SHV52; SHV53 để làm các tuyển chọn tiếp theo

3.2.3 Tuyển chọn khả năng khử chất độc hại NO 2

Trong quá trình chuyển hóa các các chất hữu cơ, sẽ sản sinh ra các chất độc hại trong môi trường ao nuôi như NH4

- của các vi sinh vật gây thối Các chất độc hại này sẽ ức chế sự phát triển của động vật thủy sản hoặc gây chết hàng loạt nếu ở hàm lƣợng cao Do đó việc lựa chọn đƣợc những chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa NH4

+ ; NO 2 - giúp cân bằng chu trình chuyển hóa Nitơ trong môi trường ao nuôi, hạn chế được khí độc phát sinh là cần thiết

11 chủng có khả năng khử NO2

+ từ 50% trở lên là các chủng SHV03; SHV10; SHV11; SHV23; SHV27; SHV36; SHV39; SHV40; SHV43; SHV52 đƣợc sử dụng để tiếp tục sàng lọc

Như vậy, qua 3 bước sàng lọc và tuyển chọn các đặc tính probiotic của các chủng Bacillus sp trong điều kiện in-vitro, thu đƣợc 23 chủng giống có các đặc tính nổi trội về khả năng sinh enzyme, khả năng sinh chất kháng khuẩn và khả năng khử khí độc có tiềm năng dùng làm probiotic trong nuôi trồng thủy sản Trong đó nhận thấy có 3 chủng là hội tụ đầy đủ các đặc tính tốt nhất là SHV27, SHV43 và SHV52 Do đó, 3 chủng SHV27, SHV43 và SHV52 đƣợc chọn để tiến hành nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tạo thành sinh khối tế bào, làm cơ sở tạo chế phẩm ứng dụng trong việc xử lý môi trường ao nuôi, hỗ trợ phòng bệnh xuất huyết do S agalactiae gây ra trên cá rô phi.

Định danh

3.3.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa a Hình thái các chủng đã tuyển chọn

Cả 3 chủng phân lập đƣợc đều là trực khuẩn, gram (+),

Hình 3.1 Hình thái của các chủng đã chọn (ở độ phóng đại 1000 lần đối với tế bào và bào tử)

(a): Hình thái tế bào chủng SHV27 (f): Hình dạng bào tử chủng SHV52

(b): Hình thái tế bào chủng SHV43 (g): Hình thái khuẩn lạc chủng SHV27 trên NA sau 24h

(c): Hình thái tế bào chủng SHV52 (h): Hình thái khuẩn lạc chủng SHV43 trên NA sau 24h

(d): Hình dạng bào tử chủng SHV27 (i): Hình thái khuẩn lạc chủng SHV52 trên NA sau 24h (e): Hình dạng bào tử chủng SHV43

Quan sát hình thái khuẩn lạc 3 chủng khảo sát thấy có sự khác nhau rõ rệt trên cùng 1 môi trường thạch NA

Chủng SHV27 dạng R, có viền nhám, bề mặt khô, nhân không rõ ràng, màu xám bạc, chấm nhân trắng đục, xung quanh nhân hơi trong

Chủng SHV43 là dạng vô định hình, nhân màu trắng đục, xung quanh xẻ thùy mạnh là những bọng nước rất nhớt

Chủng SHV52 dạng R, viền gọn, bề mặt hơi nhám, nhân trong, xung quanh nhân trắng đục b Đặc tính sinh hóa của các chủng Bacillus đã tuyển chọn

Sau khi kiểm tra các đặc điểm hình thái tế bào, khuẩn lạc trên môi trường đặc, tiến hành định danh các chủng đã chọn bằng kit sinh hóa API-50CHB để xác định tên loài phuc vụ cho quá trình nghiên cứu đặc tính nuôi cấy thu sinh khối

Bảng 3.4 Định danh bằng kít API 50CH các chủng Bacillus đã chọn

Kết quả Chủng SHV27 Chủng SHV43 Chủng SHV52

Ghi chú: (-): phản ứng không xảy ra; (+): có xảy ra phản ứng

Kết quả định danh bằng kít API chỉ ra 3 chủng lựa chọn thuộc 3 loài khác nhau Bacillus subtilis; Bacillus licheniformmis và Bacillus pumilus tương ứng kí hiệu chủng SHV27; SHV43 và SHV52 với độ tương đồng cao đều từ 99% trở lên Đây là 3 loài Bacillus điển hình trong đất, nước thường được sử dụng làm probitoic trong các chế phẩm sinh học

3.3.2 Phân loại các chủng Bacillus đã tuyển chọn bằng giải trình tự gen Để việc định danh tên loài chính xác hơn, kết hợp với phương pháp nhận diện sinh hóa tiến hành giải trình tự gen đoạn 16S rARN, DNA của chúng đƣợc trích ly và đoạn gen 16s RNA đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1492R để xác định chính xác tên loài của các chủng lựa chọn,

So sánh trình tự gen trên Blast-NCBI ta có kết quả trình tự gen 16s rARN nhƣ sau:

Bảng 3.5 Mối tương quan di truyền của các dòng vi khuẩn tuyển chọn có trong ngân hàng gen (NCBI)

Chủng Đại diện loài có quan hệ gần gũi Mã số Tỉ lệ tương đồng (%)

So sánh với trình 16s-ARN của loài vi khuẩn đã đƣợc định danh trong ngần hàng gen NCBI Kết quả cho thấy mức độ giống nhau của chủng SHV27

51 với loài Bacillus subtilis là 100% Kết quả này cho phép kết luận chủng SHV27 là loài Bacillus subtilis Tương tự chủng SHV43 là loài Bacillus paralicheniformis với độ tương đồng là 100% Chủng SHV52 là loài Bacillus pumilus với độ tương đồng là 99,93 %

Hình 3.2 Cây phân loại của các chủng SHV27

Hình 3.3 Cây phân loại của các chủng SHV43

Hình 3,4 Cây phân loại của các chủng SHV52

3.3.3 Tính đối kháng của chủng giống

Thử khả năng đối kháng của các chủng theo phương pháp ria vuông góc làm cơ sở cho việc tạo chế phẩm sinh học gổm 3 chủng vi khuẩn này,

SHV43 – SHV52 SHV27 – SHV52 SHV27 – SHV43

Hình 3,5 Tính đối kháng của chủng giống

Kết quả ria đối kháng từng cặp SHV43 với SHV52 ; SHV27 với SHV52 và SHV27 với SHV43 cho thấy 3 chủng này không có hiện tƣợng đối kháng nhau, các khuẩn lạc vẫn phát triển cạnh nhau một cách bình thường Đây là điều kiện thuận lợi cho việc tạo chế phẩm gồm hỗn hợp 3 chủng

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi sinh vật

Nhiệt độ nuôi cấy là một trong những yếu tố môi trường có ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất của vi sinh vật Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có khả năng sinh trưởng ở dải nhiệt độ khá rộng, nhưng hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ dao động từ 30-45 0 C Nhằm tìm đƣợc nhiệt độ tối ƣu cho chủng đã chọn phát triển tốt nhất, tiến hành nuôi chủng trên môi trường NB nuôi cấy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong bình tam giác với các mốc nhiệt độ khác nhau từ 30-45 0 C, Thu nhận mẫu sau các giờ nuôi cấy khác nhau và xác định nồng độ tế bào vi khuẩn Kết quả đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng sau:

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy chủng B.subtilis SHV27

Nồng độ tế bào 10 8 (CFU/ml)

40 1,15 ± 0,06 1,43 ± 0,08 1,49 ± 0,07 1,15 ± 0,04 Chủng Bacillus subtilis SHV27 cho mật độ tế bào cao nhất là 1,56 x10 8

CFU/ml sau 28 giờ nuôi ở nhiệt độ 37 0 C

3.4.2 Ảnh hưởng của pH đầu vào môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của vi sinh vật

Trị số pH ban đầu trong môi trường có vai trò quan trọng, góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn đồng hóa và tổng hợp các chất cần thiết Nên pH có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tạo thành sinh khối tế bào Do đó, pH là một trong những yếu tố quan trọng cần đƣợc nghiên cứu Với nhóm vi khuẩn Bacillus, pH từ 6,5-8,0 là khoảng pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng Chính vì vậy, để xác định ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khối tế bào của chủng Bacillus nghiên cứu, tiến hành nuôi cấy các chủng đã chọn trên môi trường NB với các điều kiện nhiệt độ tối ưu đã chọn ở trước, giá trị pH của môi trường ban đầu 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0 trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút, thời gian theo dõi ở các giờ khác nhau Kết quả đƣợc đánh giá qua hàm lƣợng vi khuẩn ở bảng sau:

Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH môi trường đầu vào chủng B.subtilis SHV27

Nồng độ tế bào 10 8 (CFU/ml) pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 7,5 pH = 8,0

Từ kết quả phân tích ở bảng 3.7 cho thấy: Chủng Bacillus subtilis SHV27 tuyển chọn sau 24 giờ nuôi cấy, hàm lƣợng vi sinh vật cao nhất 1,69 ×10 8 CFU/ml ở giá trị pH môi trường ban đầu là 7,5

Từ những phân tích trên nhận thấy để thuận lợi cho việc nuôi cấy và thu sinh khối tiến hành nuôi chủng Bacillus subtilis SHV27 đã tuyển chọn với môi trường nuôi cấy có giá trị pH ban đầu được điều chỉnh pH: 7,5

3.4.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của vi sinh vật Ảnh hưởng của dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy giữa Nutrient broth và môi trường MT1 do công ty Hanvet sản xuất

Bảng 3.8 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy chủng B subtilis SHV27

Nồng độ tế bào 10 8 (CFU/ ml)

Kết quả trên nhận thấy khi thành phần dinh dƣỡng đa dạng trong môi trường MT1 đã cải thiện đáng kể nồng độ tế bào trong quá trình nuôi cấy chủng

B.subtilis SHV27 Trong môi trường MT1 nồng độ tế bào là 10 9 CFU/ml trong khi trong môi trường NB chỉ đạt 10 8 CFU/ml Điều này có thể giải thích rằng trong môi trường NB, thành phần dinh dưỡng kém đa dạng chỉ có Meat extract trong khi môi trường MT1 do công ty Hanvet sản xuất có nguồn gốc từ đậu nành,

56 nước chiết cà chua, kết hợp dịch triết trùn quế với thành phần dinh dưỡng đa dạng nhƣ vậy giúp cho vi khuẩn phát triển tốt hơn Vì vậy MT1 đƣợc chọn làm môi trường để nuôi cấy thu sinh khối chủng Bacillus subtilis SHV27

3.4.4 Ảnh hưởng của lưu lượng khí vào đến sinh trưởng của vi sinh vật

Sau khi tối ƣu các điều kiện trên bình tam giác, để phục vụ cho quá trình sản xuất tôi tiến hành tối ưu điều kiện cấp khí vào trên môi trường MT1 trên thiết bị lên men 5 lít với pH duy trì trong suốt quá trình nuôi là 7,5 và tốc độ khuấy 150 vòng/phút ở các lưu lượng khí khác nhau là 0,3m 3 /h; 0,5m 3 /h và 0,8m 3 /h trong điều kiện 37 0 C và theo dõi các giờ nuôi cấy

Bảng 3.9 Ảnh hưởng lưu lượng khí vào khi lên men chủng B.subtilis SHV27

Nồng độ tế bào 10 8 (CFU/ ml) 0,3m 3 /h 0,5m 3 /h 0,8m 3 /h

32h 13,27 ± 0,08 15,17 ± 0,10 13,89 ± 0,70 Trong cùng điều kiện lên men, với lƣợng khí cấp vào khác nhau cho nồng độ tế bào khác nhau Lưu lượng khí cấp vào là 0,5m 3 /h cho nồng độ tế bào cao hơn khi lên men cấp vào lưu lượng khí 0,3m 3 /h và thời gian đạt nồng độ cao nhất sớm hơn so nuôi cấy lắc trong bình tam giác, điều này chứng tỏ chủng vi khuẩn

B.subtilis SHV27 hiếu khí, khi nồng độ oxi càng cao, tốc độ sinh trưởng của chủng càng nhanh và mạnh Tuy nhiên, cấp vào với lƣợng khí là 0,8m 3 /h lại không làm tăng nồng độ tế bào Điều này có thể giải thích do lưu lượng khí cấp vào lớn đồng nghĩa với việc quá trình oxi hòa tan và tiếp xúc với vi sinh vật diễn ra nhanh và không đủ thời gian để vi sinh vật có thể sử dụng nguồn oxi đƣợc cấp vào

Như vậy, nhiệt độ 37 0 C/khuấy 150 vòng/môi trường MT1 với pH duy trì là 7.5 với lưu lượng khí vào là 0,5m 3 /h được chọn làm điều kiện lên men chủng

Bacillus subtilis SHV27 và ở 20h cho hàm lƣợng tế bào cao nhất là 16,61 × 10 8

3.5 Khảo sát ên men chủng B paralicheniformis SHV43 và B.pumilus

Nhận thấy các chủng Bacillus có đặc điểm sinh học tương đối giống nhau,

Do thời gian nghiên cứu có hạn nên sau khi tối ƣu điều kiện lên men B.subtilis chủng SHV27, tiến hành áp dụng các điều kiện lên men đó cho chủng B paralicheniformis SHV43 và B.pumilus SHV52

Bảng 3.10 Khảo sát lên men chủng B paralicheniformis SHV43 và B.pumilus

Nồng độ tế bào 10 8 (CFU/ ml)

Hai chủng SHV43 và SHV52 lên men trong điều kiện 37 0 C/khuấy 150 vòng/phút, sử dụng môi trường MT1 với pH duy trì là 7,5 với lưu lượng khí vào là 0,5m 3 /h trong thời gian 20h cho hàm lƣợng tế bào cao nhất lần lƣợt là 16,57×10 8 và 16,4× 10 8 CFU/ml,

Kết luận: Cả 3 chủng SHV27; SHV43 và SHV52 đều có cùng điều kiện nuôi cấy là môi trường dinh dưỡng MT1 với pH= 7,5 lên men trong điều kiện

37 0 C, khuấy 150 vòng/phút, với lưu lượng khí vào là 0,5m 3 /h với thời gian nuôi

Khảo sát lên men chủng B paralicheniformis SHV43 và B.pumilus SHV5257 3.6 Tạo chế phẩm

cấy đều là 20h Đây có thể là do sự giống nhau về đặc điểm sinh lý của các chủng nhóm Bacillus

Các chủng Bacillus lên men đều là các chủng tạo đƣợc bào tử Do dó, sau quá trình lên men tiến hành ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút để thu cặn sinh khối Trong quá trình thu hồi có xác định đƣợc tỷ lệ thu hồi trong quá trình ly tâm là 99%

Sinh khối sau ly tâm đƣợc phối trộn với tá dƣợc trơ là tinh bột sắn đã sấy vô trùng ở 170 0 /3h và sữa gầy 10% theo tỷ lệ sinh khối: sữa gầy 10%: tinh bột sắn = 1:1:2 Tiến hành rây tạo hạt và sấy khô ở nhiệt độ 45-50 0 C đến khi hàm ẩm trong bột còn khoảng dưới 8% thì thu hồi và kiểm tra nồng độ tế bào

Sau khi tạo đƣợc nguyên liệu đơn chủng, kiểm tra nồng độ tế bào trong nguyên liệu Để xác định nồng độ tế bào trong chế phẩm, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế Streptococcus agalactiae ở các nồng độ 10 7 , 10 8 , 10 9 CFU/g từng nguyên liệu đơn chủng (bảng 3.11)

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của các nồng độ nguyên liệu khác nhau đến khả năng ức chế S.agalactiae

Nồng độ tế bào S.agalactiae 10 3 (CFU/ml)

Hình 3.6 Quy trình tổng quát tạo chế phẩm

Trong quá trình tuyển chọn chủng giống, nhận thấy B.pumilus cho vòng kháng khuẩn mạnh nhất trong 3 chủng vi khuẩn lựa chọn Sau đó là B.Subtilis và

B.paralicheniformis Thì ở kết quả này cũng thể hiện nồng độ tế bào vi khuẩn cần để ức chế vi khuẩn S.agalactiae cũng tương ứng B paralicheniformis; B.subtilis và B pumilus với hàm lƣợng lần lƣợt là 10 7 , 10 8 , 10 9 CFU/g Kết quả tương đồng với khả năng sinh chất kháng khuẩn ức chế S.agalactiae của chủng giống

Phối trộn SP PHẨMphẩm Đánh giá HQ

Ly tâm thu sinh khối

Ly tâm thu sinh khối Trộn tá dƣợc

Bảng 3.12 Thành phần công thức chế phẩm

Stt Thành phần Nồng độ

4 Tá dƣợc (dextrose) vừa đủ 1 gram

3.6.3 Khảo sát độ ổn định của chế phẩm

Chế phẩm sau khi phối trộn đƣợc khảo sát độ ổn định 3 lô về nồng độ tế bào trong quá trình bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ phòng làm căn cứ cho việc xác định hạn sử dụng của chế phẩm sau này

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ ổn định của chế phẩm

Hàm lƣợng vi khuẩn ( CFU/g)

Kết quả bước đầu nhận thấy chế phẩm giữ ổn định về nồng độ tế bào trong thời gian bảo quản.

Đánh giá hiệu quả sản phẩm

3.7.1 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm đến nồng độ NO 2 -

, NH 4 + và tăng trọng của cá a Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm đến nồng độ NO 2 - trong nước

Nồng độ khí độc NO2

- trong môi trường ao nuôi là một yếu tố phản ánh mức độ ô nhiễm môi trường ao nuôi Khi nồng độ NO2 - cao có thể dẫn đến ngộ độc gây chết cá

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến nồng độ NO 2 - trong nước

Thời gian theo dõi (ngày) Bể 1 Bể 2 Bể 3 Bể 4 Bể 5

Khi sử dụng chế phẩm nồng độ NO2

- trong môi trường nuôi được cải thiện rõ rệt Sau 7 ngày thí nghiệm, bể đối chứng không bổ sung chế phẩm bắt đầu xuất hiện NO2

- trong môi trường nuôi trong khi 4 bể còn lại có bổ sung chế phẩm đến ngày thứ 21 mới bắt đầu đo đƣợc NO2

- Từ ngày thứ 28 trở đi, bể đối chứng nồng độ NO2

- luôn đạt ngƣỡng cao là 5mg/lít Mặc dù chƣa gây ngộ độc cho cá nhƣng ở nồng độ cao, NO2 - sẽ ức chế sinh trưởng của cá

Kết quả bảng 3.15 cũng cho thấy khả năng khử NO2 - cũng không tỷ lệ thuận với nồng độ chế phẩm bổ sung vào, điều này có thể do khi hệ vi sinh trong

62 nước đã ở trạng thái ổn định thì sẽ duy trì được chất lượng Từ kết quả này cũng có thể sơ bộ lựa chọn đƣợc nồng độ chế phẩm sử dụng dự kiến 500gram/1000m 3 nước là hiệu quả mà vẫn kinh tế b Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm đến nồng độ NH 4 + trong nước

Khi môi trường ao nuôi bị ô nhiễm, chu trình chuyển hóa nitơ kém hiệu quả dẫn đến nồng độ NH4

+ tồn dư nhiều trong nước ao gây hại cho động vật thủy sản

Bảng 3 15 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến sự nồng độ

Kết quả bảng 3.14 cho thấy: Khi bổ sung chế phẩm có xu hướng làm giảm nồng độ NH4

+ gây độc trong nước so với đối chứng cụ thể với bể 1; nồng độ bổ sung chế phẩm là 500 gram/ 1000m 3 hiện tại đang giữ đƣợc nồng độ NH 4 + ổn định nhất so với các bể 1, 3, 4, 5 với nồng độ chế phẩm bổ sung tương ứng là 0 kg, 1kg và 2kg/ 1000m 3 Điều này có thể giải thích do sự biến động NH 4 + diễn ra rất mạnh theo thời gian trong quá trình nuôi c Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm đến tăng trọng của cá

Khi chất lượng môi trường tốt là điều kiện thuận lợi cho cá sinh trưởng và phát triển Do đó, khi nồng độ ô nhiễm thể hiện qua nồng độ NH4 +

, NO2 - ở các bể thí nghiệm thấp hơn bể đối chứng thì tăng trọng của cá ở các bể thí nghiệm cũng có xu hướng cao hơn sơ với bể đối chứng

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của các nồng độ chế phẩm khác nhau đến sinh trưởng của cá

42 62,0±0,9 67,0±0,7 68,5±0,8 67,6±1,8 71,5±0,3 Theo bảng 3.16 thấy tăng trọng cá ở các bể 2, 3, 4, 5 có xu hướng tốt hơn so bể 1 Điều này có thể giải thích là khi chất lượng môi trường nuôi được cải thiện tạo điều kiện thuận lợi để cá sinh trưởng và phát triển Sau 42 ngày theo dõi trọng lƣợng cá ở các bể 1, 2, 3, 4, 5 tăng trọng lần lƣợt là 21, 25,8; 27; 25,1; 29g

3.7.2 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm khác nhau đến khả năng ức chế S.agalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi Để đánh giá hiệu quả ức chế Streptococcus agalactiae của chế phẩm, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế của chế phẩm đến S.agalactiae ở 2 nồng độ bổ sung chế phẩm là 500 gram /1000m 3 và 1kg/1000m 3 để tiến hành thử nghiệm Trong điều kiện có nuôi cá, cảm nhiễm 10 3 CFU/ml vi khuẩn

Định dạng
Số trang	85
Dung lượng	2,62 MB